Pozyskiwanie ludzkiego mikrogleju z tkanki mózgowej dorosłego człowieka

Ogólnym celem protokołu jest wyizolowanie pierwotnych komórek mikrogleju z żywych tkanek mózgu dorosłego człowieka. W naszym przypadku zostało to zebrane jako okno chirurgiczne podczas operacji. Osiąga się to poprzez początkowe zebranie tkanek mózgowych w lodowatym PBS, a następnie tkankę kroi się w kostkę na małe kawałki o średnicy 1 mm, a ja właśnie to zrobiłem za pomocą trypsyny EDTA.

Następnie komórki zbiera się przez odwirowanie i posiewa w kolbie odpowiedniej do hodowli komórek androgenowych przez 48 godzin. Komórki są ponownie pobierane z kolby i hodowane do dalszego wykorzystania. Pierwotne ludzkie komórki mikrogleju można teraz scharakteryzować za pomocą immunocytochemii i wykorzystać do dalszych eksperymentów.

Główną zaletą naszego protokołu izolowania komórek mikrogleju z tkanek mózgowych dorosłego człowieka jest to, że skutecznie dostarcza on pierwotne dorosłe ludzkie komórki mikrogleju w bardzo opłacalny sposób. Protokół jest solidny i zmniejsza utratę komórek poprzez zmniejszenie liczby kroków używanych w istniejących protokołach. Zebrać tkankę do 50-mililitrowej probówki Falcon zawierającej 10 ml lodowatego aCSF.

Ostrożnie przetrzyj probówkę zbiorczą 70% alkoholem i przenieś do aseptycznej komory przepływu laminarnego powietrza. Ostrożnie wyrzucić płyn CSF i zważyć tkankę w probówce Falcon. Oblicz przybliżoną wagę tkanki, dedukując wagę pustej probówki Falcona.

Podgrzej świeże aCSF do 37 stopni Celsjusza. Utrzymuj tkankę w ciepłym płynie mózgowo-rdzeniowym przez pięć minut. Ten krok ma kluczowe znaczenie, aby uniknąć śmierci komórki.

Ostrożnie wyrzuć CSF. I umyj chusteczkę raz za pomocą 1X PBS podgrzanego do 37 stopni Celsjusza. Upewnij się, że cała krew została zmyta za pomocą powtarzających się płukań PBS w razie potrzeby.

Inkubuj tkankę w ciepłym PBS przez 5 minut. Ostrożnie wyrzuć połowę PBS. Przenieś tkankę wraz z pozostałym PBS na wysterylizowaną szalkę Petriego.

Ostrożnie usuń pozostały PBS za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Zapobiegnie to utracie tkanki. Pokrój ten problem w kostkę na co najmniej 1-milimetrowe kawałki w kostkę za pomocą sterylnego skalpela.

Dodaj 2 ml 0,25% trypsyny EDTA na szalkę Petriego i dokładnie umyj płytkę za pomocą pipety. Przenieś pokrojoną w kostkę tkankę do 50-mililitrowej probówki Falcon zawierającej 10 ml na gram tkanki 0,25% trypsyny EDTA. Wymieszać przez pipetowanie przez pipetę serologiczną o pojemności 10 ml.

Inkubować probówkę na wytrząsarce przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i prędkości 250 obr./min. Dodaj 10 ml pożywki neutralizującej, aby zneutralizować trypsynę. Dokładnie wymieszać za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml.

Odwirować probówkę o sile 2000 g w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 10 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml pożywki hodowlanej. Umieścić komórki w kolbie T25 odpowiedniej dla komórek androgenowych i dodać 4 ml dodatkowej pożywki hodowlanej.

Pożywka hodowlana będzie zawierała 20% supernatantu L929 i 1% streptomycyny. Zaleca się dodawanie supernatantu L929 oddzielnie do kolb, zamiast dodawania do pożywki podstawowej. Kończymy z kolbą, aby jednorodnie usunąć tkankę.

Unikać przykładania podłoża do szyjki kolby podczas potrząsania, ponieważ może to zwiększyć ryzyko zanieczyszczenia. Inkubować kolbę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2 przez 48 godzin. Zebrać pożywkę z kolby hodowlanej T25 przygotowanej w dniu 0 w probówkach wirówkowych.

Odwirować zebrane pożywki w temperaturze 1,466G w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 4 minuty. Podczas odwirowywania zebranych pożywek, należy przemyć kolbę dnia 0 raz 1X PBS. Delikatnie wstrząsnąć kolbą, aby usunąć wszelkie resztki pozostałych fragmentów tkanki.

Unikać mocnego potrząsania kolbą, ponieważ wszelkie resztki nie wpłyną niekorzystnie na kulturę. Dodać 5 ml świeżej pożywki do kolby. Wyrzucić supernatant z probówek odwirowanych.

Dodać 1 ml pożywki hodowlanej do jednej z probówek i dokładnie wymieszać pipetą. Szeregowo dodawaj zmieszane podłoże z komórkami do innych probówek i dokładnie wymieszaj. Ułóż komórki w oddzielnej kolbie T25 odpowiedniej dla komórek androgenowych.

Dodać 4 ml świeżej pożywki hodowlanej do kolby. Inkubować obie kolby w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2 przez 48 godzin. Wyrzucić pożywkę z obu kolb i dodać świeżą pożywkę o pojemności 5 ml.

Inkubować kolby w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy 5% CO2 przez 48 godzin. Szóstego dnia komórki będą gotowe do dalszych eksperymentów. Na przedstawionych tutaj obrazach.

Pierwszy panel sekcji Astrocyty wybarwione GFAP, koloru zielonego. W drugim panelu, w sekcji A, barwienie mikrogleju z RCA, w kolorze zielonym. W sekcji B mikroglej wybarwiony RCA, który jest koloru zielonego, a astrocyty są wybarwione GFAP w kolorze czerwonym.

Nakładanie się obrazów pokazuje mikroglej i astrocyty razem. Ze zdjęć jasno wynika, że większość komórek w przygotowanej kulturze to komórki mikrogleju. Obrazy zostały określone ilościowo za pomocą zaślepionej kontroli, a wynik przedstawiono w sekcji C. Wyniki wykazały, że około 80% komórek w przygotowanej hodowli to komórki mikrogleju.

Tę technikę można wykonać w około półtorej godziny. Postępowanie zgodnie z tą procedurą powinno dobrze zrozumieć, w jaki sposób wybrać mikroglej gruntujący z tkanek mózgowych dorosłego człowieka, które można dalej wykorzystać do dalszych eksperymentów.