Name: Pozyskiwanie ludzkiego mikrogleju z tkanki mózgowej dorosłego człowieka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Poznaj metodę izolacji pierwotnych mikroglejów z żywej tkanki mózgowej dorosłego człowieka. Protokół zapewnia wysoką wydajność i czystość około 80% komórek, umożliwiając badania w neurobiologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Laboratorium SJ zostało założone dzięki grantom instytucjonalnym od IITJ i jest finansowane z grantów Departamentu Biotechnologii (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) oraz Ministerstwa Elektroniki i Technologii Informacyjnych Rządu Indii (No.4(16)/2019-ITEA). Skrawki ludzkiej tkanki mózgowej zostały pozyskane z All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) w Jodhpur po uzyskaniu zgody instytucjonalnej komisji etyki. Dziękujemy Mayankowi Rathorowi, B.Tech studenckiemu członkowi Design and Arts Society IIT Jodhpur, za wsparcie w zakresie filmowania.

Wszystkie tkanki zostały pobrane po uzyskaniu zgody etycznej od komisji etycznych instytutu Indyjskiego Instytutu Technologii Jodhpur i All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur.
1.Pozyskiwanie i przetwarzanie tkanek (Dzień 0)
<ol>
	<li>Zbierz tkankę do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml lodowatego sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF) (2 mM CaCl2∙2H2O, 10 mM glukozy, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2∙6H2O, 202 mM sacharozy)20. Upewnij się, że probówka jest trzymana na lodzie, jeśli tkanka musi zostać przeniesiona w inne miejsce. 
	UWAGA: Przygotuj płyn CSF w autoklawowanej wodzie destylowanej. Przefiltruj go za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm w okapie laminarnym. Można go przechowywać przez 1 miesiąc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie przetrzyj probówkę zbiorczą 70% alkoholem i przenieś do aseptycznej komory przepływu laminarnego powietrza.</li>
	<li>Ostrożnie wyrzucić aCSF i zważyć tkankę w stanie aseptycznym. Masa tkanki jest niezbędna do obliczenia objętości trypsyny-EDTA potrzebnej do kolejnych etapów.</li>
	<li>Przechowywać chusteczkę w świeżym, ciepłym płynie CSF w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Ten krok ma kluczowe znaczenie, aby uniknąć śmierci komórki.</li>
	<li>Wyrzucić płyn CSF i raz przemyć tkankę 1x PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami) w temperaturze 37 °C. Upewnij się, że cała krew została zmyta za pomocą wielokrotnych płukań PBS (w razie potrzeby).</li>
	<li>Inkubować tkankę w ciepłym PBS, w temperaturze 37 °C, przez 5 minut.</li>
	<li>Ostrożnie wyrzucić PBS i przenieść tkankę na wysterylizowaną szalkę Petriego. PBS można usunąć za pomocą pipety. Zapobiegnie to utracie tkanki.</li>
	<li>Tkankę pokroić w kostkę na małe (co najmniej 1 mm3) kawałki za pomocą sterylnego skalpela. Drobno pokrojona w kostkę tkanka zapewnia większą powierzchnię tkanki do dysocjacji tkanek przez trypsynę-EDTA, zapewniając wyższą wydajność.</li>
	<li>Przenieś pokrojoną w kostkę tkankę do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml/g tkanki 0,25% trypsyny-EDTA i wymieszaj, pipetując przez pipetę serologiczną o pojemności 10 ml. Dodaj 2 ml trypsyny/EDTA do szalki Petriego i dokładnie umyj płytkę za pomocą pipety. Dodaj tę trypsynę z powrotem do probówki sokoła. Minimalizuje to utratę tkanek i komórek podczas krojenia w kostkę.</li>
	<li>Inkubować probówkę na wytrząsarce przez 30 minut w temperaturze 37 °C przy 250 obr./min. Ten krok zwiększa dysocjację komórek od tkanki.</li>
	<li>Pod koniec inkubacji dodać 10 ml pożywki neutralizującej (50% DMEM/50% F12 z glutaminą, 1% penicyliny-streptomycyny, 10% FBS) w celu zneutralizowania trypsyny. Wymieszać pipetą serologiczną o pojemności 10 ml. Ilość dodanego podłoża neutralizującego powinna być równa ilości użytej trypsyny.</li>
	<li>Odwirować probówkę o masie 2 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml pożywki hodowlanej (50% DMEM/50% F12 z glutaminą, 1% penicyliną-streptomycyną, 20% supernatantem L929, 10% FBS). 
	UWAGA: Komórki L929 są hodowane w DMEM (DMEM z glutaminą, 1% penicyliną-streptomycyną, 10% FBS). W przypadku hodowli komórkowej należy postępować zgodnie z zalecaną przez ATCC metodą hodowli. Supernatant musi być pobrany z kolby hodowlanej, która zawiera co najmniej 75% zlewania się. Może być zbierany luzem i przechowywany w temperaturze -80 °C, aby zapobiec degradacji czynników wzrostu. Zaleca się dodawanie supernatantu L929 oddzielnie do kolb, zamiast dodawania do pożywki podstawowej.</li>
	<li>Umieść komórki w kolbie T-25, odpowiedniej dla komórek przylegających, i dodaj 4 ml dodatkowej pożywki hodowlanej. Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Ostrożnie wstrząsnąć kolbą, aby równomiernie rozproszyć tkankę. Unikać przykładania pożywki do szyjki kolby podczas potrząsania, ponieważ może to zwiększyć ryzyko zanieczyszczenia.</li>
</ol>
2.Hodowla komórkowa (Dzień 2)
<ol>
	<li>Zebrać pożywkę z kolby hodowlanej T-25 przygotowanej w dniu 0 do trzech probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml, zbierając równą objętość pożywki w każdej probówce. Umyć kolbę raz 1 x PBS. Delikatnie wstrząsnąć kolbą, aby usunąć wszelkie resztki pozostałych fragmentów tkanki. Unikać mocnego potrząsania kolbą, ponieważ wszelkie resztki nie wpłyną niekorzystnie na kulturę. Dodać 5 ml świeżej pożywki hodowlanej do kolby.</li>
	<li>Odwirować zebrane pożywki przy 1,466 x g (4000 obr./min) w temperaturze 4 °C przez 4 minuty.</li>
	<li>Odrzucić sklarowany osad z każdej probówki i dodać 1 ml pożywki hodowlanej do jednej z probówek. Dokładnie wymieszać pipetą. Szeregowo dodawaj zmieszane podłoże z komórkami do innych probówek. Dokładnie wymieszaj pipetą i połącz komórki w jednej probówce.</li>
	<li>Umieść komórki w osobnej kolbie T-25, odpowiedniej dla komórek przylegających. Dodać 4 ml pożywki i inkubować kolbę w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
</ol>
3.Hodowla komórkowa (Dzień 4)
<ol>
	<li>Wyrzucić pożywkę z obu kolb i dodać do niej świeże 5 ml pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 2 dni.</li>
</ol>
4. Hodowla komórkowa (Dzień 6)
<ol>
	<li>Komórki będą gotowe do dalszych eksperymentów.</li>
</ol>

<ol><li>Allen, N. J., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia+-+more+than+just+brain+glue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glia - more than just brain glue.</a> Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).</li>
<li>Lenz, K. M., Nelson, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+Beyond%3A+Innate+Immune+Cells+As+Regulators+of+Brain+Development+and+Behavioral+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglia and Beyond: Innate Immune Cells As Regulators of Brain Development and Behavioral Function.</a> Frontiers in Immunology. 9 (698), (2018).</li>
<li>Gordon, S., Plüddemann, A., Martinez Estrada, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+heterogeneity+in+tissues%3A+phenotypic+diversity+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Macrophage heterogeneity in tissues: phenotypic diversity and functions.</a> Immunological Reviews. 262 (1), 36-55 (2014).</li>
<li>Li, Q., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+macrophages+in+brain+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).</li>
<li>Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+Alzheimer%27s+disease%3A+A+microglial+conundrum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microglia in Alzheimer's disease: A microglial conundrum.</a> Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2017).</li>
<li>Tremblay, M. -E., Cookson, M. R., Civiero, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+phagocytic+clearance+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Glial phagocytic clearance in Parkinson's disease.</a> Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 16(2019).</li>
<li>Qin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Functions+of+Microglia+in+Ischemic+Stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Dual Functions of Microglia in Ischemic Stroke.</a> Neuroscience Bulletin. 35 (5), 921-933 (2019).</li>
<li>Voet, S., Prinz, M., van Loo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+Central+Nervous+System+Inflammation+and+Multiple+Sclerosis+Pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Microglia in Central Nervous System Inflammation and Multiple Sclerosis Pathology.</a> Trends in Molecular Medicine. 25 (2), 112-123 (2019).</li>
<li>Loane, D. J., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+the+TBI+brain%3A+The+good%2C+the+bad%2C+and+the+dysregulated%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Microglia in the TBI brain: The good, the bad, and the dysregulated.</a> Experimental Neurology. 275 (03), Pt 3 316-327 (2016).</li>
<li>Inoue, K., Tsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+neuropathic+pain%3A+cellular+and+molecular+mechanisms+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential.</a> Nature Reviews Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).</li>
<li>Bellver-Landete, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+are+an+essential+component+of+the+neuroprotective+scar+that+forms+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Microglia are an essential component of the neuroprotective scar that forms after spinal cord injury.</a> Nature Communications. 10 (1), 518(2019).</li>
<li>Gutmann, D. H., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%2FBrain+Macrophages+as+Central+Drivers+of+Brain+Tumor+Pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia/Brain Macrophages as Central Drivers of Brain Tumor Pathobiology.</a> Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).</li>
<li>Smith, A. M., Dragunow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+side+of+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The human side of microglia.</a> Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).</li>
<li>Galatro, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+analysis+of+purified+human+cortical+microglia+reveals+age-associated+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).</li>
<li>Friedman, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+Brain+Myeloid+Expression+Profiles+Reveal+Distinct+Microglial+Activation+States+and+Aspects+of+Alzheimer%27s+Disease+Not+Evident+in+Mouse+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Diverse Brain Myeloid Expression Profiles Reveal Distinct Microglial Activation States and Aspects of Alzheimer's Disease Not Evident in Mouse Models.</a> Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).</li>
<li>Rustenhoven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PU.1+regulates+Alzheimer%27s+disease-associated+genes+in+primary+human+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">PU.1 regulates Alzheimer's disease-associated genes in primary human microglia.</a> Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 44(2018).</li>
<li>Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A. C., McEwen, B. S., Bulloch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+derived+from+aging+mice+exhibit+an+altered+inflammatory+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile.</a> Glia. 55 (4), 412-424 (2007).</li>
<li>Mizee, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+microglia+from+the+human+post-mortem+brain%3A+effects+of+ante-+and+post-mortem+variables%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary microglia from the human post-mortem brain: effects of ante- and post-mortem variables.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 16(2017).</li>
<li>Rustenhoven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+highly+enriched+primary+human+microglia+for+functional+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of highly enriched primary human microglia for functional studies.</a> Scientific Reports. 6 (1), 19371(2016).</li>
<li>Spaethling, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Cell+Culture+of+Live+Neurosurgically+Resected+Aged+Adult+Human+Brain+Cells+and+Single+Cell+Transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics.</a> Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).</li>
<li>Olah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+protocol+for+the+acute+isolation+of+human+microglia+from+autopsy+brain+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples.</a> Glia. 60 (1), 96-111 (2012).</li>
<li>Jha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Inflammasome+Sensor%2C+NLRP3%2C+Regulates+CNS+Inflammation+and+Demyelination+via+Caspase-1+and+Interleukin-18%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Inflammasome Sensor, NLRP3, Regulates CNS Inflammation and Demyelination via Caspase-1 and Interleukin-18.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (47), 15811(2010).</li>
<li>Freeman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NLR+members+NLRC4+and+NLRP3+mediate+sterile+inflammasome+activation+in+microglia+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).</li>
<li>Plant, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphotoxin+beta+receptor+%28Lt+betaR%29%3A+dual+roles+in+demyelination+and+remyelination+and+successful+therapeutic+intervention+using+Lt+betaR-Ig+protein%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Lymphotoxin beta receptor (Lt betaR): dual roles in demyelination and remyelination and successful therapeutic intervention using Lt betaR-Ig protein.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (28), 7429-7437 (2007).</li>
<li>Arnett, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Protective+Role+of+Nitric+Oxide+in+a+Neurotoxicant-+Induced+Demyelinating+Model%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Protective Role of Nitric Oxide in a Neurotoxicant- Induced Demyelinating Model.</a> The Journal of Immunology. 168 (1), 427(2002).</li>
<li>Arnett, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF%CE%B1+promotes+proliferation+of+oligodendrocyte+progenitors+and+remyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">TNFα promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination.</a> Nature Neuroscience. 4 (11), 1116-1122 (2001).</li>
<li>Trouplin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow-derived+macrophage+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Bone marrow-derived macrophage production.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50966(2013).</li>
<li>Boltz-Nitulescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+Rat+Bone+Marrow+Cells+Into+Macrophages+Under+the+Influence+of+Mouse+L929+Cell+Supernatant%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of Rat Bone Marrow Cells Into Macrophages Under the Influence of Mouse L929 Cell Supernatant.</a> Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).</li>
<li>Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor+is+expressed+and+secreted+in+cultures+of+murine+L929+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells.</a> Journal of Immunological Methods. 184 (2), 281-283 (1995).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Mikroglej zapewnia homeostazę w normalnym mózgu i odgrywa kluczową rolę w patofizjologii różnych chorób neurologicznych4. Mikroglej ma kluczowe znaczenie dla rozwoju neurologicznego i tworzenia synaps2. Badania nad mikroglejem okazały się kluczowe w zrozumieniu rozwoju i progresji różnych chorób neurologicznych4. Mikroglej gryzoni jest najczęściej wybieranym modelem w pierwotnych badaniach mikrogleju, mimo że mikroglej gryzoni różni się od pierwotneg...

Ośrodkowy układ nerwowy (OUN) składa się ze złożonej sieci neuronów i komórek glejowych1. Wśród komórek glejowych mikroglej funkcjonuje jako wrodzone komórki odpornościowe klasy CNS 2,3. Mikroglej jest odpowiedzialny za utrzymanie homeostazy w zdrowym OUN 4. Mikroglej odgrywa również ważną rolę w rozwoju neurologicznym, przycinając synapsy2. Mikroglej ma kluczowe znaczenie dla patofizjologii kilku chorób neurologicznych, w tym między innymi; Choroba Alzheimera5, choroba Parkinsona6, udar7, stwardnienie rozsiane8, urazowe uszkodzenie mózgu9, ból neuropatyczny10, uraz rdzenia kręgowego11 oraz nowotwory mózgu, takie jak glejaki12.
Badania związane z homeostazą i chorobami OUN wykorzystują mikroglej gryzoni ze względu na brak efektywnych kosztowo i czasowo protokołów izolacji pierwotnego mikrogleju u ludzi13. Mikroglej gryzoni przypomina pierwotny ludzki mikroglej pod względem ekspresji genów, takich jak Iba-1, PU.1, DAP12 i receptor M-CSF, i okazał się skuteczny w zrozumieniu zarówno normalnego, jak i chorego mózgu13. Co ciekawe, ekspresja kilku genów związanych z odpornością, takich jak TLR4, MHC II, Siglec-11 i Siglec-3, różni się między ludźmi i gryzoniami microglia13. Ekspresja kilku genów różni się również w ekspresji czasowej i w chorobach neurodegeneracyjnych u obu gatunków14,15. Te znaczące różnice sprawiają, że ludzki mikroglej jest niezbędnym modelem do badania funkcji mikrogleju w homeostazie i chorobie. Pierwotny ludzki mikroglej może być również skutecznym narzędziem do przedklinicznych badań przesiewowych potencjalnych kandydatów na leki16. Wyżej wymienione powody podkreślają rosnące zapotrzebowanie na opłacalne protokoły izolacji pierwotnego ludzkiego mikrogleju.
Opracowaliśmy protokół izolacji pierwotnego ludzkiego mikrogleju z tkanki mózgowej dorosłego człowieka pobranej w wyniku okna chirurgicznego stworzonego do resekcji guza lub innych resekcji chirurgicznych. Metoda ta znacznie różni się od istniejących metod. Udało nam się wyizolować i wyhodować mikroglej po czasie tranzytu wynoszącym około 75 minut od miejsca pobrania tkanek do rozpoczęcia protokołu izolacji w laboratorium. Użyliśmy supernatantu komórek fibroblastów L929 do promowania wzrostu izolowanego mikrogleju. Metoda ta koncentruje się w szczególności na hodowli i rozwoju tylko pierwotnego mikrogleju. Otrzymana przygotowana kultura składa się w około 80% z mikrogleju. Podczas gdy inne protokoły zapewniają wzbogaconą hodowlę mikrogleju poprzez wirowanie w gradionym gradieniu gęstości, cytometrię przepływową i kulki magnetyczne, protokół jest szybkim, prostym, solidnym i opłacalnym sposobem hodowli pierwotnego ludzkiego mikrogleju17,18,19,20. Możliwość wykorzystania chirurgicznie usuniętej żywej dorosłej tkanki mózgowej zamiast utrwalonych tkanek mózgowych ze zwłok dowodzi dodatkowej zalety tej metody w przeciwieństwie do istniejących procedur18,21.

<table><tbody><tr><td>Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy</td><td>Himedia</td><td>A002</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka (4 &deg; C)</td> <td>Sigma</td><td>146532</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe</td><td>Abdos</td><td>P10203</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>Nowy Brunswik</td><td>Galaxy 170 S</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Himedia</td><td>GRM077</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka DMEM z glutaminą</td><td>Himedia</td><td>AL007S</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Himedia</td><td>RM9955</td><td></td></tr><tr><td>Tubka flakonowa (50 ml)</td><td>Thermo Fsiher Scientific&nbsp;</td><td>50CD1058</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceina Ricinus communis aglutynina-1</td><td>Vector</td><td>FL-1081</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Leica</td><td>DM2000LED</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield z przeciwciałem DAPI</td><td>Sigma</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>GFAP</td><td>GA5</td><td>3670S</td> Wytrząsarka do inkubatora <td></td></tr><tr><td></td><td>Nowy Brunszwik Scientific</td><td>Innova 42</td><td></td></tr><tr><td>L929 linia komórkowa</td><td>ATCC</td><td>NCTC klon 929 [komórka L, L-929, pochodna szczepu L] (ATCC&nbsp; CCL-1)</td><td></td></tr> <tr><td>Laminarny przepływ powietrza</td><td>Thermo Fsiher Scientific&nbsp;</td><td>1386</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Himedia</td><td>MB040</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan monosodowy</td><td>Merck</td><td>567545</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka składników odżywczych F-12 Szynka Średnia</td><td>Himedia</td><td>Al106S</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>Duran Group</td><td>237554805</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Himedia</td><td>ML023</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek</td> <td>potasuHimedia</td><td>MB043</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna</td><td>Sprzęt laboratoryjny</td><td>LW-SP1010</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Himedia</td><td>MB045</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td></td><td>Himedia MB025</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy (0,2&mu;, średnica 25 mm)</td><td>Kolby do hodowli tkankowych Axiva</td><td>SFPV25R</td><td></td></tr><tr><td>T-25 odpowiednie do przylegających hodowli komórkowych.</td><td>Himedia</td><td>TCG4-20X10NO</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0.25%)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>Numer katalogowy: 25200-056</td><td></td></tr></tbody></table>

pozyskiwanie ludzkiego mikrogleju z tkanki mózgowej dorosłego człowieka

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Mikroglej to wrodzone komórki odpornościowe ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Mikroglej odgrywa kluczową rolę podczas rozwoju, w utrzymaniu homeostazy oraz podczas infekcji lub urazu. Kilka niezależnych grup badawczych podkreśliło kluczową rolę, jaką mikroglej odgrywa w chorobach autoimmunologicznych, zespołach autozapalnych i nowotworach. Aktywacja mikrogleju w niektórych chorobach neurologicznych może bezpośrednio uczestniczyć w procesach patogennych. Pierwotny mikroglej jest potężnym narzędziem do zrozumienia odpowiedzi immunologicznych w mózgu, interakcji komórka-komórka i rozregulowanych fenotypów mikrogleju w chorobie. Pierwotne mikroglej naśladuje właściwości mikrogleju in vivo lepiej niż unieśmiertelnione linie komórkowe mikrogleju. Mikroglej u dorosłych ludzi wykazuje odmienne właściwości w porównaniu z mikroglejem ludzkiego płodu i gryzoni. Protokół ten zapewnia skuteczną metodę izolacji pierwotnego mikrogleju z mózgu dorosłego człowieka. Badanie tych mikrogleju może dostarczyć krytycznych informacji na temat interakcji komórka-komórka między mikroglejem a innymi populacjami komórkowymi rezydentnymi w OUN, w tym oligodendrocytami, neuronami i astrocytami. Ponadto mikroglej z różnych ludzkich mózgów może być hodowany w celu scharakteryzowania unikalnych odpowiedzi immunologicznych dla medycyny spersonalizowanej i niezliczonych zastosowań terapeutycznych.

Stosując powyższy protokół (Rysunek 1), udało nam się wyizolować pierwotne ludzkie mikrogleje z żywych, chirurgicznie usuniętych tkanek mózgu. Hodowane komórki barwiono lektyną Ricinus communis agglutinin-1 (RCA-1) w celu identyfikacji mikrogleju (kolor zielony) oraz białkiem kwaśnym włókienstwa gliałowego (GFAP) w celu identyfikacji astrocytów (kolor czerwony) (Rysunek 2), zgodnie z wcześniejszymi opisami<sup class="xre...

Ten protokół jest wydajną, opłacalną i solidną metodą izolowania pierwotnego mikrogleju od żywej, dorosłej, ludzkiej tkanki mózgowej. Wyizolowany pierwotny mikroglej ludzki może służyć jako narzędzie do badania procesów komórkowych w homeostazie i chorobie.

Pozyskiwanie ludzkiego mikrogleju z tkanki mózgowej dorosłego człowieka

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

Ogólnym celem protokołu jest wyizolowanie pierwotnych komórek mikrogleju z żywych tkanek mózgu dorosłego człowieka. W naszym przypadku zostało to zebrane jako okno chirurgiczne podczas operacji. Osiąga się to poprzez początkowe zebranie tkanek mózgowych w lodowatym PBS, a następnie tkankę kroi się w kostkę na małe kawałki o średnicy 1 mm, a ja właśnie to zrobiłem za pomocą trypsyny EDTA.Następnie komórki zbiera się przez odwirowanie i posiewa w kolbie odpowiedniej do hodowli komórek androgenowych przez 48 godzin. Komórki są ponownie pobierane z kolby i hodowane do dalszego wykorzystania. Pierwotne ludzkie komórki mikrogleju można teraz scharakteryzować za pomocą immunocytochemii i wykorzystać do dalszych eksperymentów.Główną zaletą naszego protokołu izolowania komórek mikrogleju z tkanek mózgowych dorosłego człowieka jest to, że skutecznie dostarcza on pierwotne dorosłe ludzkie komórki mikrogleju w bardzo opłacalny sposób. Protokół jest solidny i zmniejsza utratę komórek poprzez zmniejszenie liczby kroków używanych w istniejących protokołach. Zebrać tkankę do 50-mililitrowej probówki Falcon zawierającej 10 ml lodowatego aCSF.Ostrożnie przetrzyj probówkę zbiorczą 70% alkoholem i przenieś do aseptycznej komory przepływu laminarnego powietrza. Ostrożnie wyrzucić płyn CSF i zważyć tkankę w probówce Falcon. Oblicz przybliżoną wagę tkanki, dedukując wagę pustej probówki Falcona.Podgrzej świeże aCSF do 37 stopni Celsjusza. Utrzymuj tkankę w ciepłym płynie mózgowo-rdzeniowym przez pięć minut. Ten krok ma kluczowe znaczenie, aby uniknąć śmierci komórki.Ostrożnie wyrzuć CSF. I umyj chusteczkę raz za pomocą 1X PBS podgrzanego do 37 stopni Celsjusza. Upewnij się, że cała krew została zmyta za pomocą powtarzających się płukań PBS w razie potrzeby.Inkubuj tkankę w ciepłym PBS przez 5 minut. Ostrożnie wyrzuć połowę PBS. Przenieś tkankę wraz z pozostałym PBS na wysterylizowaną szalkę Petriego.Ostrożnie usuń pozostały PBS za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Zapobiegnie to utracie tkanki. Pokrój ten problem w kostkę na co najmniej 1-milimetrowe kawałki w kostkę za pomocą sterylnego skalpela.Dodaj 2 ml 0,25% trypsyny EDTA na szalkę Petriego i dokładnie umyj płytkę za pomocą pipety. Przenieś pokrojoną w kostkę tkankę do 50-mililitrowej probówki Falcon zawierającej 10 ml na gram tkanki 0,25% trypsyny EDTA. Wymieszać przez pipetowanie przez pipetę serologiczną o pojemności 10 ml.Inkubować probówkę na wytrząsarce przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i prędkości 250 obr./min. Dodaj 10 ml pożywki neutralizującej, aby zneutralizować trypsynę. Dokładnie wymieszać za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml.Odwirować probówkę o sile 2000 g w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 10 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml pożywki hodowlanej. Umieścić komórki w kolbie T25 odpowiedniej dla komórek androgenowych i dodać 4 ml dodatkowej pożywki hodowlanej.Pożywka hodowlana będzie zawierała 20% supernatantu L929 i 1% streptomycyny. Zaleca się dodawanie supernatantu L929 oddzielnie do kolb, zamiast dodawania do pożywki podstawowej. Kończymy z kolbą, aby jednorodnie usunąć tkankę.Unikać przykładania podłoża do szyjki kolby podczas potrząsania, ponieważ może to zwiększyć ryzyko zanieczyszczenia. Inkubować kolbę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2 przez 48 godzin. Zebrać pożywkę z kolby hodowlanej T25 przygotowanej w dniu 0 w probówkach wirówkowych.Odwirować zebrane pożywki w temperaturze 1,466G w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 4 minuty. Podczas odwirowywania zebranych pożywek, należy przemyć kolbę dnia 0 raz 1X PBS. Delikatnie wstrząsnąć kolbą, aby usunąć wszelkie resztki pozostałych fragmentów tkanki.Unikać mocnego potrząsania kolbą, ponieważ wszelkie resztki nie wpłyną niekorzystnie na kulturę. Dodać 5 ml świeżej pożywki do kolby. Wyrzucić supernatant z probówek odwirowanych.Dodać 1 ml pożywki hodowlanej do jednej z probówek i dokładnie wymieszać pipetą. Szeregowo dodawaj zmieszane podłoże z komórkami do innych probówek i dokładnie wymieszaj. Ułóż komórki w oddzielnej kolbie T25 odpowiedniej dla komórek androgenowych.Dodać 4 ml świeżej pożywki hodowlanej do kolby. Inkubować obie kolby w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2 przez 48 godzin. Wyrzucić pożywkę z obu kolb i dodać świeżą pożywkę o pojemności 5 ml.Inkubować kolby w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy 5% CO2 przez 48 godzin. Szóstego dnia komórki będą gotowe do dalszych eksperymentów. Na przedstawionych tutaj obrazach.Pierwszy panel sekcji Astrocyty wybarwione GFAP, koloru zielonego. W drugim panelu, w sekcji A, barwienie mikrogleju z RCA, w kolorze zielonym. W sekcji B mikroglej wybarwiony RCA, który jest koloru zielonego, a astrocyty są wybarwione GFAP w kolorze czerwonym.Nakładanie się obrazów pokazuje mikroglej i astrocyty razem. Ze zdjęć jasno wynika, że większość komórek w przygotowanej kulturze to komórki mikrogleju. Obrazy zostały określone ilościowo za pomocą zaślepionej kontroli, a wynik przedstawiono w sekcji C. Wyniki wykazały, że około 80% komórek w przygotowanej hodowli to komórki mikrogleju.Tę technikę można wykonać w około półtorej godziny. Postępowanie zgodnie z tą procedurą powinno dobrze zrozumieć, w jaki sposób wybrać mikroglej gruntujący z tkanek mózgowych dorosłego człowieka, które można dalej wykorzystać do dalszych eksperymentów.

obtaining-human-microglia-from-adult-human-brain-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Izolowanie pierwotnych mikroglejów z heterogenicznej populacji komórek mózgu jest niezbędne do zbadania ich roli w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Niniejszy protokół opisuje technikę mechanicznej izolacji i mieszanej hodowli komórkowej, która zapewnia wysoką wydajność oraz wysoką czystość żywych, pierwotnych komórek mikrogleju do badań in vitro i dalszych zastosowań.

Izolacja pierwotnych mikroglejów z mieszanych kultur komórek glejowych tkanki mózgu noworodka szczura

Film demonstruje technikę izolowania mikrogleju z kory mózgowej dorosłej myszy. Po pierwsze, kora przechodzi segmentację i homogenizację w celu usunięcia neuronów i innych komórek glejowych, zachowując mikroglej. Następnie zawiesina komórkowa jest poddawana działaniu mikrokulek magnetycznych antymieliny i pola magnetycznego, skutecznie oddzielając komórki mikrogleju i szpiku od resztek mieliny i komórek zawierających mielinę.

Izolacja mikrogleju z kory mózgowej dorosłej myszy

Film demonstrował metodę izolowania i hodowli komórek z mózgu noworodka myszy. Polegało to na enzymatycznej i mechanicznej dysocjacji mózgu, a następnie hodowli w pożywkach wzrostowych pozbawionych neuronalnego czynnika wzrostu w celu uzyskania mieszanej populacji glejowej.

Uzyskiwanie mieszanej hodowli komórek glejowych z mózgu noworodka myszy

Przedstawiamy metody efektywnej i szybkiej izolacji/hodowli żywotnego mikrogleju z kory mózgowej noworodka i dorosłego rdzenia kręgowego.  Sekcja i posiew mikrogleju korowego może być przeprowadzona w ciągu 90 minut, a późniejsze zbieranie mikrogleju odbywa się ~ 10 dni po początkowym rozbiorze.

Hodowla mikrogleju z ośrodkowego układu nerwowego noworodków i dorosłych

Jednym z kluczy do udanego badania biologii mikrogleju jest zachowanie funkcji immunologicznej mikrogleju ex vivo podczas izolacji z tkanki OUN. Wyizolowanie mikrogleju za pomocą wytrząsania obrotowego daje wysoce czyste i immunofunkcjonalne hodowle komórek, oceniane za pomocą obrazowania fluorescencyjnego, immunocytochemii i ELISA po aktywacji mikrogleju za pomocą bodźców prozapalnych lipopolisacharydu (LPS) i Pam3CSK4 (Pam).

Izolacja mikrogleju korowego z zachowanym immunofenotypem i funkcjonalnością od mysich noworodków

Dostarczamy protokół izolacji mikrogleju z różnych wypreparowanych obszarów półkuli mózgu dorosłej myszy, a następnie półautomatyczne przygotowanie biblioteki do głębokiego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki transkryptomów pełnej długości. Metoda ta pomoże wyjaśnić funkcjonalną heterogeniczność mikrogleju w zdrowiu i chorobie.

Izolacja specyficznego dla regionu mikrogleju z jednej dorosłej półkuli mózgu myszy w celu głębokiego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki

Przedstawiony tutaj protokół pozwala na przeszczepienie indukowanego pluripotencjalnego ludzkiego mikrogleju pochodzącego z komórek macierzystych (iPSMG) do mózgu drogą przeznosową u myszy immunokompetentnych. Przedstawiono metodę przygotowania i przeznosowego przeszczepienia komórek oraz podawania mieszaniny cytokin w celu utrzymania iPSMG.

Przeszczepienie indukowanego przez człowieka pluripotencjalnego mikrogleju pochodzącego z komórek macierzystych w mózgu myszy immunokompetentnych drogą przeznosową

Ten protokół opisuje proces różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w komórki podobne do mikrogleju do eksperymentów in vitro. Dołączamy również szczegółową procedurę generowania ludzkich synaptosomów z dolnych neuronów ruchowych pochodzących z iPSC, które można wykorzystać jako substrat do testów fagocytozy in vitro przy użyciu systemów obrazowania żywych komórek.

Ludzkie komórki podobne do mikrogleju: różnicowanie z indukowanymi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi i test fagocytozy żywych komórek in vitro przy użyciu ludzkich synaptosomów

Opisujemy protokół izolowania komórek mikrogleju z podwzgórza myszy (lub równoważnych małych struktur mózgu) za pomocą magnetycznie aktywowanego sortowania komórek (MACS), w stosunkowo krótkim czasie. Mikroglej podwzgórza sortowany przez MACS może być używany do analizy ex vivo i może być posiany w celu przeprowadzenia testów in vitro.

Izolacja mikrogleju podwzgórza ze świeżo perfundowanego mózgu dorosłej myszy przez sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie

To badanie przedstawia nowatorskie podejście do tworzenia ludzkich komórek mikrogleju (iMG) pochodzących z monocytów, które umożliwiają pośrednią ocenę stanu zapalnego mózgu. Przedstawia to model komórkowy, który może być korzystny dla badań koncentrujących się na potencjalnym zapaleniu mózgu i związanych z nim zaburzeniach neuropsychiatrycznych.

Inżynieria komórek mikrogleju indukowanych ludzką krwią do badań mózgu z odwrotną translacją

Poznaj metodę izolacji pierwotnych mikroglejów z żywej tkanki mózgowej dorosłego człowieka. Protokół zapewnia wysoką wydajność i czystość około 80% komórek, umożliwiając badania w neurobiologii.

Pozyskiwanie ludzkiego mikrogleju z tkanki mózgowej dorosłego człowieka

Przeglądaj więcej filmów