Name: Ulepszona metoda UPLC-UV do oznaczania ilościowego witaminy C w odmianach sałaty (Lactuca sativa L.) i dzikich krewnych roślin uprawnych (Lactuca spp.) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Poznaj ulepszoną metodę UPLC-UV do oznaczania witaminy C w sałacie i dzikich krewnych roślin uprawnych. Technika zapewnia szybką, niezawodną i dokładną analizę kwasu askorbinowego oraz dehydroaskorbinowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Bankowi Plazmy Zarodkowej Warzyw w Saragossie (BGHZ-CITA, Hiszpania) oraz Centrum Zasobów Genetycznych (CNG, Wageningen, Holandia) za dostarczenie nasion potrzebnych do tej pracy. Dziękujemy J. A. Aranjuelo, A. Castellanosowi i "laboratorio de valoración nutritiva" z CITA za wsparcie techniczne, a także D. L. Goodchildowi za recenzję języka angielskiego. Prace te zostały sfinansowane w ramach projektów RTA2017-00093-00-00 z Narodowego Instytutu Badań i Technologii Rolnictwa i Żywności (INIA) oraz LMP164_18 z rządu Aragonii; oraz w ramach Programu Operacyjnego FEDER Aragonia 2014-2020 i Europejskiego Funduszu Społecznego Unii Europejskiej [Grupos Consolidados A12-17R: "Grupo de investigación en fruticultura: caracterización, adaptación y mejora genéica" i A14-17R: "Sistemas agroganaderos alimentarios sostenibles" (SAGAS)]. Projekt I. M.L. otrzymał wsparcie w postaci umowy przeddoktorskiej na szkolenie lekarzy wydanej przez hiszpańskie Ministerstwo Nauki, Innowacji i Uniwersytetów (MCIU) oraz Hiszpańską Państwową Agencję Badawczą (AEI).

1. Przygotowanie materiału roślinnego
<ol>
	<li>Pobierz próbki z co najmniej dwóch liści z każdej rośliny do probówek polipropylenowych o pojemności 50 mL, wybierając liść zewnętrzny (starszy) oraz wewnętrzny (młodszy), aby dokładniej reprezentować całą roślinę. Dla każdej próbki zgromadź co najmniej trzy replikaty biologiczne.</li>
	<li>Natychmiast zamroź je w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C do momentu użycia. Upewnij się, że ciekły azot nie dostanie się do wnętrza probówek; w przeciwnym razie mogłyby one eksplodować podczas wyjmowania z powodu rozprężania gazu podczas odparowania. 
	OSTROŻNIE: Ze względu na potencjalne zagrożenia związane z użyciem ciekłego azotu wymagane jest stosowanie rękawic i osłony twarzy.</li>
	<li>Zdejmij zakrętki z probówek i umieść je na tackach w komorze liofilizatora (Tabela materiałów) zaprogramowanego w następujący sposób: -25 °C przez 72 h, -10 °C przez 10 h, 0 °C przez 10 h oraz 20 °C przez co najmniej 4 h. Podczas procesu liofilizacji utrzymuj stałą temperaturę kondensatora i próżnię, odpowiednio na poziomie -80,2 °C i 112 mTorr.</li>
	<li>Gdy materiał będzie całkowicie wysuszony (po upływie od 4 do 7 dni, w zależności od rodzaju rośliny i stopnia zagęszczenia w probówce), przechowuj go w temperaturze 4 °C, -20 °C lub -80 °C odpowiednio dla krótkiego (dni do tygodni), średniego (miesiące) lub długiego (lata) okresu przechowywania. Zaleca się umieszczenie w probówkach z próbkami woreczków z żelem krzemionkowym.</li>
	<li>Umieść liofilizowane próbki w probówkach polipropylenowych o pojemności 20 mL wraz ze stalowymi kulkami o średnicy 10 mm i rozdrobnij je za pomocą wortexera wieloprobówkowego, stosując taką intensywność i czas, jakie są niezbędne do uzyskania drobnego proszku. 
	UWAGA: Przez cały czas trwania procesu chronić próbki przed bezpośrednim działaniem światła.</li>
</ol>
2. Przygotowanie odczynników i roztworów
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór do ekstrakcji rozpuszczalnikowej: 8% kwasu octowego (v/v), 1% MPA (kwasu metafosforowego) (w/v), 1 mM EDTA (kwasu etylenodiaminotetraoctowego).
	<ol>
		<li>Oblicz całkowitą objętość rozpuszczalnika potrzebną do przetworzenia całego zestawu próbek, przyjmując, że do każdej z nich zostanie dodane 5 mL. Aby przygotować 1 L roztworu, dodaj do kolby: 30 g MPA, 0,372 g EDTA dehydratu, 80 mL kwasu octowego oraz 500 mL wody ultraczystej (odpowiednio skaluj objętości i ilości). Zamknij wylot kolby folią plastikową.</li>
		<li>Po rozpuszczeniu przy użyciu mieszadła magnetycznego, użyj kolby miarowej, aby precyzyjnie odmierzyć 1 L, dodając niezbędną ilość wody ultraczystej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj bufor do reakcji redukcji (0,5 M Tris (2-amino-2-(hydroksymetylo)-1,3-propanodiol) pH 9,0) oraz roztwór redukujący (40 mM DTT (1,4-ditiotreitol) w 0,5 M Tris pH 9,0).
	<ol>
		<li>Oblicz całkowitą objętość roztworu redukującego potrzebną do przetworzenia całego zestawu próbek, przyjmując, że do każdej z nich zostanie dodane 200 µL. Aby przygotować 100 mL buforu, dodaj do zlewki: 6,055 g Trisu i 90 mL wody ultraczystej (odpowiednio skaluj objętości i ilości). Zamknij wylot zlewki folią plastikową.</li>
		<li>Po rozpuszczeniu przy użyciu mieszadła magnetycznego, dostosuj pH roztworu do 9,0 poprzez dodanie 2 M HCl i użyj kolby miarowej, aby precyzyjnie odmierzyć 100 mL, dodając niezbędną ilość wody ultraczystej.</li>
		<li>Aby przygotować 100 mL roztworu redukującego, dodaj do zlewki: 0,629 g DTT (czystość: 98%) i 90 mL wcześniej przygotowanego buforu (0,5 M Tris pH 9,0) (punkty 2.2.1 do 2.2.2). Odpowiednio skaluj objętości i ilości. Zamknij wylot zlewki folią plastikową.</li>
		<li>Po rozpuszczeniu przy użyciu mieszadła magnetycznego, użyj kolby miarowej, aby precyzyjnie odmierzyć 100 mL, dodając niezbędną objętość buforu 0,5 M Tris pH 9,0. 
		UWAGA: Roztwór redukujący jest bardzo niestabilny. Dlatego zdecydowanie zaleca się stosowanie świeżo przygotowanego roztworu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwas siarkowy (0,4 M H2SO4)
	<ol>
		<li>Oblicz całkowitą objętość 0,4 M kwasu siarkowego potrzebną do przetworzenia całego zestawu próbek, przyjmując, że do każdej z nich zostanie dodane 200 µL. Aby przygotować 100 mL roztworu, dodaj do zlewki: 80 mL wody ultraczystej, a następnie 2,22 mL H2SO4 (czystość: 96%, gęstość: 1,84 g mL-1). Użyj kolby miarowej, aby precyzyjnie odmierzyć 100 mL, dodając niezbędną ilość wody ultraczystej. 
		OSTRZEŻENIE: Kwas siarkowy jest silnie żrący, dlatego należy go obsługiwać przy użyciu środków ochrony osobistej i pod wyciągiem. Ponadto kwas należy dodawać do wody ultraczystej, a nie wodę do kwasu, aby zredukować wydzielanie oparów i uniknąć wypadków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwas solny (2 M HCl).
	<ol>
		<li>Aby przygotować 100 mL 2 M kwasu solnego, dodaj do zlewki: 80 mL wody ultraczystej, a następnie 6,13 mL HCl (czystość: 37%, gęstość: 1,19 g mL-1). Zamknij wylot zlewki folią plastikową. Użyj kolby miarowej, aby precyzyjnie odmierzyć 100 mL, dodając niezbędną ilość wody ultraczystej. Odpowiednio skaluj objętości. 
		OSTRZEŻENIE: Kwas solny jest silnie żrący, dlatego należy go obsługiwać przy użyciu środków ochrony osobistej i pod wyciągiem. Ponadto kwas należy dodawać do wody ultraczystej, a nie wodę do kwasu, aby zredukować wydzielanie oparów i uniknąć wypadków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Standard AA (roztwór zapasowy i rozcieńczenia)
	<ol>
		<li>Odważ dokładnie 10 mg standardu AA (czystość: 99%) przy użyciu wagi precyzyjnej i dodaj 90 mL fazy ruchomej (woda ultraczysta pH 2,0 z kwasem mrawkowym).</li>
		<li>Po rozpuszczeniu przy użyciu mieszadła magnetycznego, użyj kolby miarowej, aby precyzyjnie odmierzyć 100 mL, dodając niezbędną objętość wody ultraczystej pH 2,0 z kwasem mrawkowym. 
		UWAGA: Chronić ten roztwór zapasowy przed ekspozycją na światło.</li>
		<li>Przygotuj pięć rozcieńczeń z roztworu zapasowego standardu AA w celu uzyskania krzywej kalibracyjnej zgodnie z instrukcjami w Tabeli 1 i przejdź do kroku 5.2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Standard</td>
			<td >[AA] (µg mL-1)</td>
			<td >Roztwór AA (100 µg mL-1) (µL)</td>
			<td >Faza ruchoma (µL)a</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >1</td>
			<td >0.5</td>
			<td >5</td>
			<td >995</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >2</td>
			<td >2.5</td>
			<td >25</td>
			<td >975</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >3</td>
			<td >5</td>
			<td >50</td>
			<td >950</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >4</td>
			<td >10</td>
			<td >100</td>
			<td >900</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >5</td>
			<td >25</td>
			<td >250</td>
			<td >750</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="4" >aWoda ultrapure pH 2.0 zakwaszona kwasem mrówkowym.</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Protokół przygotowania pięciu wzorców AA (kwasu askorbinowego). Podano objętości substancji rozpuszczonej i rozpuszczalnika niezbędne do przygotowania każdej z różnych stężeń wzorców.
3. Ekstrakcja AA i DHAA
UWAGA: Podczas etapów ekstrakcji zaleca się pracę w warunkach niskiego natężenia światła.
<ol>
	<li>Do polipropylenowej probówki wirówkowej o pojemności 15 mL dodać 50 mg liofilizowanej, zmielonej próbki oraz 5 mL rozpuszczalnika do ekstrakcji (krok 2.1).</li>
	<li>Wymieszać zawiesinę za pomocą vortexa przez 5 s, a następnie na wytrząsarce orbitalnej przez 10 min przy 2000 rpm.</li>
	<li>Umieścić probówkę w kąpieli ultradźwiękowej na 10 min w temperaturze pokojowej przy włączonych ultradźwiękach.</li>
	<li>Wirować przy 4,000 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie zebrać nadsącz, przefiltrować go przez filtr z celulozy regenerowanej o rozmiarze porów 0.22 µm i przechowywać w bursztynowej fiolce o pojemności 5 mL. Jest to Ekstrakt 1, który zawiera AA oraz DHAA. 
	UWAGA: Protokół można w tym miejscu przerwać, zamrażając ekstrakty w temperaturze -80 °C i chroniąc je przed światłem, ponieważ AA i DHAA są bardzo niestabilne i łatwo ulegają degradacji pod wpływem światła, wysokich temperatur lub w atmosferze utleniającej (Supplemental File 1).</li>
</ol>
4. Redukcja DHAA do AA w celu ekstrakcji TAA
<ol>
	<li>Przenieś 200 µL Ekstraktu 1 do 2 mL bursztynowej fiolki do chromatografii cieczowej i dodaj 200 µL roztworu redukującego (krok 2.2). Zamknij fiolkę korkiem PTFE-silikonowym z otworem wstępnym i wymieszaj za pomocą wortexa przez 5 s.</li>
	<li>Pozostaw roztwór na 30 min w temperaturze pokojowej, chroniąc go przed światłem.</li>
	<li>Dodaj 200 µL 0,4 M H2SO4, aby zatrzymać reakcję i ustabilizować AA w kwaśnym pH. Otrzymany roztwór to Ekstrakt 2, który zawiera wyłącznie AA i stanowi w rzeczywistości TAA.</li>
</ol>
5. Oznaczenie
<ol>
	<li>Przygotowanie UPLC-UV
	<ol>
		<li>Przygotować roztwory robocze opisane w Tabeli 2, odpowiednio przefiltrować je przez filtry 0,22 µm, poddać sonikacji przez co najmniej 10 min i umieścić w systemie UPLC.</li>
		<li>Włączyć trzy moduły UPLC i poczekać na zakończenie wewnętrznego procesu kalibracji.</li>
		<li>Otworzyć oprogramowanie (np. Empower 3) i załadować program instrumentalny opisany w Tabeli 2: Empower 3 | Run Samples | Vitamin C method | UPLC_PDA | Use QuickStart.</li>
		<li>Po załadowaniu programu w oprogramowaniu przejść do konsoli zarządzania UPLC: Quaternary Solvent Manager | Kliknięcie prawym przyciskiem myszy | Launch Console.</li>
		<li>Przejść do przygotowania i stabilizacji instrumentu UPLC: System | Control | Startup.
		<ol>
			<li>Przepłukać wszystkie linie UPLC przez co najmniej 5 min: Prime Solvents | QSM | Check A, B, C, D and Seal Wash | Duration of prime &gt; 5 min.</li>
			<li>Przepłukać i oczyścić injektor: Prime Solvents | SM | Check Wash solvent (&gt; 45 s) and Check Purge solvent (&gt; 35 cycles).</li>
			<li>Równoważyć UPLC do warunków metody: Equilibrate to Method | QSM | Flow (0,3 mL min-1) | Solvent A (2%) | Solvent B (0%) | Solvent C (98%) | Solvent D (0%); Equilibrate to Method | SM | Sample (5 °C) | Column (30 °C) oraz Equilibrate to Method | Other | Check Lamp On | Press Start.</li>
			<li>Odczekać co najmniej 1 h (zaleca się dłuższy czas) do ustabilizowania się sprzętu. Stabilność można zweryfikować sprawdzając ciśnienie w kolumnie w Launch Console: System | Quaternary Solvent Manager | QSM System Pressure. Upewnić się, że nie występują żadne wyraźne trendy zmian ciśnienia (wzrosty lub spadki), a wartość delta jest mniejsza niż 10 psi.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W ekranie QuickStart wypełnić macierz nazwami standardów i próbek do analizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznaczanie AA w standardach
	<ol>
		<li>Przenieść 1 mL każdego z pięciu wcześniej przygotowanych standardów AA (krok 2.5.3) do bursztynowych fiolek 2 mL do chromatografii cieczowej. Zamknąć fiolkę korkiem PTFE-silikonowym z otworem i wstrzyknąć 5 µL do instrumentu UPLC.</li>
		<li>Przeprowadzić chromatografię zgodnie z procedurą opisaną w Tabeli 2, zaczynając od najbardziej rozcieńczonego do najbardziej stężonego roztworu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznaczanie AA w próbkach
	<ol>
		<li>Pipetować 200 µL Ekstraktu 1 do bursztynowej fiolki 2 mL do chromatografii cieczowej i dodać 800 µL wody ultrapure. Zamknąć fiolkę korkiem PTFE-silikonowym z otworem i wstrzyknąć 5 µL do instrumentu UPLC.</li>
		<li>Przeprowadzić chromatografię zgodnie z procedurą opisaną w Tabeli 2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznaczanie TAA w próbkach
	<ol>
		<li>Dodać 400 µL wody ultrapure do Ekstraktu 2. Zamknąć fiolkę korkiem PTFE-silikonowym z otworem i wstrzyknąć 5 µL do instrumentu UPLC.</li>
		<li>Przeprowadzić chromatografię zgodnie z procedurą opisaną w Tabeli 2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponenty i parametry</td>
			<td>Opis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument</td>
			<td>Acquity UPLC H-Class</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detektor</td>
			<td>Detektor PDA eλ λabs dla AA=245 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oprogramowanie</td>
			<td>Empower 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kolumna</td>
			<td>Acquity UPLC HSS T3 (150 mm x 2,1 mm x 1.8 µm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanał A</td>
			<td>CH3OH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanał B/Płukanie</td>
			<td>H2O:CH3OH (50:50 v:v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanał C</td>
			<td>Woda ultra-czysta o pH 2,0 zakwaszona kwasem mrówkowyma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanał D/Płukanie uszczelki</td>
			<td>Woda ultraczysta:acetonitryl (90:10 v:v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faza ruchoma</td>
			<td>0,3 ml/min-1 2% A + 98% C (tryb izokratyczny)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperatura kolumny</td>
			<td>30 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperatura autosamplera</td>
			<td>5 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objętość iniekcji</td>
			<td>5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>czas retencji AA</td>
			<td>1,874 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Czas trwania</td>
			<td>3 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">aNieokreślona objętość kwasu mrówkowego użyta do momentu regulacji pH</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Procedura chromatograficzna zoptymalizowana do oznaczania AA (kwasu askorbinowego) w ekstraktach z sałaty i jej dzikich krewnych. Opis zastosowanych komponentów, warunków i roztworów.
6. Oznaczanie ilościowe AA i DHAA
<ol>
	<li>Analiza statystyczna
	<ol>
		<li>Wyznaczyć parametry analityczne metody chromatograficznej zgodnie z opisem Bertolín i wsp.18 (Tabela 3). 
		UWAGA: Wartości parametrów przedstawione w Tabeli 3 będą wymagały zdefiniowania w konkretnych warunkach eksperymentalnych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Parametry analityczne metody</td>
			<td>Wartości</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zakres liniowy (μg ml-1)</td>
			<td>0.5-25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Równanie liniowe</td>
			<td>y=53 143,03x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R2</td>
			<td>0.99998</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Granica wykrywalności (mg AA g-1)-1 suchej masy)</td>
			<td>0.013</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Granica oznaczalności (mg AA g-1)-1 suchej masy)</td>
			<td>0.045</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powtarzalność (CV, %)a</td>
			<td>1.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precyzja pośrednia (CV, %)a</td>
			<td>4.22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odzysk (Rec, %)b</td>
			<td>95.6±2.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">aCV: współczynnik zmienności</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">bAnalizę odzysku przeprowadzono z wykorzystaniem 10 alikwotów zawierających po 50 mg tej samej próbki, z czego 5 wzbogacono 2 mg AA g-1 suchej masy oraz 5 próbek nieposiewanych. %Rec=([AA]próbka posiewana-[AA]próbka)/([AA]posiewana)x100.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Zoptymalizowane parametry analityczne dla detekcji i oznaczania ilościowego AA (kwasu askorbinowego) i TAA (całkowitego kwasu askorbinowego). Zakres liniowy, równanie i współczynnik determinacji (R2) krzywej kalibracyjnej, a także granice detekcji i oznaczania AA (analogicznie dla TAA), a także powtarzalność, precyzja pośrednia i odzysk zostały wyznaczone przy objętości wtrysku próbki wynoszącej 5 μL.
<ol start="2">
	<li>Oblicz stężenie AA oraz TAA.
	<ol>
		<li>Otwórz chromatogramy wzorców i próbek: QuickStart | Browse Project | Channels | „nazwa wzorca lub próbki” | PDA Ch1 245 nm@1.2 nm.</li>
		<li>Zintegruj odpowiedni pik (AA lub TAA) we wzorcach i próbkach, klikając w jego punkt początkowy (około 1,790 min) i przeciągając myszą do punktu końcowego (około 1,910 min).</li>
		<li>Wykreśl krzywą kalibracyjną, nanosząc wartości absorbancji wyznaczone chromatograficznie (krok 5.2.) w funkcji stężeń pięciu przygotowanych wcześniej wzorców AA (Tabela 1).</li>
		<li>Interpoluj wartości absorbancji próbek wyznaczone w krokach 5.3 i 5.4, aby uzyskać odpowiednio stężenie AA i TAA, korzystając z następującego wzoru: 
		<img alt="Równanie liniowe y=mx+n; formuła matematyczna; schemat edukacyjny; algebra; koncepcja nachylenia i punktu przecięcia." src="/files/ftp_upload/61440/61440equ01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"> 
		gdzie y to zintegrowana powierzchnia piku, x to stężenie AA lub TAA w ppm, a m i n to odpowiednio nachylenie i punkt przecięcia z osią y uzyskanej linii regresji.</li>
		<li>Do obliczenia stężenia DHAA zastosuj następujący wzór: 
		<img alt="Równanie do wyznaczenia stężenia DHAA, [DHAA](µg/mL)= [TAA] − [AA], analiza chemiczna." src="/files/ftp_upload/61440/61440equ02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 2"> 
		UWAGA: Aby uzyskać całkowite stężenia DHAA, AA i TAA w mg g-1 suchej masy, wartości uzyskane bezpośrednio poprzez interpolację na krzywej kalibracyjnej należy pomnożyć przez całkowitą objętość ekstraktu oraz zastosowany czynnik rozcieńczenia, a następnie podzielić przez masę próbki użytej do ekstrakcji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>FAOSTAT. Statistics of the Food and Agriculture Organization of the United Nations. FAOSTAT. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.fao.org/faostat/en/#data/QC">http://www.fao.org/faostat/en/#data/QC</a> (2018).</li>
<li>Llorach, R., Martínez-Sánchez, A., Tomás-Barberán, F. A., Gil, M. I., Ferreres, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+polyphenols+and+antioxidant+properties+of+five+lettuce+varieties+and+escarole%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Characterisation of polyphenols and antioxidant properties of five lettuce varieties and escarole.</a> Food Chemistry. 108 (3), 1028-1038 (2008).</li>
<li>Carr, A. C., Frei, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+new+recommended+dietary+allowance+for+vitamin+C+based+on+antioxidant+and+health+effects+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Toward a new recommended dietary allowance for vitamin C based on antioxidant and health effects in humans.</a> American Journal of Clinical Nutrition. 69 (6), 1086-1107 (1999).</li>
<li>Carr, A. C., Vissers, M. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+or+food-derived+vitamin+C-Are+they+equally+bioavailable%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Synthetic or food-derived vitamin C-Are they equally bioavailable.</a> Nutrients. 5 (11), 4284-4304 (2013).</li>
<li>Lee, S. K., Kader, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preharvest+and+postharvest+factors+influencing+vitamin+C+content+of+horticultural+crops%5BTitle%5D)+AND+%22Postharvest+Biology+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Preharvest and postharvest factors influencing vitamin C content of horticultural crops.</a> Postharvest Biology and Technology. 20 (3), 207-220 (2000).</li>
<li>Shekhovtsova, T. N., Muginova, S. V., Luchinina, J. A., Galimova, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+methods+in+food+analysis%3A+determination+of+ascorbic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Enzymatic methods in food analysis: determination of ascorbic acid.</a> Analytica Chimica Acta. 573-574, 125-132 (2006).</li>
<li>Zhan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+exposure+during+storage+preserving+soluble+sugar+and+L-ascorbic+acid+content+of+minimally+processed+romaine+lettuce+%28Lactuca+sativa+L.var.+longifolia%29%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Light exposure during storage preserving soluble sugar and L-ascorbic acid content of minimally processed romaine lettuce (Lactuca sativa L.var. longifolia).</a> Food Chemistry. 136 (1), 273-278 (2013).</li>
<li>Malejane, D. N., Tinyani, P., Soundy, P., Sultanbawa, Y., Sivakumar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficit+irrigation+improves+phenolic+content+and+antioxidant+activity+in+leafy+lettuce+varieties%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Science+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Deficit irrigation improves phenolic content and antioxidant activity in leafy lettuce varieties.</a> Food Science and Nutrition. 6 (2), 334-341 (2017).</li>
<li>Tarrago-Trani, M. T., Phillips, K. M., Cotty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-specific+method+validation+for+quantitative+analysis+of+vitamin+C+in+diverse+foods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Composition+and+Analysis%22%5BJournal%5D)">Matrix-specific method validation for quantitative analysis of vitamin C in diverse foods.</a> Journal of Food Composition and Analysis. 26 (1-2), 12-25 (2012).</li>
<li>Klimczak, I., Gliszczyńska-Świgło, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+UPLC+and+HPLC+methods+for+determination+of+vitamin+C%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Comparison of UPLC and HPLC methods for determination of vitamin C.</a> Food Chemistry. 175, 100-105 (2015).</li>
<li>Złotek, U., Świeca, M., Jakubczyk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+abiotic+elicitation+on+main+health-promoting+compounds%2C+antioxidant+activity+and+commercial+quality+of+butter+lettuce+%28Lactuca+sativa+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of abiotic elicitation on main health-promoting compounds, antioxidant activity and commercial quality of butter lettuce (Lactuca sativa L.).</a> Food Chemistry. 148, 253-260 (2014).</li>
<li>Koh, E., Charoenprasert, S., Mitchell, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+organic+and+conventional+cropping+systems+on+ascorbic+acid%2C+vitamin+C%2C+flavonoids%2C+nitrate%2C+and+oxalate+in+27+varieties+of+spinach+%28Spinacia+oleracea+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of organic and conventional cropping systems on ascorbic acid, vitamin C, flavonoids, nitrate, and oxalate in 27 varieties of spinach (Spinacia oleracea L).</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 60 (12), 3144-3150 (2012).</li>
<li>Kałuzewicz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+short-term+storage+on+the+content+of+flavonoids+and+vitamin+C+in+Broccoli%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Horticultural+Science%22%5BJournal%5D)">The influence of short-term storage on the content of flavonoids and vitamin C in Broccoli.</a> European Journal of Horticultural Science. 77 (3), 137-143 (2012).</li>
<li>van Treuren, R., van Eekelen, H. D. L. M., Wehrens, R., de Vos, R. C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolite+variation+in+the+lettuce+gene+pool%3A+towards+healthier+crop+varieties+and+food%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Metabolite variation in the lettuce gene pool: towards healthier crop varieties and food.</a> Metabolomics. 14 (11), 1-14 (2018).</li>
<li>Swartz, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UPLC%3A+An+introduction+and+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Liquid+Chromatography+%26+Related+Technologies%22%5BJournal%5D)">UPLC: An introduction and review.</a> Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 28 (7), 1253-1263 (2005).</li>
<li>Spínola, V., Mendes, B., Câmara, J. S., Castilho, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+and+fast+UHPLC-PDA+methodology+for+determination+of+L-ascorbic+and+dehydroascorbic+acids+in+fruits+and+vegetables.+Evaluation+of+degradation+rate+during+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An improved and fast UHPLC-PDA methodology for determination of L-ascorbic and dehydroascorbic acids in fruits and vegetables. Evaluation of degradation rate during storage.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 403 (4), 1049-1058 (2012).</li>
<li>Ball, G. F. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBall%2C+GFM+%22Water-soluble+vitamin+assays+in+human+nutrition%22">Water-soluble vitamin assays in human nutrition</a>. , Springer. Boston, MA. (1994).</li>
<li>Bertolín, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+determination+of+carotenoids%2C+tocopherols%2C+retinol+and+cholesterol+in+ovine+lyophilised+samples+of+milk%2C+meat%2C+and+liver+and+in+unprocessed%2Fraw+samples+of+fat%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous determination of carotenoids, tocopherols, retinol and cholesterol in ovine lyophilised samples of milk, meat, and liver and in unprocessed/raw samples of fat.</a> Food Chemistry. 257, 182-188 (2018).</li>
<li>Spínola, V., Llorent-Martínez, E. J., Castilho, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+vitamin+C+in+foods%3A+Current+state+of+method+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Determination of vitamin C in foods: Current state of method validation.</a> Journal of Chromatography A. 1369, 2-17 (2014).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((radiation+is+beneficial+for+yield+and+quality+of+indoor+cultivated+lettuce%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">radiation is beneficial for yield and quality of indoor cultivated lettuce.</a> Frontiers in Plant Science. 10, 1-10 (2019).</li>
<li>Damerum, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+the+genetic+basis+of+antioxidant+status+in+lettuce+%28Lactuca+sativa%29%5BTitle%5D)+AND+%22Horticulture+Research%22%5BJournal%5D)">Elucidating the genetic basis of antioxidant status in lettuce (Lactuca sativa).</a> Horticulture Research. 2 (15055), 1-13 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Witamina C jest bardzo ważnym składnikiem odżywczym, ale jest również związkiem bardzo labilnym, dlatego jej oznaczanie metodą UPLC-UV zależy od wielu czynników, takich jak przechowywanie i przygotowanie próbki, metoda ekstrakcji oraz warunki chromatograficzne. W związku z tym konieczne było opracowanie szybkiej i prostej procedury zapobiegającej utlenianiu AA (wykazującej potencjał przeciwutleniający) do DHAA (pozbawionej właściwości przeciwutleniających). Kluczowe było również unikanie wysokiego pH i temperatury, a także intensywnego światła i utleniającej atmosfery podczas obróbki próbek, aby zwiększyć stabilność związku.
Aby zminimalizować utlenianie AA, podjęto następujące środki. Przede wszystkim próbki zostały liofilizowane jako materiał wyjściowy dla obu protokołów, aby zapewnić dokładne ilościowe oznaczenie zawartości witaminy C i ułatwić manipulację próbkami. Opcję tę preferowano nad drobne mielenie, powszechnie spotykane w literaturze19, ponieważ pył rozmraża się bardzo szybko, przez co woda ponownie staje się dostępna. Podczas procedury ekstrakcji, w protokole zoptymalizowanym (Supplemental File 2) jako ekstrahent zastosowano większą objętość bardziej kwasowego roztworu (8% kwasu octowego i 1% MPA), który pełnił również rolę stabilizatora, zapobiegając degradacji AA. Roztwór ten zawierał również EDTA jako czynnik chelatujący w celu zwiększenia stabilizacji16, w przeciwieństwie do ekstrahentu w protokole nieoptymalizowanym (Supplemental File 2). Ponadto przetestowano, czy procedurę ekstrakcji można usprawnić, stosując dwie następujące po sobie ekstrakcje z 2,5 mL ekstrahentu zamiast jednej z 5 mL oraz w atmosferze N2 zamiast w standardowych warunkach atmosferycznych. Najlepsze wyniki uzyskano, stosując tylko jedną ekstrakcję w niemodyfikowanej atmosferze, co uprościło protokół poprzez wyeliminowanie zbędnych dodatkowych kroków (dane nie pokazane). W protokole wprowadzono również inne niewielkie zmiany w celu usprawnienia ekstrakcji (np. sonikację), uzyskania klarowniejszego ekstraktu (drobniejsza filtracja) i skrócenia czasu trwania protokołu (Supplemental File 2). W odniesieniu do warunków chromatograficznych, walidacja metody została przeprowadzona zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami18, co zagwarantowało dobre parametry analityczne (Table 3). Ponadto, zastosowanie wody ultrapure z kwasem mrówkowym (pH 2.0) i metanolem (98:2 v:v) przy przepływie 0,3 mL min-1, zamiast 30 mM fosforanu potasu (pH 3.0) przy 1 mL min-1 jako fazy ruchomej (Supplemental File 2), doprowadziło do udoskonalenia metody. Najważniejszym usprawnieniem było prawdopodobnie zastosowanie systemu UPLC zamiast HPLC, co pozwoliło na większą kontrolę nad warunkami wpływającymi na wynik (takimi jak temperatura) i skutkowało rozdzieleniem pików AA bez interferencji ze strony nieznanych związków, w krótszym czasie i przy zużyciu mniejszej objętości ekstraktu (Supplemental File 2).
Niemniej jednak, metoda ta posiada dwa główne ograniczenia. Pierwszym z nich jest fakt, że DHAA nie można zmierzyć bezpośrednio przy użyciu detektora UV ze względu na niską absorpcyjność w zakresie UV widma. Ilościowe oznaczenie zawartości DHAA jest istotne, ponieważ wykazuje ona określoną aktywność biologiczną i jest łatwo przekształcana w AA w organizmie człowieka5. W tym celu niezbędna jest dodatkowa reakcja redukcji DHAA do AA, wraz z drugim przebiegiem chromatograficznym w celu pomiaru TAA, a następnie pośredniego wyznaczenia DHAA poprzez odjęcie zawartości AA od TAA (Rycina 3). W tym kontekście etap redukcji zoptymalizowano poprzez zastosowanie wyższego stężenia czynnika redukującego (DTT), wydłużenie czasu reakcji z 5 do 30 min oraz zatrzymanie reakcji kwasem siarkowym (Plik uzupełniający 2). Drugim ograniczeniem metody jest niska stabilność AA. Ponieważ AA zaczyna ulegać degradacji 4 h po ekstrakcji (Plik uzupełniający 1), konieczne jest jej ilościowe oznaczenie w tym przedziale czasowym. Zatem liczba próbek do ekstrakcji jest uwarunkowana procedurą chromatograficzną. Dlatego w niniejszym protokole proponujemy ich zamrożenie na tym etapie, choć w takim przypadku nie wszystkie mogłyby zostać umieszczone w autosamplerze UPLC w celu automatycznego pomiaru. Na szczęście zredukowany RT dla AA pozwolił nam uzyskać chromatogramy 3-minutowe, znacznie krótsze niż 7-minutowe chromatogramy uzyskiwane przy użyciu HPLC (Plik uzupełniający 2). W związku z tym zawartość witaminy C mogła zostać określona w dużej liczbie próbek w oknie czasowym 4 h.
<img alt="Schemat pomiaru TAA; ekstrakcja AA, DHAA, wyniki UPLC-UV, analiza danych, analiza witamin." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61440/61440fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Schemat ilościowego oznaczania witaminy C w sałacie i niektórych jej dzikich krewniakach. 
Schemat zoptymalizowanego protokołu przedstawiający dwie ścieżki oznaczania: wyłącznie AA lub AA + DHAA (TAA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61440/61440fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Ponieważ witamina C jest niezbędnym składnikiem odżywczym dla ludzi i ze względu na jej istotne korzyści zdrowotne, stała się ona obiektem wielu badań. W związku z tym określano jej ilość w bardzo wielu uprawach, w tym w sałacie, która jest jednym z najczęściej spożywanych warzyw na świecie. Proste metody klasyczne były stopniowo zastępowane technikami chromatografii cieczowej, ponieważ są one bardziej specyficzne i dokładne10. Jednakże, ze względu na konieczność przeprowadzenia dodatkowej reakcji w celu ilościowego oznaczenia zarówno AA, jak i DHAA za pomocą HPLC, w niektórych badaniach nad sałatą mierzono tylko AA14 lub tylko TAA11 (bez oznaczania AA przed redukcją DHAA do AA). Co więcej, tylko niewielu autorów określiło ilość AA i DHAA, pomimo udziału obu cząsteczek w aktywności przeciwutleniającej witaminy C2. Niemniej jednak technika UPLC zyskała w ostatnim czasie na znaczeniu ze względu na wyższą wydajność podczas pomiaru witaminy C w kilku uprawach16. Porównując wyniki uzyskane w niniejszym badaniu przy zastosowaniu dwóch metodologii, UPLC i HPLC, potwierdzono te zalety: osiągnięto dobrze zdefiniowane piki AA dzięki wyższej czułości i w bardzo krótkim czasie, co wiąże się również z mniejszym zużyciem zasobów. Pomimo wydajności UPLC, tylko Chen i wsp.20 zastosowali tę technikę do pomiaru zawartości witaminy C w sałacie, co nadal prowadziło do niedoszacowania, ponieważ określono ilość tylko formy AA.
Podsumowując, niniejsza praca stanowi pierwszą udaną próbę oznaczenia całkowitej zawartości witaminy C nie tylko w różnych odmianach sałaty, ale także w niektórych z jej dzikich krewniaków. Ilościowe oznaczenie witaminy C jest również niezbędne do wyboru odmian sałaty o wyższej aktywności antyoksydacyjnej w ramach programów hodowlanych. W związku z tym, stwierdzona w niniejszej pracy zwiększona całkowita zawartość witaminy C w dzikich krewniakach sałaty oraz zwiększona zawartość AA zgłoszona w poprzednich badaniach14, jak i innych związków antyoksydacyjnych21, poszerza grupę odpowiednich kandydatów do poprawy wartości odżywczej sałat.
Podsumowując, mimo pewnych ograniczeń wynikających z natury witaminy C, takich jak jej stopniowa degradacja kilka godzin po ekstrakcji czy konieczność przeprowadzenia reakcji redukcji ze względu na niską absorbancję UV DHAA, metoda ta stanowi mniej pracochłonny i szybszy sposób pomiaru zawartości witaminy C. Ponadto jest ona bardzo stabilna i wykazuje wysoką czułość oraz rozdzielczość. Co więcej, można ją łatwo przenieść nie tylko na inne materiały roślinne przy niewielkich zmianach lub bez nich, ale także na produkty przetworzone stanowiące źródło witaminy C w diecie człowieka, co otwiera szeroki zakres przyszłych zastosowań w rozwijającej się dziedzinie weryfikacji jakości żywności.

Sałata uprawna (Lactuca sativa L.) jest jednym z najczęściej produkowanych i spożywanych warzyw liściastych na świecie, z łączną produkcją około 27,3 miliona ton w 2018 roku1. Sałata jest postrzegana przez konsumentów jako zdrowa. Właściwości odżywcze przypisuje się głównie źródłu związków przeciwutleniających w uprawie, takich jak m.in. witamina C, polifenole i witaminaE2. Witamina C jest niezbędnym mikroelementem dla ludzi, w przeciwieństwie do wielu innych kręgowców, ponieważ nie jesteśmy w stanie jej wyprodukować z powodu mutacji obecnych w genie kodującym enzym ostatniego kroku w szlaku biosyntezy3. Jest niezbędny do prawidłowego metabolizmu komórkowego, a także odgrywa ważną rolę w odpowiedziach immunologicznych, głównie ze względu na swoją aktywność przeciwutleniającą3,4.
Całkowita witamina C składa się z kwasu askorbinowego (AA) i kwasu dehydroaskorbinowego (DHAA). AA jest najbardziej biologicznie aktywną formą witaminy, ale DHAA (produkt jej utleniania) również wykazuje aktywność biologiczną i może być łatwo przekształcony w AA w organizmie człowieka5. Dlatego określenie ilościowe obu form jest ważne dla określenia całkowitej zawartości witaminy C w każdej uprawie ogrodniczej, w tym sałaty.
Do pomiaru witaminy C w warzywach zastosowano szeroką gamę podejść opartych na różnych technikach analitycznych, takich jak metody enzymatyczne, spektrofotometryczne i miareczkowe6,7,8. Chociaż te metody są proste, nie są chemicznie specyficzne dla AA9. W związku z tym preferowane są metody chromatograficzne, zwłaszcza technika wysokosprawnej chromatografii cieczowej w ultrafiolecie (HPLC-UV), ze względu na ich wyższą dokładność10. HPLC-UV został wykorzystany do określenia witaminy C w wielu różnych uprawach, takich jak brokuły, szpinak i sałata11,12,13. Jednak jednoczesna kwantyfikacja AA i DHAA jest skomplikowana ze względu na niską absorpcję DHAA w zakresie UV widma. Alternatywnie, DHAA można oznaczyć pośrednio za pomocą środka redukującego, który przekształca DHAA w AA, mierząc całkowity kwas askorbinowy (TAA), a następnie obliczając różnicę między TAA i AA. Ze względu na konieczność reakcji redukcji, w niektórych badaniach tylko AA zostało określone ilościowo14, co w rzeczywistości może oznaczać niedoszacowanie aktywności witaminy C. Ta dodatkowa reakcja redukcji jest również potrzebna do pośredniego oznaczenia DHAA, nawet jeśli stosuje się ostatni postęp w technikach chromatografii cieczowej, ultra-wysokosprawną chromatografię cieczową (UPLC). Ten etap korzysta również z zalet, które UPLC wykazuje w porównaniu z HPLC: wyższa wydajność i rozdzielczość, zwiększona czułość, krótszy czas analizy i niższe zużycie rozpuszczalnika15. W związku z tym technika UPLC-UV została wykorzystana do ilościowego określenia witaminy C w różnych uprawach16.
Ponadto, AA jest bardzo labilną cząsteczką; dlatego ważne jest opracowanie protokołu, który zapobiega jej degradacji podczas przechowywania sałaty i analizy witaminy C9. W tym kontekście, poniższy protokół oferuje szybką i lepszą ocenę ilościową zawartości witaminy C w sałacie za pomocą UPLC-UV, a także wydajną procedurę ekstrakcji. W niniejszym badaniu uwzględniono nie tylko elitarne odmiany, ale także tradycyjne rasy lokalne i niektórych dzikich krewnych ze względu na ich potencjalne zainteresowanie hodowlą roślin, w szczególności poprawą wartości odżywczej sałaty.

<table><tbody><tr><td>1,4-ditiotreitol (DTT) &ge; 98% (Ellman&prime; </td><td>Roche</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>10 mm &#934; kulka ze stali nierdzewnej</td><td>Euro Aznar Supplies S.L.</td><td></td><td></td>20112100</tr><tr><td>15 ml probówka polipropylenowa do wirówki</td><td>Deltalab</td><td>429946</td><td></td></tr><tr><td>2 ml HPLC bursztynowa fiolka</td><td>Agilent</td><td>5190-9063</td><td></td></tr><tr><td>2 ml strzykawka z igłą</td><td>Deltalab</td><td>JS2</td><td></td></tr><tr><td>20 ml probówki polipropylenowe</td><td>Deltalab</td><td>202840</td><td></td></tr><tr><td>2-amino-2-(hydroksymetylo)-1,3-propanodiol (TRIS) &ge; 99,9% (miareczkowanie)</td><td>Roche</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówka polipropylenowa</td><td>Deltalab</td><td>429951</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy (CH3COOH) &ge; 99% czystości lodowcowej, ReagentPlus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl, klasa HPLC o super gradiencie (99,9 +% CH3CN-0,2 i mikro; m przefiltrowany)</td><td>Chem-lab</td><td>CL00.0189</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna Acquity UPLC HSS T3 (150 mm x 2,1 mm x 1,8 &micro; m)</td><td>Wody</td><td>186003540</td><td></td></tr><tr><td>Zlewka 1 l, 200 ml</td><td>Deltalab</td><td>191725, 191722</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan dipotasowy (KH2PO4)</td><td>Panreac</td><td>766384</td><td>Tylko w niezoptymalizowanym protokole (Plik uzupełniający 2)</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy Sól disodowa (EDTA x 2H2O) Test 99-101%, odczynnik ACS</td><td>Panreac</td><td>131669</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Analog MultiTube Vortexer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15549004</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy 98-100% do HPLC Liofilizator Liofilizator LiChropur</td><td>Supelco</td><td>5438040100</td><td></td></tr><tr><td>VirTis genesis 25EL</td><td>VirTis</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>Heidolph Multi Reax mikser</td><td>Heidolph</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>Heidolph Reax mikser górny</td><td>Heidolph</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>Hewlett Packard HPLC 1050 wyposażony w e&lambda; Detektor</td><td>Hewlett Packard</td><td>na</td><td>Tylko w niezoptymalizowanym protokole (Plik uzupełniający 2)</td></tr><tr><td>Kwas solny (HCl) czystość 37%, odczynnik ACS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy &ge; 99%, odczynnik ACS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255564</td><td></td></tr><tr><td>Kwas metafosforowy (MPA) Odczynnik ACS, chipsy, 33,5-36,5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239275</td><td></td></tr><tr><td>Metanol &ge; 99,9% (klasa supergradientu HPLC)</td><td>ChemLab</td><td>CL00.0189.2500</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipety 10-1000 &mu; L</td><td>Socorex</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>Nucleosil 120 C18 Kolumna Tracer (250 mm x 4 mm x 5 & mikro; m)</td> <td>Merck (Sigma-Aldrich)</td> <td>54919</td><td>Tylko w niezoptymalizowanym protokole (plik uzupełniający 2)</td></tr> <tr><td>Nasadka PTFE-silikonowa z otworem</td><td>wstępnym Agilent</td><td>5190-9067</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka z chłodzeniem Gyrozen 1248R</td><td>Gyrozen</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>Filtry z regenerowanej celulozy 0,22 i mikro; m (13 mm)</td><td>Agilent</td><td>1015190-5108</td><td></td></tr><tr><td>Filtry z regenerowanej celulozy 0,45-&mikro; m (13 mm)</td><td>Labbox</td><td>SFCA-145-100</td><td>Tylko w niezoptymalizowanym protokole (Plik uzupełniający 2)</td></tr><tr><td>Spektrofotometr He&lambda; iOS i wersja beta;</td><td>Thermo Scientific Corporation</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>Kwas siarkowy (H2SO4) czystość 95,0-98,0%, odczynnik ACS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258105</td><td></td></tr><tr><td>Woda ultraczysta</td><td>WasserLab</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasons H-D</td><td>Selecta</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>Kolby miarowe 1 L, 100 ml</td><td>DeltaLab</td><td>191489, 191486</td><td></td></tr><tr><td>Waters Acquity UPLC H-Class wyposażony w PDA e&lambda; Detektor</td><td>Wody</td><td>na</td><td></td></tr></tbody></table>

ulepszona metoda uplc-uv do oznaczania ilościowego witaminy c w odmianach sałaty (lactuca sativa l.) i dzikich krewnych roślin uprawnych (lactuca spp.)

Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties (Lactuca sativa L.) and Crop Wild Relatives (Lactuca spp.)

Witaminy, zwłaszcza witamina C, są ważnymi mikroelementami występującymi w owocach i warzywach. Witamina C jest również głównym czynnikiem przyczyniającym się do ich zdolności przeciwutleniającej. Sałata jest jednym z najpopularniejszych warzyw wśród konsumentów na całym świecie. Kluczowy jest dokładny protokół pomiaru zawartości witaminy C w sałacie i innych pokrewnych gatunkach. Opisano tutaj metodę wykorzystującą technikę ultra-wysokosprawnej chromatografii cieczowej w ultrafiolecie (UPLC-UV), w której zoptymalizowano warunki przygotowania próbki, ekstrakcji witaminowej i chromatografii.
Próbki zostały pobrane, aby reprezentować całą roślinę, zamrożone w temperaturze -80 °C i liofilizowane, aby zapobiec niepożądanemu utlenianiu i ułatwić manipulowanie nimi. Ekstrakcja witaminy C odbywała się w środowisku kwaśnym, co również przyczyniło się do jej stabilności. Ponieważ witamina C może występować w dwóch różnych wymiennych formach, kwasie askorbinowym (AA) i kwasie dehydroaskorbinowym (DHAA), oba związki powinny być mierzone w celu dokładnej oceny ilościowej. DHAA określono ilościowo pośrednio po jego redukcji do AA, ponieważ AA wykazuje wyższą absorpcję niż DHAA w zakresie UV widma. Z tego samego ekstraktu przeprowadzono dwa pomiary, jeden przed i jeden po tej reakcji redukcji. W pierwszym przypadku określaliśmy ilościowo zawartość AA, a w drugim określaliśmy ilościowo sumę AA i DHAA (TAA: całkowity kwas askorbinowy) w postaci AA. Następnie ilość DHAA uzyskano pośrednio poprzez odjęcie AA pochodzącego z pierwszego pomiaru od TAA. Zostały one określone za pomocą UPLC-UV, przy użyciu komercyjnego wzorca AA do zbudowania krzywej kalibracyjnej i optymalizacji procedury chromatograficznej, aby uzyskać piki AA, które zostały całkowicie rozwiązane w krótkim czasie. Protokół ten można łatwo ekstrapolować na dowolny inny materiał roślinny z niewielkimi lub żadnymi zmianami. Jego dokładność ujawniła statystycznie istotne różnice, których inaczej nie można by dostrzec. Inne mocne strony i ograniczenia zostały omówione bardziej szczegółowo w manuskrypcie.

Oznaczenie ilościowe witaminy C w matrycach Lactuca wymaga opracowania podejścia chromatograficznego, które zapewni wiarygodne wyniki. Rysunek 1A przedstawia chromatogram uzyskany za pomocą niezoptymalizowanego protokołu (Plik uzupełniający 2), w którym widoczny jest pik AA wraz z niezidentyfikowanym niewielkim „ramieniem”. Niemniej jednak, po usprawnieniu warunków ekstrakcji i chromatografii, uzyskano rozdzielony pik AA bez interferencji nieznanych związków (Rysunek 1B). Ponadto zastosowanie sprzętu UPLC-UV zamiast HPLC-UV pozwoliło na skrócenie czasu retencji (RT) dla AA: 1,874 min w zoptymalizowanych chromatogramach w stosunku do 2,980 min w niezoptymalizowanych (Rysunek 1), a także czasu analizy, który wyniósł odpowiednio 3 i 7 minut dla protokołów zoptymalizowanego i niezoptymalizowanego.
<img alt="Chromatogram HPLC i wykres absorpcji UV kwasu askorbinowego, pokazujący pik w czasie retencji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61440/61440fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Chromatogramy AA w tej samej próbce sałaty (odmiana handlowa ‘Begoña’).(A) Chromatogram HPLC-UV uzyskany przy użyciu niezoptymalizowanego protokołu (warunki opisane w Pliku uzupełniającym 2). (B) Chromatogram UPLC-UV uzyskany przy użyciu zoptymalizowanego protokołu (warunki opisane w Tabeli 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61440/61440fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Interferencje w pikach AA, takie jak te zaobserwowane na Rysunku 1A, konsekwentnie prowadziły do niedoszacowania zawartości witaminy C (AA, DHAA i TAA) (Rysunek 2) z powodu niewystarczającego rozdzielenia podczas procesu chromatograficznego, ponieważ nakładające się obszary pików były integrowane poprzez pionowy spadek w najgłębszym punkcie między nimi. Odchylenie to jest szczególnie zauważalne w przypadku dzikich krewnych roślin uprawnych, zwłaszcza w odniesieniu do zawartości DHAA i TAA (Rysunek 2).
<img alt="Wykres skrzypcowy analizujący zawartość witaminy C w odmianach szpinaku; wpływ protokołu na poziomy DHAA, AA i TAA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61440/61440fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Rozkład zawartości witaminy C.Podzielone wykresy skrzypcowe zawartości DHAA, AA i TAA (mg g-1 suchej masy) w komercyjnych i tradycyjnych odmianach sałaty oraz u niektórych krewniaków dzikich z zastosowaniem protokołów nieoptymalizowanych i optymalizowanych. Czarne linie wskazują wartości średnie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61440/61440fig2v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Co więcej, zastosowanie nieoptymalizowanego protokołu uniemożliwiło nam wyciągnięcie jakichkolwiek użytecznych wniosków z wyników, ponieważ wykazały one, że wszystkie próbki, zarówno oba typy sałat, jak i krewniakie dzikie, posiadają podobną zawartość witaminy C. W przeciwieństwie do tego, zoptymalizowany protokół pozwolił nam wykryć statystycznie istotne różnice między nimi w zawartości DHAA i TAA (Tabela 4), przy czym najwyższą zawartość odnotowano u gatunków dzikich (Rycina 2).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="2">Nieoptymalizowany</td>
			<td colspan="2">Zoptymalizowany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>stosunek F</td>
			<td>pwartość p</td>
			<td>stosunek F</td>
			<td>pwartość p</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DHAA</td>
			<td>0.460</td>
			<td>0.637ns</td>
			<td>5.613</td>
			<td>0.009**</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AA</td>
			<td>0.070</td>
			<td>0.932ns</td>
			<td>1.020</td>
			<td>0.374ns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAA</td>
			<td>0.015</td>
			<td>0.985ns</td>
			<td>4.438</td>
			<td>0.022*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">ns, * i ** oznaczają brak istotności oraz istotność na poziomie p&lt;odpowiednio 0,05 i 0,01.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 4: Zmienność zawartości witaminy C. Stosunki F (ilorazy dwóch wariancji: wariancji międzygrupowej i wariancji wewnątrzgrupowej) oraz wartości istotności z jednoczynnikowej analizy ANOVA z uwzględnieniem typu Lactuca (komercyjne odmiany sałaty, tradycyjne odmiany sałaty oraz dzikie krewniacy uprawne) dla zawartości DHAA, AA i TAA w protokołach nieoptymalizowanych i optymalizowanych.
Plik uzupełniający 1: Stabilność AA i TAA w temperaturze 5 °C przez 24 h. (A) Powierzchnie pików AA i TAA w ciągu 24 h. (B) Zawartość AA i TAA (mg g-1 suchej masy) w ciągu 24 h. Słupki reprezentują odchylenia standardowe dwóch powtórzeń technicznych (n=2) przechowywanych w autopróbniku w temperaturze 5 °C i chronionych przed światłem. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61440/Supplemental_File_1_.pptx" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 2: Główne różnice między zoptymalizowanym a nieoptymalizowanym protokołem ekstrakcji i oznaczania ilościowego TAA, AA i DHAA. W obu przypadkach wykorzystano te same próbki. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61440/Supplemental__File_2_.xlsx" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Przedstawiamy szybką i niezawodną metodę ilościowego oznaczania witaminy C w Lactuca spp. za pomocą UPLC-UV, potencjalnie przenoszącą się na inne rośliny. Kluczowymi etapami są przygotowanie próbki i ekstrakcja witaminy C w stabilnych warunkach, redukcja kwasu dehydroaskorbinowego do kwasu askorbinowego oraz optymalizacja procedury chromatograficznej.

Ulepszona metoda UPLC-UV do oznaczania ilościowego witaminy C w odmianach sałaty (Lactuca sativa L.) i dzikich krewnych roślin uprawnych (Lactuca spp.)

Vitamins, especially vitamin C, are important micronutrients found in fruits and vegetables. Vitamin C is also a major contributor to their antioxidant ...

Witamina C jest wskaźnikiem wartości odżywczej owoców i warzyw. Potrzebujemy łatwej i niezawodnej metody jego ilościowego określania, zwłaszcza w przypadku sałaty, najczęściej spożywanego warzywa liściastego na świecie. Metoda ta zapobiega degradacji witaminy C i zapewnia lepszą ekstrakcję oraz szybkie, wiarygodne oznaczanie ilościowe zarówno kwasu askorbinowego, jak i dehydroaskorbinowego, dzięki swojej dokładności i czułości.Metoda ta może być stosowana w technologii żywności do tworzenia etykiet z informacjami o wartościach odżywczych, w medycynie do badania wpływu żywności na zdrowie oraz w hodowli roślin, w celu zwiększenia zawartości witaminy C u różnych gatunków. Procedurę zademonstrują Jose Angel Aranjuelo i Arantzazu Castellanos, dwaj analitycy z mojego laboratorium. Aby przygotować próbki roślin, zbierz co najmniej jeden zewnętrzny i jeden wewnętrzny liść na roślinę i natychmiast zamroź liście w ciekłym azocie, przed umieszczeniem ich w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Aby liofilizować zamrożone próbki roślinne, umieść niezakorkowane probówki z próbkami na tacach w komorze liofilizatora liofilizatora i zaprogramuj liofilizator zgodnie ze wskazaniami. Utrzymuj temperaturę skraplacza na poziomie minus 80,2 stopni Celsjusza, a próżnię na stałym poziomie 112 Gdy materiał jest całkowicie suchy, dodaj kulki ze stali nierdzewnej o średnicy 10 milimetrów do liofilizowanych próbek w 20-mililitrowych probówkach polipropylenowych. I użyj Multi-Tube Vortexer, w odpowiednim czasie i z odpowiednią intensywnością, aby zmielić próbki na drobny pył.Aby przygotować wzorcowy roztwór kwasu askorbinowego i roztwory rozcieńczające, należy odważyć dokładnie 10 miligramów wzorca kwasu askorbinowego na wadze precyzyjnej. I przy 90 mililitrach fazy ruchomej do próbki. Użyj mieszadła magnetycznego, aby rozpuścić próbkę i użyj kolby miarowej, aby dokładnie odmierzyć 100 mililitrów otrzymanego roztworu.Dodanie dodatkowej ultraczystej wody, zakwaszonej do pH drugiego kwasem mrówkowym, jeśli to konieczne. Następnie należy przygotować pięć rozcieńczeń z podstawy, aby uzyskać krzywą kalibracyjną. Pracując przy niskim natężeniu światła, dodaj 50 miligramów liofilizowanej próbki mielonej i pięć mililitrów rozpuszczalnika ekstrakcyjnego do 15-mililitrowej probówki wirówki polipropylenowej i wiruj roztwór przez pięć sekund.Po wytrząsaniu próbki przez 10 minut na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 2000 obrotów na minutę, przenieść probówkę do łaźni ultradźwiękowej na 10 minut w temperaturze pokojowej i zebrać próbkę przez odwirowanie. Następnie przecedź supernatant przez filtr z regenerowanej celulozy o średnicy 0,22 mikrona do pięciomililitrowej bursztynowej fiolki, aby wyekstrahować zarówno kwas askorbinowy, jak i dehydroaskorbinowy z ekstraktu pierwszego. Aby przygotować rozcieńczenie do oznaczania stężenia kwasu askorbinowego w próbkach liści, dodaj 200 mikrolitrów ekstraktu pierwszego i 800 mikrolitrów ultraczystej wody do dwumililitrowej fiolki do chromatografii bursztynowej w cieczach i zamknij fiolkę zatyczką z PTFE/silikonu.W celu całkowitej ekstrakcji kwasem askorbinowym przenieś 200 mikrolitrów ekstraktu do dwumililitrowej fiolki do chromatografii bursztynowej i dodaj 200 mikrolitrów roztworu redukującego do fiolki. Zamknąć fiolkę zatyczką i mieszać roztwór przez pięć sekund. Po 30 minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej, chronionej przed światłem, należy użyć 200 mikrolitrów 0,4 molowego kwasu siarkowego, aby zatrzymać reakcję i ustabilizować kwas askorbinowy do kwaśnego pH.Aby przygotować rozcieńczenie do oznaczania całkowitego stężenia kwasu askorbinowego w próbkach, dodaj 400 mikrolitrów ultraczystej wody do całkowitego ekstraktu kwasu askorbinowego dwa. Zamknąć fiolkę korkiem. Co najmniej godzinę przed rozpoczęciem eksperymentu upewnij się, że wszystkie roztwory robocze zostały załadowane do systemu UPLC i włącz trzy moduły UPLC.Po zakończeniu procesu kalibracji wewnętrznej otwórz oprogramowanie i załaduj program instrumentalny. Po załadowaniu oprogramowania kliknij Quaternary Solvent Manager i kliknij prawy przycisk myszy, aby wybrać Launch Console (Uruchom konsolę), aby uzyskać dostęp do konsoli zarządzania UPLC. Kliknij System, Sterowanie i uruchamianie, aby przejść do przygotowania i stabilizacji przyrządu UPLC, a następnie kliknij Prime Solvents, QSM, sprawdź A, B, C, D, Seal Wash i Duration of Prime, większy niż pięć minut, aby oczyścić wszystkie linie UPLC przez co najmniej pięć minut.Kliknij SM, sprawdź Rozpuszczalnik do mycia dłuższy niż 45 sekund. Sprawdź rozpuszczalnik do czyszczenia i 35 cykli, aby oczyścić i wyczyścić wtryskiwacz. Aby zrównoważyć UPLC z warunkami metody, zaznacz opcję Równowaga z metodą i QSM i ustaw przepływ na 0,3 mililitra na minutę.Rozpuszczalnik A do 2%, rozpuszczalnik B do 0%, rozpuszczalnik C 98% i rozpuszczalnik D do 0%Nadal w równowadze z metodą i SM i ustawić próbkę na 5 stopni Celsjusza, a kolumnę na 30 stopni Celsjusza. Pozostając w opcji Równowaga z metodą i innymi, wybierz opcję Lamp On (Lampa włączona) i kliknij przycisk Start. Pozwól sprzętowi ustabilizować się przez co najmniej godzinę.Aby sprawdzić stabilność, kliknij opcję Launch Console System and QSM (Uruchom system konsoli i QSM), a następnie wybierz opcję QSM System Pressure (Ciśnienie w systemie QSM), tylko w celu sprawdzenia ciśnienia w kolumnie. Jeśli nie ma możliwych do zidentyfikowania trendów w zmianach ciśnienia, a wartość delta jest mniejsza niż 10 funtów na cal kwadratowy ciśnienia, na ekranie szybkiego startu wypełnij matrycę nazwami wzorców i próbek, które mają być analizowane. W celu określenia stężenia kwasu askorbinowego w wzorcach, wstrzyknąć pięć mikrolitrów każdego rozcieńczenia do przyrządu UPLC i przeprowadzić chromatografię, zaczynając od najbardziej rozcieńczonego do najbardziej stężonego roztworu, jak wskazano w tabeli.Aby oznaczyć kwas askorbinowy i całkowite stężenie kwasu askorbinowego w próbkach liści, należy wstrzyknąć pięć mikrolitrów rozcieńczonego ekstraktu odpowiednio jeden i ekstrahować dwa do przyrządu UPLC w celu analizy chromatograficznej. Aby obliczyć kwas askorbinowy i całkowite stężenie kwasu askorbinowego, w oprogramowaniu kliknij Szybki start, Przeglądaj projekt, Kanały, nazwę wzorca lub próbki i kanał PDA jeden, 245 nanometrów przy 1,2 nanometra. Aby otworzyć chromatogramy wzorca i próbki, należy kliknąć punkt początkowy chromatogramu i przeciągnąć go do punktu końcowego, aby zintegrować odpowiedni pik z wzorcami i próbkami.Następnie wykorzystaj dane z rozcieńczeń wzorcowych kwasu askorbinowego do zbudowania krzywej kalibracyjnej, aby przedstawić chromatograficznie wyznaczone wartości absorbancji i interpolować wartości absorbancji próbki, aby uzyskać kwas askorbinowy i całkowite stężenie kwasu askorbinowego, zgodnie ze wzorem. Kwantyfikacja witaminy C w matrycach Lactuca wymaga opracowania podejścia chromatograficznego, które może zapewnić wiarygodne wyniki. W tym miejscu można zaobserwować chromatogram wynikający z niezoptymalizowanego protokołu prezentującego pik kwasu askorbinowego wraz z niezidentyfikowanym na ramieniu górnika.Niemniej jednak, po poprawie warunków ekstrakcji i chromatografii, można osiągnąć rozwiązany pik kwasu askorbinowego bez zakłóceń nieznanych związków. Ponadto zastosowanie sprzętu ultrafioletowego UPLC, zamiast ultrafioletu HPLC, skraca czas retencji i pracy. Zakłócenia w pikach kwasu askorbinowego konsekwentnie skutkują niedoszacowaniem zawartości witaminy C, z powodu niewystarczającej separacji podczas procesu chromatograficznego.Ponieważ nakładające się na siebie obszary pików są zintegrowane przez pionowy spadek w najgłębszym punkcie między nimi. Co więcej, użycie niezoptymalizowanego protokołu uniemożliwia wyciągnięcie jakichkolwiek użytecznych wniosków z wyników. Ponieważ wszystkie próbki wydają się mieć podobną zawartość witaminy C, w każdej z jej postaci.Natomiast zastosowanie zoptymalizowanego protokołu pozwala na wykrycie statystycznie istotnych różnic między różnymi typami próbek. Należy pamiętać o pobraniu wielu próbek, aby prawidłowo je zakonserwować, zminimalizować narażenie próbki na czynniki utleniające i określić ilościowo obie formy witaminy C. Całkowitą zawartość witaminy C można określić ilościowo nie tylko w dowolnym gatunku roślin, ale także w każdym owocu, w dowolnym owocu i warzywie, a nawet w przetworzonej żywności z niewielkimi modyfikacjami techniki.

improved-uplc-uv-method-for-quantification-vitamin-c-lettuce

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten protokół został opracowany w celu przesiewania dużej kolekcji plazmy zarodkowej liściastej sałaty warzywnej (Lactuca sativa L.) pod kątem tolerancji na suszę, w celu zidentyfikowania małej puli kandydatów do wykorzystania w badaniach fizjologicznych, molekularnych i genetycznych w celu zidentyfikowania podstawowych cech tolerancji na suszę wraz z programami hodowlanymi.

Półwysokoprzepustowe badania przesiewowe pod kątem potencjalnej tolerancji na suszę w kolekcjach plazmy zarodkowej sałaty (Lactuca sativa)

Ten artykuł przedstawia metodę wykrywania i kwantyfikacji kwasów organicznych z materiału roślinnego za pomocą swobodnej strefowej elektroforezy kapilarnej. Podano przykład potencjalnego zastosowania tej metody, określającej wpływ wtórnej fermentacji na poziom kwasów organicznych w nasionach kawy.

Zastosowanie elektroforezy kapilarnej do ilościowego oznaczania kwasów organicznych z tkanki roślinnej: przypadek testowy badający nasiona Coffea arabica

Tutaj opisujemy bardzo szczegółowo sprawdzony i solidny protokół ekstrakcji glukozynolanów z mielonych materiałów roślinnych. Po zastosowaniu sulfatazy w kolumnie ekstraktów, desulfoglucozynolany są eluowane i analizowane za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej.

Prosta metoda ekstrakcji i analizy glukozynolanu za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC)

Pędy przybyszowe mogą być indukowane na międzywęzłowych segmentach ipecac bez leczenia fitohormonami. Aby ocenić dynamikę fitohormonów podczas tworzenia pędów przybyszowych, zmierzyliśmy endogenną auksynę i cytokininę w segmentach międzywęzłowych za pomocą LC-MS / MS.

Kwantyfikacja endogennej auksyny i cytokininy podczas hodowli międzywęźlowej Ipecac

Demonstrujemy średnioprzepustową metodę ilościowego oznaczania aflatoksyn i fitoaleksyn stilbenoidowych w pojedynczych nasionach orzeszków ziemnych przy użyciu ultra wydajnej chromatografii cieczowej. Metoda ta została opracowana specjalnie do analiz dzikich gatunków pajęczaków zagrożonych przez aflatoksynogenne gatunki Aspergillus.

Nieniszcząca kwantyfikacja aflatoksyn i fitoaleksyn stilbenoidowych w pojedynczych orzechach ziemnych (Arachis spp.) Nasiona

Tutaj opisana jest metoda wysokosprawnej chromatografii cieczowej fazy normalnej, mająca na celu wykrywanie i ilościowe określanie krytycznych retinoidów zaangażowanych w ułatwianie funkcji wzrokowych zarówno w tkance ocznej, jak i ogólnoustrojowej, w kontekście ogólnoustrojowego dostarczania witaminy A do wytwarzania niezbędnego światłoczułego chromoforu rodopsyny 11-cis-retinal.

Analiza ilościowa metabolitów witaminy A w diecie metabolitów witaminy A w mysich tkankach ocznych i nieocznych przy użyciu wysokosprawnej chromatografii cieczowej

Tutaj prezentujemy metodę kolorymetryczną chlorku glinu, bezpośrednią technikę analityczną do ilościowego oznaczania flawonoidów w nagietku. Podejście to wykorzystuje prostą reakcję chemiczną polegającą na traktowaniu ekstraktu z nagietka odczynnikiem chlorku glinu, tworząc kolorowy kompleks. Intensywność koloru, oceniana za pomocą spektrofotometrii, koreluje ze stężeniem flawonoidów.

Zawartość flawonoidów podczas wzrostu i rozwoju kwiatowego nagietka lekarskiego (Calendula officinalis L.)

Ten protokół opisuje izolację i kwantyfikację małych RNA lipoprotein o dużej gęstości.

Izolacja lipoprotein o dużej gęstości do niekodującej kwantyfikacji małego RNA

Przedstawiono protokół syntezy peptoidów o mieszanej funkcjonalności kationowej w tej samej sekwencji (monomery typu lizyny i argininy). Opisano również późniejsze testy tych związków przeciwko Leishmania mexicana, pasożytniczym pierwotniakom wywołującym leiszmaniozę skórną.

Skuteczna metoda syntezy peptoidów z monomerami typu mieszanego lizyny/argininy i oceny ich aktywności przeciwleiszmanicznej

Opisaliśmy szczegółowo dwa protokoły chemiczne do hodowli embrionalnych komórek macierzystych myszy. Ta nowa metoda wykorzystuje synergiczne mechanizmy promowania utleniania za pośrednictwem Tet (przez witaminę C) i tłumienia syntezy de novo 5-metylocytozyny (przez PD0325901) w celu utrzymania hipometylacji DNA i pluripotencji embrionalnych komórek macierzystych myszy.

Alternatywna metoda hodowli w celu utrzymania genomowej hipometylacji embrionalnych komórek macierzystych myszy przy użyciu inhibitora MEK PD0325901 i witaminy C

Poznaj ulepszoną metodę UPLC-UV do oznaczania witaminy C w sałacie i dzikich krewnych roślin uprawnych. Technika zapewnia szybką, niezawodną i dokładną analizę kwasu askorbinowego oraz dehydroaskorbinowego.

Ulepszona metoda UPLC-UV do oznaczania ilościowego witaminy C w odmianach sałaty (Lactuca sativa L.) i dzikich krewnych roślin uprawnych (Lactuca spp.) (Wideo) | JoVE Journal

Ulepszona metoda UPLC-UV do oznaczania ilościowego witaminy C w odmianach sałaty (Lactuca sativa L.) i dzikich krewnych roślin uprawnych (Lactuca spp.)

Przeglądaj więcej filmów