Ulepszona metoda UPLC-UV do oznaczania ilościowego witaminy C w odmianach sałaty (Lactuca sativa L.) i dzikich krewnych roślin uprawnych (Lactuca spp.)

Witamina C jest wskaźnikiem wartości odżywczej owoców i warzyw. Potrzebujemy łatwej i niezawodnej metody jego ilościowego określania, zwłaszcza w przypadku sałaty, najczęściej spożywanego warzywa liściastego na świecie. Metoda ta zapobiega degradacji witaminy C i zapewnia lepszą ekstrakcję oraz szybkie, wiarygodne oznaczanie ilościowe zarówno kwasu askorbinowego, jak i dehydroaskorbinowego, dzięki swojej dokładności i czułości.

Metoda ta może być stosowana w technologii żywności do tworzenia etykiet z informacjami o wartościach odżywczych, w medycynie do badania wpływu żywności na zdrowie oraz w hodowli roślin, w celu zwiększenia zawartości witaminy C u różnych gatunków. Procedurę zademonstrują Jose Angel Aranjuelo i Arantzazu Castellanos, dwaj analitycy z mojego laboratorium. Aby przygotować próbki roślin, zbierz co najmniej jeden zewnętrzny i jeden wewnętrzny liść na roślinę i natychmiast zamroź liście w ciekłym azocie, przed umieszczeniem ich w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Aby liofilizować zamrożone próbki roślinne, umieść niezakorkowane probówki z próbkami na tacach w komorze liofilizatora liofilizatora i zaprogramuj liofilizator zgodnie ze wskazaniami. Utrzymuj temperaturę skraplacza na poziomie minus 80,2 stopni Celsjusza, a próżnię na stałym poziomie 112 Gdy materiał jest całkowicie suchy, dodaj kulki ze stali nierdzewnej o średnicy 10 milimetrów do liofilizowanych próbek w 20-mililitrowych probówkach polipropylenowych. I użyj Multi-Tube Vortexer, w odpowiednim czasie i z odpowiednią intensywnością, aby zmielić próbki na drobny pył.

Aby przygotować wzorcowy roztwór kwasu askorbinowego i roztwory rozcieńczające, należy odważyć dokładnie 10 miligramów wzorca kwasu askorbinowego na wadze precyzyjnej. I przy 90 mililitrach fazy ruchomej do próbki. Użyj mieszadła magnetycznego, aby rozpuścić próbkę i użyj kolby miarowej, aby dokładnie odmierzyć 100 mililitrów otrzymanego roztworu.

Dodanie dodatkowej ultraczystej wody, zakwaszonej do pH drugiego kwasem mrówkowym, jeśli to konieczne. Następnie należy przygotować pięć rozcieńczeń z podstawy, aby uzyskać krzywą kalibracyjną. Pracując przy niskim natężeniu światła, dodaj 50 miligramów liofilizowanej próbki mielonej i pięć mililitrów rozpuszczalnika ekstrakcyjnego do 15-mililitrowej probówki wirówki polipropylenowej i wiruj roztwór przez pięć sekund.

Po wytrząsaniu próbki przez 10 minut na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 2000 obrotów na minutę, przenieść probówkę do łaźni ultradźwiękowej na 10 minut w temperaturze pokojowej i zebrać próbkę przez odwirowanie. Następnie przecedź supernatant przez filtr z regenerowanej celulozy o średnicy 0,22 mikrona do pięciomililitrowej bursztynowej fiolki, aby wyekstrahować zarówno kwas askorbinowy, jak i dehydroaskorbinowy z ekstraktu pierwszego. Aby przygotować rozcieńczenie do oznaczania stężenia kwasu askorbinowego w próbkach liści, dodaj 200 mikrolitrów ekstraktu pierwszego i 800 mikrolitrów ultraczystej wody do dwumililitrowej fiolki do chromatografii bursztynowej w cieczach i zamknij fiolkę zatyczką z PTFE/silikonu.

W celu całkowitej ekstrakcji kwasem askorbinowym przenieś 200 mikrolitrów ekstraktu do dwumililitrowej fiolki do chromatografii bursztynowej i dodaj 200 mikrolitrów roztworu redukującego do fiolki. Zamknąć fiolkę zatyczką i mieszać roztwór przez pięć sekund. Po 30 minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej, chronionej przed światłem, należy użyć 200 mikrolitrów 0,4 molowego kwasu siarkowego, aby zatrzymać reakcję i ustabilizować kwas askorbinowy do kwaśnego pH.

Aby przygotować rozcieńczenie do oznaczania całkowitego stężenia kwasu askorbinowego w próbkach, dodaj 400 mikrolitrów ultraczystej wody do całkowitego ekstraktu kwasu askorbinowego dwa. Zamknąć fiolkę korkiem. Co najmniej godzinę przed rozpoczęciem eksperymentu upewnij się, że wszystkie roztwory robocze zostały załadowane do systemu UPLC i włącz trzy moduły UPLC.

Po zakończeniu procesu kalibracji wewnętrznej otwórz oprogramowanie i załaduj program instrumentalny. Po załadowaniu oprogramowania kliknij Quaternary Solvent Manager i kliknij prawy przycisk myszy, aby wybrać Launch Console (Uruchom konsolę), aby uzyskać dostęp do konsoli zarządzania UPLC. Kliknij System, Sterowanie i uruchamianie, aby przejść do przygotowania i stabilizacji przyrządu UPLC, a następnie kliknij Prime Solvents, QSM, sprawdź A, B, C, D, Seal Wash i Duration of Prime, większy niż pięć minut, aby oczyścić wszystkie linie UPLC przez co najmniej pięć minut.

Kliknij SM, sprawdź Rozpuszczalnik do mycia dłuższy niż 45 sekund. Sprawdź rozpuszczalnik do czyszczenia i 35 cykli, aby oczyścić i wyczyścić wtryskiwacz. Aby zrównoważyć UPLC z warunkami metody, zaznacz opcję Równowaga z metodą i QSM i ustaw przepływ na 0,3 mililitra na minutę.

Rozpuszczalnik A do 2%, rozpuszczalnik B do 0%, rozpuszczalnik C 98% i rozpuszczalnik D do 0%Nadal w równowadze z metodą i SM i ustawić próbkę na 5 stopni Celsjusza, a kolumnę na 30 stopni Celsjusza. Pozostając w opcji Równowaga z metodą i innymi, wybierz opcję Lamp On (Lampa włączona) i kliknij przycisk Start. Pozwól sprzętowi ustabilizować się przez co najmniej godzinę.

Aby sprawdzić stabilność, kliknij opcję Launch Console System and QSM (Uruchom system konsoli i QSM), a następnie wybierz opcję QSM System Pressure (Ciśnienie w systemie QSM), tylko w celu sprawdzenia ciśnienia w kolumnie. Jeśli nie ma możliwych do zidentyfikowania trendów w zmianach ciśnienia, a wartość delta jest mniejsza niż 10 funtów na cal kwadratowy ciśnienia, na ekranie szybkiego startu wypełnij matrycę nazwami wzorców i próbek, które mają być analizowane. W celu określenia stężenia kwasu askorbinowego w wzorcach, wstrzyknąć pięć mikrolitrów każdego rozcieńczenia do przyrządu UPLC i przeprowadzić chromatografię, zaczynając od najbardziej rozcieńczonego do najbardziej stężonego roztworu, jak wskazano w tabeli.

Aby oznaczyć kwas askorbinowy i całkowite stężenie kwasu askorbinowego w próbkach liści, należy wstrzyknąć pięć mikrolitrów rozcieńczonego ekstraktu odpowiednio jeden i ekstrahować dwa do przyrządu UPLC w celu analizy chromatograficznej. Aby obliczyć kwas askorbinowy i całkowite stężenie kwasu askorbinowego, w oprogramowaniu kliknij Szybki start, Przeglądaj projekt, Kanały, nazwę wzorca lub próbki i kanał PDA jeden, 245 nanometrów przy 1,2 nanometra. Aby otworzyć chromatogramy wzorca i próbki, należy kliknąć punkt początkowy chromatogramu i przeciągnąć go do punktu końcowego, aby zintegrować odpowiedni pik z wzorcami i próbkami.

Następnie wykorzystaj dane z rozcieńczeń wzorcowych kwasu askorbinowego do zbudowania krzywej kalibracyjnej, aby przedstawić chromatograficznie wyznaczone wartości absorbancji i interpolować wartości absorbancji próbki, aby uzyskać kwas askorbinowy i całkowite stężenie kwasu askorbinowego, zgodnie ze wzorem. Kwantyfikacja witaminy C w matrycach Lactuca wymaga opracowania podejścia chromatograficznego, które może zapewnić wiarygodne wyniki. W tym miejscu można zaobserwować chromatogram wynikający z niezoptymalizowanego protokołu prezentującego pik kwasu askorbinowego wraz z niezidentyfikowanym na ramieniu górnika.

Niemniej jednak, po poprawie warunków ekstrakcji i chromatografii, można osiągnąć rozwiązany pik kwasu askorbinowego bez zakłóceń nieznanych związków. Ponadto zastosowanie sprzętu ultrafioletowego UPLC, zamiast ultrafioletu HPLC, skraca czas retencji i pracy. Zakłócenia w pikach kwasu askorbinowego konsekwentnie skutkują niedoszacowaniem zawartości witaminy C, z powodu niewystarczającej separacji podczas procesu chromatograficznego.

Ponieważ nakładające się na siebie obszary pików są zintegrowane przez pionowy spadek w najgłębszym punkcie między nimi. Co więcej, użycie niezoptymalizowanego protokołu uniemożliwia wyciągnięcie jakichkolwiek użytecznych wniosków z wyników. Ponieważ wszystkie próbki wydają się mieć podobną zawartość witaminy C, w każdej z jej postaci.

Natomiast zastosowanie zoptymalizowanego protokołu pozwala na wykrycie statystycznie istotnych różnic między różnymi typami próbek. Należy pamiętać o pobraniu wielu próbek, aby prawidłowo je zakonserwować, zminimalizować narażenie próbki na czynniki utleniające i określić ilościowo obie formy witaminy C. Całkowitą zawartość witaminy C można określić ilościowo nie tylko w dowolnym gatunku roślin, ale także w każdym owocu, w dowolnym owocu i warzywie, a nawet w przetworzonej żywności z niewielkimi modyfikacjami techniki.