Różnicowanie i charakterystyka neuronalnych progenitorów i neuronów z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Oprócz protokołu różnicowania embrionalnych komórek macierzystych myszy w komórki neuronalne, pokazujemy również zestaw eksperymentów, które mogą kompleksowo przeanalizować proces różnicowania. Techniki te są istotne dla wczesnego rozwoju embrionalnego ektodermy, zapewniając naukowcom możliwości analizy różnicowania komórek neuronów. Podejmując się tej procedury, konieczne jest rozpoczęcie od komórek macierzystych w optymalnym stanie.

Dlatego ważne jest, aby EB, MPC i neurony były hodowane w świeżych i optymalnych pożywkach. Wizualna demonstracja tego protokołu jest ważna, ponieważ zawiera najdrobniejsze szczegóły, które mogą wpłynąć na jego sukces i skuteczność, zwłaszcza część różnicowania. Zacznij od skonfigurowania wiszącej hodowli komórek kroplowych.

W przypadku 10-centymetrowej płytki do hodowli komórkowej dostosuj stężenie do 500 komórek na 20 mikrolitrów pożywki różnicującej. Przygotuj wystarczającą ilość zawiesiny komórek na 50 kropelek o pojemności 20 mikrolitrów. Użyj mikropipety lub pipety powtarzalnej, aby umieścić 20-mikrolitrowe kropelki zawiesiny komórek na pokrywie płytki do hodowli tkankowej, upewniając się, że kropelki nie są zbyt blisko siebie, aby zapobiec ich łączeniu się.

Napełnij talerz pięcioma do 10 mililitrami PBS i ostrożnie załóż pokrywkę z powrotem na talerz. Inkubuj kulturę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po dwóch dniach zbierz kropelki z pokrywki i umieść je na 10-centymetrowej płytce zawiesinowej do hodowli komórkowych wypełnionej 10 mililitrami pożywki różnicującej, a następnie umieść płytkę na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na niską prędkość w inkubatorze.

Po kolejnych dwóch dniach odwirować komórki w temperaturze 200 razy G przez trzy minuty i usunąć supernatant. Aby indukować różnicowanie ciała embrionalnego w nerwowe komórki progenitorowe, należy ponownie zawiesić komórki w pożywce różnicowej za pomocą pięciomikromolowego kwasu retinowego. Inkubować płytkę przez dwa dni, a następnie zastąpić co najmniej połowę pożywki świeżą pożywką, przechylając płytkę i odpipetowując ją.

Zebrać komórki dwa dni później, odwirowując je w temperaturze 200 razy G przez trzy minuty i usuwając supernatant. Utrwal ciała zarodkowe i nerwowe komórki progenitorowe za pomocą 4% PFA w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie usuń PFA i myj komórki w PBS przez pięć minut.

Inkubować komórki seryjnie w 10-, 20- i 30% roztworach sacharozy PBS, w temperaturze od 25 do 28 stopni Celsjusza, przy czym każda inkubacja trwa 30 minut lub dłużej, aż komórki osiądą na dnie probówki. I użyj go, aby przenieść próbkę do środka Cryomold, odpipetując nadmiar cieczy. Ostrożnie dodaj optymalną temperaturę cięcia lub roztwór OCT do formy, bez ponownego zawieszania próbki, a następnie usuń nadmiar pęcherzyków za pomocą pipety.

Umieść formę z próbką na mieszalniku laboratoryjnym z niską prędkością na 15 minut, co spowoduje osadzenie ciał zarodkowych i nerwowych komórek progenitorowych na dnie roztworu OCT. Następnie szybko zamroź próbkę, umieszczając formę w ciekłym azocie. Zablokuj sekcje OCT lub komory hodowlane zawierające neurony w 10% normalnej surowicy osła i 0,1% Triton X-100 w PBS przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.

Następnie inkubuj próbki w pierwotnym przeciwciałie, rozcieńczonym w 5% normalnej surowicy osła i 0,05% Triton X-100 w PBS, w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia umyj próbki w PBS za pomocą 0,1% Triton X-100 trzy razy przez pięć minut na pranie. Inkubuj je z przeciwciałem drugorzędowym, rozcieńczonym w 5% normalnej surowicy osła i 0,05% Triton X-100 w PBS, przez godzinę w temperaturze pokojowej.

Powtórzyć płukanie w Triton X-100 i PBS, a następnie inkubować próbkę w jednym mikrogramie na mililitr DAPI. Zamocuj próbkę za pomocą szkiełka nakrywkowego i odrobiny podłoża montażowego, pozostaw do wyschnięcia i zobrazuj za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Aby przeprowadzić różnicowanie neuronów, komórki E14 hodowano na napromieniowanych promieniami gamma mysich fibroblastach embrionalnych, aż do rozcieńczenia populacji fibroblastów.

Pluripotencję komórek E14 potwierdzono barwieniem fosfatazą alkaliczną. Po różnicowaniu ciała embrionalne miały okrągły kształt, który stale zwiększał swoje rozmiary. Do 10 dnia nerwowe komórki progenitorowe różnicujące się w neurony miały wydłużony kształt komórki.

Eksperymenty immunofluorescencyjne przeprowadzono na nerwowych komórkach progenitorowych w ósmym dniu i na neuronach w 12 dniu. Barwienie dodatnie zaobserwowano w przypadku zagnieżdżania się w neuronalnych komórkach progenitorowych oraz dla neurofilamentu w neuronach. Linia embrionalnych komórek macierzystych myszy wykazująca ekspresję reportera GFP sterowanego przez promotor Sox1 została zróżnicowana, a następnie przeprowadzono cytometrię przepływową na embrionalnych komórkach macierzystych i nerwowych komórkach progenitorowych.

Stwierdzono, że 58,7% wszystkich komórek na etapie NPC jest dodatnich w stosunku do GFP, podczas gdy 0% jest dodatnich w fazie ESC. Eksperymenty z sekwencją RNA przeprowadzono na embrionalnych komórkach macierzystych E14, ciałach zarodkowych i nerwowych komórkach progenitorowych. Geny na mapie cieplnej sekwencji RNA zostały posortowane na podstawie ich poziomów ekspresji.

Analiza ontologii genów czterech klastrów genów wykazała, że odpowiadają one różnym funkcjom lub szlakom komórkowym. Podczas wykonywania tego protokołu EBS powinny wyglądać jak kuliste, poczerniałe masy komórek. Aby upewnić się, że EBS rośnie z takimi, zmień podłoże pierwszego dnia, jeśli podłoże zacznie żółtawe

To samo podejście jest ważne w przypadku hodowli MPC, ponieważ zarówno EB, jak i MPC znajdują się w krytycznym stadium wczesnego rozwoju embrionalnego. Inne funkcjonalne testy genomowe, takie jak ChIPseek i testy wychwytywania potwierdzenia chromatyny z różnych etapów różnicowania neuronów, mogą być przeprowadzone w celu zrozumienia podstawowych procesów biologicznych. Integracja za pomocą chemicznych i funkcjonalnych testów genomicznych w procesie różnicowania neuronów pozwala naukowcom lepiej nakreślić mechanizmy molekularne wczesnego rozwoju embrionalnego.