Name: Wizualizacja oddziaływania białek naprawy DNA za pomocą immunofluorescencji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-26T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Poznaj metodę immunofluorescencji pośredniej do wizualizacji białek naprawy DNA w komórkach HeLa. Technika ta pozwala analizować rekrutację przestrzenną i czasową białek oraz ich kolokalizację w miejscach uszkodzeń DNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta grantem z San Antonio Area Foundation. Mays Cancer Center jest wspierane przez NCI Cancer Center Support core grant P30 CA054174. Chcielibyśmy podziękować Stephenowi Hollowayowi za pomoc w pozyskiwaniu odczynników oraz laboratorium Sung za udostępnienie przestrzeni i możliwości mikroskopowych.

1. Hodowla komórek HeLa
<ol>
	<li>Przedwstępnie potraktować okrągłe szkiełka nakrywki 1 M HCl w temperaturze 50 °C przez 16-18 godzin. Przepłukać ddH2O i przechowywać w 10% EtOH.</li>
	<li>Przygotować pożywkę do hodowli komórkowej: dodać 10% (v/v) FBS do pożywki DMEM.</li>
	<li>Hodować 4,0 x 104 komórek/dołek w sterylnej płytce 12-dołkowej z okrągłym szkiełkiem nakrywką o średnicy 18 mm w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze z nawilżaniem. Hodować komórki do osiągnięcia 80% konfluencji (około 24 godziny).</li>
</ol>
2. Naświetlanie komórek promieniowaniem (IR)
<ol>
	<li>Aby indukować powstawanie pęknięć dwuniciowych, poddaj komórki promieniowaniu γ o dawce 4 Gy (kontrola: brak napromieniowania, t=0). W urządzeniu Gamma Cell -40 odpowiada to 4,54 min przy dawce 0,815 Gy na minutę.</li>
	<li>Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze z nawilżeniem przez odpowiedni czas (wybrane punkty czasowe: t=1, 2, 4, 16 h).</li>
</ol>
3. Ekstrakcja jądrowa i fiksacja komórek
<ol>
	<li>Przygotować roztwory stokowe: 0,2 M PIPES (pH 6,8), 5 M NaCl, 2 M sacharozy, 1 M MgCl2, 0,1 M EGTA (pH 8,0).</li>
	<li>Przygotować bufor do ekstrakcji jąder (NEB): rozpuścić 10 mM PIPES (pH 6,8), 10 mM NaCl, 30 mM sacharozy, 3 mM MgCl2, 1 mM EGTA (pH 8,0) oraz 0,5% (v/v) Triton X-100 w ddH2O. Mieszać do całkowitego rozpuszczenia.</li>
	<li>Przygotować 4% (v/v) paraformaldehyd (PFA): rozpuścić 10 mL 16% wodnego roztworu PFA w 30 mL PBS. Mieszać do całkowitego rozpuszczenia.</li>
	<li>W odpowiednich punktach czasowych (t=0, 1, 2, 4, 16 h) wypłukać komórki dwukrotnie 1 mL PBS. Całkowicie usunąć PBS.</li>
	<li>Do każdego dołka dodać 20 μL NEB w celu ekstrakcji jąder komórkowych (cytoplazma ulega degradacji, pozostaje tylko jądro) (Rysunek 2). Inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie całkowicie usunąć. 
	UWAGA: Nie przekraczać 2 minut.</li>
</ol>
<img alt="Porównanie morfologii komórek: wpływ ekstrakcji jąder, obraz mikroskopowy, analiza struktury komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61447/61447fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Ekstrakcja jąder komórkowych. 
Reprezentatywne obrazy komórek przed (lewo) i po (prawo) ekstrakcji jąder. Po ekstrakcji (prawo) cytoplazma powinna ulec strawieniu, natomiast struktura jądra powinna pozostać nienaruszona. (A) powiększenie 20x; pasek skali = 20 μm oraz (B) powiększenie 40x; pasek skali = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61447/61447fig02large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol start="6">
	<li>Przemyć komórki 1 mL PBS. Całkowicie usunąć PBS. Ostrożnie dodać PBS; na tym etapie komórki są bardzo delikatne.</li>
	<li>Do każdej studni dodać 20 μL 4% (v/v) PFA w celu utrwalenia komórek. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Całkowicie usunąć PFA.</li>
	<li>Dodać 1 mL PBS. 
	UWAGA: Komórki można przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
4. Barwienie immunofluorescencyjne
<ol>
	<li>Przygotować roztwór blokujący: rozpuścić 5% BSA (w/v) w PBS i dodać 0,3% (v/v) Triton X-10. Mieszać do całkowitego rozpuszczenia.</li>
	<li>Przygotować bufor do rozcieńczeń: rozpuścić 1% BSA (w/v) w PBS i dodać 0,3% (v/v) Triton X-10. Mieszać do całkowitego rozpuszczenia.</li>
	<li>W celu blokowania dodać 20 μL roztworu blokującego do każdej studzienki. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez 16-18 godzin w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Jeśli używane będą przeciwciała kozie, do roztworu blokującego należy dodać 5% surowicy koziej.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe w buforze do rozcieńczeń (1:500; lista przeciwciał znajduje się w Tabeli 2) i wymieszać za pomocą vorteksa. 
	UWAGA: Jeśli używane jest przeciwciało kozie, do buforu do rozcieńczeń należy dodać 1% surowicy koziej.</li>
	<li>W komorze inkubacyjnej/wilgotnościowej przykleić kawałek parafilmu. Nanieść 10 μL przeciwciała pierwszorzędowego (w jednej kropli). Dopasować krawędź szkiełka nakrywki do kropli i powoli opuścić na parafilm, aby ciecz rozprzestrzeniła się po całej powierzchni (jeśli to możliwe, unikać pęcherzyków powietrza). Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć szkiełka nakrywki trzy razy w PBS przez 1 minutę.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w buforze do rozcieńczeń (stężenie końcowe: 2 μg/mL) i wymieszać za pomocą vorteksa.</li>
	<li>Nanieść 10 μL przeciwciała drugorzędowego zgodnie z procedurą opisaną dla przeciwciał pierwszorzędowych. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Chronić przed światłem.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Przeciwciało</td>
			<td>Firma</td>
			<td>Literatura</td>
			<td>Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>53BP1</td>
			<td>Sygnalizacja komórkowa</td>
			<td>4937</td>
			<td>Królik</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anty-IgG mysie H&amp;L (Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150103</td>
			<td>Osioł</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przeciwciało przeciwko fosfo-histonie H2A.X (Ser139), klon JBW301</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-636</td>
			<td>Mysz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>przeciwciała anty-królicze IgG H&amp;L (Alexa Fluor 48)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150081</td>
			<td>Koza</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Wykorzystane przeciwciała. Lista przeciwciał użytych w niniejszym badaniu.
<ol start="9">
	<li>Przemyj szkiełka podstawowe trzy razy w PBS przez 1 minutę.</li>
	<li>Przemyj szkiełka podstawowe w H2O przez 1 minutę.</li>
	<li>Przebarw DNA za pomocą DAPI: nanieś 10 μL 30 nM DAPI (zgodnie z opisem dla przeciwciał), inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie zamontuj na szkiełku przedmiotowym przy użyciu medium montażowego na bazie glicerolu. Alternatywnie, nanieś na szkiełko jedną kroplę (10 μL) komercyjnego medium montażowego z DAPI zapobiegającego blaknięciu, a następnie nałóż szkiełko podstawowe. Delikatnie dociśnij szkiełko podstawowe i usuń nadmiar cieczy wokół niego za pomocą ręcznika papierowego.</li>
	<li>Uszczelnij szkiełka podstawowe przezroczystym lakierem do paznokci i pozostaw do wyschnięcia na 20 minut.</li>
	<li>Przechowuj szkiełka w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
5. Akwizycja obrazu
<ol>
	<li>Nanieś kroplę olejku immersyjnego na obiektyw 60x. Użyj DAPI, aby zlokalizować jądra komórkowe przez okular mikroskopu.
	<ol>
		<li>W celu akwizycji obrazów XYZ otwórz oprogramowanie akwizycyjne i wybierz następujące parametry: Typ skanera: Galvano; Tryb skanera: Roundtrip; Rozmiar obrazu: 512×512; Tryb PMT: VBF; Średnia PMT: klatka (4 razy); Skanowanie sekwencyjne PMT: linia.</li>
		<li>Wybierz barwniki i detektory: 
		Kanał (CH1), Barwnik (DAPI), Detektor (SD1) 
		Kanał (CH2), Barwnik (Alexa Fluor 48), Detektor (HSD3) 
		Kanał (CH3), Barwnik (Alexa Fluor 647), Detektor (HSD4)</li>
		<li>W sekcji „Z” zaznacz opcję ON.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dostosuj obraz na żywo. Naciśnij przycisk Live w oknie Live.
	<ol>
		<li>Ustaw ostrość oraz natężenie lasera (%), czułość (HV), wzmocnienie (gain) i offset w oknie narzędziowym „PMT”.
		<ol>
			<li>Dostosuj natężenie lasera (%): w celu regulacji jasności i zapobiegania fotobieleniu. Wyższe natężenie lasera daje silniejszy sygnał, ale powoduje fotobielenie preparatu.</li>
			<li>Dostosuj czułość (HV): poziom szumów. Im wyższe HV, tym silniejszy sygnał, jednak zbyt wysoka wartość spowoduje pojawienie się szumów na obrazie. 
			UWAGA: Zawsze utrzymuj stałe napięcie.</li>
			<li>Dostosuj offset: poziom tła.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dla stosów Z wybierz Start/End (15 przekrojów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozpocznij akwizycję.
	<ol>
		<li>Wybierz folder do zapisu obrazów. Naciśnij przycisk LSM Start, aby rozpocząć akwizycję obrazu. Naciśnij przycisk Series Done, aby zakończyć proces akwizycji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Analiza danych
<ol>
	<li>W celu analizy obrazów należy otworzyć oprogramowanie analityczne.
	<ol>
		<li>W oknie narzędzia Batch należy wybrać obrazy do analizy oraz folder wyjściowy.</li>
		<li>W oknie narzędzia Analysis należy wybrać opcję Projection (wyświetli ona projekcję maksymalnej intensywności z 15 warstw).</li>
		<li>W sekcji Input/Output setting należy wybrać utworzoną partię.</li>
		<li>Należy nacisnąć Process, aby przetworzyć obrazy.</li>
		<li>Wyeksportować obrazy do plików w formacie .tiff.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu ilościowego oznaczenia ognisk jądrowych należy otworzyć program CellProfiler.
	<ol>
		<li>Otworzyć potok analizy ilościowej ognisk γH2AX i 53BP1 (patrz Supplemental information).</li>
		<li>Przedstawić dane na wykresach przy użyciu oprogramowania do tworzenia tabel.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu analizy kolokalizacji należy otworzyć program CellProfiler.
	<ol>
		<li>Otworzyć potok Colocalization (patrz Supplemental information). Zostanie utworzony plik arkusza kalkulacyjnego i zapisany w wybranym folderze. Same wykresy nie będą jednak zapisywane automatycznie. Zaleca się wykonanie zrzutów ekranu okien w celu zachowania dokumentacji wyników.</li>
		<li>Przedstawić dane na wykresach przy użyciu oprogramowania do tworzenia tabel.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Prakash, R., Zhang, Y., Feng, W., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+recombination+and+human+health%3A+the+roles+of+BRCA1%2C+BRCA2%2C+and+associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Homologous recombination and human health: the roles of BRCA1, BRCA2, and associated proteins.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (4), 016600(2015).</li>
<li>Jalan, M., Olsen, K. S., Powell, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+Roles+of+RAD52+in+Genome+Maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Emerging Roles of RAD52 in Genome Maintenance.</a> Cancers (Basel). 11 (7), (2019).</li>
<li>Oh, J., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+Mre11+Complex+in+Preserving+Genome+Integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Role of the Mre11 Complex in Preserving Genome Integrity.</a> Genes (Basel). 9 (12), (2018).</li>
<li>Uziel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+the+MRN+complex+for+ATM+activation+by+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Requirement of the MRN complex for ATM activation by DNA damage.</a> The EMBO Journal. 22 (20), 5612-5621 (2003).</li>
<li>Lee, J. H., Paull, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATM+activation+by+DNA+double-strand+breaks+through+the+Mre11-Rad50-Nbs1+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">ATM activation by DNA double-strand breaks through the Mre11-Rad50-Nbs1 complex.</a> Science. 308 (5721), 551-554 (2005).</li>
<li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> Journal of Biological Chemistry. 273, 5858-5868 (1998).</li>
<li>Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., Iliakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B3-H2AX+in+recognition+and+signaling+of+DNA+double-strand+breaks+in+the+context+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">γ-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin.</a> Nucleic Acids Research. 36 (17), 5678-5694 (2008).</li>
<li>Martin, O. A., Pilch, D. R., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H2AX+in+DNA+damage+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biology+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Histone H2AX in DNA damage repair.</a> Cancer Biology & Therapy. 2 (3), 233-235 (2003).</li>
<li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> Journal of Cell Biology. 146 (5), 905-916 (1999).</li>
<li>Stucki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MDC1+directly+binds+phosphorylated+histone+H2AX+to+regulate+cellular+responses+to+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MDC1 directly binds phosphorylated histone H2AX to regulate cellular responses to DNA double-strand breaks.</a> Cell. 123 (7), 1213-1226 (2005).</li>
<li>Lou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MDC1+maintains+genomic+stability+by+participating+in+the+amplification+of+ATM-dependent+DNA+damage+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">MDC1 maintains genomic stability by participating in the amplification of ATM-dependent DNA damage signals.</a> Molecular Cell. 21 (2), 187-200 (2006).</li>
<li>Chapman, J. R., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospho-dependent+interaction+between+NBS1+and+MDC1+mediate+chromatin+retention+of+the+MRN+complex+at+sites+of+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Phospho-dependent interaction between NBS1 and MDC1 mediate chromatin retention of the MRN complex at sites of DNA damage.</a> EMBO Reports. 9 (8), 795-801 (2008).</li>
<li>Melander, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+SDT+repeats+in+the+MDC1+N+terminus+triggers+retention+of+NBS1+at+the+DNA+damage-modified+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of SDT repeats in the MDC1 N terminus triggers retention of NBS1 at the DNA damage-modified chromatin.</a> Journal of Cell Biology. 181 (2), 213-226 (2008).</li>
<li>Branzei, D., Foiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+DNA+repair+throughout+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of DNA repair throughout the cell cycle.</a> Nature Review. Molecular Cell Biology. 9 (4), 297-308 (2008).</li>
<li>Chiruvella, K. K., Liang, Z., Wilson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+double-strand+breaks+by+end+joining%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Repair of double-strand breaks by end joining.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (5), 012757(2013).</li>
<li>Mehta, A., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sources+of+DNA+double-strand+breaks+and+models+of+recombinational+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Sources of DNA double-strand breaks and models of recombinational DNA repair.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (9), 016428(2014).</li>
<li>Symington, L. S., Gautier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-strand+break+end+resection+and+repair+pathway+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Double-strand break end resection and repair pathway choice.</a> Annual Review of Genetics. 45, 247-271 (2011).</li>
<li>Huertas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+resection+in+eukaryotes%3A+deciding+how+to+fix+the+break%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA resection in eukaryotes: deciding how to fix the break.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 17 (1), 11-16 (2010).</li>
<li>Nimonkar, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLM-DNA2-RPA-MRN+and+EXO1-BLM-RPA-MRN+constitute+two+DNA+end+resection+machineries+for+human+DNA+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">BLM-DNA2-RPA-MRN and EXO1-BLM-RPA-MRN constitute two DNA end resection machineries for human DNA break repair.</a> Genes & Development. 25 (4), 350-362 (2011).</li>
<li>Garcia, V., Phelps, S. E. L., Gray, S., Neale, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+resection+of+DNA+double-strand+breaks+by+Mre11+and+Exo1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bidirectional resection of DNA double-strand breaks by Mre11 and Exo1.</a> Nature. 479 (7372), 241-244 (2011).</li>
<li>Sturzenegger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA2+cooperates+with+the+WRN+and+BLM+RecQ+helicases+to+mediate+long-range+DNA+end+resection+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">DNA2 cooperates with the WRN and BLM RecQ helicases to mediate long-range DNA end resection in human cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (39), 27314-27326 (2014).</li>
<li>Daley, J. M., Niu, H., Miller, A. S., Sung, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+mechanism+of+DSB+end+resection+and+its+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Biochemical mechanism of DSB end resection and its regulation.</a> DNA Repair. 32, 66-74 (2015).</li>
<li>Sartori, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CtIP+promotes+DNA+end+resection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human CtIP promotes DNA end resection.</a> Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).</li>
<li>Chen, L., Nievera, C. J., Lee, A. Y. L., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle-dependent+complex+formation+of+BRCA1-CtIP-MRN+is+important+for+DNA+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cell cycle-dependent complex formation of BRCA1-CtIP-MRN is important for DNA double-strand break repair.</a> Journal of Biological Chemistry. 283, 7713-7720 (2008).</li>
<li>Yun, M. H., Hiom, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CtIP-BRCA1+modulates+the+choice+of+DNA+double-strand+break+repair+pathway+throughout+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">CtIP-BRCA1 modulates the choice of DNA double-strand break repair pathway throughout the cell cycle.</a> Nature. 459 (7245), 460-463 (2009).</li>
<li>Sung, P., Klein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+homologous+recombination%3A+mediators+and+helicases+take+on+regulatory+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanism of homologous recombination: mediators and helicases take on regulatory functions.</a> Nature Review. Molecular Cell Biology. 7, 739-750 (2006).</li>
<li>San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+eukaryotic+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of eukaryotic homologous recombination.</a> Annual Review of Biochemistry. 77, 229-257 (2008).</li>
<li>Jasin, M., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+strand+breaks+by+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Repair of strand breaks by homologous recombination.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (11), 012740(2013).</li>
<li>Dynan, W. S., Yoo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+Ku+protein+and+DNA-dependent+protein+kinase+catalytic+subunit+with+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Interaction of Ku protein and DNA-dependent protein kinase catalytic subunit with nucleic acids.</a> Nucleic Acids Research. 26 (7), 1551-1559 (1998).</li>
<li>Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+double-strand+DNA+break+repair+by+the+nonhomologous+DNA+end-joining+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway.</a> Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).</li>
<li>Cejka, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+end+resection%3A+nucleases+team+up+with+the+right+partners+to+initiate+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">DNA end resection: nucleases team up with the right partners to initiate homologous recombination.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (38), 22931-22938 (2015).</li>
<li>Mirman, Z., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1%3A+a+DSB+escort%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">53BP1: a DSB escort.</a> Genes & Development. 34, 7-23 (2020).</li>
<li>Cao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+selective+requirement+for+53BP1+in+the+biological+response+to+genomic+instability+induces+by+BRCA1+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A selective requirement for 53BP1 in the biological response to genomic instability induces by BRCA1 deficiency.</a> Molecular Cell. 35 (4), 534-541 (2009).</li>
<li>Zimmermann, M., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1%3A+Pro+choice+in+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">53BP1: Pro choice in DNA repair.</a> Trends in Cell Biology. 24 (2), 108-117 (2014).</li>
<li>Mavragani, I. V., Nikitaki, Z., Kalospyros, S. A., Georgakilas, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionizing+Radiation+and+Complex+DNA+Damage%3A+From+Prediction+to+Detection+Challenges+and+Biological+Significance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Ionizing Radiation and Complex DNA Damage: From Prediction to Detection Challenges and Biological Significance.</a> Cancers (Basel). 11 (11), (2019).</li>
<li>Nikitaki, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+complex+DNA+damage+induction+and+repair+in+human+cellular+systems+after+exposure+to+ionizing+radiations+of+varying+linear+energy+transfer+%28LET%29%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Research%22%5BJournal%5D)">Measurement of complex DNA damage induction and repair in human cellular systems after exposure to ionizing radiations of varying linear energy transfer (LET).</a> Free Radical Research. 50, sup1 64-78 (2016).</li>
<li>Redon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H2A+variants+H2AX+and+H2AZ%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Histone H2A variants H2AX and H2AZ.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 12 (2), 162-169 (2002).</li>
<li>Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+the+histone+guardian+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">H2AX: the histone guardian of the genome.</a> DNA Repair. 3 (8-9), 959-967 (2004).</li>
<li>Paull, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+histone+H2AX+in+recruitment+of+repair+factors+to+nuclear+foci+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage.</a> Current Biology. 10 (15), 886-895 (2000).</li>
<li>Sy, S. M. H., Huen, M. S. Y., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PALB2+is+an+integral+component+of+the+BRCA+complex+required+for+homologous+recombination+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">PALB2 is an integral component of the BRCA complex required for homologous recombination repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (17), 7155-7160 (2009).</li>
<li>Buisson, R., Masson, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PALB2+self-interaction+controls+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">PALB2 self-interaction controls homologous recombination.</a> Nucleic Acids Research. 40 (20), 10312-10323 (2012).</li>
<li>Belotserkovskaya, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PALB2+chromatin+recruitment+restores+homologous+recombination+in+BRCA1-deficient+cells+depleted+of+53BP1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">PALB2 chromatin recruitment restores homologous recombination in BRCA1-deficient cells depleted of 53BP1.</a> Nature Communications. 11 (1), 819(2020).</li>
<li>Betts, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+noncoding+RNAs+CUPID1+and+CUPID2+mediate+breast+cancer+risk+at+11q13+by+modulating+the+response+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Long noncoding RNAs CUPID1 and CUPID2 mediate breast cancer risk at 11q13 by modulating the response to DNA damage.</a> American Journal of Human Genetics. 101 (2), 255-266 (2017).</li>
<li>Dray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+enhancement+of+the+meiotic+DMC1+recombinase+by+RAD51+associated+protein+1+%28RAD51AP1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for enhancement of the meiotic DMC1 recombinase by RAD51 associated protein 1 (RAD51AP1).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (9), 3560-3565 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Analiza czasu i skuteczności naprawy uszkodzeń DNA za pomocą mikroskopii okazała się niezbędna do zrozumienia, jak działa maszyneria naprawy DNA w normalnych komórkach i w patologiach ludzkich, takich jak rak.
Opracowanie specyficznych przeciwciał, które umożliwiają wykrywanie aktywowanych białek w ich ufosforylowanej wersji (takich jak γH2AX, pRPA, pRAD50 i inne 10,23,39,43) odegrało kluczową rolę w lepszym zrozumieniu czasu naprawy DNA i jego synchronizacji z cyklem komórkowym.<sup class="xr...

Komórki ludzkie są nieustannie narażone na działanie różnych czynników uszkadzających DNA o różnym pochodzeniu. Źródła egzogenne obejmują głównie ekspozycję na promieniowanie, substancje chemiczne (w tym leki chemoterapeutyczne i niektóre antybiotyki) oraz wirusy, natomiast głównymi źródłami endogennymi są błędy w replikacji DNA oraz stres oksydacyjny. Bezpośrednie skutki ekspozycji genotoksycznej mogą obejmować zarówno modyfikację pojedynczej zasady, jak i potencjalnie letalne pęknięcia dwuniciowe DNA (DSB), w zależności od rodzaju stresu i dawki ekspozycji. Ostatecznie nieusunięte lub błędnie naprawione uszkodzenia DNA mogą prowadzić do akumulacji mutacji, przetasowań genomicznych, niestabilności genomu, a w konsekwencji do kancerogenezy1. Komórki ssaków wykształciły złożone szlaki rozpoznawania specyficznych rodzajów uszkodzeń DNA2,3 i ich terminowej naprawy, zsynchronizowanej z przebiegiem cyklu komórkowego.
Promieniowanie jonizujące (IR) uszkadza podwójną helisę DNA i tworzy pęknięcia obu nici (DSBs), które są jedną z najgroźniejszych form uszkodzeń DNA. Kompleks MRN (MRE1, RAD50, NBS1) pełni funkcję sensora końców DNA i aktywuje kinazę białkową ATM (ataxia telangiectasia mutated)4,5. Po wstępnej aktywacji ATM przez końce DNA, ATM inicjuje kaskadę zdarzeń DDR w miejscu pęknięcia, rozpoczynając od kluczowego etapu, jakim jest fosforylacja wariantu histony H2AX6. Fosforylacja H2AX w pozostałości S139 aktywuje go do postaci γH2AX, obejmując obszary o wielkości do megabaz wokół uszkodzenia DNA6,7,8,9. Zdarzenie to zwiększa dostępność DNA, co prowadzi do rekrutacji i akumulacji innych białek naprawczych DNA7. Ponieważ γH2AX jest obficie i specyficznie indukowany w otoczeniu pęknięć DSB, można go łatwo zwizualizować przy użyciu specyficznych przeciwciał, dlatego jest on powszechnie stosowany jako marker zastępczy dla DSB w badaniach nad naprawą DNA. Po zasygnalizowaniu pęknięcia komórki aktywują swoje szlaki naprawy DNA i przetwarzają uszkodzenia DNA. Białko MDC1 (mediator of DNA damage checkpoint protein 1) bezpośrednio wiąże γH2AX10, oddziałuje z ATM1, a także z NBS112,13. Przyczynia się ono do zwiększenia stężenia kompleksu MRN w miejscu DSB i inicjuje pozytywną pętlę sprzężenia zwrotnego ATM. γH2AX jest szybko usuwany po naprawie pęknięcia, co w konsekwencji pozwala na monitorowanie eliminacji DSB. Dzięki zastosowaniu mikroskopii spadek poziomu γH2AX w czasie stanowi pośredni pomiar pozostałych pęknięć oraz wydajności naprawy DNA.
Komórki eukariotyczne mogą naprawiać pęknięcia dwuniciowe (DSB) za pomocą kilku szlaków, z których dwa główne to niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) oraz rekombinacja homologiczna (HR) (Rysunek 1). NHEJ w zasadzie liguje końce dwuniciowe DNA bez wykorzystania rozległej homologii i działa przez cały cykl komórkowy14,15. HR dominuje podczas faz S i G2 i jest w innym czasie tłumiona, ponieważ do naprawy wymaga ona chromatydy siostrzanej jako matrycy homologicznej14,16. Wybór szlaku między NHEJ a HR zależy nie tylko od fizycznej bliskości chromatydy siostrzanej, ale także od stopnia resekcji końców DNA17, która hamuje proces NHEJ.
Naprawa DSB zależna od homologii rozpoczyna się od nukleolitycznej degradacji nici 5’ od końców pęknięcia w celu wytworzenia jednoniciowych końców DNA (ssDNA) 3’, proces ten nazywa się resekcją 5’-3’. Kompleks MRN inicjuje resekcję końców DNA, a dalsza resekcja przebiega przy udziale BLM/EXO1 (białka zespołu Blooma/egzonukleazy 1) lub BLM/DNA2 (ATP-zależnej helikazy/nukleazy replikacji DNA)18,19,20,21,2. Resekcja końców DNA jest wspomagana przez CtIP (białko oddziałujące z CtBP) poprzez jego bezpośrednią interakcję z kompleksem MRN23 oraz rekrutację białka BRCA1 (białka podatności na raka piersi typu 1)24,25. Białko RPA (białko replikacyjne A) szybko wiąże się z odsłoniętym ssDNA, a następnie zostaje zastąpione przez rekombinazę RAD51, tworząc filament nukleoproteinowy, który katalizuje wyszukiwanie homologii i inwazję nici26,27,28.
Rozpoczęcie resekcji jest krytycznym krokiem w wyborze ścieżki naprawy. Po zainicjowaniu resekcji końce DNA stają się słabymi substratami dla wiązania przez heterodimer Ku70/Ku80 (składnik ścieżki NHEJ), a komórki zostają skierowane na drogę HR17,29,30. Heterodimer Ku70/Ku80 wiąże się z końcami DSB, rekrutując DNA-PKcs oraz białko wiążące p53 1 (53BP1)29,30. 53BP1 działa jako bariera dla resekcji w fazie G1, blokując tym samym HR przy jednoczesnym promowaniu NHEJ31,32, jednak jest ono usuwane w sposób zależny od BRCA1 w fazie S, co w konsekwencji umożliwia przeprowadzenie resekcji33,34. Zatem 53BP1 i BRCA1 pełnią przeciwstawne role w naprawie DSB, gdzie 53BP1 jest facylitatorem NHEJ, podczas gdy BRCA1 umożliwia naprawę pęknięć poprzez HR.
W warunkach laboratoryjnych powstawanie DSB można indukowanie za pomocą promieniowania jonizującego (IR). Choć w niniejszym przykładzie wykorzystano wysoką dawkę 4 Gy, dawki 1 Gy i 2 Gy również powodują powstanie znacznej liczby DSB, co jest odpowiednie do analizy tworzenia się ognisk przez białka występujące w dużym stężeniu. Należy zauważyć, że rodzaj i dawka zastosowanego promieniowania mogą prowadzić do różnych uszkodzeń DNA i komórek: o ile IR indukuje DSB, może ono również powodować pęknięcia pojedynczej nici lub modyfikacje zasad (patrz35,36 w celu uzyskania informacji na temat liniowego przekazu energii (LET) promieniowania i rodzaju uszkodzeń DNA). Aby określić kinetykę tworzenia się ognisk indukowanych promieniowaniem jonizującym (IRIF) oraz ich znikanie, co wskazuje na naprawę uszkodzeń i odwrócenie aktywacji DDR8,9,37,38, proces tworzenia ognisk można monitorować w różnych punktach czasowych po napromieniowaniu. Czas aktywacji i znikania wszystkich głównych białek odpowiedzi na uszkodzenia DNA jest znany39, a wiele z nich jest badanych jako markery zastępcze dla kluczowych zdarzeń. Na przykład pRPA, wykazujące wysokie powinowactwo do ssDNA, jest wykorzystywane jako marker zastępczy dla resekcji pęknięć; białka MRN (MRE1, RAD50, NBS1) oraz egzonukleazy mogą być również używane do oceny wydajności resekcji. Podczas gdy białka RAD51, BRCA1, BRCA2 (białko podatności na raka piersi typu 2) oraz PALB2 (partner i lokalizator BRCA2) mogą być monitorowane w celu oceny wydajności HR, obecność białek Ku lub 53BP1 służy jako markery NHEJ (Rysunek 1).
Ponieważ białka aparatu naprawy DNA rekrutują się nawzajem do miejsca pęknięcia i łączą w superkompleksy, oddziaływania DNA-białko oraz białko-białko można wnioskować, śledząc ich indywidualną lokalizację w czasie i analizując ko-lokalizację białek, wizualizowaną jako nakładające się sygnały w komórce40,41,42. W liniach komórkowych wprowadzenie mutacji punktowych lub delecji w specyficznych genach naprawy DNA – albo poprzez edycję genomu, albo poprzez nadekspresję mutantów opartych na plazmidach – pozwala na badanie konkretnych reszt aminokwasowych i ich możliwej roli w rozpoznawaniu uszkodzeń DNA (np. ko-lokalizacja z γH2AX) lub w montażu kompleksu (ko-lokalizacja z innym białkiem lub kilkoma białkami), a także ich wpływu na naprawę DNA. W niniejszej pracy wykorzystujemy pośrednią immunofluorescencję jako metodę badania tworzenia i usuwania pęknięć DSB poprzez śledzenie ognisk γH2AX w czasie. Przedstawiamy również przykład analizy tworzenia ognisk i ko-lokalizacji dla kluczowego białka w naprawie DSB: p53 Binding Protein 1 (53BP1)32. Jak wspomniano wcześniej, 53BP1 jest uważane za centralne dla wyboru ścieżki naprawy DNA. Śledzenie akumulacji 53BP1 i jego ko-lokalizacji z γH2AX dostarcza cennych informacji o fazie cyklu komórkowego, akumulacji uszkodzeń DNA oraz ścieżce wykorzystanej do naprawy DSB. Celem pośredniej immunolokalizacji jest ocena efektywności naprawy uszkodzeń DNA w liniach komórkowych po naświetlaniu IR, jak w niniejszym badaniu, lub po ekspozycji komórek na różne stresy, od sieciowania DNA po blokadę widełek replikacyjnych (lista czynników uszkadzających DNA znajduje się w Tabeli 1).
<img alt="Schemat naprawy DNA przedstawiający procesy HR i NHEJ; etapy resekcji, ligacji i rekombinacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61447/61447fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Szlaki naprawy pęknięć obu nici DNA (DSB). 
Naprawa DSB przebiega dwiema głównymi drogami: rekombinacją homologiczną (HR, po lewej) oraz niespokrewnionym łączeniem końców (NHEJ, po prawej). Po wystąpieniu pęknięcia aktywowane są białka służące do znakowania miejsca pęknięcia (γH2AX), biorące udział w resekcji końców (MRN), pokrywające resekowane ssDNA (pRPA), promujące rekombinację (BRCA1, PALB2, BRCA2, RAD51) lub ograniczające resekcję i promujące NHEJ (53BP1). W naprawie uszkodzeń uczestniczą również inne białka, jednak wymienione powyżej są rutynowo monitorowane za pomocą pośredniej immunofluorescencji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61447/61447fig1v2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Agent uszkadzający DNA</td>
			<td >Mechanizm działania</td>
			<td >Zalecana dawka</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >promienie γ/promienie X</td>
			<td >Promieniowanie 
			Powstawanie pęknięć dwuniciowych z niektórymi niekontrolowanymi efektami komórkowymi</td>
			<td >1-4 Gy</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >36jony Ar</td>
			<td >Promieniowanie 
			Powstawanie pęknięć dwuniciowych</td>
			<td >270 keV/μm</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >cząstki α</td>
			<td >Promieniowanie 
			Powstawanie pęknięć dwuniciowych</td>
			<td >116 keV/μm</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bleomycyna</td>
			<td >Inhibitor syntezy DNA</td>
			<td >0.4-2 μg/mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kamptotecyna</td>
			<td >Inhibitor topoizomerazy I</td>
			<td >10-200 nM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cysplatyna</td>
			<td >Agent alkilujący 
			(indukujący wiązania krzyżowe wewnątrz nici)</td>
			<td >0.25-2 μM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Doksorubicyna</td>
			<td >Agent interkalujący 
			Inhibitor topoizomerazy II</td>
			<td >10-20 nM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Etopozyd</td>
			<td >Inhibitor topoizomerazy II</td>
			<td >10 μM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hydroksymocznik</td>
			<td >Inhibitor syntezy DNA 
			(poprzez reduktazę rybonukleotydową)</td>
			<td >10-20 μM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Metylometanosulfonian</td>
			<td >Agent alkilujący</td>
			<td >0.25-2 mM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mitomycyna C</td>
			<td >Agent alkilujący</td>
			<td >0.25-2 μM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Światło ultrafioletowe (UV)</td>
			<td >Powstawanie dimerów tymydyny 
			(generujące zniekształcenie łańcucha DNA)</td>
			<td >50-10 mJ/cm2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Agenty genotoksyczne. Przykłady czynników uszkadzających DNA, ich mechanizm działania oraz indukowane uszkodzenia w oparciu o sugerowane stężenie robocze.

<table><tbody><tr><td>16% (v/v) wodny roztwór paraformaldehydu (PFA)</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>15710</td><td>Jakość mikroskopowa PFA zapewnia najlepsze obrazy. Jeśli używasz "domowego PFA", przefiltruj przed użyciem.</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td>Zalecana jest frakcja szoku cieplnego, aby uniknąć opadów/tła.</td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe #1, okrągłe 18 mm (szkiełka nakrywkowe)Szkiełka</td> nakrywkowe <td>Neuvitro</td><td>NC0308920</td><td>należy przed użyciem wyczyścić i wysterylizować HCl lub etanolem.</td></tr><tr><td>DMEM, Wysoka Glukoza [(+) 4,5 g/L D-Glukoza, (+) L-Glutamina, (-) Pirogronian Sodu]</td><td>Gibco</td><td>11965118</td><td>Dostosuj podłoża uprawowe do potrzeb użytej linii komórkowej.</td></tr><tr><td>DPBS, bez wapnia, bez magnezu</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td>PBS do hodowli tkankowych.</td></tr><tr><td>Kwas bis(beta-aminoetylowy)-glikolu etylenowego-bis(beta;-aminoetylowego)-N,N,N&prime;,N&prime;-tetraoctowego (EGTA)</td><td>Research Products International</td><td>E57060</td><td>Bufor do ekstrakcji jądrowej.</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>104370028</td><td>Jakość FBS można ocenić, testując tworzenie ognisk gH2AX. Jeśli w partii obecne są śladowe ilości genotoksycznej endotoksyny, gH2AX będzie dodatni przy braku stresu.</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu (MgCl2)</td><td>Research Products International</td><td>M24000</td><td>Bufor do ekstrakcji jądrowej.</td></tr><tr><td>Piperazyna-N,N&prime;-bis (kwas 2-etanosulfonowy) (PIPES)</td><td>Research Products International</td><td>P40150</td><td>Bufor do ekstrakcji jądrowej.</td></tr><tr>Zamiast tego można użyć <td>SlowFade Diamond Antifade Mountant z DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>S36973</td><td>300 nM DAPI z VECTASHIELD Antifade Mounting Medium.</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Research Products International</td><td>S23020</td><td>Bufor do ekstrakcji jądrowej.</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Research Products International</td><td>S24060</td><td>Bufor do ekstrakcji jądrowej.</td></tr><tr>Zamiast tego można użyć <td>szkiełek mikroskopowych Superfrost Plus</td><td>Fisherbrand</td><td>1255015</td><td>Polysine Slides.</td></tr><tr><td>Płytki wielodołkowe poddane działaniu TC, rozmiar 12 dołków</td><td>Costar</td><td>3513</td><td>Wysiew na szkiełkach nakrywkowych odbywa się na płytce 12-dołkowej.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>AmericanBio</td><td>AB02025</td><td>Bufor do ekstrakcji jądrowej.</td></tr><tr>Zamiast tego można użyć <td>TrypLE Express Enzyme (1X), bez Phenol Red</td><td>Gibco</td><td>12604021</td><td>Trypsin-EDTA.</td></tr><tr>Zamiast tego można stosować <td>Trypsin-EDTA (0,5%), No Phenol Red</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td>TrypLE.</td></tr></tbody></table>

wizualizacja oddziaływania białek naprawy dna za pomocą immunofluorescencji

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Komórki ssaków są stale narażone na działanie substancji chemicznych, promieniowania i naturalnie występujących produktów ubocznych przemiany materii, które tworzą specyficzne rodzaje uszkodzeń DNA. Czynniki genotoksyczne mogą uszkadzać szkielet DNA, łamać go lub modyfikować charakter chemiczny poszczególnych zasad. Po uszkodzeniu DNA aktywowane są szlaki odpowiedzi na uszkodzenie DNA (DDR) i rekrutowane są białka zaangażowane w naprawę. Na wyczuwanie rodzaju uszkodzenia i aktywowanie odpowiedniej reakcji naprawczej zaangażowanych jest wiele czynników. Brak prawidłowej aktywacji i rekrutacji czynników DDR może prowadzić do niestabilności genomu, która leży u podstaw wielu patologii u ludzi, w tym raka. Badania białek DDR mogą dostarczyć informacji na temat genotoksycznej odpowiedzi na leki i komórkowych mechanizmów oporności na leki.
Istnieją dwa główne sposoby wizualizacji białek in vivo: bezpośrednia obserwacja, poprzez oznaczanie interesującego białka białkiem fluorescencyjnym i śledzenie go za pomocą obrazowania na żywo, lub pośrednia immunofluorescencja na ustalonych próbkach. Podczas gdy wizualizacja białek znakowanych fluorescencyjnie umożliwia precyzyjne monitorowanie w czasie, bezpośrednie znakowanie na końcu N lub C może zakłócać lokalizację lub funkcję białka. Preferowana jest obserwacja białek w ich niezmodyfikowanej, endogennej wersji. Kiedy białka naprawy DNA są rekrutowane do uszkodzenia DNA, ich stężenie wzrasta lokalnie i tworzą grupy lub "ogniska", które można uwidocznić za pomocą pośredniej immunofluorescencji przy użyciu specyficznych przeciwciał.
Chociaż wykrycie ognisk białkowych nie dostarcza ostatecznego dowodu na bezpośrednią interakcję, kolokalizacja białek w komórkach wskazuje, że przegrupowują się one do miejsca uszkodzenia i mogą informować o sekwencji zdarzeń wymaganych do tworzenia kompleksu. Dokładna analiza nakładania się przestrzennego ognisk w komórkach wykazujących ekspresję dzikich lub zmutowanych wersji białka może dostarczyć cennych wskazówek na temat domen funkcjonalnych ważnych dla funkcji naprawy DNA. Wreszcie, kolokalizacja białek wskazuje na możliwe bezpośrednie interakcje, które można zweryfikować przez koimmunoprecypitację w komórkach lub bezpośrednie ściąganie przy użyciu oczyszczonych białek.

W drugim dniu, czyli 24 h po wysianiu komórek na szkiełka nakrywki, komórki przechodzą jeden podział i osiągają 80% konfluencji. Specyficzne wyciszenia (knock-down) lub mutacje w białkach naprawy DNA mogą wydłużyć czas podwojenia lub zwiększyć wrażliwość komórek na działanie genotoksyczne, dlatego gęstość wysiewu oraz dawki traktowania powinny zostać odpowiednio dostosowane. Aby określić optymalne warunki pracy, przebieg odpowiedzi na uszkodzenia DNA w czasie można ustalić za pomocą Western blottingu białka γH2AX, a wraż...

Po uszkodzeniu DNA, ludzkie komórki aktywują niezbędne szlaki naprawcze, aby przywrócić integralność swojego genomu. W tym miejscu opisujemy metodę immunofluorescencji pośredniej jako sposób na wykrycie białek naprawy DNA, analizę ich przestrzennej i czasowej rekrutacji oraz pomoc w badaniu interakcji białko-białko w miejscach uszkodzenia DNA.

Wizualizacja oddziaływania białek naprawy DNA za pomocą immunofluorescencji

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA ...

Immunofluorescencja pośrednia umożliwia wykrycie białek naprawczych DNA, zdjęć rekrutacji przestrzennej i czasowej oraz pomaga w badaniu interakcji białkobiałkowych w miejscu uszkodzenia DNA. Po uszkodzeniu DNA białka naprawcze DNA są rekrutowane do uszkodzenia DNA, podczas gdy ich stężenie wzrasta lokalnie i tworzą grupy zwane ogniskami, które można uwidocznić za pomocą pośredniej immunofluorescencji na utrwalonych próbkach. Technika ta może być wykorzystana do wykrywania ognisk białkowych, a także do ilościowego określenia kolokalizacji obecnych w komórkach.Może to pomóc w wyjaśnieniu sekwencji zdarzeń wymaganych do tworzenia kompleksów i naprawy DNA. Z takich eksperymentów można wynikać z określonych interakcji białkowo-białkowych. Procedurę zademonstruje Barbara De La Pena, bardzo utalentowana doktor habilitowany Zdjęcie z mojego laboratorium Zacznij od wyhodowania 40 000 komórek HeLa w każdej studni na ponad 12-dołkowej płytce z 18-milimetrowym okrągłym szklanym szkiełkiem nakrywkowym do 80% konfluencji.Po wystawieniu komórek na działanie czterech szarych promieni gamma, umyj je dwukrotnie jednym mililitrem PBS. Następnie całkowicie usuń PBS i dodaj 200 mikrolitrów NDB do każdej studzienki. Inkubować komórki przez dwie minuty w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć NDB.Należy pamiętać, że czas inkubacji może się różnić w zależności od linii komórkowej, ale generalnie nie powinien przekraczać dwóch minut. Umyj komórki jednym mililitrem PBS. Następnie całkowicie usuń PBS i dodaj 200 mikrolitrów 4% PFA do każdej studzienki w celu utrwalenia komórek.Inkubuj komórki przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie usuń PFA i dodaj jeden mililitr PBS do każdej studzienki. Całkowicie usunąć PBS, a następnie dodać 200 mikrolitrów roztworu blokującego do każdej studzienki i inkubować komórki przez dwie godziny w temperaturze pokojowej lub 16 do 18 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Rozcieńczyć przeciwciało pierwotne i bufor rozcieńczający i wirować je, aż dobrze wymieszają się w pojemniku na wilgoć, a tutaj kawałek parafilmu i dodać 10 mikrolitrów przeciwciała pierwszorzędowego w jednej kropli. Wyrównaj jedną krawędź szkiełka nakrywkowego ze studzienki z kroplą i powoli opuść ją na parafilm, rozprowadzając płyn. Inkubować szkiełko nakrywkowe przez dwie godziny w temperaturze pokojowej.Po inkubacji przemyć szkiełko nakrywkowe trzy razy w PBS przez jedną minutę na przemycie. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe i bufor rozcieńczający i wirować je aż do dobrego wymieszania, nałożyć 10 mikrolitrów przeciwciała drugorzędowego na każde szkiełko nakrywkowe, jak opisano poprzednio, i inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy PBS i raz wodą przez jedną minutę na pranie.Następnie zamontuj je na szkiełkach z nośnikiem montażowym na bazie glicerolu zawierającym szkiełka nakrywkowe DAPI z przezroczystym lakierem do paznokci i pozostaw do wyschnięcia na 20 minut. Umieść kroplę olejku immersyjnego na soczewce obiektywu 60 x i użyj DAPI, aby zlokalizować jądra przez okular w celu akwizycji obrazu XYZ, otwórz oprogramowanie do akwizycji i ustaw typ skanera jako galvano, typ skanera jako podróż w obie strony i rozmiar obrazu 512 na 512. W panelu PMT ustaw tryb na VBM uśredniony do klatki i sekwencyjne skanowanie do linii.Następnie ustaw detektory barwnika i ciepła, ustaw kanał pierwszy na DAPI i SD jeden, kanał drugi na alexafluor 488 i HSD trzy, a kanał trzeci na alexafluor na 647 i HSD cztery wybierz włączone, aby Z.To dostosować obraz na żywo, naciśnij przycisk na żywo w oknie na żywo i dostosuj ostrość. Następnie użyj okna narzędzi PMT, aby ustawić czułość intensywności lasera, wzmocnienie i przesunięcie W przypadku stosów z wybierz początek do końca i 15 plasterków. Wybierz folder, w którym chcesz zapisać obrazy i naciśnij przycisk Start LSM, aby rozpocząć pobieranie.Po zakończeniu naciśnij przycisk zakończenia serii, aby zakończyć akwizycję obrazu. Otwórz oprogramowanie do analizy, a następnie naciśnij okno narzędzia wsadowego i wybierz obrazy do analizy. Przejdź do okna narzędzia analizy i wybierz projekcję, która wyświetli projekcję maksymalnej intensywności z 15 wycinków.W obszarze ustawienia danych wejściowych i wyjściowych wybierz utworzony folder wsadowy i wyjściowy. Naciśnij przycisk proces, aby obrazy zostały przetworzone i wyeksportuj obrazy jako pliki TIFF. Przeprowadzić kwantyfikację jądrową za pomocą cellprofilera zgodnie ze wskazówkami manuskryptu.Ogniwa, które nie zostały poddane działaniu promieniowania, wykazują bardzo mało znaków ekspozycji gamma H2AX. W przypadku braku niezbędnych białek naprawczych DNA, akumulację gamma H2AX można zaobserwować przy przerwach DNA. Nagromadzenie nienaprawionych pęknięć może prowadzić do tego, że komórki stają się prehipotoniczne, na co wskazują stałe jądra gamma H2AX.Po napromieniowaniu jądra wykazują dużą liczbę dwuniciowych pęknięć, do których lokalizacja gamma H2AX jest niezwykle szybka. Podczas gdy niewiele, jeśli w ogóle, ognisk obserwuje się przy braku promieniowania, liczbę ognisk określono ilościowo po pierwszej, dwóch, czterech i 16 godzinach po promieniowaniu oraz dla kontroli promieniowania NOA. W zależności od postawionego pytania biologicznego i rodzaju wymaganych danych, należy rozważyć różne opcje kreślenia Kolokalizację można badać poprzez multipleksowanie przeciwciał pierwszorzędowych wyhodowanych u różnych gatunków zwierząt i użycie przeciwciał drugorzędowych, znakowanych odrębnymi fluoroforami.Superpozycja koloru zielonego i czerwonego powoduje powstawanie żółtych hotspotów, w których dwa interesujące białka są obecne w tych samych pikselach. Ilościową analizę kolokalizacji można przeprowadzić za pomocą podejścia obiektowego lub podejścia statystycznego, które przeprowadza analizy oparte na współczynnikach korelacji intensywności. W tym protokole można zastosować kombinację przeciwciał pierwotnych wyhodowanych u różnych gatunków zwierząt.Upewnij się, że przeciwciała są kompatybilne i nie będą ze sobą kolidować. Należy odpowiednio ustawić przeciwciało drugorzędowe, które ma być użyte przeciwko każdemu z przeciwciał pierwszorzędowych i wziąć pod uwagę szczególne nakładanie się widma przy wyborze mniejszej siły, która ma być użyta. Kolokalizacja lub białka wskazują na możliwe bezpośrednie interakcje.Można to zweryfikować poprzez granulowane wytrącanie w komórkach lub bezpośrednie usuwanie przy użyciu oczyszczonych białek in vitro.

visualization-of-dna-repair-proteins-interaction-by-immunofluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W tym filmie opisujemy metodę immunofluorescencji, aby zobrazować lokalizację białek naprawy DNA γH2AX i 53BP1 w miejscach pęknięć dwuniciowego DNA w napromieniowanych jądrach komórkowych.

Oparta na immunofluorescencji wizualizacja interakcji białek naprawy DNA

W tym filmie opisujemy technikę mikroskopii immunofluorescencyjnej do wykrywania specyficznych białek odpowiedzi na uszkodzenia DNA zlokalizowanych w miejscach pęknięć dwuniciowych DNA w ludzkich komórkach jednojądrzastych. Białka są rozpoznawane przez specyficzne przeciwciała pierwszorzędowe, które z kolei wiążą się z przeciwciałami drugorzędowymi znakowanymi fluoroforem, które fluoryzują podczas wizualizacji mikroskopowej, umożliwiając wizualizację białek jako odrębnych ognisk...

Mikroskopia immunofluorescencyjna do analizy pęknięć dwuniciowych DNA

Obrazowanie spektroskopowe elektronów może obrazować i odróżniać kwas nukleinowy od białka z rozdzielczością nanometrów. Można go połączyć z systemem miniSOG, który jest w stanie specyficznie znakować znakowane białka w próbkach z transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Zastosowanie tych technologii ilustrujemy na przykładzie dwuniciowych ognisk naprawy pęknięć.

Wizualizacja białek naprawczych DNA oznaczonych tagami miniSOG w połączeniu z obrazowaniem spektroskopowym elektronów (ESI)

Tutaj pokazano, jak test ligacji zbliżeniowej in situ (PLA) może być wykorzystany do wykrywania i wizualizacji bezpośrednich interakcji białko-białko między ATM i p53 w hodowlach komórek zawiesinowych narażonych na stres genotoksyczny.

Wykrywanie i wizualizacja kompleksów białkowych indukowanych uszkodzeniem DNA w hodowlach komórek zawiesinowych za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Mikronaświetlanie laserowe jest użytecznym narzędziem do badań nad naprawą DNA w żywych komórkach. Przedstawiono metodologiczne podejście do stosowania laserów UVA do wywoływania różnych zmian w DNA. Zoptymalizowaliśmy metodę miejscowego mikronapromieniowania, która utrzymuje normalny cykl komórkowy; W ten sposób napromieniowane komórki przechodzą przez mitozę.

Zaawansowane techniki mikroskopii konfokalnej do badania interakcji białko-białko i kinetyki zmian w DNA

Ten manuskrypt zawiera protokół do analizy pęknięć dwuniciowych DNA za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej γH2AX i 53BP1.

Mikroskopia immunofluorescencyjna γH2AX i 53BP1 do analizy powstawania i naprawy pęknięć dwuniciowych DNA

Badanie kinetyki naprawy uszkodzeń DNA wymaga systemu do wywoływania uszkodzeń w określonych regionach subjądrowych. Opisujemy metodę tworzenia zlokalizowanych dwuniciowych pęknięć za pomocą laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w laser 405 nm i zapewniamy zautomatyzowane procedury ilościowego określania dynamiki czynników naprawczych w tych zmianach.

Badanie rekrutacji białek do zmian DNA za pomocą mikropromieniowania laserowego 405 nm

Naprawa pęknięć dwuniciowego DNA jest procesem dynamicznym, wymagającym nie tylko tworzenia kompleksów naprawczych w miejscach pęknięć, ale także ich rozwiązania po usunięciu zmiany. W tym przypadku używamy mikroskopii immunofluorescencyjnej do przejściowych i długotrwałych pęknięć dwuniciowych jako narzędzia do analizy tego mechanizmu utrzymania genomu.

Charakterystyka procesów naprawy DNA przy przejściowych i długotrwałych pęknięciach dwuniciowego DNA za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej

Reakcja na uszkodzenia DNA wywołana promieniowaniem, aktywowana przez wiązkę neutronów używaną w terapii wychwytywania neutronów borowych (BNCT), nie została w pełni ustalona. Protokół ten zapewnia procedurę krok po kroku do wykrywania ognisk indukowanych promieniowaniem (RIF) białek naprawczych poprzez barwienie immunofluorescencyjne w liniach komórkowych ludzkiego raka jelita grubego po napromieniowaniu wiązką zmieszaną z neutronami.

Obrazowanie immunofluorescencyjne uszkodzeń DNA i ognisk naprawczych w ludzkich komórkach raka jelita grubego

Obecny protokół opisuje metody oceny białek naprawiających uszkodzenia DNA w organoidach raka jajnika pochodzących od pacjentek. Obejmuje to kompleksowe metody galwanizacji i barwienia, a także szczegółowe, obiektywne procedury kwantyfikacji.

Wizualizacja białek naprawiających uszkodzenia DNA w organoidach raka jajnika pochodzących od pacjentki za pomocą testów immunofluorescencyjnych

Poniższy protokół przedstawia wykrywanie jednoniciowych ognisk DNA w fazie G1 cyklu komórkowego za pomocą synchronizacji cyklu komórkowego, a następnie barwienia immunofluorescencyjnego RPA2.

Wizualizacja ognisk jednoniciowego DNA w fazie G1 cyklu komórkowego

Poznaj metodę immunofluorescencji pośredniej do wizualizacji białek naprawy DNA w komórkach HeLa. Technika ta pozwala analizować rekrutację przestrzenną i czasową białek oraz ich kolokalizację w miejscach uszkodzeń DNA.

Wizualizacja oddziaływania białek naprawy DNA za pomocą immunofluorescencji

Przeglądaj więcej filmów