Wizualizacja oddziaływania białek naprawy DNA za pomocą immunofluorescencji

Immunofluorescencja pośrednia umożliwia wykrycie białek naprawczych DNA, zdjęć rekrutacji przestrzennej i czasowej oraz pomaga w badaniu interakcji białkobiałkowych w miejscu uszkodzenia DNA. Po uszkodzeniu DNA białka naprawcze DNA są rekrutowane do uszkodzenia DNA, podczas gdy ich stężenie wzrasta lokalnie i tworzą grupy zwane ogniskami, które można uwidocznić za pomocą pośredniej immunofluorescencji na utrwalonych próbkach. Technika ta może być wykorzystana do wykrywania ognisk białkowych, a także do ilościowego określenia kolokalizacji obecnych w komórkach.

Może to pomóc w wyjaśnieniu sekwencji zdarzeń wymaganych do tworzenia kompleksów i naprawy DNA. Z takich eksperymentów można wynikać z określonych interakcji białkowo-białkowych. Procedurę zademonstruje Barbara De La Pena, bardzo utalentowana doktor habilitowany Zdjęcie z mojego laboratorium Zacznij od wyhodowania 40 000 komórek HeLa w każdej studni na ponad 12-dołkowej płytce z 18-milimetrowym okrągłym szklanym szkiełkiem nakrywkowym do 80% konfluencji.

Po wystawieniu komórek na działanie czterech szarych promieni gamma, umyj je dwukrotnie jednym mililitrem PBS. Następnie całkowicie usuń PBS i dodaj 200 mikrolitrów NDB do każdej studzienki. Inkubować komórki przez dwie minuty w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć NDB.

Należy pamiętać, że czas inkubacji może się różnić w zależności od linii komórkowej, ale generalnie nie powinien przekraczać dwóch minut. Umyj komórki jednym mililitrem PBS. Następnie całkowicie usuń PBS i dodaj 200 mikrolitrów 4% PFA do każdej studzienki w celu utrwalenia komórek.

Inkubuj komórki przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie usuń PFA i dodaj jeden mililitr PBS do każdej studzienki. Całkowicie usunąć PBS, a następnie dodać 200 mikrolitrów roztworu blokującego do każdej studzienki i inkubować komórki przez dwie godziny w temperaturze pokojowej lub 16 do 18 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Rozcieńczyć przeciwciało pierwotne i bufor rozcieńczający i wirować je, aż dobrze wymieszają się w pojemniku na wilgoć, a tutaj kawałek parafilmu i dodać 10 mikrolitrów przeciwciała pierwszorzędowego w jednej kropli. Wyrównaj jedną krawędź szkiełka nakrywkowego ze studzienki z kroplą i powoli opuść ją na parafilm, rozprowadzając płyn. Inkubować szkiełko nakrywkowe przez dwie godziny w temperaturze pokojowej.

Po inkubacji przemyć szkiełko nakrywkowe trzy razy w PBS przez jedną minutę na przemycie. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe i bufor rozcieńczający i wirować je aż do dobrego wymieszania, nałożyć 10 mikrolitrów przeciwciała drugorzędowego na każde szkiełko nakrywkowe, jak opisano poprzednio, i inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy PBS i raz wodą przez jedną minutę na pranie.

Następnie zamontuj je na szkiełkach z nośnikiem montażowym na bazie glicerolu zawierającym szkiełka nakrywkowe DAPI z przezroczystym lakierem do paznokci i pozostaw do wyschnięcia na 20 minut. Umieść kroplę olejku immersyjnego na soczewce obiektywu 60 x i użyj DAPI, aby zlokalizować jądra przez okular w celu akwizycji obrazu XYZ, otwórz oprogramowanie do akwizycji i ustaw typ skanera jako galvano, typ skanera jako podróż w obie strony i rozmiar obrazu 512 na 512. W panelu PMT ustaw tryb na VBM uśredniony do klatki i sekwencyjne skanowanie do linii.

Następnie ustaw detektory barwnika i ciepła, ustaw kanał pierwszy na DAPI i SD jeden, kanał drugi na alexafluor 488 i HSD trzy, a kanał trzeci na alexafluor na 647 i HSD cztery wybierz włączone, aby Z.To dostosować obraz na żywo, naciśnij przycisk na żywo w oknie na żywo i dostosuj ostrość. Następnie użyj okna narzędzi PMT, aby ustawić czułość intensywności lasera, wzmocnienie i przesunięcie W przypadku stosów z wybierz początek do końca i 15 plasterków. Wybierz folder, w którym chcesz zapisać obrazy i naciśnij przycisk Start LSM, aby rozpocząć pobieranie.

Po zakończeniu naciśnij przycisk zakończenia serii, aby zakończyć akwizycję obrazu. Otwórz oprogramowanie do analizy, a następnie naciśnij okno narzędzia wsadowego i wybierz obrazy do analizy. Przejdź do okna narzędzia analizy i wybierz projekcję, która wyświetli projekcję maksymalnej intensywności z 15 wycinków.

W obszarze ustawienia danych wejściowych i wyjściowych wybierz utworzony folder wsadowy i wyjściowy. Naciśnij przycisk proces, aby obrazy zostały przetworzone i wyeksportuj obrazy jako pliki TIFF. Przeprowadzić kwantyfikację jądrową za pomocą cellprofilera zgodnie ze wskazówkami manuskryptu.

Ogniwa, które nie zostały poddane działaniu promieniowania, wykazują bardzo mało znaków ekspozycji gamma H2AX. W przypadku braku niezbędnych białek naprawczych DNA, akumulację gamma H2AX można zaobserwować przy przerwach DNA. Nagromadzenie nienaprawionych pęknięć może prowadzić do tego, że komórki stają się prehipotoniczne, na co wskazują stałe jądra gamma H2AX.

Po napromieniowaniu jądra wykazują dużą liczbę dwuniciowych pęknięć, do których lokalizacja gamma H2AX jest niezwykle szybka. Podczas gdy niewiele, jeśli w ogóle, ognisk obserwuje się przy braku promieniowania, liczbę ognisk określono ilościowo po pierwszej, dwóch, czterech i 16 godzinach po promieniowaniu oraz dla kontroli promieniowania NOA. W zależności od postawionego pytania biologicznego i rodzaju wymaganych danych, należy rozważyć różne opcje kreślenia Kolokalizację można badać poprzez multipleksowanie przeciwciał pierwszorzędowych wyhodowanych u różnych gatunków zwierząt i użycie przeciwciał drugorzędowych, znakowanych odrębnymi fluoroforami.

Superpozycja koloru zielonego i czerwonego powoduje powstawanie żółtych hotspotów, w których dwa interesujące białka są obecne w tych samych pikselach. Ilościową analizę kolokalizacji można przeprowadzić za pomocą podejścia obiektowego lub podejścia statystycznego, które przeprowadza analizy oparte na współczynnikach korelacji intensywności. W tym protokole można zastosować kombinację przeciwciał pierwotnych wyhodowanych u różnych gatunków zwierząt.

Upewnij się, że przeciwciała są kompatybilne i nie będą ze sobą kolidować. Należy odpowiednio ustawić przeciwciało drugorzędowe, które ma być użyte przeciwko każdemu z przeciwciał pierwszorzędowych i wziąć pod uwagę szczególne nakładanie się widma przy wyborze mniejszej siły, która ma być użyta. Kolokalizacja lub białka wskazują na możliwe bezpośrednie interakcje.

Można to zweryfikować poprzez granulowane wytrącanie w komórkach lub bezpośrednie usuwanie przy użyciu oczyszczonych białek in vitro.