Name: Kultura i analiza populacji dużoskalowych o mieszanym stadium Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Poznaj metodę hodowli dużych populacji Caenorhabditis elegans na dużych płytkach kulturowych do badań omicznych. Technika ta umożliwia minimalną manipulację próbkami i wspiera kompleksowe analizy wielopoziomowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom Edison Lab za pomocne dyskusje i opinie dotyczące tego manuskryptu; w szczególności B.M. Garcię. Niektóre szczepy zostały dostarczone przez CGC, finansowane przez NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440), oraz CeNDR, które jest finansowane przez NSF Living Collections CSBR 1930382. Prace te były wspierane grantem od NIH (U2CES030167).

<ol><li>Félix, M. A., Braendle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+natural+history+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The natural history of Caenorhabditis elegans.</a> Current Biology. 20 (22), 965-969 (2010).</li>
<li>Corsi, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transparent+window+into+biology%3A+A+primer+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. , 1-31 (2015).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22British+Medical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">The genetics of behaviour.</a> British Medical Bulletin. 29 (3), 269-271 (1973).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19649/ (2006).</li>
<li>Xiong, H., Pears, C., Woollard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+C.+elegans+based+platform+for+toxicity+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An enhanced C. elegans based platform for toxicity assessment.</a> Scientific Reports. 7 (1), 9839(2017).</li>
<li>Loer, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cuticle+integrity+and+biogenic+amine+synthesis+in+Caenorhabditis+elegans+require+the+cofactor+tetrahydrobiopterin+%28BH4%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Cuticle integrity and biogenic amine synthesis in Caenorhabditis elegans require the cofactor tetrahydrobiopterin (BH4).</a> Genetics. 200 (1), 237-253 (2015).</li>
<li>Li, Y., Paik, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+potential+role+for+fatty+acid+biosynthesis+genes+during+molting+and+cuticle+formation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Reports%22%5BJournal%5D)">A potential role for fatty acid biosynthesis genes during molting and cuticle formation in Caenorhabditis elegans.</a> BMB Reports. 44 (4), 285-290 (2011).</li>
<li>Meli, V. S., Osuna, B., Ruvkun, G., Frand, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLT-10+Defines+a+Family+of+DUF644+and+Proline-rich+Repeat+Proteins+Involved+in+the+Molting+Cycle+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">MLT-10 Defines a Family of DUF644 and Proline-rich Repeat Proteins Involved in the Molting Cycle of Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Biology of the Cell. 21 (10), 1648-1661 (2010).</li>
<li>Fritz, J. A., Behm, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUTI-1%3A+A+novel+tetraspan+protein+involved+in+C.+elegans+CUTicle+formation+and+epithelial+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">CUTI-1: A novel tetraspan protein involved in C. elegans CUTicle formation and epithelial integrity.</a> PloS One. 4 (4), 5117(2009).</li>
<li>Golden, J., Riddle, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pheromone+influences+larval+development+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A pheromone influences larval development in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Science. 218 (4572), 578-580 (1982).</li>
<li>Jeong, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+structure+and+biological+activity+of+the+Caenorhabditis+elegans+dauer-inducing+pheromone%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemical structure and biological activity of the Caenorhabditis elegans dauer-inducing pheromone.</a> Nature. 433 (7025), 541-545 (2005).</li>
<li>Srinivasan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+blend+of+small+molecules+regulates+both+mating+and+development+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).</li>
<li>Kaplan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascaroside+Expression+in+Caenorhabditis+elegans+Is+Strongly+Dependent+on+Diet+and+Developmental+Stage%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Ascaroside Expression in Caenorhabditis elegans Is Strongly Dependent on Diet and Developmental Stage.</a> PLoS One. 6 (3), 17804(2011).</li>
<li>Golden, J., Riddle, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pheromone+influences+larval+development+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A pheromone influences larval development in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Science. 218 (4572), 578-580 (1982).</li>
<li>Çelen, İ, Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+liquid+cultivation+on+gene+expression+and+phenotype+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans.</a> BMC Genomics. 19 (1), 562(2018).</li>
<li>Andersen, E. C., Bloom, J. S., Gerke, J. P., Kruglyak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Variant+in+the+Neuropeptide+Receptor+npr-1+is+a+Major+Determinant+of+Caenorhabditis+elegans+Growth+and+Physiology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A Variant in the Neuropeptide Receptor npr-1 is a Major Determinant of Caenorhabditis elegans Growth and Physiology.</a> PLoS Genetics. 10 (2), 1004156(2014).</li>
<li>Rosenblatt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+central+limit+theorem+and+a+strong+mixing+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A central limit theorem and a strong mixing condition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 42 (1), 43-47 (1956).</li>
<li>Boyd, W. A., Smith, M. V., Freedman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+a+model+in+developmental+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as a model in developmental toxicology.</a> Methods in Molecular Biology. 889, 15-24 (2012).</li>
<li>Nika, L., Gibson, T., Konkus, R., Karp, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Beads+Are+a+Versatile+Tool+for+Staging+Caenorhabditis+elegans+in+Different+Life+Histories%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Genomes%2C+Genetics%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Beads Are a Versatile Tool for Staging Caenorhabditis elegans in Different Life Histories.</a> Genes, Genomes, Genetics. 6 (7), 1923-1933 (2016).</li>
<li>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html">http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html</a> (2020).</li>
<li>Denver, D. R., Morris, K., Streelman, J. T., Kim, S. K., Lynch, M., Thomas, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+consequences+of+mutation+and+natural+selection+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The transcriptional consequences of mutation and natural selection in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Genetics. 37 (5), 544-548 (2005).</li>
<li>Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+the+metabolic+inhibitor+sodium+azide+induces+stress+protein+expression+and+thermotolerance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stress+%26+Chaperones%22%5BJournal%5D)">Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Cell Stress & Chaperones. 8 (1), 1-7 (2003).</li>
<li>Kevin, S., Pulak, R. Techniques for Analysis, Sorting, and Dispensing of C. elegans on the COPAS Flow-Sorting System. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKevin%2C+S+%22C.+elegans.+Methods+in+Molecular+Biology%22">C. elegans. Methods in Molecular Biology</a>. Strange, K. 351, Humana Press. 275-286 (2006).</li>
<li>Lee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+and+gene+flow+shape+niche-associated+variation+in+pheromone+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Ecology+%26+Evolution%22%5BJournal%5D)">Selection and gene flow shape niche-associated variation in pheromone response.</a> Nature Ecology & Evolution. 3 (10), 1455-1463 (2019).</li>
<li>Cook, D. E., Zdraljevic, S., Roberts, J. P., Andersen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CeNDR%2C+the+Caenorhabditis+elegans+natural+diversity+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CeNDR, the Caenorhabditis elegans natural diversity resource.</a> Nucleic Acids Research. 45, 650-657 (2016).</li>
<li>Nika, L., Gibson, T., Konkus, R., Karp, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Beads+Are+a+Versatile+Tool+for+Staging+Caenorhabditis+elegans+in+Different+Life+Histories%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Genomes%2C+Genetics%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Beads Are a Versatile Tool for Staging Caenorhabditis elegans in Different Life Histories.</a> Genes, Genomes, Genetics. 6 (7), 1923-1933 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Jako LSCP można używać różnych naczyń. W tym protokole używano standardowej szklanej formy do pieczenia. Używane LSPC miały wymiary zewnętrzne 35,56 x 20,32 cm, wewnętrzne 27,94 x 17,78 cm oraz około 4,45 cm głębokości i wyposażone w pokrywę z zamocowaną pokrywą. W związku z tym ilość bakterii użytych tutaj została zoptymalizowana dla LSCP o powyższych wymiarach, aby uzyskać dużą populację robaków o mieszanym stadium. Objętość i stężenie bakterii można dostosować do potrzeb eksperymentalnych.
Zanieczyszczenie pleśnią, grzybami lub innymi źródłami bakteryjnymi może wystąpić na każdym etapie metody LSCP, dlatego należy obchodzić się z próbkami z ostrożnością. Przed rozpoczęciem jakiegokolwiek etapu protokołu upewnij się, że przestrzeń robocza jest oczyszczona 70% etanolem i 10% wybielaczem. Jeśli jest to możliwe, potraktuj używane miejsca światłem UV przez 30 minut i włącz filtr HEPA 30 minut przed rozpoczęciem każdego kroku.
Uprawiając LSCP w kontrolowanych warunkach (czyli w pomieszczeniu CT ustawionym na 20 °C), użytkownik może łatwiej śledzić wzrost próbki i dokumentować potencjalne skażenie. Jeśli powierzchnia LSCP ulega skażeniu, albo wytnij zanieczyszczenie, gdy to możliwe, i pozwól próbce dalej rosnąć, albo wyrzuć ją, jeśli nie da się kontrolować skażenia. Konieczne jest szybkie zwalczanie skażeń, aby ograniczyć niepożądany wzrost i upewnić się, że nie wypiera ono robaków o zasoby.
Ta metoda jest przeznaczona dla tych, którzy chcą uprawiać na dużą skalę kultury mieszanej populacji C. elegans. Chociaż możliwe jest hodowanie zsynchronizowanych populacji robaków na LSCP, tak jak na komercyjnie dostępnych szalkach Petriego i w ciekłej kulturze, autorzy nie testowali tej opcji. Dodatkowo, jeśli użytkownicy chcą wyhodować średnio ponad około 2,4 miliona robaków w danej próbie, zaleca się inną metodę4. Sukces wzrostu zależy od rodzaju szczepu przetwarzanego w rurociągu. Autorzy zdołali z powodzeniem wyhodować populacje około 2,4 miliona robaków w co najmniej pięciu biologicznych replikacjach 15 szczepów C. elegans , co wskazuje, że metoda ta jest solidna.
Przed rozpoczęciem eksperymentu należy zauważyć, że wiek i stan zdrowia danego robaka mogą wpływać na płodność i czas wzrostu populacji. Upewnij się, że robaki są utrzymywane w zdrowych warunkach i minimalnym stresie przed użyciem w tym rurociągu. Zakłada się, że próbki stocku zostały stworzone, zamrożone i przechowywane w temperaturze -80 °C, aby zmniejszyć dryf genetyczny w czasie.
W zależności od potrzeb danego eksperymentu, liczba dorosłych dorosłych na LSCP może się zmieniać. Zmiana liczby dorosłych osobników na LSCP w stanie początkowym wpłynąć na tempo wzrostu, a tym samym czas na podział. Do nasienia każdego LSCP używa się pięciu grawidnych dorosłych osobników z następujących powodów: (1) potrzebny był prosty, szybki i efektywny sposób na jednoczesne zasiewanie wielu szczepów C. elegans na LSCP oraz (2) zmniejszenie różnic wieku między wyselekcjonowanymi dorosłymi, które mogłyby prowadzić do heterogeniczności wzrostu.
Ta metoda pozwala użytkownikowi na zbieranie dużych populacji robaków przy obecności wszystkich etapów cyklu życia. Przy obecnych dostępnych metodach pobieranie dużych próbek C. elegans wymaga synchronizacji wybielacza, aby uzyskać pożądaną liczbę robaków do dalszych prac. Dzięki temu podejściu można teraz hodować tyle robaków, ile było to możliwe wcześniej w fermentorach lub dużych kulturach cieczy, bez trudności związanych z synchronizacją wybielacza i wieloma etapami obróbki. Nasz protokół pozwala efektywnie celować w interesujące szczepy, poświęcać minimalny czas obsługi na wzrost samej próbki oraz izolować stadia robaków lub populacji w razie potrzeby w potokach downstream.
LPFC był wykorzystywany jako narzędzie do dokumentowania rozkładu i wielkości populacji w danym LSCP. Używany LPFC to system ciągłego przepływu, który analizuje, sortuje i rozsypuje robaki na podstawie ich rozmiaru (TOF) i gęstości optycznej. Gdy dany robak przechodzi przez komórkę przepływową, osiowy detektor strat światła rejestruje ilość światła sygnałowego blokowanego przez laser półprzewodnikowy o średnicy 488 nm na czas przejścia przez ni, dając użytkownikowi poziom TOF oraz gęstość optyczną robaka. Optyka i detektory zbierania fluorescencji mogą być również wykorzystywane do maksymalizacji czułości i zbierania fluorescencji na każdej próbce. Parametry zbioru LPFC będą się różnić w zależności od instrumentu. Użytkownicy mogą korzystać z różnych platform do rejestrowania rozmiaru robaka i nie są ograniczeni do korzystania z tego protokołu, jeśli LPFC nie jest dostępny.
Autorzy wykorzystują próbki hodowane metodą opisaną tutaj, aby zidentyfikować nieznane metabolity w różnych szczepach C. elegans za pomocą chromatografii cieczowej – spektrometrii mas, spektroskopii NMR oraz sekwencjonowania RNA. Autorzy planują kontynuować stosowanie tej metody do hodowli próbek w tym potoku z różnymi szczepami C. elegans , ponieważ nowe interesujące szczepy można łatwo przetwarzać za pomocą tego potoku.

C. elegans to mały, wolno żyjący nicieniec, występujący na całym świecie w różnorodnychnaturalnych siedliskach. Jego względna łatwość wzrostu, szybki czas generowania, system rozrodczy i przezroczyste ciało czynią go potężnym organizmem modelowym, szeroko badanym w biologii rozwoju, starzeniu, neurobiologii i genetyce 2,3. Obszerne badania nad C. elegans czynią go idealnym kandydatem do wykorzystania w badaniach -omiki do kompleksowego powiązania fenotypów ze złożonymi komponentami biologicznymi i ich relacjami w danym organizmie.
Aby wykorzystać C. elegans w badaniach współpracujących -omics, potrzebna jest metoda generowania dużych populacji zwierząt w mieszanym stadium, gdzie pojedyncza próba może być podzielona i wykorzystana na różnych platformach i instrumentach do analiz porównawczych. Stworzenie potoku do wygenerowania takiej próbki wymaga doskonałej świadomości diety, środowiska, stresu, struktury populacji oraz obsługi i zbierania próbek. Dlatego kluczowe jest zintegrowanie standardowych i powtarzalnych warunków hodowlanych w dużych rurociągach. W badaniach C. elegans stosuje się dwie tradycyjne metody hodowli robaków – agarowe szalki Petriego oraz płynną kulturę4.
Historycznie, gdy potrzebne są duże ilości C. elegans, uprawia się je w hodowli płynnej4. Etapy związane z generowaniem dużej populacji robaków w hodowli płynnej wymagają wielu kroków obsługi, które często obejmują synchronizację wybielacza do pęknięcia skórek dorosłych grawidnych dorosłych, uwalnianie zarodków w celu osiągnięcia pożądanej wielkości populacji. Jednak gdy stosuje się synchronizację wybielacza, wzrost populacji zależy od początkowej wielkości spisu, co wpływa na późniejszy wzrost i liczbę ludności. Ponadto szczepy C. elegans różnią się pod względem wrażliwości skórek, czasu ekspozycji oraz reakcji stresowej na synchronizację wybielaczu, co utrudnia badanie wielu szczepów naraz 5,6,7,8,9.
Dodatkowo, wzrost robaków w hodowli płynnej wymaga kilku etapów transferu, ponieważ często zaleca się wyhodowanie tylko jednego pokolenia robaków przed zbiorem, gdyż przeludnienie może łatwo dojść do przeludnienia przy uprawie przez kilka pokoleń i prowadzić do powstawania dauerów mimo obecności pożywienia. Powstawanie dauerów zachodzi poprzez małe cząsteczki sygnalizacyjne, takie jak ascarozydy, często nazywane "feromonami dauera"11,12,13,14, które są uwalniane do płynnego medium i wpływają na wzrost populacji. Ponadto wzrost dużych populacji robaków w hodowli ciekłej prowadzi do nadmiernego gromadzenia się bakterii w hodowli, co utrudnia się, gdy potrzebna jest czysta próbka do dalszych testów fenotypowych. Wreszcie, gdy hodowla płynna ulega skażeniu, trudniej ją utrzymać, ponieważ zarodniki grzybów lub komórki bakteryjne łatwo rozpraszają się w podłożu15.
Drugą tradycyjną metodą uprawy C. elegans są naczynia z agaru Petriego. Dostępne komercyjnie szalki Petriego pozwalają łatwo hodować wiele pokoleń robaków mieszanych bez gwałtownych efektów przeludnienia i wysokiego powstawania dauerów, jak w kulturach ciekłych. Jednak wadą wzrostu robaków na tradycyjnych agarowych szalkach Petriego jest to, że największa komercyjnie dostępna szalka Petriego nie daje dużych populacji dżdżownic w badaniu -omics bez dodania kroku synchronizacji wybielacza. Podsumowując, hodowla populacji mieszanych stadij C. elegans na szalkach Petriego agaru jest bardziej odpowiednia do zbierania danych -omicznych, ale potrzebowaliśmy metody generowania bardzo dużych populacji bez hodowli ciekłą.
Przedstawiamy tutaj metodę hodowli i zbierania dużych populacji C. elegans w mieszanym stadium na płytkach hodowli na dużą skalę (LSCP). Pobieranie próbek w tym procesie daje wystarczającą ilość próbek do zebrania danych fenotypowych i populacyjnych, a także wszelkich danych potrzebnych do eksperymentów -omiki (tj. genomiki, transkryptomiki, proteomiki i metabolomiki). Ponadto metoda LSCP wymaga minimalnej manipulacji zwierzętami, krótszego czasu przygotowania użytkownika, zapewnia ścisłą kontrolę środowiskową oraz zapewnia spójne traktowanie każdej próbki przez cały okres badania, co zapewnia ogólną powtarzalność.

<table><tbody><tr><td>10 mL sterylnych pipet serologicznych</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki pipety 10 ul</td><td>VWR</td><td>89079-438</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki pipety 100 ul</td><td>VWR</td><td>89079-442</td><td></td></tr><tr><td>Cylindr z podziałem 1000 mL</td><td>VWR</td><td>10124-380</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki pipety 1000 ul</td><td>VWR</td><td>89079-488</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe lampy o pojemności 15 mL</td><td>VWR</td><td>89039-668</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 190 proof</td><td>VWR</td><td>89125-166</td><td></td></tr><tr><td>Kolba Erlenmeyera z szerokim szyjką 2 L</td><td>VWR</td><td>75804-654</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe lampy o pojemności 50 mL</td><td>VWR</td><td>75874-294</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td>05040-100G</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539-500G</td><td></td></tr><tr><td>System aspiracji płynu BVC Control G</td><td>Vacuubrand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma</td><td>449709-10G</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma</td><td>C3045-25G</td><td></td></tr><tr><td>Clorox Bleach</td><td>VWR</td><td>89414-502</td><td></td></tr><tr><td>Pokój z kontrolą temperatury Conviron</td><td>Conviron</td><td></td><td>https://www.conviron.com/environmental-rooms</td></tr><tr><td>Corning Low Volume 384 Well Black z przezroczystym płaskim dnem mikropłytą z polistyrenem TC impregnowanym</td><td>VWR</td><td>89089-866</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Accuspin 3R</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytka z płaskim dnem z 24 dołami</td><td>VWR</td><td>29443-952</td><td></td></tr><tr><td>Honeywell True HEPA Purifier 465 stóp kwadratowych.</td><td>Home Depot</td><td>204390560</td><td></td></tr><tr><td>HT115 E. coli (DE3)</td><td>CGC</td><td>HT115(DE3)</td><td>https://cgc.umn.edu/strain/HT115(DE3)</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>VWR</td><td>470224-038</td><td></td></tr><tr><td>Płytka hodowli dużej skali (LSCP)</td><td>Pyrex</td><td>1090948</td><td>Szklana naczynka Pyrex o pojemności 2 litrów z czerwoną pokrywką</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Sigma</td><td>C86677-25G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>VWR</td><td>97062-998</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka proste mikroskopowe</td><td>VWR</td><td>16004-422</td><td></td></tr><tr><td>Filtr miliporowy</td><td>Millipore</td><td>1.11727.2500</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenia molekularne ImageXpress</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Numer modelu: IXMConfocal</td><td>https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/high-content-imaging/imagexpress-micro-confocal#gref , Autorzy używali oprogramowania MetaXpress w wersji 6.5.4.532</td></tr><tr><td>Nystatyna (10mg/mL)</td><td>Sigma</td><td>N6261-25MU</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Sigma</td><td>P7750-100G</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego (6 cm)</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td></td></tr><tr><td>Kontroler pipety</td><td>VWR</td><td>613-4180</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Fisher</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>Monozasada fosforanu potasu</td><td>VWR</td><td>0781-500G</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek potassu</td><td>Fisher</td><td>P250-500</td><td></td></tr><tr><td>Czerwone Mikrosfery Fluroscent</td><td>Nauki polinaukowe</td><td>19507-5</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma</td><td>746398-500G</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Fisher</td><td>111357</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu bezwodny</td><td>Fisher</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Standardowy zestaw pipety Gilsona</td><td>Gilson</td><td>FA10002M, FA10004M, FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycyna (100 mg/mL)</td><td>Sigma</td><td>S6501-25G</td><td></td></tr><tr><td>Union Biometrica COPAS BioSorter</td><td>Union Biometrica</td><td></td><td>https://www.unionbio.com/biosorter/ , autorzy używali: Flow Pilot w wersji 1.6.1.3.</td></tr></tbody></table>

kultura i analiza populacji dużoskalowych o mieszanym stadium caenorhabditis elegans

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Caenorhabditis elegans (C. elegans) był i pozostaje cennym organizmem modelowym do badania biologii rozwojowej, starzenia, neurobiologii i genetyki. Obszerny dorobek badań nad C. elegans czyni go idealnym kandydatem do integracji z badaniami nad dużymi populacjami całego organizmu, aby rozłożyć złożone składniki biologiczne i ich relacje z innym organizmem. Aby wykorzystać C. elegans w badaniach kolaboracyjnych -omics, potrzebna jest metoda generowania dużych populacji zwierząt, gdzie pojedyncza próba może być podzielona i analizowana na różnych platformach do analiz porównawczych.
Przedstawiono tutaj metodę hodowli i zbierania obfitej populacji C. elegans w stadiu mieszanym na dużej skali płyty hodowlanej (LSCP) oraz późniejsze dane fenotypowe. Ten pipeline dostarcza wystarczającą liczbę zwierząt do zbierania danych fenotypowych i populacyjnych, wraz z danymi potrzebnymi do eksperymentów -omiki (tj. genomika, transkryptomika, proteomika i metabolomika). Ponadto metoda LSCP wymaga minimalnej manipulacji samych zwierząt, krótszego czasu przygotowania użytkownika, zapewnia ścisłą kontrolę środowiskową oraz zapewnia spójne traktowanie każdej próbki przez cały czas badania, co zapewnia ogólną powtarzalność. Na koniec przedstawiono metody dokumentowania wielkości populacji i rozkładu populacji stadij życiowych C. elegans w danym LSCP.

Wzrost C. elegans przy użyciu metody LSCP daje średnio około 2,4 miliona robaków mieszanego stadium na próbkę w ciągu 12,2 dnia. Wzrost C. elegans przy użyciu metody LSCP pozwala użytkownikom generować duże populacje C. elegans w mieszanym stadium przy minimalnym manipulowaniu i manipulacji zwierzętami, co jest idealne dla dużych badań -omiki (Rysunek 1). Gdy LSCP jest pełen dorosłych robaków, osiągnie dużą populację i pozostanie minimalna ilość bakterii, użytkownicy mogą zbierać i oszacować wielkość populacji. Ten punkt może również służyć jako kontrola jakości, oceniając, czy populacja jest wystarczająca do wykorzystania w potoku -omics (Rysunek 2). Dynamika populacji zależy od samego szczepu, jego zachowania (np. odmiany kopiące miały tendencję do mniejszej regeneracji robaków) oraz sukcesu wzrostu (czyli zanieczyszczenia). Metoda LSCP została przetestowana na 15 szczepach C. elegans zawierających mieszaninę mutantów Caenorhabditis Genetics Center (CGC) oraz dzikich szczepów Caenorhabditis elegans (CeNDR) z zasobów naturalnych (CeNDR). Genotypy szczepów opisano w Tabeli Uzupełniającej 3.
Metoda LSCP dała liczebność populacji od około 94 500 do 9 290 000. Średnia wielkość populacji w obrębie referencyjnego szczepu PD1074 i między szczepami wynosiła około 2,4 miliona robaków (Rysunek 3). Nie stwierdzono istotnych różnic w szacowanych wielkościach populacji między szczepami C. elegans w średnim okresie średnio 12,2 dni wzrostu LSCP (Rysunek 4). LSCP PD1074 potrzebowały od 10 do 14 dni, aby osiągnąć pełną populację w stadium mieszanym. Średni czas wzrostu PD1074 wynosił 10 dni. Najwolniej rosnący szczep rósł maksymalnie 20 dni, a najszybciej rozwijający się szczep przez minimum 10 dni (Rysunek 4).
Dlatego dzięki tej metodzie LSCP użytkownicy mogą łatwo integrować nowe interesujące się szczepy w badaniu, mając niewielką wiedzę o czasach rozwoju i doświadczeniach z przeszłości. Należy zauważyć, że szczepy i fenotypy, które muszą być utrzymywane przez skubanie, mają wady płodności, są heterozygotyczne lub mają wady wzrostowe, mogą nie działać dobrze w tym procesie.
Cytometria przepływu dużych cząstek oraz obrazowanie próbek pozwalają użytkownikom dokumentować rozkład populacji. Do pomiaru skutecznego wzrostu populacji można wykorzystać szeroką gamę platform.
Dla powtarzalnych pomiarów -omiki ważne jest hodowanie spójnych kultur. Metrykami powtarzalności hodowli są liczba robaków oraz spójny rozkład wielkości dla danego szczepu. Pokazujemy rozkład próbek dla referencyjnego szczepu PD1074 – wariantu oryginalnego szczepu N2 Bristol, wykorzystując obrazy LPFC23,26 oraz mikroskopem mikrokonfokalnym jako wskaźniki sukcesu wzrostu. Ponieważ robaki były mierzone od stadium L1 przez dorosłego osobnika grawidacyjnego według rozkładu LPFC (rysunek 5), późniejszych obrazów (rysunek 6) oraz zmienności w rozmieszczeniu populacji między próbkami (rysunek 7), widać, że ten kanał generował populację C. elegans w mieszanym stadium.
Aby bliżej przyjrzeć się rozkładowi populacji naszych próbek mieszanych stopni, przyjrzeliśmy się rozkładowi 35 PD1074 LSCP, analizując procent robaków znajdujących się w każdym regionie na całym rozkładzie Time of Flight (TOF) (czyli długości ciała) (Rysunek 7A,B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig01.jpg" /> 
Rysunek 1: Przegląd pipeline'u wzrostu robaka LSCP. (A) Po otrzymaniu do laboratorium wszystkie szczepy były przygotowywane i zamrażane do długoterminowego przechowywania w temperaturze -80 °C2. (B) Przygotowywano płytę "master chunk" z zamrożonego materiału robaczkowego i przechowywano w temperaturze 15 °C, aby używać nie dłużej niż miesiąc. (C) Każda próbka przechodziła przez cztery kolejne etapy chunkingu, aby zmniejszyć stres pokoleniowy przed wzrostem na LSCP. (D) 5 osobników grawidnych dorosłych zostało wybranych z płytki "chunk 4" o wymiarach 6 cm w kroku (D) i wybielonych w miejscach na pięciu wybranych obszarach LSCP. (E) LSCP umieszczono w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze i uprawiano w temperaturze 20 °C, aż LSCP wypełniło się dorosłymi robakami, osiągnęło dużą populację i pozostało minimalnie bakterii. (F) Populacja robaków była zbierana i zbierana na etapach w dół rzeki. (G) Aliquoty zostały utworzone z LSCP i zamrażone na bieżąco dla dalszych zastosowań. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig01large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig02.jpg" /> 
Rysunek 2: Przegląd zbiorów LSCP i szacowanie wielkości populacji. (A) 50 mL M9 zostało użytych do zmycia robaków z powierzchni NGMA. Zawieszenie ślimakowe było podłączane do stożkowej rury o pojemności 50 mL. Krok (A) powtarzano dwukrotnie. (B) 15 mL zawieszenia ślimakowego zostało wlane do nowej stożkowej rury o pojemności 15 mL. Robaki były rozpylane przez wirowanie. Odpadki M9+ zostały odciągnięte bez zakłócania granulek robaków. Krok (B) powtarzano, aż zebrano wszystkie 150 ml zawieszenia ślimakowego. (C) Granulat robaka był myty i wirowany trzykrotnie M9, aby wyeliminować pozostałe zanieczyszczenia. Po oczyszczeniu próbki pellet robaka został ponownie zawieszony w 10 mL ddH2O. (D) Przeprowadzono seryjne rozcieńczanie próbki w celu oszacowania wielkości populacji robaków. Wykorzystano czynniki rozcieńczenia, które pozwalały na dokładne liczenie robaków. Stosowane współczynniki rozcieńczenia zmieniały się w zależności od wielkości populacji LSCP. (E) Po wybraniu czynnika rozcieńczenia wszystkie robaki ze wszystkich trzech aliquotowych replik tego rozcieńczenia były podsuwane pipetą na czyste szkiełko, a robaki liczono pod mikroskopem rozcinającym. (F) Próbka została podzielona na alikwoty o odpowiedniej wielkości. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig02large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig03.jpg" /> 
Rysunek 3: Metoda LSCP wygenerowała średnio populację 2,4 miliona robaków o mieszanym stadium. LSCP daje najmniejsze przyrosty populacji około 94 500, a największe około 9 290 000. Średnia wielkość populacji wszystkich szczepów wynosiła 2,4 miliona robaków. Paski pod nazwami szczepów C. elegans wskazują, czy szczep jest mutantem CGC, czy naturalnym izolatem CeNDR. Dla każdego szczepu wyświetlany jest rozmiar próbki LSCP. Przeprowadzono porównania dla wszystkich par za pomocą testu HSD Tukeya. Nie zaobserwowano istotnych różnic między szacowanymi wielkością populacji w szczepach C. elegans (F(14 108) = 0,7, p = 0,77). Kolorowe paski wskazują standardowe kolorowe wyświetlacze dla odpowiedniej reprezentacji szczepu C. elegans . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig03large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig04.jpg" /> 
Rysunek 4: Metoda LSCP wygenerowała duże populacje dżdżownic w mieszanym stadium w ciągu 10–20 dni. Dana populacja C. elegans LSCP rosła, aż próbka była pełna dorosłych robaków, osiągnęła dużą populację i pozostała minimalna ilość bakteryjnego trawnika. LSCP potrzebowały od 10 do 20 dni, aby osiągnąć pełną populację stadia mieszanego, w zależności od szczepu. Średni czas wzrostu między szczepami wynosił 12,2 dnia. Dla każdego szczepu wyświetlany jest rozmiar próbki LSCP. Każdy pasek błędu był konstruowany z 1 odchyleniem standardowym od średniej. Poziomy niepołączone tą samą literą są znacząco różne. Porównania dla wszystkich par według testu HSD Tukeya. Istotną różnicę stwierdzono w ilości potrzebnego czasu wzrostu na LSCP między szczepami C. elegans (F(14 108) = 8,8, s. < 0,0001*). Kolorowe paski wskazują standardowe kolorowe wyświetlacze dla odpowiedniej reprezentacji szczepu C. elegans . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig04large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig5v2.jpg" /> 
Rysunek 5: Mieszany pomiar populacji i wzrostu referencyjnego szczepu typu dzikiego, PD1074. Reprezentatywny rozkład LPFC jednego wzrostu LSCP dzikiego rodzaju referencyjnego, wariantu oryginalnego szczepu N2 Bristol (PD1074), dokumentuje rozkład wielkości i liczbę zdarzeń populacji mieszanego stadium. Oś x pokazuje długość (Czas lotu, TOF) posortowanych robaków. Oś y pokazuje gęstość optyczną (optyczne wygaszanie, EXT) sortowanych robaków. Każdy punkt danych to robak udokumentowany w próbce. Każdy region TOF używany do analizy obrazu jest wyświetlany w innym kolorze. Utworzono dwadzieścia regionów TOF (R2 – R21) w zakresie od TOF 50 do 2050. Szczegóły dotyczące każdego regionu TOF można znaleźć w Tabeli Uzupełniającej 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig5v2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig06.jpg" /> 
Rysunek 6: Obrazy robaków posortowanych z regionów TOF w zakresie od R2 do R12 pokazują rozkład LPFC PD1074. W regionie R2 można zidentyfikować robaki L1, a w regionie R9 głównie grawidacyjne dorosłe osobniki, obejmujące dwa ekstremalne larwalne rozwojowe, dając nam przybliżone obszary w rozkładzie cytometru przepływowego, gdzie oczekiwane są stadia rozkładu. Pasek skali oznacza 1 mm. Reprezentatywne obrazy pochodzą z rozkładu LPFC pokazanego na Rysunku 5, a kolorowe ramki odpowiadają regionom z Rysunku 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig06large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig07.jpg" /> 
Rysunek 7: Rozkład populacji w regionach czasu lotu (TOF) w referencyjnym szczepie typu dzikiego, PD1074. Rozmieszczenie robaków w całym regionie TOF pokazuje obszary, w których występowały robaki. Każdy PD1074 LSCP jest reprezentowany jako indywidualny kolor. (A) Oś x pokazuje dwadzieścia regionów TOF (R2 – R21) obserwowanych i zliczonych dla LSCP, pokazując cały rozkład rozmiarów. Oś y pokazuje procent robaków z danego LSCP, które miały rozmiar ciała mieściący się w danym obszarze TOF. (B) Ponieważ mniejsza część populacji robaków mieści się między regionami R7-R21, w celu pokazania rozkładu populacji wykonano log procentowy liczby robaków należących do każdego regionu. Oś x wyświetla obszary TOF R7-R21. Oś y pokazuje log procentowy udziału robaków z danego LSCP, które miały rozmiar ciała mieściący się w danym obszarze TOF. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig07large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
Rysunek uzupełniający 1: Średnia dzienna temperatura (°C) warunków wzrostu, w których LSCP był uprawiany i traktowany. Zgłoszone temperatury w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze (CT) były dokumentowane i zbierane przez sześć miesięcy wzrostu i pobierania próbek. Średnia dzienna temperatura jest tutaj podana. Nie zaobserwowano istotnych różnic między temperaturą, w jakiej LCSP rosła w trakcie trwania projektu (F(5,24) = 2,59, p = 0,0524). Cała różnica temperatur nie przekraczała 0,003 °C przez sześć miesięcy wzrostu i generowania próbki. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453supfig01.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę figurkę.</a>
Tabela uzupełniająca 1: Obszary z bramkami TOF używane do sortowania robaków na płytki z 384 dołkami do obrazowania. Regiony wykluczone zostały stworzone, aby obejmować TOF 100 na całym obszarze TOF od 50 do 2050 roku. Strefy zamknięte można zmieniać i optymalizować pod kątem potrzeb. Każdy region TOF używany do analizy obrazu jest wyświetlany w innym kolorze. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/Supplementary_Table1_FINAL.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela uzupełniająca 2: szablon płyty 384-dołkowy regionów TOF oraz układ replikacji. Każda próbka była sortowana na płytce z 384 dołkami do obrazowania. Dla każdego regionu wybranego do sortowania stworzono cztery repliki. Strefy zamknięte można zmieniać i optymalizować pod kątem potrzeb. Zobacz Tabelę Uzupełniającą 1, aby przedstawić konkretne obszary ograniczone utworzone i używane w tym protokole. Każdy region TOF używany do analizy obrazu jest wyświetlany w innym kolorze. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/Supplementary_Table2_FINAL.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela uzupełniająca 3: Szczepy C. elegans stosowane w tym protokole zawierają mieszaninę szczepów CGC i CeNDR. Szczep, genotyp, źródło szczepu oraz szczegóły opisane są w tej tabeli. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/Supplementary_Table3_FINAL.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Aby wykorzystać Caenorhabditis elegans (C. elegans) w badaniach omiki, potrzebna jest metoda generowania dużych populacji robaków, gdzie pojedyncza próbka może być mierzona na różnych platformach do analiz porównawczych. Przedstawiono tutaj metodę hodowli populacji C. elegans na płytkach hodowlowych na dużą skalę (LSCP) oraz dokumentowania wzrostu populacji.

Kultura i analiza populacji dużoskalowych o mieszanym stadium Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

Ta technika pozwala nam zbierać duże populacje robaków do wykorzystania na wielu platformach omicznych przy minimalnej manipulacji. Technika ta pozwala nam zbierać populacje C. elegans w mieszanym stadium w wielu eksperymentach omicznych, aby uzyskać całościowy obraz każdej próbki. Aby punktowo wybielić dorosłe osobniki na dużych płytkach hodowlanych, rozpal kiljak na palniku Bunsena i użyj go do nabierania świeżej E. coli z krawędzi trawnika bakteryjnego na dużą płytkę hodowlową.Wybierz jednego grawidacyjnego dorosłego osobnika z czwartej płytki do wybielania punktowego i dodaj pięć mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu zasadowego podchlorynu do jednego rogu dużej płyty hodowlającej, z dala od trawnika E. coli. Włóż dorosłego grawidatora do roztworu zasadowego podchlorynu i nakłuj nicienia, aby rozbić skórkę i uwolnić jaja. Gdy na trawniku E.coli równomiernie rozmieszczono pięć dorosłych osobników, przyłóż pokrywę z powrotem na talerz.Aby pobrać próbki z dużych płyt hodowlanych, należy wylać 50 mililitrów roztworu M9 na jedną dużą powierzchnię płyty hodowlarskiej i zakręcić płytą, aby M9 pokrył całą powierzchnię agarozowego medium wzrostu nicieni. Sterylną pipetę serologiczną nałóż M9 i przechyl płytkę tak, aby populacja M9 i dżdżownic zebrała się w jednym rogu płyty. Użyj zagruntowanej pipety do zasysania zawiesiny robacza i dodaj robaki do stożkowej rurki o pojemności 50 milimetrów.Umieść rurkę na bujace, aby rozbić grudki bakteryjne i zanieczyszczenia. Gdy wszystkie robaki zostaną zebrane ze wszystkich trzech płytek, przenieś 15 mililitrów robaków z każdej rurki do każdej z trzech stożkowych rurek o pojemności 15 mililitrów i osadz robaki w rurkach przez wirowanie. Ostrożnie zasysaj supernatanty, nie naruszając granulek robaków i dodaj 13 mililitrów zawiesiny do każdej rurki.Odwróć rurki, aby ponownie zawiesować granulki i zmyć jak najwięcej bakterii oraz zanieczyszczeń, a następnie ponownie odwiruj robaki. Gdy każda populacja robaka zostanie zebrana, przemyj granulki trzy razy w 10 mililitrach świeżego roztworu M9 na każde płukanie. Po ostatnim myciu ponownie zawiesz każdy oczyszczony pellet dżdżownicy w 10 mililitrach podwójnie destylowanej wody.Aby oszacować wielkość populacji, szybko rozcieńcz trzy aliquoty 100 mikrolitrów próbki robaka z każdej probówki w 900 mikrolitrach roztworu M9 na próbkę i użyj aliquotów do przeprowadzania serii rozcieńczeń. Umieść zapasowe próbki robaków na kołysce, aby stale przemieszczać hodowle podczas liczenia alikwot i mieszaj rozcieńczenia robaków, aż staną się jednorodne. Dodaj pięć mikrolitrów roztworu z pierwszej do 10 próbek robaków do szkiełka mikroskopowego i policzyć robaki mikroskopem świetlnym.Jeśli w próbce jest mniej niż 50 robaków, policz rozcieńczenia 1:100 i 1:1 000. Jeśli jest więcej niż 50 robaków, przejdź do następnego rozcieńczania seryjnego. Po trzykrotnym przeliczeniu każdego aliquotowego powtórzenia każdego rozcieńczenia, uśrednij liczby rozcieńczeń, aby określić szacowaną wielkość populacji robaka.Następnie rozdziel próbki robaków na odpowiednie eksperymentalne aliquoty i szybko zamroz próbki w ciekłym azocie na przechowywanie w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby przygotować próbkę robaka do cytometrii przepływu dużych cząstek, rozcieńcz około pięć razy 10 do aliquotu czwartego etapu mieszanego do końcowej objętości 10 mililitrów roztworu M9 i dodaj 200 mikrolitrów jednego miligramu na mililitr E.coli oraz rozcieńczenie 1:50 roztworu mikrosfery czerwonej fluorescencji o pojemności 0,5 mikromola do zawiesiny robaka. Po 20-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej z kołysaniami zbieraj robaki i mikrosfery przez wirowanie, a następnie dwukrotnie myj robaki świeżym roztworem M9, aby usunąć nadmiar bakterii i nieinternalizowanych mikrosfer.Po drugim przepłukaniu ponownie zawiesić pellet w pięciu mililitrach roztworu M9. Jeśli granulat wygląda czysto, dodaj do robaków pięć mililitrów M9 z dodatkiem 50 milimolarnych azydów sodu i umieść rurkę na dźwigni, aby zarówno wyprostować, jak i uśpić robaki dla dokładnego liczenia i rozmiarowania. Do dokumentacji rozkładu populacji otwórz skalibrowany szablon płytki z 384 dołkami i ustaw szablon tak, aby wydawał 20 obiektów z bramką do czterech dołków, aby uzyskać cztery techniczne repliki każdego obszaru zamkniętego dla każdego z 20 obszarów barowych próbki.Załaduj próbkę robaków o pojemności 40 mililitrów na cytometr przepływu dużych cząstek i rozpocznij automatyczne sortowanie próbki, jednocześnie mieszając próbkę, aby zapobiec osadzaniu się, i jednocześnie wypuszczając obiekty z próbki na skalibrowaną płytkę z 384 dołkami. Po posortowaniu całej próbki i podaniu maksymalnej liczby obszarów z bramkami do płytki 384-dołkowej, należy usunąć próbkę z cytometru i wyczyścić urządzenie. Metoda dużej skali z płytami hodowlanymi została przetestowana na 15 szczepach C. elegans, w tym mieszance mutantów Caenorhabditis Genetics Center oraz dzikich szczepów Caenorhabditis elegans Natural Diversity Resource (Zasobów Naturalnej Różnorodności).W tej analizie metoda dużej skali z płytami hodowlowymi dała populacje od około 94 500 do 9 290 000. Średnia wielkość populacji w obrębie referencyjnego szczepu PD1074 i między szczepami wynosiła około 2,4 miliona robaków. Nie stwierdzono istotnych różnic w szacowanych liczebnościach populacji między szczepami C. elegans w średnio 12,2 dużych dniach wzrostu płyt hodowlanych.Płytki hodowlane na dużą skalę PD1074 potrzebowały od 10 do 14 dni, aby osiągnąć pełną populację stadia mieszanego ze średnim czasem wzrostu wynoszącym 12,2 dnia. Najwolniej rosnący szczep rósł maksymalnie 20 dni, a najszybciej przez minimum 10 dni. W tym rozdziale próbki dla PD1074 robaki mierzono od stadium L1 do dorosłego osobnika grawidnego na cytometrze przepływu dużych cząstek.Późniejsze obrazowanie i wizualizacja różnic w rozkładzie populacji w różnych próbkach wykazały, że pipeline wygenerował populację C. elegansów w stadium mieszanym. Ważne jest, aby dokładnie liczyć robaki w trakcie pobierania próbki, aby uzyskać dane porównywalne w różnych fazach wzrostu i badaniach. To podejście do zbierania można zastosować w sekwencjonowaniu RNA, genomice i innych analizach omicznych, aby poszerzyć naszą wiedzę o skomplikowanej dynamice zachodzącej w populacjach C. elegans.Technika ta pozwala nam zbierać populacje C. elegans w mieszanych etapach w wielu eksperymentach omikowych, aby uzyskać całościowy obraz każdej próbki.

culture-assay-large-scale-mixed-stage-caenorhabditis-elegans

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Opisano procedurę hodowli w środowisku ciekłym oraz rozdziału szczepów C. elegans wykazujących ekspresję fluorescencyjnych białek reporterowych, która nie wymaga użycia kosztownego sprzętu do sortowania. Podejście to można zastosować w przypadku licznych indukowalnych genów C. elegans w celu odkrywania leków lub biosensingu zanieczyszczeń.

Przesiewanie wysokoprzepustowe i biosensing z wykorzystaniem fluorescencyjnych szczepów C. elegans

Tutaj opisujemy prosty protokół szybkiego wytwarzania setek pożywek hodowlanych dla nicieni, 96-dołkowych płytek hodowlanych ze stałą liczbą Caenorhhabditis elegans na studzienkę. Kultury te są przydatne do fenotypowych badań przesiewowych całych organizmów. Skupiamy się tutaj na wykorzystaniu tych kultur do badań przesiewowych substancji chemicznych pod kątem efektów sprzyjających długowieczności.

Prosta metoda wysokoprzepustowych badań przesiewowych w kierunku Caenorhabditis elegans

Opisujemy zmodyfikowaną ekstrakcję na małą skalę i testy kolorymetryczne mleczanu i pirogronianu u nicieni C. elegans. W przypadku korzystania z komercyjnych zestawów testowych ważny jest techniczny rozwój ich czułości i dokładności. Wytrącanie białek podczas ekstrakcji jest najbardziej krytycznym etapem ilościowego oznaczania metabolitów wewnątrzkomórkowych.

Małoskalowe testy kolorymetryczne wewnątrzkomórkowego mleczanu i pirogronianu u nicienia Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje metodę uprawy Caenorhabditis elegans na dużą skalę na stałych podłożach. Jako alternatywa dla hodowli płynnej, protokół ten pozwala na uzyskanie parametrów o różnych skalach pod uprawą płytkową. Zwiększa to porównywalność wyników poprzez pominięcie różnic morfologicznych i metabolicznych między hodowlą pożywek płynnych i stałych.

Hodowla Caenorhabditis elegans na dużych obszarach na płytkach: przygotowanie próbki do badania zmian metabolicznych w cukrzycy

Trans- i wielopokoleniowe skutki trwałych chemikaliów są niezbędne do oceny ich długoterminowych konsekwencji dla środowiska i zdrowia ludzkiego. Udostępniamy nowatorskie szczegółowe metody badania efektów trans- i wielopokoleniowych z wykorzystaniem wolno żyjących nicieni Caenorhabditis elegans.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans do badania trans- i wielopokoleniowych skutków substancji toksycznych

Aby zbadać interakcje chaperon-chaperon i chaperon-substrate, przeprowadzamy syntetyczne badania przesiewowe interakcji w Caenorhabditis elegans za pomocą interferencji RNA w połączeniu z łagodnymi mutacjami lub nadmierną ekspresją białek opiekuńczych i monitorujemy dysfunkcję białek specyficznych dla tkanek na poziomie organizmu.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans do badań przesiewowych pod kątem interakcji opiekuńczych specyficznych dla tkanek

Mikroby jelitowe mogą pozytywnie lub negatywnie wpływać na zdrowie swojego gospodarza poprzez specyficzne lub konserwatywne mechanizmy. Caenorhabditis elegans to wygodna platforma do badań przesiewowych pod kątem takich drobnoustrojów. Niniejszy protokół opisuje wysokoprzepustowe badania przesiewowe 48 izolatów bakteryjnych pod kątem wpływu na odporność nicieni na stres, wykorzystywane jako wskaźnik zdrowia robaków.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe izolatów drobnoustrojów mające wpływ na zdrowie Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans służy jako doskonały system modelowy z solidnymi i tanimi metodami badania zdrowia, długości życia i odporności na stres.

Badanie tanich metod pomiaru długości życia i długości zdrowia u Caenorhabditis elegans

Prezentowany tutaj jest zoptymalizowany protokół hodowli izolowanych pojedynczych nicieni na stałych podłożach w mikrofabrykowanych urządzeniach wielodołkowych. Takie podejście pozwala na monitorowanie poszczególnych zwierząt przez całe życie pod kątem różnych fenotypów związanych ze starzeniem się i zdrowiem, w tym aktywności, wielkości i kształtu ciała, geometrii ruchu i przeżycia.

Długotrwała hodowla i monitorowanie izolowanych Caenorhabditis elegans na pożywkach stałych w urządzeniach wielodołkowych

Tutaj prezentujemy protokół hodowli izolowanych pojedynczych nicieni na stałych podłożach w celu śledzenia parametrów fizjologicznych przez całe życie i kwantyfikacji fluorescencji. Ten system hodowli obejmuje barierę kwasu palmitynowego wokół studni z pojedynczymi robakami, aby zapobiec ucieczce zwierząt, umożliwiając stosowanie interwencji awersyjnych, w tym bakterii chorobotwórczych i chemicznych czynników stresogennych.

Długotrwała hodowla poszczególnych Caenorhabditis elegans na pożywkach stałych do długotrwałego monitorowania fluorescencji i interwencji awersyjnych

Poznaj metodę hodowli dużych populacji Caenorhabditis elegans na dużych płytkach kulturowych do badań omicznych. Technika ta umożliwia minimalną manipulację próbkami i wspiera kompleksowe analizy wielopoziomowe.

Kultura i analiza populacji dużoskalowych o mieszanym stadium Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów