Name: Metoda dysocjacji pojedynczych komórek do analizy molekularnej pęcherza moczowego u myszy po urazie rdzenia kręgowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Poznaj metodę dysocjacji pojedynczych komórek do analizy pęcherza moczowego u myszy po urazie rdzenia kręgowego. Technika zapewnia wysoką żywotność komórek i wierną reprezentację izolowanych typów komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te były wspierane przez granty z National Institutes of Health (R01 DK077195 do R.M.A, R01 DK104641 do R.M.A i D.R.B.). Doceniamy cenny wkład dr Stuarta Orkina z Oddziału Hematologii/Onkologii Szpitala Dziecięcego w Bostonie, Oddziału Pediatrii Harvard Medical School i Dana-Farber Cancer Institute. Dziękujemy również za wsparcie ze strony Kyle'a Costy w opiece pooperacyjnej nad myszami, Mary Taglienti i dr Habiballah Shojaeisaadi (Dr. Yang Shi Laboratory, Wydział Pediatrii, Oddział Medycyny Noworodków, Wydział Pediatrii, Oddział Medycyny Noworodków, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School) za pomoc techniczną i pomocne dyskusje.

<ol><li>Grange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+characterization+and+functional+analysis+of+human+tumor+immune+infiltration+after+mechanical+and+enzymatic+disaggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Phenotypic characterization and functional analysis of human tumor immune infiltration after mechanical and enzymatic disaggregation.</a> Journal of Immunological Methods. 372 (1-2), 119-126 (2011).</li>
<li>van den Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li>
<li>Seth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+discrete+modes+of+spinal+cord+injury+on+bladder+muscle+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Urology%22%5BJournal%5D)">The impact of discrete modes of spinal cord injury on bladder muscle contractility.</a> BMC Urology. 13, 24(2013).</li>
<li>Doyle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inosine+attenuates+spontaneous+activity+in+the+rat+neurogenic+bladder+through+an+A2B+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Inosine attenuates spontaneous activity in the rat neurogenic bladder through an A2B pathway.</a> Scientific Reports. 7, 44416(2017).</li>
<li>Gheinani, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+miRNA-regulated+networks%2C+hubs+of+signaling%2C+and+biomarkers+in+obstruction-induced+bladder+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Characterization of miRNA-regulated networks, hubs of signaling, and biomarkers in obstruction-induced bladder dysfunction.</a> JCI Insight. 2 (2), 89560(2017).</li>
<li>Gheinani, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concordant+miRNA+and+mRNA+expression+profiles+in+humans+and+mice+with+bladder+outlet+obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Urology%22%5BJournal%5D)">Concordant miRNA and mRNA expression profiles in humans and mice with bladder outlet obstruction.</a> American Journal of Clinical and Experimental Urology. 6 (6), 219-233 (2018).</li>
<li>Krishna, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+contusion+model+of+severe+spinal+cord+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A contusion model of severe spinal cord injury in rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50111(2013).</li>
<li>The Tabula Muris Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+of+20+mouse+organs+creates+a+Tabula+Muris%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris.</a> Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).</li>
<li>Gray, C. J., Boukouvalas, J., Szawelski, R. J., Wharton, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzyloxycarbonylphenylalanylcitrulline+p-nitroanilide+as+a+substrate+for+papain+and+other+plant+cysteine+proteinases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Benzyloxycarbonylphenylalanylcitrulline p-nitroanilide as a substrate for papain and other plant cysteine proteinases.</a> Biochemical Journal. 219 (1), 325-328 (1984).</li>
<li>Feodorova, Y., Koch, M., Bultman, S., Michalakis, S., Solovei, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quick+and+reliable+method+for+retina+dissociation+and+separation+of+rod+photoreceptor+perikarya+from+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Quick and reliable method for retina dissociation and separation of rod photoreceptor perikarya from adult mice.</a> MethodsX. 2, 39-46 (2015).</li>
<li>Aitken, K. J., Bagli, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bladder+extracellular+matrix.+Part+I%3A+architecture%2C+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Urology%22%5BJournal%5D)">The bladder extracellular matrix. Part I: architecture, development and disease.</a> Nature Reviews Urology. 6 (11), 596-611 (2009).</li>
<li>Aitken, K. J., Bagli, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bladder+extracellular+matrix.+Part+II%3A+regenerative+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Urology%22%5BJournal%5D)">The bladder extracellular matrix. Part II: regenerative applications.</a> Nature Reviews Urology. 6 (11), 612-621 (2009).</li>
<li>The ENCODE Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Yue, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+mouse+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome.</a> Nature. 515 (7527), 355-364 (2014).</li>
<li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+Activated+Cell+Populations+Using+Single-Cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Opisany tutaj model uszkodzenia rdzenia kręgowego myszy zapewnia powtarzalną metodę tworzenia funkcjonalnej niedrożności ujścia pęcherza z powodu utraty koordynacji między skurczem pęcherza a rozluźnieniem zewnętrznego zwieracza cewki moczowej. To z kolei wywołuje głęboką przebudowę ściany pęcherza moczowego już 2 tygodnie po urazie, charakteryzującą się rozszerzeniem przedziałów dróg moczowych i mięśni gładkich. Kluczowe kroki we wdrażaniu modelu SCI u gryzoni obejmują: (i) rygorystyczne zwracanie uwagi na manualną ekspresję pęcherza moczowego w okresie wstrząsu rdzeniowego, który następuje przez 10-14 dni po urazie; (ii) wzbogacenie składników odżywczych w celu zminimalizowania utraty masy ciała; oraz (iii) ograniczenie ryzyka oparzenia moczem, szczególnie w przypadku eksperymentów, które wykraczają poza powrót odruchowego oddawania moczu. Ograniczenia modelu obejmują możliwość niedrożności cewki moczowej u myszy z powodu zakrzepów krwi w okresie przejściowego krwiomoczu, a dodatkowo u samców myszy z krzepnięcia nasienia po wytrysku wstecznym po operacji.
Opisane tutaj podejście do dysocjacji tkanek ilustruje znaczenie uwzględnienia zmian strukturalnych w tkankach, które wynikają z eksperymentalnego urazu, w tym przypadku znaczącej przebudowy tkanek po SCI, które mogą mieć wpływ na dalsze analizy. Wraz ze wzrostem liczby analiz pojedynczych komórek kluczowe znaczenie ma zapewnienie, że obserwowane różnice w ekspresji genów nie są po prostu wynikiem perturbacji wywołanych dysocjacją, ale są naprawdę reprezentatywne dla podstawowych zmian biologicznych istotnych dla modelu choroby. Wykorzystanie publicznie dostępnych danych dotyczących ekspresji pozwoliło nam zmodyfikować formułę trawiennych, aby zapewnić skuteczne trawienie macierzy zewnątrzkomórkowej przy jednoczesnej maksymalizacji żywotności. Dodatkowe modyfikacje, które mogą być brane pod uwagę w przyszłych zastosowaniach, obejmują dodanie aktynomycyny D, w celu zatrzymania transkrypcji natychmiastowych wczesnych genów, które są wrażliwe na protokół dysocjacji15.
Technika pipetowania ma kluczowe znaczenie w przypadku dysocjacji tkanek lub przenoszenia komórek, które są już w zawiesinie. Aby zmniejszyć fizyczne uszkodzenia komórek spowodowane siłami ścinającymi, ważne jest, aby pipetować delikatnie i powoli podczas ponownego zawieszania komórek. Ogólnie zaleca się stosowanie końcówek do pipet o szerokim otworze. W przypadku korzystania ze standardowych końcówek szczególnie ważne jest, aby delikatnie pipetować zawiesiny komórek, aby uniknąć sił ścinających, które w przeciwnym razie mogłyby uszkodzić komórki. W tym protokole nie da się uniknąć stosowania filtrów siatkowych, jednak stężenie komórek może spaść o 20% lub więcej, czemu towarzyszy utrata objętości o 100 μl lub więcej. Zalecamy określenie stężenia komórek po odcedzeniu, aby zapewnić dokładną liczbę komórek.
W cytometrii przepływowej kontrole FMO zapewniają pomiar tła z powodu przebijania sygnału z nakładających się pików emisji. Nie są one miarą niespecyficznego wiązania przeciwciał ani barwienia tła, które może być obecne, gdy przeciwciało jest włączone do tego kanału. Aby uwzględnić niespecyficzne wiązanie przeciwciał, należy uwzględnić odpowiednie kontrole izotypu; Do barwienia tła należy uwzględnić kontrole negatywne. Podsumowując, te kontrole zapewniają dokładny pomiar populacji komórek.

Zaburzenia normalnego funkcjonowania pęcherza moczowego mogą prowadzić do obniżenia jakości życia wielu osób. Aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób uraz lub choroba zakłóca normalne funkcjonowanie pęcherza moczowego, ważne jest zbadanie normalnego stanu biologicznego komórek w pęcherzu moczowym i tego, jak zmieniają się one pod wpływem eksperymentalnych zakłóceń. Do tej pory jednak specyficzne populacje komórek, które znajdują się w pęcherzu moczowym, i sposób, w jaki zmieniają się one pod wpływem urazu, nie zostały w pełni scharakteryzowane.
Metody profilowania pojedynczych komórek, takie jak cytometria przepływowa lub sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq) mają potencjał, aby rzucić światło na określone typy komórek w pęcherzu moczowym. Jednak, aby te podejścia miały charakter informacyjny, tkanka musi być trawiona w sposób, który nie wpływa na żywotność, ekspresję genów i reprezentatywną procentową populację komórek pobranej tkanki. Protokoły, które wykorzystują dezagregację enzymatyczną, mogą wpływać na ekspresję markerów powierzchniowych poprzez masową aktywność proteazy1, wpływając w ten sposób na identyfikację komórek za pomocą cytometrii przepływowej, podczas gdy sam proces dysocjacji może prowadzić do indukcji natychmiastowych wczesnych genów, jak opisano niedawno przez Van den Brink i współpracowników2. Autorzy wykazali, że chociaż subpopulacja dotknięta dysocjacją była niewielka, może wywołać silny sygnał zanieczyszczający w badaniach nad ekspresją masową ze względu na wysoki poziom ekspresji natychmiastowych wczesnych genów. Ponadto czas trwania protokołu dysocjacji wpłynął na wykryte poziomy ekspresji masowej genów, które okazały się unikalne dla niektórych subpopulacji. W związku z tym zestawy danych z pojedynczych komórek wygenerowane bez uwzględnienia wpływu protokołu dysocjacji mogą powodować zmiany ekspresji genów wynikające z metody dysocjacji, w przeciwieństwie do leżącej u jej podstaw biologii. Obserwacje te sugerują, że opublikowane dane transkryptomiczne z pojedynczych komórek powinny być interpretowane z ostrożnością, a wyniki powinny być walidowane niezależnymi metodami.
Chociaż metody ostrej i długotrwałej dysocjacji mogą zmienić ekspresję genów w komórkach2; skuteczna izolacja komórek jest niezbędna do uzyskania dokładnej reprezentacji obecnych typów komórek. Ponieważ pęcherz moczowy jest złożonym narządem składającym się z wielu typów komórek, niektóre populacje, takie jak komórki urotelialne lub zrębowe, mogą być stosunkowo słabo reprezentowane, podczas gdy inne typy komórek, takie jak fibroblasty, istnieją w macierzy zewnątrzkomórkowej i mogą być trudne do wyizolowania. Dysocjacja staje się jeszcze trudniejsza, jeśli pęcherz moczowy przeszedł znaczną przebudowę i zwłóknienie, takie jak obserwowane w urazie rdzenia kręgowego3,4 lub przeszkoda w ujściu pęcherza moczowego5,6.
Tutaj opisujemy zoptymalizowaną metodę dysocjacji tkanek do dalszej analizy pojedynczych komórek w pęcherzu myszy z uszkodzonym rdzeniem kręgowym. Korzystając z cytometrii przepływowej, porównaliśmy cztery protokoły trawienia enzymatycznego pod kątem ich zdolności do uzyskiwania zawiesiny pojedynczej komórki, wspierania żywotności komórek i utrzymywania prawidłowej proporcji populacji komórek. Na podstawie tej analizy dochodzimy do wniosku, że minimalizacja śmierci komórki, agregatów komórkowych, niekomórkowych kwasów nukleinowych i potencjalnych inhibitorów dalszej analizy ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości danych.

<table><tbody><tr><td>2,5 X Lupy</td><td></td><td></td><td></td>powiększające</tr><tr><td>7-0 Vicryl szew, igła 6,5mm koło 3/8 koło</td><td>ETHICON</td><td>J546</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m Sitko komórkowe</td><td>Thermofisher</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Accutase w BPBS, 0,5 mM EDTA</td><td>Millipore</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>Filtr aerozolowy Końcówki pipetora z szerokim otworem (1000 &mikro; L)</td> <td>VWR</td><td>89049-168</td><td></td></tr><tr><td>Filtr aerozolowy Końcówki pipetora z szerokim otworem (1000 &micro; L)</td> <td>VWR</td><td>89049-168</td><td></td></tr><tr><td>APC anty-mysi CD326 (Ep-CAM), monoklonalny szczur, IgG2a, &kappa;, oczyszczony powinowactwem</td><td>BioLegend</td><td>118213</td><td></td></tr><tr><td>BB515 Rat Anti-Mouse CD45, monoklonalny szczur, IgG2b, &kappa;, Clone 30-F11</td><td>BD Biosciences</td><td>564590</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokleszcze preparacyjne BONN, proste, 1x2 zęby, długość 3,75", szerokość końcówki 0,3 mm, zęby 0,12 mm</td><td>Firma zajmująca się instrumentami chirurgicznymiInc.</td><td>RS-5172</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>2115-250ML</td><td></td></tr><tr><td>CASTROVIEJO Mikrouchwyt na igły do szycia, prosty z zamkiem, długość 5,75 cala</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.</td><td>RS-6412</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Zestaw do liczenia komórek Gaithersburg MD</td></tr><tr><td>, 30 dwukomorowych szkiełek, 60 zliczeń, z błękitem trypanowym</td><td>Biorad</td><td>1450003</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do barwienia komórek</td><td>BioLegend</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza z Clostridium histolyticum</td><td>Sigma</td><td>C0130-1G</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu I</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td></td><td></td>LS004196</tr><tr><td>Kolagenaza typu III</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004182</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza, typ 6</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS005319</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do apoptozy martwych komórek z załącznikiem V Alexa Fluor 488 i Jodek propydu (PI)</td><td>Thermofisher</td><td>V13241</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma</td><td>D4693-1G</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>Enrofloksacyna (Baytril)</td><td>Bayer Health Care LLC,</td> <td>NADA # 140-913 Zatwierdzony przez FDA. Nr partii: AH01CGP</td><td>2,27% roztwór do wstrzykiwań</td></tr><tr><td>Falcon 15 ml stożkowe probówki wirówkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 ml stożkowe probówki wirówkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>FITC anty-mysie Ly-6A/E (Sca-1), monoklonalne szczury, IgG2a, &kappa;, oczyszczone powinowactwo</td><td>BioLegend</td><td>122505</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidaza z jąder owiec, typ II</td><td>Filtry siatkowe Sigma</td><td>H2126</td><td></td></tr><tr><td>MACS (100 &micro; m)</td><td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-110-917</td><td></td></tr><tr><td>- McPHERSON-VANNAS - Nożyczki sprężynowe do mikropreparacji, proste, długość 4", szerokość końcówki 0,15mm</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.</td><td>RS-5630</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD</td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-891-7959</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS003119</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie CD19 PE / Cy5, monoklonalne szczura, IgG2a, &kappa;, oczyszczone powinowactwo</td><td>BioLegend</td><td>115509</td><td>Dump Channel</td></tr><tr><td>PE/Cy5 anty-mysi CD3 i epsilon; Przeciwciało, monoklonalne chomik ormiański, IgG, oczyszczone powinowactwo</td><td>BioLegend</td><td>100309</td><td>Dump Channel</td></tr><tr><td>PE/Cy5 przeciwciało anty-mysie CD4, monoklonalne szczura, IgG2b, &kappa;, oczyszczone powinowactwo</td><td>BioLegend</td><td>100409</td><td>Dump Channel</td></tr><tr><td>PE/Cy5 przeciwciało anty-mysie CD8a, monoklonalne szczura, IgG2a, &kappa;, oczyszczone powinowactwo</td><td>BioLegend</td><td>100709</td><td>Dump Channel</td></tr><tr><td>PE / Cy5 przeciwciało anty-mysie NK-1.1, monoklonalne mysie, IgG2a, &kappa;, oczyszczone powinowactwo</td><td>BioLegend</td><td>108715</td><td>Dump Channel</td></tr><tr><td>PE / Cy5 przeciwciało przeciw mysim komórkom TER-119 / erytroidalnym, IgG2b, &kappa;, oczyszczone powinowactwo</td><td>BioLegend</td><td>116209</td><td>Dump Channel</td></tr><tr><td>Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32 (blok myszy BD Fc), monoklonalny szczur, IgG2b, &kappa;, klon 2.4G2</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy RBC (10X)</td><td>BioLegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy czerwonych krwinek 1x</td><td>Biolegend</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek z nakrętką, 1,5 ml</td><td>VWR</td><td>89004-290</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Automatyczny licznik komórek</td><td>Biorad</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>Maść z potrójnym antybiotykiem (neomycyna/polimyksyna B/bacytracyna)</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-893-7216</td><td>środek chroniący skórę</td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme (10X), bez czerwieni fenolowej</td><td>Thermofisher</td><td>A1217701</td><td></td></tr><tr><td>Vetropolycin maść do oczu</td><td>Dechra Veterinary Products</td><td>NADA # 065-016. Zatwierdzony przez FDA.</td><td>chronić oczy podczas znieczulenia</td></tr></tbody></table>

metoda dysocjacji pojedynczych komórek do analizy molekularnej pęcherza moczowego u myszy po urazie rdzenia kręgowego

A Single Cell Dissociation Approach for Molecular Analysis of Urinary Bladder in the Mouse Following Spinal Cord Injury

Opisujemy implementację uszkodzenia rdzenia kręgowego u myszy w celu wywołania dyssynergii detrusor-zwieracz, funkcjonalnej niedrożności ujścia pęcherza moczowego i późniejszej przebudowy ściany pęcherza. Aby ułatwić ocenę składu komórkowego ściany pęcherza moczowego u myszy kontrolnych i myszy z uszkodzeniem rdzenia kręgowego, opracowaliśmy zoptymalizowany protokół dysocjacji, który wspiera wysoką żywotność komórek i umożliwia wykrywanie dyskretnych subpopulacji za pomocą cytometrii przepływowej.
Uraz rdzenia kręgowego powstaje w wyniku całkowitego przecięcia rdzenia kręgowego klatki piersiowej. W momencie pobierania tkanek zwierzę jest poddawane perfuzji soli fizjologicznej buforowanej fosforanami w głębokim znieczuleniu, a pęcherze są zbierane do buforu Tyrode. Tkanki są mielone przed inkubacją w buforze trawiennym, który został zoptymalizowany na podstawie zawartości kolagenu w pęcherzu myszy, określonej na podstawie badania publicznie dostępnych baz danych ekspresji genów. Po wytworzeniu zawiesiny pojedynczej komórki materiał jest analizowany za pomocą cytometrii przepływowej w celu oceny żywotności komórek, liczby komórek i określonych subpopulacji. Wykazaliśmy, że metoda daje populacje komórek o żywotności większej niż 90% i solidnej reprezentacji komórek pochodzenia mezenchymalnego i nabłonkowego. Metoda ta umożliwi dokładną analizę poszczególnych typów komórek w pęcherzu moczowym myszy i potencjalnie w innych narządach.

Procedura chirurgiczna 
Sukces torakalnej transekcji rdzenia kręgowego określa się poprzez ocenę szeregu parametrów, z których najbardziej oczywistym jest paraliż kończyn tylnych. Zwierzę porusza się wyłącznie za pomocą kończyn przednich, ciągnąc za sobą kończyny tylne. Poza tym poziomy aktywności, w tym karmienie, pielęgnacja i czujność, są zazwyczaj prawidłowe. Dodatkowo zwierzęta tracą dobrowolną kontrolę nad pęcherzem moczowym, co powoduje konieczność ręcznego opróżniania pęcherza przez badacza co 12 h, aż do momentu powrotu odruchy oddawania moczu od 10 do 14 dni po urazie. Po eutanazji dodatkowe oznaki sukcesu zabiegu wiążą się przede wszystkim ze wzrostem stosunku masy pęcherza do masy ciała, co świadczy o przebudowie tkanek. Analiza histologiczna wykazuje hiperplazję zarówno w obrębie urothelium, jak i w komponentach mięśni gładkich3.
Przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek 
Wykorzystując publicznie dostępne dane dotyczące ekspresji, określono stopień wzbogacenia tkanki pęcherza moczowego w białka macierzy pozakomórkowej (Ryc. 2) i wykorzystano te informacje do opracowania składu mieszaniny trawiącej. Ponieważ kolageny są kluczowymi komponentami ściany pęcherza moczowego11,12, w pierwszej kolejności dążono do określenia najliczniej występujących kolagenów w pęcherzu myszy, wykorzystując zestawy danych z profilowania RNA wygenerowane w ramach projektu Mouse ENCODE13. Analiza wykazała, że kolagen 1A1, kolagen 3A1, kolagen 1A2 oraz kolagen 6A1 są najliczniejszymi typami kolagenów w pęcherzu myszy (Ryc. 2A). Skorzystano również z Tabula Muris (kompendium danych transkryptomicznych pojedynczych komórek myszy (Mus musculus))8, aby określić poziom ekspresji mRNA kolagenów 1, 3, 6 oraz hialuronianu. Dane te pozwalają na bezpośrednie i kontrolowane porównanie ekspresji genów w typach komórek wspólnych dla różnych tkanek. Analiza ta wykazała, że ekspresja tych komponentów macierzy pozakomórkowej jest bardziej powszechna w typach komórek mezenchymalnych niż w urothelium (Ryc. 2B).
Wpływ dysocjacji na żywotność wyizolowanych komórek pęcherza moczowego 
Analiza cytometrii przepływowej wykazała, że trawienie enzymatyczne z zastosowaniem 4 różnych protokołów pozwoliło uzyskać żywotność odpowiednio na poziomie 83%, 86%, 93% lub 90%. W związku z tym uznano, że protokół z sekcji 3 jest najkorzystniejszy dla zachowania żywotności komórek. Zaobserwowaliśmy również, że około 4% komórek miało charakter nekrotyczny (PI+/Annexin V-) (Rysunek 4A). Obserwacje te podkreślają skuteczność protokołu trawienia i wynikającą z niego korzyść dla żywotności komórek.
Wpływ uszkodzenia rdzenia kręgowego na różne populacje komórek w pęcherzu moczowym 
Zaobserwowaliśmy istotny wzrost całkowitej liczby komórek w pęcherzach moczowych myszy z SCI w porównaniu z grupą kontrolną. Wzorzec wykresów kropkowych uzyskanych z pęcherzy zwierząt z SCI był również nieco inny, co jest zgodne z trwającym przebudowaniem narządu w wyniku uszkodzenia rdzenia kręgowego (Rycina 4B: pierwsza kolumna). W porównaniu z grupą kontrolną, w pęcherzach moczowych zwierząt z SCI stwierdzono istotny wzrost liczby komórek CD45-dodatnich.
<img alt="Operacja brzuszna myszy, odsłonięcie wątroby; układ eksperymentalny, badanie organu, porównanie procedur laboratoryjnych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Reprezentatywny obraz zakończenia perfuzji z rozjaśnieniem koloru wątroby. (A) Przedstawia kolor wątroby na początku perfuzji. (B) Pokazuje rozjaśniony kolor wątroby po zakończeniu perfuzji. Mysz w (A) przeszła przerwanie rdzenia kręgowego dwa tygodnie przed perfuzją, co spowodowało przerost pęcherza moczowego i jego uwypuklenie poza miednicę, w przeciwieństwie do myszy w (B), u której nie wystąpił uraz rdzenia kręgowego; w tym przypadku pęcherz jest mały i ukryty w miednicy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres analizy ekspresji kolagenu, dane RPKM, pęcherz myszy; wykresy skrzypcowe przedstawiające rozkład typów komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Ekspresja transkrypcyjna składników macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) w pęcherzu myszy. (A) Wykres słupkowy 43 różnych typów kolagenu. Ekspresję określono jako liczbę odczytów na kilobazę transkryptu na milion zmapowanych odczytów (RPKM) (dane pobrano z BioProject: PRJNA66167)14. (B) Wykresy skrzypcowe ekspresji genów w typach komórek uzyskanych za pomocą mikrofluidycznego zliczania końców 3' w puli dysocjowanych próbek pęcherza moczowego samców i samic (samce i samice). Liczby dla każdej komórki poddano normalizacji logarytmicznej przy użyciu logarytmu naturalnego z 1 + liczby odczytów na milion ln(CPM+1)8. Przed obliczeniem logarytmów dodano pseudoliczbę 1 CPM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat cytometrii przepływowej przedstawiający barwienie komórek, koniugację przeciwciał i analizę apoptozy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Strategia bramkowania i kontrole FMO w celu określenia rozrzutu fluorescencji. (A) Wybór populacji komórek. (B) Strategia bramkowania dla singletów. (C) Bramkowanie komórek nekrotycznych oraz wczesnej i późnej apoptozy z użyciem PI i przeciwciała Annexin V. (D‒F) Schematyczny wykres kropkowy wielokolorowej cytometrii przepływowej (np. przeciwciała koniugowane z fluorochromami A, B, C, D + (Annexin V i PI). Przedstawiono rozrzut fluorescencji w kanale przeciwciała z fluorochromem A wykazany przez kontrolę FMO w porównaniu z kontrolą niebarwioną. Pomarańczowa przerywana linia reprezentuje granicę bramkowania FMO w porównaniu do granicy dla próby niebarwionej zaznaczonej na czerwono. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza cytometryczna; wykresy kropkowe, histogram; markery anneksyny V, PI, FITC, APC; apoptoza komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Cytometria przepływowa różnych typów komórek w pęcherzu moczowym. (A) Wykresy przepływowe dla podwójnego barwienia Anneksyną V/PI. Różne kombinacje enzymów i substancji chemicznych zastosowane w każdym protokole są przedstawione przed odpowiednim wykresem żywotności. Dane te wykazują, że najwyższą żywotność uzyskano przy zastosowaniu protokołu z sekcji 3. (B) Reprezentatywne histogramy ilustrujące intensywność sygnału dla Ly-6A/E (Sca-1) i CD326 (Ep-CAM) wykrytych w pojedynczych kanałach. (C) Wpływ SCI na populację komórek w pęcherzu moczowym myszy. Panel górny przedstawia wyniki barwienia trzech dysocjowanych pęcherzy uzyskanych od kontrolnych myszy nieskupionych operacyjnie, a panel dolny przedstawia wyniki barwienia trzech zwierząt z SCI. Pierwsza kolumna to całkowita populacja komórek. Druga kolumna przedstawia selekcję bramkowania singletów. Trzecia kolumna przedstawia subpopulację żywych komórek wykazujących brak ekspresji dla limfocytów B, limfocytów T i komórek NK. Czwarta kolumna przedstawia barwienie żywych komórek dodatnich dla CD45. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Składnik</td>
			<td >Ilość (na 500 mL)</td>
			<td >Molarność</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >NaCl</td>
			<td >4.091 g</td>
			<td >140 mM</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >KCl</td>
			<td >0.186 g</td>
			<td >5 mM</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >MgCl2</td>
			<td >0.0476 g</td>
			<td >1 mM</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >D-glukoza</td>
			<td >0.9 g</td>
			<td >10 mM</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td >1.19 g</td>
			<td >10 mM</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Składniki do przygotowania roztworu Tyrode'a. Wskazane składniki służą do przygotowania 500 mL roztworu Tyrode'a.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponent</td>
			<td>Ilość</td>
			<td>Sekcja protokołu 1</td>
			<td>Sekcja protokołu 2</td>
			<td>Sekcja 3 protokołu</td>
			<td>Sekcja protokołu 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>5 mg</td>
			<td>Tak</td>
			<td>Tak</td>
			<td>Tak</td>
			<td>Tak</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl22</td>
			<td>0,03 mM</td>
			<td>Tak</td>
			<td>Tak</td>
			<td>Tak</td>
			<td>Tak</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kolagenaza typu I</td>
			<td>132,5 jednostek</td>
			<td>Tak</td>
			<td>Tak</td>
			<td>Tak</td>
			<td>Tak</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kolagenaza typu III</td>
			<td>96,4 jednostek</td>
			<td>Tak</td>
			<td>Tak</td>
			<td>Tak</td>
			<td>Tak</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kolagenaza typu VI</td>
			<td>50 jednostek</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Tak</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNaza</td>
			<td>10 jednostek</td>
			<td>Tak</td>
			<td>Tak</td>
			<td>Tak</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papaina</td>
			<td>115 jednostek</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Tak</td>
			<td>Tak</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kollagenaza Pan</td>
			<td>50 jednostek</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Tak</td>
			<td>Tak</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hialuronidaza</td>
			<td>10,5 jednostek</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Tak</td>
			<td>Tak</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>1,25 jednostki</td>
			<td>Tak</td>
			<td>Tak</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór do dysocjacji komórek</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>Tak</td>
			<td>-</td>
			<td>Tak</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzym rekombinowany</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>-</td>
			<td>Tak</td>
			<td>-</td>
			<td>Tak</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Składniki do przygotowania buforu do trawienia. Wskazane składniki służą do przygotowania 2,5 mL mieszaniny do trawienia (1 U katalizuje hydrolizę 1 µmol substratu na minutę w temperaturze 37 °C. Definicję jednostki każdego enzymu należy sprawdzić w karcie charakterystyki produktu).

Celem tego protokołu jest zastosowanie zoptymalizowanego protokołu dysocjacji tkanek do mysiego modelu uszkodzenia rdzenia kręgowego i walidacja podejścia do analizy pojedynczych komórek za pomocą cytometrii przepływowej.

Metoda dysocjacji pojedynczych komórek do analizy molekularnej pęcherza moczowego u myszy po urazie rdzenia kręgowego

We describe the implementation of spinal cord injury in mice to elicit detrusor-sphincter dyssynergia, a functional bladder outlet obstruction, and ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ wykorzystuje informacje biologiczne, aby ułatwić wytwarzanie zawiesiny pojedynczej komórki o wysokiej żywotności komórek. Główną zaletą tej techniki jest możliwość generowania zawiesin pojedynczych komórek, które zachowują wysoką żywotność komórek i odpowiednią reprezentację izolowanych typów komórek. Zabieg chirurgiczny zademonstruje Hussein Atta, pracownik mojego laboratorium.Procedurę dysocjacji tkanek zademonstruje Ali Hashemi, a analiza FACS Yaser Heshmati. Po potwierdzeniu braku reakcji na odruch pedałowania u dorosłej myszy znieczulonej badaniem dotykowym należy dotknąć najbardziej widocznego wyrostka kolczystego w odcinku piersiowym kręgosłupa. Analgezja i antybiotyki są podawane przed zabiegiem chirurgicznym.Ogol podłużny prostokąt z tyłu myszy od dolnej części szyi do tuż poniżej najbardziej widocznego wyrostka kolczystego i po jednym centymetrze z każdej strony linii środkowej. Zdezynfekuj odsłoniętą skórę trzykrotnie za pomocą sekwencyjnych chusteczek z 10% jodowidonem i 70% etanolem w okrężny sposób, zaczynając od miejsca nacięcia i kierując się na zewnątrz. Po ostatnim przetarciu przykryj mysz sterylnym kawałkiem gąbki z gazy o wymiarach cztery na cztery cale z okienkiem nad polem operacyjnym.Aby wywołać uraz rdzenia kręgowego, najpierw wykonaj 1,5-centymetrowe nacięcie na środku pleców i użyj ostrej, sekcji, aby oddzielić mięśnie od wyrostków kolczystych i blaszek kręgów T9, T10 i T11. Użyj cienkich nożyczek, aby ostro podzielić więzadła międzykolcowe między T9 i T10 oraz T10 i T11 przed wykonaniem obustronnej laminektomii wyrostka kolczystego T10. Po całkowitym wycięciu blaszek użyj nożyczek, aby przeciąć rdzeń kręgowy.Aby całkowicie przeciąć boczne kolumny, delikatnie przesuń końcówkę cienkich nożyczek po obu stronach. Użyj sterylnej bawełnianej końcówki, aby zatamować krwawienie. Po osiągnięciu homeostazy zamknij skórę ciągłymi szwami 7-0 polyglactin910 i podskórnie podaj jeden mililitr roztworu soli fizjologicznej, aby zapobiec pooperacyjnemu odwodnieniu, a następnie wróć do nowej klatki z monitorowaniem aż do pełnego leżenia.Co 12 godzin, trzymając zwierzę jedną ręką i masując dolną część brzucha drugą, użyj palca wskazującego i kciuka, aby zlokalizować i delikatnie ścisnąć rozszerzony pęcherz moczowy, aby stymulować ręczne odciąganie pęcherza, aż zwierzę będzie w stanie samodzielnie oddać mocz. W celu dalszej analizy interesujących typów komórek pęcherza moczowego, w odpowiednim eksperymentalnym punkcie czasowym i po odpowiednim znieczuleniu zwierzęcia, należy wykonać laparotomię w linii środkowej od miednicy do przepony i odciąć przeponę od żeber. Podążając za granicą chrząstki kostnej równolegle do mostka, otwórz klatkę piersiową wzdłuż żeber po obu stronach zwierzęcia, zaczynając od przepony i przechodząc do pierwszego żebra.Po zamocowaniu przedniej ściany klatki piersiowej nad głową zwierzęcia, za pomocą cienkich nożyczek odetnij osierdzie i podłącz igłę o rozmiarze 23 do aparatu perfuzyjnego. Włóż igłę do lewej komory i powoli wsuń igłę do aorty bez nakłuwania tkanki. Gdy igła jest na miejscu, rozpocznij infuzję tkanki PBS z prędkością 15 mililitrów na minutę i użyj końcówek cienkich nożyczek, aby szybko wykonać małe nacięcie w prawym przedsionku.Gdy drenaż jest czysty i można zaobserwować rozjaśniony kolor wątroby, zatrzymaj perfuzję i uwolnij pęcherz z szypułek naczyniowych i cewki moczowej, a następnie umieść pęcherz w probówce mikrowirówkowej zawierającej lodowaty roztwór Tyrode. Aby przygotować zawiesinę jednokomórkową, po zebraniu wszystkich pęcherzy, należy rozerwać 1,5-mililitrową probówkę wirówkową zawierającą 100 mikrolitrów roztworu Tyrode'a. Po zważeniu zmiel pęcherze na 10-centymetrowej szalce Petriego zawierającej 100 mikrolitrów roztworu Tyrode'a i użyj końcówki pipety o szerokim otworze, aby przenieść fragmenty tkanek do 2,5 mililitra buforu trawiennego na pęcherz.Inkubować tkankę przez 40 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza na mieszalniku nutatorowym i użyć pięciomililitrowej pipety do rozcierania próbki przez jedną minutę przed zebraniem zdysocjowanych komórek i tkanek przez odwirowanie. Ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze roztworu do odrywania komórek i umieścić komórki w mikserze nutatora na dodatkowe 10 minut. Pod koniec inkubacji zebrać komórki za pomocą kolejnego wirowania i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze buforu do lizy krwinek czerwonych.Po jednej minucie przerwij lizę z dodatkiem dziewięciu mililitrów PBS i przefiltruj komórki przez sitko o średnicy 70 mikrometrów do probówki o pojemności 50 mililitrów, a następnie ponownie odwiruj komórki i ponownie zawieś osad w 200 mikrolitrach buforu barwiącego uzupełnionego blokiem FC. Po 10-minutowej inkubacji na lodzie, zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości głównej mieszaniny przeciwciał sprzężonych z fluoroforem przez 20 minut na lodzie chronionym przed światłem. Pod koniec inkubacji przemyć komórki jednym mililitrem buforu do barwienia komórek i ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach świeżego buforu do barwienia komórek uzupełnionego pięcioma mikrolitrami FITC Aneksyny V i jednym mikrolitrem jodku propidyny.Po 15 minutach w temperaturze pokojowej dodać 400 mikrolitrów buforu wiążącego aneksynę do komórek i wymieszać przez inwersję. Aby przeanalizować komórki za pomocą cytometrii przepływowej, najpierw użyj niebarwionej próbki komórek, aby ustawić parametry rozpraszania bocznego i przedniego komórek, a następnie zmierz emisję fluorescencji na głębokości 530 nanometrów i większej niż 575 nanometrów, aby wykluczyć martwe komórki. Użyj siatek na każdej plamie punktowej, aby zdefiniować populację ujemną w pierwszym rozpadzie i użyj kontrolek fluorescencja minus jeden, aby skorygować nakładanie się widma, aż ujemne i dodatnie pochodne populacji zostaną wyrównane.Następnie zmierz 100 000 zdarzeń w komórkach za pomocą określonych markerów będących przedmiotem zainteresowania, tworząc w razie potrzeby bramki dla interesujących populacji komórek. Po uruchomieniu wszystkich próbek należy przeanalizować dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej. Kolagen 1A1, kolagen 3A1, kolagen 1A2 i kolagen 6A1 to najliczniejsze typy kolagenu występujące w pęcherzu myszy.Analiza mająca na celu określenie poziomów ekspresji mRNA kolagenu pierwszego, trzeciego, szóstego i hialuronianu ujawnia, że ekspresja tych składników macierzy zewnątrzkomórkowej jest bardziej rozpowszechniona w populacjach komórek mezenchymalnych niż w nabłonku dróg moczowych. Analiza cytometrii przepływowej wskazuje, że wiele różnych protokołów trawienia enzymatycznego daje wysoce żywotne populacje komórek, przy czym trzeci protokół trawienia zastosowany w tej analizie został uznany za najbardziej skuteczny w zachowaniu komórek. Stosując tę metodę, można uzyskać znaczny wzrost całkowitej liczby komórek wyizolowanych z pęcherzy myszy z uszkodzeniem rdzenia kręgowego w celu porównania go z pęcherzami kontrolnymi.W porównaniu z grupą kontrolną, pęcherze moczowe zwierząt z urazem rdzenia kręgowego wykazują również znaczny wzrost komórek CD45-dodatnich. Krok 7.1 jest ważny dla identyfikacji populacji sercowej. Strategia bramkowania powinna być oparta na komórkach będących przedmiotem zainteresowania.Pęcherze moczowe zwierząt SCI mają odrębną populację komórek. Protokół ten może być używany do sortowania komórek, pierwotnej hodowli komórek, sekwencjonowania pojedynczych komórek i innych procedur cząsteczkowych i komórkowych, które wymagają żywotnych pojedynczych komórek. Protokół ten zapewnia wysoką żywotność, a tym samym niską utratę populacji komórek, co jest kluczowym punktem dla technik analizy pojedynczych komórek, takich jak sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki.

a-single-cell-dissociation-approach-for-molecular-analysis-urinary

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja dorosłych komórek macierzystych z miękkich tkanek układu mięśniowo-szkieletowego na podstawie szybkości przylegania komórek do kolby.

Izolowanie komórek macierzystych z miękkich tkanek mięśniowo-szkieletowych

Opisano zoptymalizowaną procedurę oczyszczania neuronalnych progenitorów pochodzących z grzebienia neuronalnego z tkanek zarodkowych myszy. Metoda ta wykorzystuje ekspresję fluorescencyjnych alleli reporterowych do izolowania odrębnych populacji za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS). Technikę tę można zastosować do izolowania neuronalnych subpopulacji na różnych etapach rozwoju lub z tkanek dorosłych.

Zoptymalizowana procedura izolacji autonomicznych progenitorów neuronalnych z narządów trzewnych płodów myszy przy użyciu sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS)

Źródło: Yang, E. i inni. Izolacja pojedynczych społeczności bakteryjnych wewnątrzkomórkowych uzyskanych na podstawie modelu myszego zakażenia dróg moczowych do analizy pojedynczych komórek w dalszej fazie. J. Vis. Exp. (2019)Ten film demonstruje ręczną izolację pojedynczych komórek nabłonkowych zawierających wewnątrzkomórkowe społeczności bakteryjne z zakażonego pęcherza mysiego za pomocą mikropipetowania w jamie ustnej, umożliwiając dalszą analizę pojedynczych komórek populacji E. coli...

Izolacja komórek nabłonkowych pęcherza myszy zawierających wewnątrzkomórkowe społeczności bakteryjne

Ustalony model przezcewkowego cewnikowania myszy pozwala na badanie patologii pęcherza moczowego, w tym infekcji dróg moczowych, ale może być wykonywane tylko u samic. Zaprezentowany tu nowy model wkraplania przezcewkowego u mężczyzn umożliwi prowadzenie badań w obszarze charakteryzującym się silnymi różnicami klinicznymi i epidemiologicznymi między płciami.

Zakażenie dróg moczowych w modelu małego zwierzęcia: cewnikowanie przezcewkowe samców i samic myszy

Tutaj demonstrujemy działanie modelu minimalnego uszkodzenia rdzenia kręgowego u dorosłej myszy, która oszczędza centralną niszę kanałową, w której znajdują się endogenne nerwowe komórki macierzyste (NSC). Pokazujemy, w jaki sposób test neurosfery można wykorzystać do ilościowego określenia aktywacji i migracji ostatecznych i pierwotnych NSC po urazie.

Test neurosfery do oceny endogennej aktywacji nerwowych komórek macierzystych w mysim modelu minimalnego uszkodzenia rdzenia kręgowego

Ten protokół opisuje prostą metodę izolowania pojedynczych, zainfekowanych komórek nabłonka pęcherza moczowego od mysiego modelu infekcji dróg moczowych.

Izolacja pojedynczych wewnątrzkomórkowych zbiorowisk bakteryjnych wygenerowanych z mysiego modelu infekcji dróg moczowych do dalszej analizy pojedynczych komórek

Ten protokół próbuje ustalić powtarzalny protokół dla pierwotnych neuronów i izolacji gleju z pęcherza szczura dla dalszych eksperymentów komórkowych.

Izolacja i hodowla pierwotnych neuronów i gleju z pęcherza moczowego dorosłego szczura

Ten protokół dysocjacji komórek nerwowych jest przeznaczony dla próbek z małą ilością materiału wyjściowego i daje wysoce żywotną zawiesinę pojedynczej komórki do dalszej analizy, z opcjonalnymi etapami utrwalania i barwienia.

Połączona mechaniczna i enzymatyczna dysocjacja tkanki hipokampa mózgu myszy

Ten protokół opisuje proces generowania i charakterystyki mysich organoidów urotelialnych zawierających delecje w interesujących genach. Metody obejmują pobieranie mysich komórek urotelialnych, transdukcję ex vivo z adenowirusem napędzającym ekspresję Cre za pomocą promotora CMV oraz charakterystykę in vitro i in vivo.

Ex vivo Organoidalny model delecji genów za pośrednictwem adenowirusa-cre w mysich komórkach urotelialnych

Ten protokół opisuje izolację oczyszczonych astrocytów i mikrogleju z rdzenia kręgowego dorosłej myszy, ułatwiając późniejsze zastosowania, takie jak analiza RNA i hodowla komórek. Zawiera szczegółowe metody i procedury dysocjacji komórek mające na celu poprawę zarówno jakości, jak i wydajności izolowanych komórek.

Izolacja czystych astrocytów i mikrogleju z rdzenia kręgowego dorosłej myszy do testów in vitro i badań transkryptomicznych

To badanie przedstawia dwie kluczowe techniki eksperymentalne: budowę mysiego modelu rany do oceny zamknięcia rany oraz przygotowanie zawiesin jednokomórkowych z mysiej skóry w celu zachowania żywotności komórek.

Modele ran u myszy i przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek

Poznaj metodę dysocjacji pojedynczych komórek do analizy pęcherza moczowego u myszy po urazie rdzenia kręgowego. Technika zapewnia wysoką żywotność komórek i wierną reprezentację izolowanych typów komórkowych.

Metoda dysocjacji pojedynczych komórek do analizy molekularnej pęcherza moczowego u myszy po urazie rdzenia kręgowego

Przeglądaj więcej filmów