Ocena zaangażowania komórek w cele przez inhibitory fosfatazy SHP2 (PTPN11)

Tyrozynowa fosfataza SHP2 jest kluczowym mediatorem sygnalizacji komórkowej, wspierając przeżywalność i proliferację komórek. Mój zespół koncentruje się na znalezieniu inhibitorów SHP2 w małych cząsteczkach do leczenia nowotworów. Nasza technika zapewnia szybką i skuteczną metodę ustalania penetrantów komórek, a także celowego zaangażowania inhibitorów SHP2 w komórkach.

To zapewnia, że zasoby do odkrywania są skutecznie kierowane. SHP2 jako atrakcyjny cel terapii nowotworowej. Kilka inhibitorów SHP2 jest w badaniach klinicznych.

Nasza technika ułatwiająca odkrywanie inhibitorów nowej generacji o lepszych profilach skuteczności. Procedurę demonstrują Celeste Romero, asystentka badawcza, oraz Douglas Sheffler, adiunkt badawczy z naszego laboratorium. Aby rozpocząć odłączenie limfocytów T HEK293 od płytek, używając trzech mililitrów odczynnika odłączającego komórki.

Rozcieńcz komórki 12 mililitrami medium wzrostu i zbieraj je przez wirowanie przy 1 400 razy G przez cztery minuty. Ponownie zawiesij podniebienie komórkowe w 10 mililitrach pożywki wzrostu i zmierz stężenie oraz żywotność komórek za pomocą trypanowego niebieskiego i licznika komórek. Płyta 700 000 wykładniczo rozmieszcza komórki w każdej studni na sześciodołowej płycie hodowli i inkubuje je przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Następnego dnia rozcieńcz dwa mikrogramy plazmowego DNA do 200 mikrolitrów buforu transfekcyjnego. Zrób vortex plazmowego DNA przez 10 sekund i centralizuj je na 1 400 razy G przez cztery minuty. Dodaj cztery mikrolitry odczynnika transfekcyjnego do rozcieńczonego DNA.

Zrób to w wirze przez 10 sekund, a potem powtórz wirowanie. Inkubuj DNA w temperaturze 23 stopni Celsjusza przez 10 minut, następnie dodaj mieszankę transfekcyjną do przymocowanych komórek T HEK293 w płytce sześciodołkowej i przekładaj komórki do inkubatora na kolejne 24 godziny. Aby przygotować płytki testowe, rozcieńcz roztwory inhibitorów w DMSO, dla stężenia 10 milimolarów i podawaj je do płytki źródłowej o niskiej martwej objętości 384 dołków, do natychmiastowego użytku.

Zlokalizuj pożądaną objętość inhibitorów lub nośnika, używając obsługi cieczy w płytkach PCR o długości 384 dołków w czasie rzeczywistym przy docelowej objętości końcowej poniżej 0,5% DMSO. Uszczelnij płyty za pomocą uszczelniacza płytowego z oczyszczaniem gazów obojętnych. Aby przygotować transfekowane komórki, preinkubować podłoże wzrostu i sprzedawać odczynnik odłączający w kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Wyjmij komórki z inkubatora i delikatnie zasysaj podłoże z dołków. Dodaj 0,3 mililitra odczynnika odłączającego komórkę do każdego dołka i delikatnie kołysz płytę tam i z powrotem, aby dokładnie pokryć powierzchnię dna płytki. Inkubuj płytkę w temperaturze 23 stopni Celsjusza przez dwie minuty.

Dodaj po mililitrze podłoża do każdego dołku i delikatnie pipetuj komórki w dołku. Następnie przenieś je do 15-mililitrowej rurki wirówki Falcon. Wiruj komórki w temperaturze 1 400 razy G przez cztery minuty, aby zebrać komórki. Delikatnie aspiruj podłoże, a następnie ponownie zawiesuj osad komórkowy w dwóch mililitrach pożywki wzrostowej.

Upewnij się, że żywotność komórek przekracza 90%, stosując pan-blue i licznik komórek. Rozcieńcz komórki do stężenia 125 komórek na mikrolitr, utrzymując komórki w zawiesie nie dłużej niż dwie godziny, aby zapewnić optymalną żywotność. Do inkubacji inhibitorami SHP2 należy przeprowadzić komórki do sterylnego jednokanałowego roztworu.

Wiruj wcześniej przygotowaną płytkę PCR o pojemności 384 dołków w czasie rzeczywistym o temperaturze 2 500 razy G przez pięć minut, następnie zdejmij uszczelkę i użyj pipety wielokanałowej o pojemności 125 mikrolitrów, aby dodać pięć mikrolitrów rozcieńczonych komórek do pożądanych dołków. Wiruj płytę w 42-krotnym G przez 30 sekund bez pokrywki, następnie przymocuj pokrywkę i inkubuj ją przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Zaprogramuj cykler termo zgodnie z instrukcjami z rękopisu dla eksperymentu gradientu profilu termicznego lub eksperymentu izotermicznego.

Rozpocznij program termocyklera do impulsów cieplnych i umieść płytkę testową na bloku termicznym. Po zakończeniu programu usuń płytkę testową. Uzupełnij każdą jamkę płytki testowej pięcioma mikrolitrami licencjonowanej mieszanki do wykrywania testów.

Wiruj płytę w 42-krotnym G przez 30 sekund i przechowywaj w temperaturze 23 stopni Celsjusza w ciemności przez 30 do 60 minut. Mierz chemiluminescencję za pomocą czytnika mikropłyt z optymalnym czasem integracji. Eksperyment gradientu termicznego dla dzikiego typu SHP2 dał sigmoidalny profil termiczny komórkowy z wąskim przejściem topnienia, typowym dla białka fałdowanego.

Inkubacja dzikiego typu SHP2 z inhibitorem allosterycznym SHP099, ustabilizowana do profilu termicznego w znaczącym i mierzalnym stopniu. Stabilizacja SHP2 również została powiązana z mocą SHP099 podobnych do związków alosterycznych. Przy 10 mikromolach silniejszy RMC-4550 zapewniał większy stopień stabilizacji niż SHP099 dla dzikiego typu SHP2.

Ze względu na swój unikalny mechanizm, inhibitory allosteryczne podobne do SHP099 są mniej skuteczne przeciwko wielu onkogennym mutantom SHP2, w tym SHP2-E76K. Zgodnie z tymi znanymi właściwościami obserwuje się jedynie marginalną stabilizację termiczną SHP2-E76K przez SHP099. Poziom ekspresji białka tagu EPL może znacząco wpływać na intensywność sygnału.

Profile termiczne dla komórek typu dzikiego przejściowego i stabilnie zintegrowanego. Pokazano w identycznych warunkach aktywów. Normalizacja rozproszonych krzywych pozwala uzyskać porównywalne profile termiczne, ujawniając szeroki zakres systemu detekcji EFC.

Wykorzystując zdolność termicznego cyklera do generowania gradientów termicznych na krótkiej osi płytki o pojemności 384 otworów. na jednej płycie można wykonać serię miareczek izotermicznych. W optymalnej temperaturze, izotermiczna miareczkowanie z użyciem pełnych 10 punktów Dawka-Odpowiedź dało użyteczny wynik EC50, dla RMC-4550.

Zasady tego zasobu mogłyby być wykorzystane do monitorowania degradacji białek w komórkach, wywołanej przez związki PROTOC. Stosujemy technikę przesunięcia Thelmy komórkowej, aby odkryć inhibitory mutantów SHP2 i białaczek, leki specyficzne przeciwko częstym mutantom onkogennym SHP2, które będą miały istotny wpływ na leczenie tych nowotworów.