Name: Ocena zaangażowania komórek w cele przez inhibitory fosfatazy SHP2 (PTPN11) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Poznaj metodę oceny zaangażowania celu przez inhibitory SHP2 w komórkach HEK293 przy użyciu testu termicznego w formacie 384-well. Ta technika wspiera odkrywanie leków przeciwnowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te zostały wsparte przez grant National Institutes of Health 1R21CA195422 (dla L. T.), Epstein Family Foundation Award (dla N. D. P.C.) oraz grant wsparcia NCI Cancer Center P30CA030199. Dodatkowo, projekt ten został w całości lub częściowo finansowany ze środków federalnych z National Cancer Institute, National Institutes of Health, w ramach umowy Chemical Biology Consortium nr HHSN261200800001E. Treść tej publikacji niekoniecznie odzwierciedla poglądy lub politykę Departamentu Zdrowia i Opieki Społecznej, ani wzmianka o nazwach handlowych, produktach komercyjnych czy organizacjach nie sugeruje poparcia przez rząd USA. Treść jest wyłącznie odpowiedzialnością autorów i niekoniecznie odzwierciedla oficjalne poglądy Narodowych Instytutów Zdrowia.

1. Przygotowanie hodowli komórkowych i odczynników
<ol>
	<li>Sformułuj butelkę 500 mL podłoża wzrostowego z 10% surowicy bydlęcej płodu, 1 razem antybiotyku/leku przeciwmikotycznego, 20 mM HEPES i 1 mM pirorurianianu sodu. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Rozmroź komórkowe odczynniki termiczne (odczynnik EA, bufor lizy i podłoże) z mrożonych oryginalnych butelek.</li>
	<li>Podawaj odczynniki i bufor w formie 2 mL aliquotów i przechowuj w temperaturze -20 °C. UWAGA: Unikaj zamrożenia/rozmrażania dla powtarzalności i używaj tylko takiej ilości odczynnika potrzebnej do procesu testowania.</li>
</ol>
2. Wzrost i utrzymanie komórek HEK293T
<ol>
	<li>Uzyskaj komórki HEK293T o niskim przepustku z magazynu kriogenicznego.</li>
	<li>Utrzymuj HEK293T komórki w podłożu wzrostu w temperaturze 37 °C, 5%CO2.</li>
	<li>Rozdzielaj komórki co 4 dni w proporcji 1:14. UWAGA: Dla najlepszej wydajności HEK293T komórki nie mogą przejść dłużej niż 25 razy.</li>
</ol>
3. HEK293T przygotowanie komórek do transfekcji przejściowej
<ol>
	<li>Odłącz HEK293T ogniwa od płytek 16 mL, używając 3 mL odczynnika odłączającego komórkę.</li>
	<li>Rozcieńcz 12 mL podłoża wzrostowego. Zbieraj komórki przez wirowanie w 1 400 x g przez 4 minuty.</li>
	<li>Ponownie zawiesij granulek w podłożu do wzrostu o pojemności 10 mL. Zmierz stężenie i żywotność komórek za pomocą trypanowego niebieskiego i licznika komórek.</li>
	<li>Płytka 7,0 x 10 5 wykładniczo rosnąca HEK293T komórek na dołek w 6-dołkowej płytce hodowli komórek około 24 godziny przed transfekcją. UWAGA: Zarezerwuj jeden dołek na transfekcję każdego plazmidu.</li>
	<li>Inkubuj przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, 5%CO2.</li>
</ol>
4. Transfekcja komórek HEK293T
<ol>
	<li>Z oczyszczonego zapasu plazmidów pICP-ePL-N-SHP2-WT lub pICP-ePL-N-SHP2-E76K (~200 ng/μL) rozcieńcz 2 μg DNA plazmidowego do 200 μL buforu transfekcyjnego.</li>
	<li>Wiruj przez 10 sekund i wirówkę z 1 400 x g przez 4 minuty.</li>
	<li>Dodaj 4 μL odczynnika transfekcyjnego do rozcieńczonego DNA. Wiruj przez 10 sekund i wirówkę z 1 400 x g przez 4 minuty.</li>
	<li>Inkubuj w temperaturze 23 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Usuń płytkę z 6 dołkami zawierającą rosnące HEK293T komórki z inkubatora. Dodaj mieszankę transfekcyjną do przymocowanych komórek na płytce 6-dołkowej. Inkubuj przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, 5%CO2.</li>
</ol>
5. Przygotowanie płytek testowych
<ol>
	<li>Przygotuj 10 mM roztworów zapasowych w DMSO z związkami do testu.</li>
	<li>Roztwory inhibitorów należy wydać do płytki źródłowej o niskiej martwej objętości o pojemności 384 dołków do natychmiastowego użycia.</li>
	<li>Określ pożądaną objętość inhibitorów lub nośnika (DMSO) za pomocą płynowego urządzenia do płytek PCR z 384 dołkami w czasie rzeczywistym przy docelowej objętości końcowej poniżej 0,5% DMSO (v/v). Uszczelnij płytę za pomocą uszczelniacza z oczyszczaniem gazów obojętnych. UWAGA: W przypadku testów dawka-odpowiedź inhibitora należy odpowiednio uzupełnić DMSO, aby dla każdego stężenia inhibitora były stosowane równe ilości DMSO. Dla najlepszych rezultatów przechowuj talerze w temperaturze 23 °C i używaj w ciągu 24 godzin.</li>
</ol>
6. Odłączenie i przygotowanie komórek transfekowanych
<ol>
	<li>Preinkubuj podłoże wzrostu i odczynnik odłączający komórkę w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Usuń transfekowane komórki z inkubatora. Delikatnie zasysaj medium z wgłębień płyty. UWAGA: Użyj nowego aspiratora dla każdego dołka zawierającego inny transfekowany plazmid.</li>
	<li>Dodaj 0,3 mL odczynnika odłączającego komórkę. Delikatnie kołysz talerzem tam i z powrotem, aby dokładnie zakryć powierzchnię dna talerza. Inkubuj w temperaturze 23 °C przez 2 minuty.</li>
	<li>Dodaj 1 ml podłoża do każdego dołu. Delikatnie pipetować podłoże i komórki do studni i przelać do 15 mL rurki wirówki Falcon. Zbieraj komórki przez wirowanie w 1 400 x g przez 4 minuty.</li>
	<li>Delikatnie, ale dokładnie odpompuj z podłoża. UWAGA: Resztki czerwieni fenolowej w odczynniku odłączającym komórkę mogą zakłócać działanie testu.</li>
	<li>Ostrożnie ponownie zawiesnij pellet komórkowy w 2 mL podłoża wzrostowego. Zmierz stężenie i żywotność komórek za pomocą trypanowego niebieskiego i licznika komórek. UWAGA: Żywotność komórek powinna wynosić > 90%, aby uzyskać najlepsze rezultaty.</li>
	<li>Rozcieńcz komórki do stężenia 125 komórek/μL. Na przykład dla testu 5 μL to ~625 komórek/μL. Dla optymalnej żywotności utrzymuj komórki w zawiesinie nie dłużej niż 2 godziny.</li>
</ol>
7. Inkubacja komórek z inhibitorami SHP2
<ol>
	<li>Komórki wydawaj do sterylnej jednokanałowej koryty.</li>
	<li>Wirówka 384-dołkowa płyta PCR w czasie rzeczywistym, przygotowana wcześniej przez depozycję inhibitora SHP2 w dawce 2 500 x g przez 5 minut w 23 °C.</li>
	<li>Usuń uszczelkę z płyty złożonej. Używając pipety wielokanałowej o pojemności 125 μL, dodaj 5 μL rozcieńczonych komórek do pożądanych dołków.</li>
	<li>Wiruj płytę w 42 x g przez 30 sekund bez pokrywki na płytce. Po jej obrócie przymocuj uszczelkę pokrywy i inkubuj płytkę testową w temperaturze 37 °C, 5%CO2 przez 1 godzinę.</li>
</ol>
8. Przygotowanie chemiluminescencyjnej mieszanki głównej odczynników
<ol>
	<li>Usuń niezbędną ilość odczynników detekcyjnych (odczynnik EA, bufor lizy i podłoże) z magazynu o temperaturze -20 °C po powleknięciu komórek. Odmrażają odczynniki w temperaturze 23 °C. UWAGA: Dla wygody transferu przygotuj objętość 1,5 razy całkowitą objętość komórek zdeponowanych na płytce. Nie używaj odczynników ponownie po użyciu.</li>
	<li>Przygotuj mieszankę główną odczynników według warunków EA-10, która składa się z ułamków składników i objętościowych w następujący sposób: odczynnik EA (0,17), bufor lizy (0,17), substrat (0,67). UWAGA: Proporcje odczynników opierają się na eksperymentach optymalizacyjnych przeprowadzanych zgodnie z instrukcjami dostawcy określonymi.</li>
</ol>
9. Impuls cieplny gradientu izotermicznego lub profilu termicznego
<ol>
	<li>Zaprogramuj termocykler zdolny do gradientu do dostarczania impulsu cieplnego.<ol>
		<li>W eksperymentach z gradientem profilu termicznego należy wstępnie zaprogramować termocykler według następujących przykładowych specyfikacji:</li>
		<li>Impuls cieplny: 3 minuty pożądanej temperatury topnienia (gradient pionowy lub poziomy +/- 15 °C; przykład 38-68 °C rozłożony na 24 otworach daje przyrosty temperatury o 1,25 °C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Krok odzyskiwania równowagi: 3 min 20 °C z prędkością rampy = 1 °C/s<ol>
		<li>Do eksperymentów izotermicznych ustaw protokół następujący:</li>
		<li>Impuls cieplny: 3 min 55 °C. Krok odzyskiwania równowagi: 3 min 20 °C z prędkością rampy = 1°C/s UWAGA: Aby zwiększyć powtarzalność, ponieważ może być trudno dokładnie umieścić płytę w momencie, gdy termocykler osiągnie pożądaną temperaturę, ustaw program tak, by odliczał 15 sekund przed rozpoczęciem 3-minutowego impulsu. W przypadku termocyklera używanego w tym eksperymencie zobacz Tabelę materiałów, pokrywa jest utrzymywana podczas impulsu cieplnego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
10. Wykrywanie i pomiar lizy
<ol>
	<li>Uzupełnij płytki testowe mieszanką główną do wykrywania lizy, dodając do każdej jamki do analizy za pomocą pipety wielokanałowej dodając równe objętości (5 μL).</li>
	<li>Wiruj płytę 42 x g przez 30 sekund. Przechowuj w 23 °C w ciemności przez 30-60 minut.</li>
	<li>Mierz chemiluminescencję za pomocą czytnika mikropłytek zdolnego do wykrywania luminescencji w formacie 384-dołkow. Wykonaj pomiar luminescencji z zoptymalizowanym typem płyty i czasem integracji (czas integracji 1000 ms, czas stabilizacji 0 s). Mierz wartości jako liczby/s i wyniki do dalszej analizy.</li>
</ol>
11. Analiza danych
<ol>
	<li>Analizuj dane luminescencji za pomocą naukowego oprogramowania do grafiki 2D i statystyki.</li>
	<li>Generuj profile termiczne poprzez analizę znormalizowanych danych luminescencji (znormalizowanych do sterowania pojazdem) za pomocą regresji nieliniowej i modelu sigmoidalnego Boltzmanna. UWAGA: W eksperymentach z profilami termicznymi obliczona wartość V50, czyli temperatura będąca punktem pośrednim między dolną a górną częścią krzywej, definiuje temperaturę topnienia SHP2. W eksperymentach izotermicznych EC50 definiuje stężenie inhibitora, które daje odpowiedź półmaksymalną.</li>
</ol>

<ol><li>Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+phosphorylation%3A+thirty+years+and+counting%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tyrosine phosphorylation: thirty years and counting.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21 (2), 140-146 (2009).</li>
<li>Alonso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+tyrosine+phosphatases+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Protein tyrosine phosphatases in the human genome.</a> Cell. 117 (6), 699-711 (2004).</li>
<li>Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinases-the+major+drug+targets+of+the+twenty-first+century%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Protein kinases-the major drug targets of the twenty-first century.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 1 (4), 309(2002).</li>
<li>Ferguson, F. M., Gray, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinase+inhibitors%3A+the+road+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Kinase inhibitors: the road ahead.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (5), 353-377 (2018).</li>
<li>Stanford, S. M., Bottini, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Tyrosine+Phosphatases%3A+Time+to+End+the+Stigma%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Targeting Tyrosine Phosphatases: Time to End the Stigma.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 38 (6), 524-540 (2017).</li>
<li>Tonks, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+tyrosine+phosphatases--from+housekeeping+enzymes+to+master+regulators+of+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Protein tyrosine phosphatases--from housekeeping enzymes to master regulators of signal transduction.</a> FEBS Journal. 280 (2), 346-378 (2013).</li>
<li>Chan, R., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTPN11+is+the+first+identified+proto-oncogene+that+encodes+a+tyrosine+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">PTPN11 is the first identified proto-oncogene that encodes a tyrosine phosphatase.</a> Blood. 109 (3), 862-867 (2007).</li>
<li>Chan, G., Kalaitzidis, D., Neel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tyrosine+phosphatase+Shp2+%28PTPN11%29+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">The tyrosine phosphatase Shp2 (PTPN11) in cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 27 (2), 179-192 (2008).</li>
<li>Hof, P., Pluskey, S., Dhe-Paganon, S., Eck, M., Shoelson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+tyrosine+phosphatase+SHP-2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the tyrosine phosphatase SHP-2.</a> Cell. 92 (4), 441-450 (1998).</li>
<li>Barford, D., Neel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+mechanisms+for+SH2+domain+mediated+regulation+of+the+protein+tyrosine+phosphatase+SHP-2%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Revealing mechanisms for SH2 domain mediated regulation of the protein tyrosine phosphatase SHP-2.</a> Structure. 6 (3), 249-254 (1998).</li>
<li>Neel, B. G., Chan, G., Dhanji, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNeel%2C+BG+%22Handbook+of+Cell+Signaling+%28Second+Edition%29%22">Handbook of Cell Signaling (Second Edition)</a>. 2, Academic Press. Amsterdam. 771-809 (2010).</li>
<li>Tartaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+PTPN11%2C+encoding+the+protein+tyrosine+phosphatase+SHP-2%2C+cause+Noonan+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome.</a> Nature Genetics. 29 (4), 465-468 (2001).</li>
<li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell+death+1+forms+negative+costimulatory+microclusters+that+directly+inhibit+T+cell+receptor+signaling+by+recruiting+phosphatase+SHP2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2.</a> Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).</li>
<li>Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+immunoreceptor+inhibits+B+cell+receptor-mediated+signaling+by+recruiting+src+homology+2-domain-containing+tyrosine+phosphatase+2+to+phosphotyrosine%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (24), 13866-13871 (2001).</li>
<li>Watanabe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BTLA+is+a+lymphocyte+inhibitory+receptor+with+similarities+to+CTLA-4+and+PD-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">BTLA is a lymphocyte inhibitory receptor with similarities to CTLA-4 and PD-1.</a> Nature Immunology. 4 (7), 670-679 (2003).</li>
<li>Bialy, L., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+protein+tyrosine+phosphatases%3A+next-generation+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition+England%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of protein tyrosine phosphatases: next-generation drugs.</a> Angewandte Chemie International Edition England. 44 (25), 3814-3839 (2005).</li>
<li>Kumar, S., Liang, F., Lawrence, D., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+approach+to+studying+protein+tyrosine+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Small molecule approach to studying protein tyrosine phosphatase.</a> Methods. 35 (1), 9-21 (2005).</li>
<li>Tautz, L., Pellecchia, M., Mustelin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+PTPome+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+in+Thereapeutics+Targets%22%5BJournal%5D)">Targeting the PTPome in human disease.</a> Expert Opinion in Thereapeutics Targets. 10 (1), 157-177 (2006).</li>
<li>Tautz, L., Mustelin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+developing+protein+tyrosine+phosphatase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Strategies for developing protein tyrosine phosphatase inhibitors.</a> Methods. 42 (3), 250-260 (2007).</li>
<li>Vintonyak, V., Antonchick, A., Rauh, D., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+potential+of+phosphatase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">The therapeutic potential of phosphatase inhibitors.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 13 (3), 272-283 (2009).</li>
<li>Barr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+tyrosine+phosphatases+as+drug+targets%3A+strategies+and+challenges+of+inhibitor+development%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Protein tyrosine phosphatases as drug targets: strategies and challenges of inhibitor development.</a> Future Medicinal Chemistry. 2 (10), 1563-1576 (2010).</li>
<li>He, R., Zeng, L., He, Y., Zhang, S., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+tools+for+functional+interrogation+of+protein+tyrosine+phosphatases%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Small molecule tools for functional interrogation of protein tyrosine phosphatases.</a> FEBS Journal. 280, 731-750 (2012).</li>
<li>Tsutsumi, R., Ran, H., Neel, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-target+inhibition+by+active+site-targeting+SHP2+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Off-target inhibition by active site-targeting SHP2 inhibitors.</a> FEBS Open Biology. 8 (9), 1405-1411 (2018).</li>
<li>Chen, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+inhibition+of+SHP2+phosphatase+inhibits+cancers+driven+by+receptor+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Allosteric inhibition of SHP2 phosphatase inhibits cancers driven by receptor tyrosine kinases.</a> Nature. 535 (7610), 148-152 (2016).</li>
<li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAS+nucleotide+cycling+underlies+the+SHP2+phosphatase+dependence+of+mutant+BRAF-%2C+NF1-+and+RAS-driven+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">RAS nucleotide cycling underlies the SHP2 phosphatase dependence of mutant BRAF-, NF1- and RAS-driven cancers.</a> Nature Cell Biology. 20 (9), 1064-1073 (2018).</li>
<li>Clinical Trial NCT03114319. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1</a> (2019).</li>
<li>Clinical Trial NCT03634982. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1</a> (2019).</li>
<li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+inhibition+of+leukemia-associated+SHP2%28E69K%29+mutant+by+the+allosteric+SHP2+inhibitor+SHP099%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Selective inhibition of leukemia-associated SHP2(E69K) mutant by the allosteric SHP2 inhibitor SHP099.</a> Leukemia. 32 (5), 1246-1249 (2018).</li>
<li>LaRochelle, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+reorganization+of+SHP2+by+oncogenic+mutations+and+implications+for+oncoprotein+resistance+to+allosteric+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Structural reorganization of SHP2 by oncogenic mutations and implications for oncoprotein resistance to allosteric inhibition.</a> Nature Communication. 9 (1), 4508(2018).</li>
<li>Padua, R. A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+activating+mutations+and+allosteric+drug+inhibition+of+the+phosphatase+SHP2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Mechanism of activating mutations and allosteric drug inhibition of the phosphatase SHP2.</a> Nature Communication. 9 (1), 4507(2018).</li>
<li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+allosteric+SHP2+inhibition+in+FGFR-driven+cancers+through+rapid+feedback+activation+of+FGFR%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Resistance to allosteric SHP2 inhibition in FGFR-driven cancers through rapid feedback activation of FGFR.</a> Oncotarget. 11 (3), 265-281 (2020).</li>
<li>Smyth, L. A., Collins, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+and+interpreting+the+selectivity+of+protein+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring and interpreting the selectivity of protein kinase inhibitors.</a> Journal of Chemical Biology. 2 (3), 131-151 (2009).</li>
<li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li>
<li>Ericsson, U., Hallberg, B., Detitta, G., Dekker, N., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermofluor-based+high-throughput+stability+optimization+of+proteins+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies.</a> Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).</li>
<li>McNulty, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High-Throughput+Dose-Response+Cellular+Thermal+Shift+Assay+for+Rapid+Screening+of+Drug+Target+Engagement+in+Living+Cells%2C+Exemplified+Using+SMYD3+and+IDO1%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">A High-Throughput Dose-Response Cellular Thermal Shift Assay for Rapid Screening of Drug Target Engagement in Living Cells, Exemplified Using SMYD3 and IDO1.</a> SLAS Discovery. 23 (1), 34-46 (2018).</li>
<li>Romero, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cellular+target+engagement+assay+for+the+characterization+of+SHP2+%28PTPN11%29+phosphatase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A cellular target engagement assay for the characterization of SHP2 (PTPN11) phosphatase inhibitors.</a> Journal of Biological Chemistry. 295 (9), 2601-2613 (2020).</li>
<li>Ran, H., Tsutsumi, R., Araki, T., Neel, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sticking+It+to+Cancer+with+Molecular+Glue+for+SHP2%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Sticking It to Cancer with Molecular Glue for SHP2.</a> Cancer Cell. 30 (2), 194-196 (2016).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie mają żadnych konfliktów interesów z treścią tego artykułu.

Przedstawiliśmy test zaangażowania celu, który może potwierdzić bezpośrednie wiązanie małych cząsteczek z fosfatazą SHP2 w komórkach. Test pozwala rozróżnić inhibitory o niskiej i wysokiej afinitecie oraz, co ważne, potwierdzać brak mocy allosterycznych inhibitorów typu SHP099 dla mutanta SHP2-E76K onkogennego GOF. Siłą tego zminiaturyzowanego testu jest jego zdolność do integracji z kampanią przesiewową inhibitorów SHP2. Zdolność testu do potwierdzenia wewnątrzkomórkowego wiązania SHP2 przez nieznaną materię chemiczną j...

Fosforylacja tyrozyny odgrywa ważną rolę w transdukcji sygnału w komórkach 1,2. Ta modyfikacja potranslowana jest katalizowana przez kinazy tyrozyny białkowe (PTK) i odwracana przez tyrozynowe fosforazy białkowe (PTP). Dlatego nieprawidłowa funkcja PTK lub PTP prowadzi do wielu dziedzicznych lub nabytych chorób ludzkich 3,4,5,6. Fosfataza 2 (SHP2) zawierająca domenę Src-homologia 2 (SHP2) to szeroko eksprimowany typ niereceptorowy PTP kodowany przez protoonkogen PTPN117 i jest kluczowym regulatorem licznych procesów fizjologicznych związanych z transdukcją sygnału poprzez aktywację szlaków sygnalizacyjnych Ras/Raf/ERK, PI3K/Akt lub JAK/STAT8. Zazwyczaj aktywność SHP2 jest ściśle regulowana, aby zapobiec nieprawidłowym sygnalizacji. W warunkach podstawowych SHP2 jest autohamowany przez domenę N-końcową SH2, która blokuje dostęp do aktywnego miejsca w obrębie domeny katalitycznej fosfatazy (Rysunek 1A)9,10. Po aktywacji komórki tyrozynowe fosforylowane białka wiążące rekrutują SHP2, powodując jego aktywną konformację, w której miejsce aktywne jest teraz dostępne dla substratów. W wielu nowotworach aktywność SHP2 jest podwyższona. Mutacje somatyczne zyskujące funkcje (GOF) w PTPN11 zostały zidentyfikowane głównie w białaczkach i zapobiegają wiązaniu domeny N-SH2 z domeną fosfatazą, co skutkuje konstytutywnie aktywnym SHP2 (Rysunek 1B)11. Mutacje linii zarodkowej GOF w PTPN11 odpowiadają za ~50% przypadków zespołu Noonana, zaburzenia rozwojowego o zwiększonym ryzyku nowotworów12. W guzach litych, gdzie mutacje PTPN11 są rzadkie, wyższe poziomy fosforylowanych białek wiążących prowadzą do zwiększonej aktywności SHP2 (Rysunek 1C). SHP2 jest również istotny dla sygnalizacji punktów kontrolnych odporności, ponieważ receptory punktów kontrolnych, takie jak BTLA czy PD-1, rekrutują SHP2 do defosforylacji kluczowych cząsteczek sygnalizacji, zapobiegając aktywacji komórek odpornościowych 13,14,15.
Celowanie w PTP za pomocą małych cząsteczek stanowiło wyzwanie, ponieważ aktywne miejsce PTP jest silnie konserwowane i mocno naładowane; Inhibitory skierowane do miejsca aktywnego są często silne, ale wykazują słabą selektywność i biodostępność doustną 16,17,18,19,20,21,22. Rzeczywiście, wiele zgłaszanych inhibitorów SHP2 cierpi na słabą selektywność i brak skuteczności w komórkach23. Ostatnio zgłoszono allosteryczne inhibitory SHP2 o dobrej silności i doskonałej selektywności (np. SHP09924 oraz RMC-455025), które wzbudziły ponowne zainteresowanie inhibitorami SHP2. Związki oparte na SHP099 i RMC-4550 są obecnie w fazie I badań klinicznych dotyczących leczenia guzów litych za pomocą aktywacji szlaku receptorowo-tyrozynowej (RTK)26,27. Choć są przełomowe, związki te są nieskuteczne przeciwko wielu onkogennym mutantom SHP2, które powodują leukemogenezę u znacznej liczby pacjentów z nowotworami krwi(28,29,30). Brak siły związków podobnych do SHP099 wobec onkogennych wariantów SHP2 wynika z ich unikalnego mechanizmu allosterycznego, ponieważ hamują one aktywność SHP2 poprzez wiązanie i stabilizację nieaktywnej, zamkniętej konformacji, która jest zakłócana u mutantów SHP2. Ponadto, na podstawie niedawnego raportu31, mechanizmy adaptacyjnej oporności u pacjentów leczonych inhibitorami podobnymi do SHP099 są całkiem możliwe. W konsekwencji rozwój inhibitorów SHP2 nowej generacji, które celują w jego aktywny, otwarty stan, jest przedmiotem intensywnych badań.
Charakterystyka nowych inhibitorów SHP2 w komórkach jest istotnym elementem procesu optymalizacji ołowiu. Co istotne, udowodnione zaangażowanie inhibitora w cele w warunkach fizjologicznych zapewnia dodatkowy poziom pewności, że zasoby chemii medycznej są efektywnie wykorzystywane na związkach o obiecującej skuteczności komórkowej. W przeszłości opracowano kilka metod oceny wiązania inhibitorów małych cząsteczek z ich celami, głównie dla kinaz białkowych32. Aby opracować test zaangażowania komórek SHP2, zastosowaliśmy test termiczny33. Test, podobny do testu in vitro thermal shift (PTS) dla białek34, monitoruje stabilność termiczną białka docelowego, która zazwyczaj jest zmieniana przez wiązanie małych cząsteczek. Oryginalny test to test o niskiej przepustowości, który wykorzystuje przeciwciała do ilościowego określania docelowych poziomów białek. Alternatywnie wybraliśmy niedawno opisaną odmianę testu termicznego przesunięcia, która wykorzystuje test komplementacji fragmentów enzymu β-galaktozydazy (EFC) (Rysunek 2)35. W tych eksperymentach interesujące białko jest wyrażane w komórkach jako N- lub C-końcowe białko fuzyjne niosące wzmocniony tag ProLabel (ePL, fragment 42 aminokwasów β-galaktozydazy). Następnie komórki są przenoszone na płytki zgodne z PCR z 384 dołkami i inkubowane z interesującymi się związkami. Termocykler służy do nałożenia gradientu temperatury na komórki, których białka denaturują się i agregują wraz ze wzrostem temperatury w zależności od ich stabilności termicznej. Zdolność związku kandydata do wiązania i stabilizacji interesującego białka prowadzi do zwiększonej stabilności termicznej tego białka. Dlatego po analizie komórek, te oznakowane białka ustabilizowane przez związek kandydatski pozostaną w roztworze w wyższych temperaturach niż oznakowane białka komórek inkubowane z kontrolą pojazdu. Akceptor enzymu reporterowego (EA) jest w stanie uzupełniać rozpuszczalne białka oznaczone ePL, co skutkuje wykrywalną aktywnością β-galaktozydazy przy użyciu luminescencyjnego substratu.
Niedawno opracowaliśmy solidny test przesunięcia termicznego komórkowego dla dzikiego typu SHP2 (SHP2-WT) oraz częstego onkogennego wariantu SHP2 (SHP2-E76K) w zminiaturyzowanym formacie36 z 384 dołkami. Przedstawiamy szczegółowy protokół tego testu, który niezawodnie wykrywa zaangażowanie inhibitorów SHP2 w komórkach i wykazuje wysoki stopień korelacji między mocą inhibitora a danymi termicznymi komórek. Ogólny sposób pracy analizy przedstawiono na Rysunku 3. Nasza platforma wykorzystuje pełnowymiarowe białka fuzyjne ePL-SHP2 z oznakowaniem N-terminalnym. Aby uzyskać odpowiadające im plazmidy ekspresyjne pICP-ePL-N-SHP2-WT oraz pICP-ePL-N-SHP2-E76K, prosimy o zapoznanie się z naszą najnowszą publikacją36. Test ten można wykonać za pomocą gradientu termicznego w celu ustalenia profili termicznych SHP2 oraz określenia temperatur topnienia SHP2 niezależnie od obecności lub braku inhibitora. Po ustaleniu profili termicznych można je również wykonać w warunkach izotermicznych, co umożliwia ocenę dawki i odpowiedzi inhibitora. Oba typy eksperymentów opisano poniżej.

<table><tbody><tr><td>Termocykler wyposażony w gradient z 384 otworami</td><td>Eppendorf AG</td><td>X50h</td><td></td></tr><tr><td>384-dołkowy mikropłytkowy mikropłyt o niskiej martwej objętości kwalifikuje się</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>LP-0200</td><td></td></tr><tr><td>Płytki hodowli komórek 6-dołkowy</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657 160</td><td>Sterylny z pokrywką</td></tr><tr><td>Antybiotyk przeciwmykotyczny (anty-anti-anti) 100 X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Licznik komórek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Hrabina II FL</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10566-016</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Echo akustyczny handler cieczy</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>Echo 550</td><td></td></tr><tr><td>Elektroniczna pipeta wielokanałowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E1 ClipTip</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydła płodowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26140-079</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Bufor HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-680</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Zestaw startowy InCell Pulse</td><td>Eurofins DiscoverX Corp.</td><td>94-4007</td><td>Komponenty to bufor EA, bufor lizy oraz podłoże</td></tr><tr><td>Czytnik mikropłyt</td><td>Tecan Trading AG</td><td>Iskra</td><td></td></tr><tr><td>Jednokanałowa kanałowa dolina roztworu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S253012005</td><td></td></tr><tr><td>Pirorotroczan sodu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360-010</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Termiczna mikropłytowa impregnacja</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>PlateLoc</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki transfekcyjne</td><td>Transfekcja Polyplus</td><td>jetPRIME</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik TrypLE Express</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Płytki PCR Twin.tec 384 w czasie rzeczywistym</td><td>Eppendorf AG</td><td>30132734</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena zaangażowania komórek w cele przez inhibitory fosfatazy shp2 (ptpn11)

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors

Domena Src-homologii 2 (SH2) zawierająca domenę fosfataza 2 (SHP2), kodowana przez protoonkogen PTPN11 , jest kluczowym mediatorem sygnalizacji komórkowej sterowanej kinazą receptorową (RTK), wspierając przeżywalność i proliferację komórek. Ponadto SHP2 jest rekrutowany przez receptory punktów kontrolnych układu odpornościowego, aby hamować aktywację komórek B i T. Nieprawidłowa funkcja SHP2 była powiązana z rozwojem, progresją i przerzutami wielu nowotworów. Rzeczywiście, inhibitory SHP2 na poziomie małych cząsteczek niedawno weszły do badań klinicznych w leczeniu guzów litych z aktywacją szlaku Ras/Raf/ERK, w tym guzów z niektórymi onkogennymi mutacjami Ras. Jednak obecna klasa inhibitorów SHP2 nie jest skuteczna przeciwko onkogennym wariantom SHP2, które często występują w białaczkach, a rozwój specyficznych małych cząsteczek celujących w onkogenny SHP2 jest przedmiotem obecnych badań. Częstym problemem większości kampanii odkrywania leków z udziałem białek cytosolowych, takich jak SHP2, jest to, że główne testy napędzające odkrycia chemiczne to często testy in vitro, które nie raportują zaangażowania związków kandydatów na cele komórkowe. Aby zapewnić platformę do pomiaru zaangażowania celów komórkowych, opracowaliśmy zarówno testy termiczne SHP2 dla typów dzikich, jak i mutantów. Testy te niezawodnie wykrywają zaangażowanie inhibitorów SHP2 w komórkach do celów. Przedstawiamy tutaj kompleksowy protokół tego testu, który stanowi cenne narzędzie do oceny i charakteryzacji inhibitorów SHP2.

Eksperyment gradientu termicznego dla SHP2-WT dał sigmoidalny profil termiczny komórkowy z wąskim przejściem topnienia, który jest typowy i spójny dla białka fałdowanego (Rysunek 4A). SHP2 składa się z trzech niezależnych dziedzin: dwóch domen SH2 oraz dziedziny katalitycznej (Rysunek 1). W autohamowanej zamkniętej konformacji te domeny samoasociują się; Przejście topnienia zaobserwowane w eksperymencie profilu termicznego prawdopodobnie odzwierciedlało ten stan...

Możliwość oceny zaangażowania inhibitorów kandydatów w komórkach nienaruszonych jest kluczowa dla odkrywania leków. Protokół ten opisuje 384-dołkowy test termiczny przesunięcia komórkowego, który niezawodnie wykrywa zaangażowanie inhibitorów celujących w dziki typ SHP2 lub jego warianty onkogenne.

Ocena zaangażowania komórek w cele przez inhibitory fosfatazy SHP2 (PTPN11)

The Src-homology 2 (SH2) domain-containing phosphatase 2 (SHP2), encoded by the PTPN11 proto-oncogene, is a key mediator of receptor tyrosine kinase ...

Tyrozynowa fosfataza SHP2 jest kluczowym mediatorem sygnalizacji komórkowej, wspierając przeżywalność i proliferację komórek. Mój zespół koncentruje się na znalezieniu inhibitorów SHP2 w małych cząsteczkach do leczenia nowotworów. Nasza technika zapewnia szybką i skuteczną metodę ustalania penetrantów komórek, a także celowego zaangażowania inhibitorów SHP2 w komórkach.To zapewnia, że zasoby do odkrywania są skutecznie kierowane. SHP2 jako atrakcyjny cel terapii nowotworowej. Kilka inhibitorów SHP2 jest w badaniach klinicznych.Nasza technika ułatwiająca odkrywanie inhibitorów nowej generacji o lepszych profilach skuteczności. Procedurę demonstrują Celeste Romero, asystentka badawcza, oraz Douglas Sheffler, adiunkt badawczy z naszego laboratorium. Aby rozpocząć odłączenie limfocytów T HEK293 od płytek, używając trzech mililitrów odczynnika odłączającego komórki.Rozcieńcz komórki 12 mililitrami medium wzrostu i zbieraj je przez wirowanie przy 1 400 razy G przez cztery minuty. Ponownie zawiesij podniebienie komórkowe w 10 mililitrach pożywki wzrostu i zmierz stężenie oraz żywotność komórek za pomocą trypanowego niebieskiego i licznika komórek. Płyta 700 000 wykładniczo rozmieszcza komórki w każdej studni na sześciodołowej płycie hodowli i inkubuje je przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Następnego dnia rozcieńcz dwa mikrogramy plazmowego DNA do 200 mikrolitrów buforu transfekcyjnego. Zrób vortex plazmowego DNA przez 10 sekund i centralizuj je na 1 400 razy G przez cztery minuty. Dodaj cztery mikrolitry odczynnika transfekcyjnego do rozcieńczonego DNA.Zrób to w wirze przez 10 sekund, a potem powtórz wirowanie. Inkubuj DNA w temperaturze 23 stopni Celsjusza przez 10 minut, następnie dodaj mieszankę transfekcyjną do przymocowanych komórek T HEK293 w płytce sześciodołkowej i przekładaj komórki do inkubatora na kolejne 24 godziny. Aby przygotować płytki testowe, rozcieńcz roztwory inhibitorów w DMSO, dla stężenia 10 milimolarów i podawaj je do płytki źródłowej o niskiej martwej objętości 384 dołków, do natychmiastowego użytku.Zlokalizuj pożądaną objętość inhibitorów lub nośnika, używając obsługi cieczy w płytkach PCR o długości 384 dołków w czasie rzeczywistym przy docelowej objętości końcowej poniżej 0,5% DMSO. Uszczelnij płyty za pomocą uszczelniacza płytowego z oczyszczaniem gazów obojętnych. Aby przygotować transfekowane komórki, preinkubować podłoże wzrostu i sprzedawać odczynnik odłączający w kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.Wyjmij komórki z inkubatora i delikatnie zasysaj podłoże z dołków. Dodaj 0,3 mililitra odczynnika odłączającego komórkę do każdego dołka i delikatnie kołysz płytę tam i z powrotem, aby dokładnie pokryć powierzchnię dna płytki. Inkubuj płytkę w temperaturze 23 stopni Celsjusza przez dwie minuty.Dodaj po mililitrze podłoża do każdego dołku i delikatnie pipetuj komórki w dołku. Następnie przenieś je do 15-mililitrowej rurki wirówki Falcon. Wiruj komórki w temperaturze 1 400 razy G przez cztery minuty, aby zebrać komórki. Delikatnie aspiruj podłoże, a następnie ponownie zawiesuj osad komórkowy w dwóch mililitrach pożywki wzrostowej.Upewnij się, że żywotność komórek przekracza 90%, stosując pan-blue i licznik komórek. Rozcieńcz komórki do stężenia 125 komórek na mikrolitr, utrzymując komórki w zawiesie nie dłużej niż dwie godziny, aby zapewnić optymalną żywotność. Do inkubacji inhibitorami SHP2 należy przeprowadzić komórki do sterylnego jednokanałowego roztworu.Wiruj wcześniej przygotowaną płytkę PCR o pojemności 384 dołków w czasie rzeczywistym o temperaturze 2 500 razy G przez pięć minut, następnie zdejmij uszczelkę i użyj pipety wielokanałowej o pojemności 125 mikrolitrów, aby dodać pięć mikrolitrów rozcieńczonych komórek do pożądanych dołków. Wiruj płytę w 42-krotnym G przez 30 sekund bez pokrywki, następnie przymocuj pokrywkę i inkubuj ją przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Zaprogramuj cykler termo zgodnie z instrukcjami z rękopisu dla eksperymentu gradientu profilu termicznego lub eksperymentu izotermicznego.Rozpocznij program termocyklera do impulsów cieplnych i umieść płytkę testową na bloku termicznym. Po zakończeniu programu usuń płytkę testową. Uzupełnij każdą jamkę płytki testowej pięcioma mikrolitrami licencjonowanej mieszanki do wykrywania testów.Wiruj płytę w 42-krotnym G przez 30 sekund i przechowywaj w temperaturze 23 stopni Celsjusza w ciemności przez 30 do 60 minut. Mierz chemiluminescencję za pomocą czytnika mikropłyt z optymalnym czasem integracji. Eksperyment gradientu termicznego dla dzikiego typu SHP2 dał sigmoidalny profil termiczny komórkowy z wąskim przejściem topnienia, typowym dla białka fałdowanego.Inkubacja dzikiego typu SHP2 z inhibitorem allosterycznym SHP099, ustabilizowana do profilu termicznego w znaczącym i mierzalnym stopniu. Stabilizacja SHP2 również została powiązana z mocą SHP099 podobnych do związków alosterycznych. Przy 10 mikromolach silniejszy RMC-4550 zapewniał większy stopień stabilizacji niż SHP099 dla dzikiego typu SHP2.Ze względu na swój unikalny mechanizm, inhibitory allosteryczne podobne do SHP099 są mniej skuteczne przeciwko wielu onkogennym mutantom SHP2, w tym SHP2-E76K. Zgodnie z tymi znanymi właściwościami obserwuje się jedynie marginalną stabilizację termiczną SHP2-E76K przez SHP099. Poziom ekspresji białka tagu EPL może znacząco wpływać na intensywność sygnału.Profile termiczne dla komórek typu dzikiego przejściowego i stabilnie zintegrowanego. Pokazano w identycznych warunkach aktywów. Normalizacja rozproszonych krzywych pozwala uzyskać porównywalne profile termiczne, ujawniając szeroki zakres systemu detekcji EFC.Wykorzystując zdolność termicznego cyklera do generowania gradientów termicznych na krótkiej osi płytki o pojemności 384 otworów. na jednej płycie można wykonać serię miareczek izotermicznych. W optymalnej temperaturze, izotermiczna miareczkowanie z użyciem pełnych 10 punktów Dawka-Odpowiedź dało użyteczny wynik EC50, dla RMC-4550.Zasady tego zasobu mogłyby być wykorzystane do monitorowania degradacji białek w komórkach, wywołanej przez związki PROTOC. Stosujemy technikę przesunięcia Thelmy komórkowej, aby odkryć inhibitory mutantów SHP2 i białaczek, leki specyficzne przeciwko częstym mutantom onkogennym SHP2, które będą miały istotny wpływ na leczenie tych nowotworów.

assessing-cellular-target-engagement-shp2-ptpn11-phosphatase

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W tym filmie demonstrujemy technikę przeprowadzania ko-immunoprecypitacji oznaczonych przez GFP dzikich i zmutowanych białek PD-1 za pomocą koralików pokrytych przeciwciałami anty-GFP. Białka PD-1-GFP związane z kulkami są inkubowane z białkami SHP2, które oddziałują z PD-1, umożliwiając identyfikację określonych motywów strukturalnych w PD-1, które odgrywają kluczową rolę w interakcji SHP2.

Test immunoprecypitacyjny do badania interakcji receptorów enzymatycznych w transfekowanych komórkach

Tutaj prezentujemy protokół dla macierzy przeciwciał do identyfikacji zmian w szlakach sygnałowych w różnych modelach komórkowych. Zmiany te, spowodowane przez leki/niedotlenienie/światło ultrafioletowe/promieniowanie lub przez nadekspresję/regulację w dół/nokauty, są ważne dla różnych modeli choroby i mogą wskazywać, czy terapia będzie skuteczna lub czy mogą zidentyfikować mechanizmy oporności na leki.

Ocena oporności na inhibitory kinazy tyrozynowej poprzez badanie szlaków transdukcji sygnału przez macierze przeciwciał

Tutaj prezentujemy protokół koimmunoprecypitacji i test aktywności enzymatycznej na koraliku, aby jednocześnie badać udział specyficznych domen białkowych receptorów błony komórkowej zarówno w rekrutacji enzymów, jak i ich aktywności.

Test koimmunoprecypitacji do badania funkcjonalnych interakcji między receptorami i enzymami

Ten artykuł wykorzystuje test oparty na cytometrii przepływowej do badania bibliotek chemicznych inhibitorów w celu identyfikacji inhibitorów i ich celów, które wpływają na sygnalizację receptora limfocytów T. Opisane tutaj metody można również rozszerzyć o badania przesiewowe o wysokiej przepustowości.

Identyfikacja mediatorów sygnalizacji receptora limfocytów T poprzez badania przesiewowe bibliotek inhibitorów chemicznych

Przedstawiono szczegółowy protokół generowania samodzielnie składających się mikromacierzy białek ludzkich do badań przesiewowych inhibitorów kinaz.

Badania przesiewowe inhibitorów kinaz w samoorganizujących się mikromacierzach białek ludzkich

Tutaj prezentujemy protokół wzbogacania endogennych fosfataz fosfoproteinowych i ich oddziałujących białek z komórek i tkanek oraz ich identyfikacji i kwantyfikacji za pomocą proteomiki opartej na spektrometrii mas.

Podejście oparte na spektrometrii mas do identyfikacji fosfataz fosfoproteinowych i ich interaktorów

Ten protokół opisuje projektowanie, tworzenie i stosowanie fosfataz regulowanych rapamycyną. Metoda ta zapewnia wysoką swoistość i ścisłą kontrolę czasową aktywacji fosfatazy w żywych komórkach.

Rozwój i zastosowanie fosfataz tyrozynowych regulowanych rapamycyną

RASopatie to wielosystemowe zespoły genetyczne wywołane hiperaktywacją szlaku RAS-MAPUK. Potencjalnie patogenne warianty oczekujące na walidację pojawiają się nieustannie, podczas gdy słabe dowody przedkliniczne ograniczają terapię. Tutaj opisujemy nasz protokół in vivo polegający na testowaniu i krzyżowej weryfikacji poziomów aktywacji ERK związanych z RASopatią oraz jego modulacji farmakologicznej podczas embrigenezy za pomocą obrazowania FRET na żywo u danio danio młodego typu Teen-reporter.

Efektywny protokół oceny modulacji aktywności ERK w wczesnych modelach zespołu Noonana u danio danio za pomocą mikroskopii na żywo FRET i immunofluorescencji

Tutaj wprowadzamy protokół do używania substratów z powierzchni drożdży do testów modyfikacji enzymatycznej. Platformę zademonstrowano, wykorzystując analizę aktywności defosforylacji fosfatazy tyrozynowej SHP-2 w stosunku do jednego z jej substratów jako reprezentatywny test modyfikacji enzymatycznej.

Modyfikacja enzymatyczna i cytometria przepływowa oceny białek powierzchniowych drożdży

Ten protokół ma na celu odzyskanie i przygotowanie rzadkich komórek docelowych z mieszaniny z komórkami tła niebędącymi celem, do molekularnej charakterystyki genetycznej na poziomie pojedynczej komórki. Jakość DNA jest równa jakości pojedynczych komórek niepoddanych działaniu metody i pozwala na zastosowanie pojedynczych komórek (zarówno w oparciu o badania przesiewowe, jak i analizę celowaną).

Wstępne wzbogacanie komórek docelowych i amplifikacja całego genomu w celu dalszej charakterystyki pojedynczej komórki

Poznaj metodę oceny zaangażowania celu przez inhibitory SHP2 w komórkach HEK293 przy użyciu testu termicznego w formacie 384-well. Ta technika wspiera odkrywanie leków przeciwnowotworowych.

Ocena zaangażowania komórek w cele przez inhibitory fosfatazy SHP2 (PTPN11)

Przeglądaj więcej filmów