Name: Grafenowa obudowa chemicznie utrwalonych komórek ssaków do mikroskopii elektronowej w fazie ciekłej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Poznaj metodę obrazowania białek błonowych w komórkach ssaków przy użyciu mikroskopii STEM z grafenową obudową. Technika zachowuje rodzime środowisko próbek i minimalizuje artefakty wiązki elektronowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy D. B. Peckysowi za pomoc przy protokole hodowli komórkowej, F. Weinbergowi za przejrzenie manuskryptu, T. Trampertowi za pomoc przy eksperymentach i rysunkach, S. Smolce za pomoc przy rysunkach i E. Arzt za wsparcie za pośrednictwem INM. Badania są finansowane przez Else Kröner-Fresenius-Stiftung.

<ol><li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Far-field+optical+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Far-field optical nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li>
<li>Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+and+discovering+cellular+structures+with+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy.</a> Science. 361 (6405), 880-887 (2018).</li>
<li>Williams, D. B., Carter, C. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilliams%2C+DB+%22The+Transmission+Electron+Microscope%22">The Transmission Electron Microscope</a>. , Springer. (2009).</li>
<li>Bozzola, J. J., Russell, L. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBozzola%2C+JJ+%22Electron+Microscopy+Principles+and+Techniques+for+Biologists%22">Electron Microscopy Principles and Techniques for Biologists</a>. , Jones and Barlett Publishers. (1999).</li>
<li>Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+sample+preparation+and+imaging+by+cryo-electron+microscopy+for+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology.</a> Methods. 100, 3-15 (2016).</li>
<li>Lucic, V., Leis, A., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+tomography+of+cells%3A+connecting+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron tomography of cells: connecting structure and function.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 185-196 (2008).</li>
<li>Carson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+technical+elements+of+freeze-fracture%2Ffreeze-etch+in+biological+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51694(2014).</li>
<li>Nishiyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atmospheric+scanning+electron+microscope+observes+cells+and+tissues+in+open+medium+through+silicon+nitride+film%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Atmospheric scanning electron microscope observes cells and tissues in open medium through silicon nitride film.</a> Journal of Structural Biology. 169 (3), 438-449 (2010).</li>
<li>Dahmke, I. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene+Liquid+Enclosure+for+Single-Molecule+Analysis+of+Membrane+Proteins+in+Whole+Cells+Using+Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Graphene Liquid Enclosure for Single-Molecule Analysis of Membrane Proteins in Whole Cells Using Electron Microscopy.</a> ACS Nano. 11 (11), 11108-11117 (2017).</li>
<li>Maruyama, Y., Ebihara, T., Nishiyama, H., Suga, M., Sato, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno+EM-OM+correlative+microscopy+in+solution+by+atmospheric+scanning+electron+microscopy+%28ASEM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Immuno EM-OM correlative microscopy in solution by atmospheric scanning electron microscopy (ASEM).</a> Journal of Structural Biology. 180 (2), 259-270 (2012).</li>
<li>Kinoshita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-electron+microscopy+of+primary+cell+cultures+from+genetically+modified+animals+in+liquid+by+atmospheric+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Immuno-electron microscopy of primary cell cultures from genetically modified animals in liquid by atmospheric scanning electron microscopy.</a> Microscopy and Microanalysis. 20 (2), 469-483 (2014).</li>
<li>Hauwiller, M. R., Ondry, J. C., Alivisatos, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+graphene+liquid+cell+transmission+electron+microscopy+to+study+in+situ+nanocrystal+etching%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Using graphene liquid cell transmission electron microscopy to study in situ nanocrystal etching.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57665(2018).</li>
<li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Use+of+Graphene+and+Its+Derivatives+for+Liquid-Phase+Transmission+Electron+Microscopy+of+Radiation-Sensitive+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">The Use of Graphene and Its Derivatives for Liquid-Phase Transmission Electron Microscopy of Radiation-Sensitive Specimens.</a> Nano Letters. 17 (1), 414-420 (2017).</li>
<li>Meng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene-Based+Fibers%3A+A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Graphene-Based Fibers: A Review.</a> Advanced Materials. 27 (35), 5113-5131 (2015).</li>
<li>Sun, P. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limits+on+gas+impermeability+of+graphene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Limits on gas impermeability of graphene.</a> Nature. 579 (7798), 229-232 (2020).</li>
<li>Kato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-precision+thickness+control+of+ice+layer+on+CVD+grown+bilayer+graphene+for+cryo-TEM%5BTitle%5D)+AND+%22Carbon%22%5BJournal%5D)">High-precision thickness control of ice layer on CVD grown bilayer graphene for cryo-TEM.</a> Carbon. 160, 107-112 (2020).</li>
<li>Keskin, S., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+Radiation+Damage+in+Transmission+Electron+Microscopy+of+Proteins+in+Graphene+Liquid+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Reduced Radiation Damage in Transmission Electron Microscopy of Proteins in Graphene Liquid Cells.</a> Nano Letters. 18 (12), 7435-7440 (2018).</li>
<li>Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+light+and+electron+microscopic+imaging+of+multiple+endogenous+proteins+using+Quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots.</a> Nature Methods. 2, 743-749 (2005).</li>
<li>Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. P., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicon+nitride+windows+for+electron+microscopy+of+whole+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells.</a> Journal of Microscopy. 243 (3), 273-283 (2011).</li>
<li>Peckys, D. B., Korf, U., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+variations+of+HER2+dimerization+in+breast+cancer+cells+discovered+by+correlative+fluorescence+and+liquid+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Local variations of HER2 dimerization in breast cancer cells discovered by correlative fluorescence and liquid electron microscopy.</a> Science Advances. 1 (6), 1500165(2015).</li>
<li>Eigenbrot, C., Ultsch, M., Dubnovitsky, A., Abrahmsen, L., Hard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+high-affinity+HER2+receptor+binding+by+an+engineered+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Structural basis for high-affinity HER2 receptor binding by an engineered protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (34), 15039-15044 (2010).</li>
<li>Textor, M., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+Preparing+Graphene+Liquid+Cells+for+Transmission+Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Strategies for Preparing Graphene Liquid Cells for Transmission Electron Microscopy.</a> Nano Letters. 18, 3313-3321 (2018).</li>
<li>Henjes, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+EGFR+signaling+in+cell+line+models+of+ERBB2-amplified+breast+cancer+attenuates+response+towards+ERBB2-targeting+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogenesis%22%5BJournal%5D)">Strong EGFR signaling in cell line models of ERBB2-amplified breast cancer attenuates response towards ERBB2-targeting drugs.</a> Oncogenesis. 1, 16(2012).</li>
<li>Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+Stoichiometry+of+Epidermal+Growth+Factor+Receptor+in+Intact+Cells+using+Correlative+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (103), e53186(2015).</li>
<li>Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+starvation%3A+caveat+emptor%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Serum starvation: caveat emptor.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 301 (2), 272-279 (2011).</li>
<li>Kohl, H., Reimer, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKohl%2C+H+%22Transmission+electron+microscopy%3A+physics+of+image+formation%22">Transmission electron microscopy: physics of image formation</a>. , Springer. (2008).</li>
<li>Yi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+immunogold+labeling+of+cell+surface+proteins+and+viral+glycoproteins+for+cryo-electron+microscopy+and+cryo-electron+tomography+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Native immunogold labeling of cell surface proteins and viral glycoproteins for cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography applications.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (10), 780-792 (2015).</li>
<li>Wolf, S. G., Houben, L., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-scanning+transmission+electron+tomography+of+vitrified+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cryo-scanning transmission electron tomography of vitrified cells.</a> Nature Methods. 11 (4), 423-428 (2014).</li>
<li>Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Jerome, W. G., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+locations+of+gold-labeled+proteins+in+a+whole+mount+eukaryotic+cell+obtained+with+3+nm+precision+using+aberration-corrected+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3 nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 174, 552-562 (2011).</li>
<li>Meier, C., Beckmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze+fracture%3A+new+avenues+for+the+ultrastructural+analysis+of+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Freeze fracture: new avenues for the ultrastructural analysis of cells in vitro.</a> Histochemistry and Cell Biology. 149 (1), 3-13 (2018).</li>
<li>Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+scanning+transmission+electron+microscopy%3A+imaging+protein+complexes+in+their+native+environment+in+whole+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Liquid scanning transmission electron microscopy: imaging protein complexes in their native environment in whole eukaryotic cells.</a> Microscopy and Microanalysis. 20 (2), 346-365 (2014).</li>
<li>Egerton, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+radiation+damage+in+the+TEM%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Control of radiation damage in the TEM.</a> Ultramicroscopy. 127, 100-108 (2013).</li>
<li>Wojcik, M., Hauser, M., Li, W., Moon, S., Xu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene-enabled+electron+microscopy+and+correlated+super-resolution+microscopy+of+wet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Graphene-enabled electron microscopy and correlated super-resolution microscopy of wet cells.</a> Nature Communications. 6, 7384(2015).</li>
<li>Huebinger, J., Spindler, J., Holl, K. J., Koos, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+protein+mobility+and+associated+reshuffling+of+cytoplasm+during+chemical+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Quantification of protein mobility and associated reshuffling of cytoplasm during chemical fixation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 17756(2018).</li>
<li>Glauert, A. M., Lewis, P. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGlauert%2C+AM+%22Biological+specimen+preparation+for+transmission+electron+microscopy%22">Biological specimen preparation for transmission electron microscopy</a>. , Princeton University Press. (2014).</li>
<li>Koo, K., Dae, K. S., Hahn, Y. K., Yuk, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Cell+Electron+Microscopy+Using+Graphene+Veils%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Live Cell Electron Microscopy Using Graphene Veils.</a> Nano Letters. 20 (6), 4708-4713 (2020).</li>
<li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+JB+%22Handbook+of+biological+confocal+microscopy%2C+2+edn%22">Handbook of biological confocal microscopy, 2 edn</a>. , Springer. (1995).</li>
<li>Chung, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+control+of+EGF+receptor+activation+by+reversible+dimerization+on+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatial control of EGF receptor activation by reversible dimerization on living cells.</a> Nature. 464 (7289), 783-787 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Aby lepiej zrozumieć funkcję białek, ważne jest uzyskanie informacji o lokalizacji białek w błonie komórkowej nienaruszonych komórek. Metody uzyskiwania tych informacji obejmują mikroskopię fluorescencyjną o wysokiej rozdzielczości 1,2. Chociaż mikroskopia superrozdzielcza rozwinęła się w ciągu ostatnich lat, jej rozdzielczość jest nadal ograniczona do około 20 nm dla praktycznych warunków eksperymentów komórkowych, podczas gdy typowe białka receptorowe mają rozmiary w zakresie 1-10 nm. Obrazowanie białek na poziomie pojedynczej komórki i pojedynczej cząsteczki z rozdzielczością wystarczającą do wizualizacji białek jest możliwe za pomocą EM. Jednak ze względu na sekcje, konwencjonalne metody EM zazwyczaj nie pozostawiają komórki nienaruszonej26, co prowadzi do utraty ważnych informacji o kontekście i przestrzennym rozmieszczeniu białek w błonie komórkowej. Opracowano metody dla całych komórek za pomocą cryo-TEM6, możliwe jest połączenie znakowania białek z cryo-EM27, wykazano również cryo-STEM28. Jednak przepływy pracy cryo-EM są zoptymalizowane pod kątem badania ultrastruktury komórkowej i struktury białek, a nie pod kątem analizy rozkładów przestrzennych białek błonowych. Suszenie w punkcie krytycznym jest inną metodą przygotowania całych komórek, ale próbki są poddawane kilku etapom suszenia, a technika ta jest bardzo czasochłonna29. Białka błonowe zostały również zbadane za pomocą pęknięcia zamrażalniczego7. W tej metodzie komórki są unieruchalane, zamrażane i pękane. Pęknięte części są replikowane przez warstwy węgla i platyny, a próbka biologiczna jest usuwana. Repliki można następnie analizować za pomocą EM30. Analiza całych komórek jest niemożliwa w przypadku frakcji zamrażającej, ponieważ informacje o rozmieszczeniu białek w błonie w kontekście całej komórki są tracone.
Przedstawiona tutaj metoda pozwala na badanie błony komórkowej bez konieczności cienkiego krojenia próbki 9,31. Komórki są utrzymywane w stanie nienaruszonym, dzięki czemu lokalizacja białek błonowych jest widoczna na obrazach fluorescencyjnych, które są skorelowane z obrazami EM. Badanie białek na poziomie pojedynczej komórki i pojedynczej cząsteczki w nienaruszonych komórkach w stanie uwodnionym okazało się możliwe przy rozdzielczości 2 nm przy użyciu STEM białek znakowanych QD przy użyciu tej metody obudowy grafenu9. Utrzymanie komórek w ich naturalnym stanie ma kluczowe znaczenie, ponieważ pozwala zachować przestrzenne rozmieszczenie białek błonowych, dzięki czemu możliwe są analizy na poziomie pojedynczej komórki i pojedynczej cząsteczki, co jest ważne dla zrozumienia funkcji białek i opracowania nowych leków do metod terapeutycznych.
Innym krytycznym aspektem obrazowania próbek biologicznych za pomocą EM jest uszkodzenie próbek spowodowane promieniowaniem przez wiązkę elektronów. Rozwiązania często obejmują maksymalne zmniejszenie dawki elektronów lub różne metody powlekania, takie jak zamknięcie próbki między cienkimi warstwami węgla32. Nasza metoda pokazuje, że powłoka grafenowa zmniejsza artefakty wywołane wiązką, które pojawiają się na powierzchni komórki w przypadku próbek niepowlekanych. Badanie chemicznie utrwalonych i pokrytych grafenem próbek biologicznych jest możliwe pod napromieniowaniem wiązką elektronów o energii wiązki 200 keV do D = (7,8±0,4) x 103 e-/Å2 bez uszkodzeń radiacyjnych, takich jak jasne punkty, pojawiające się na próbce. W porównaniu z innymi metodami EM, które obejmują skomplikowane przygotowanie próbki, na przykład barwienie, zatapianie, cięcie (krio)cięcie, pękanie itp., opisana tutaj metoda jest mniej czasochłonna. Znakowanie białek odbywa się w ciągu kilku godzin, a powłoka grafenowa wymaga tylko około 15 minut dla przeszkolonych badaczy. Przygotowanie próbki jest porównywalne z procedurami potrzebnymi do mikroskopii fluorescencyjnej.
Protokół można modyfikować w niektórych krokach. Grafen na mikrochipie można również wysuszyć na powietrzu, aby upewnić się, że grafen nie porusza się po osuszeniu bibułą filtracyjną. Jeśli grafen jest zanieczyszczony solą, można pozwolić mu unosić się na powierzchni wody przez około godzinę, aby rozpuścić sól, a tym samym zminimalizować zanieczyszczenie. Występujące na grafenie zanieczyszczenie miedzią lub PMMA można zmniejszyć, rozszerzając odpowiednie etapy trawienia w protokole. Opisano inne metody powlekania grafenem, w których na przykład grafen-PMMA był bezpośrednio osadzany na komórkach, a PMMA był usuwany przez mycie w acetonie, a następnie33. W naszej metodzie PMMA został usunięty przed powlekaniem, aby uniknąć ewentualnych uszkodzeń komórek spowodowanych dodatkowymi etapami płukania acetonem. NaCl został tutaj wybrany jako podłoże, ponieważ jest płaski, więc nie marszczy grafenu i rozpuszcza się w wodzie, uwalniając grafen9. Poza tym można go przyciąć do pożądanego rozmiaru, a na grafenie nie pozostają żadne pozostałości podłoża. Ale biorąc pod uwagę te kryteria, można również zastosować inne substraty, takie jak chlorek potasu.
Aby zmniejszyć ryzyko potencjalnego grupowania indukowanego przez znacznik, etap utrwalania GA można wdrożyć bezpośrednio po utrwaleniu FA, po którym wszystkie białka błonowe są unieruchomione. Pierwszy etap fiksacji FA już naprawia strukturę biologiczną, ale nadal może wystąpić zmniejszony poziom dyfuzji białek błonowych34, co może prowadzić do grupowania indukowanego znacznikiem z powodu obecności wielu streptawidyny na QD. Fiksacja za pomocą GA może prowadzić do sygnału autofluorescencji podczas LM, a zatem jest wykonywana po LM w opisanym protokole, ale może być zredukowana, jak opisano w innym miejscu34. Bufor kakodylanu jest dość toksyczny i można również stosować inne utrwalacze, ale tutaj stosuje się kakodylat, ponieważ jest powszechnie stosowanym buforem dla protokołów EM, unika wytrącania się, zapobiega rozwojowi bakterii i grzybów oraz jest kompatybilny z jonami wapnia, które są potrzebne do zachowania ultrastrukturalnej integralności błon lipidowych35. W razie potrzeby tetratlenek osmu może być użyty jako dodatkowe utrwalenie w celu stabilizacji lipidów. Pomogłoby to zwiększyć kontrast struktury komórki, ale także dodać kolejny metal do systemu i zmniejszyć kontrast uzyskany na QD.
Opisany tutaj protokół zawiera wiele kroków, które wymagają dobrego instruktażu. Przed obchodzeniem się z mikroczipami wymagane jest pewne szkolenie, aby uniknąć zarysowania powierzchni SiN mikroczipów i zapobiec ich pękaniu. Jak wspomniano wcześniej, zaleca się przygotowanie mikroczipów w dwóch egzemplarzach, ponieważ okienko SiN może się od czasu do czasu zepsuć. Uzyskanie wymaganej liczby komórek na mikroczipie również wymaga pewnego doświadczenia. Powlekanie ogniw grafenem wymaga pewnego treningu, ponieważ znalezienie odpowiedniego kąta nachylenia do unoszenia grafenu na wodzie może być trudne. Podczas wyłapywania grafenu z wody może być również trudno dostrzec cienki grafen. Gdy tylko grafen znajdzie się na mikrochipie, nadmiar wody należy zetrzeć bibułą filtracyjną. Należy to robić tylko za pomocą końcówki bibuły filtracyjnej, aby uniknąć usunięcia grafenu z mikroczipa.
Powłoka grafenowa zapobiegała pojawianiu się artefaktów na próbce. Ale dla D < 4 x 102 e-/Å2 również nie pojawiły się żadne artefakty dla próbki niepowlekanej, a artefakty pojawiły się tylko dla 2 próbek niepowlekanych. W związku z tym badania ogniw niepowlekanych również wydają się możliwe, choć lepiej byłoby użyć grafenu i uniknąć ryzyka powstawania artefaktów. Skład tych artefaktów może być analizowany w przyszłości, aby dać wskazówki, jak zapobiec ich powstawaniu. Jeśli chodzi o stabilność strukturalną ogniw, zaobserwowano jedynie niewielką poprawę powłoki grafenowej. Utrwalone komórki były najwyraźniej stabilizowane w badanych cienkich obszarach, gdzie ich struktura znajdowała się w bliskim sąsiedztwie błony SiN. To, czego jednak tutaj nie zbadaliśmy, to artefakty suszenia, o których wiadomo, że występują w próbkach komórkowych po wystawieniu na działanie próżni4. Wysuszenie komórek doprowadziłoby do obkurczenia się komórek, tak że w konsekwencji zmieniłyby się również odległości QD. Dla zastosowanej tu dawki elektronów odległość odstępów czasu dla próbek pokrytych grafenem i niepowlekanych pozostała stabilna. Potrzebne są dalsze badania, aby zbadać wpływ powłoki grafenowej na ogniwa EM.
Jednym z ograniczeń tej metody jest to, że konieczne jest chemiczne utrwalenie komórek; W związku z tym nie można przeprowadzać eksperymentów z żywymi komórkami. Ale w przypadku, gdy etykietowanie nie jest potrzebne i stosowane są komórki o wyższej stabilności strukturalnej, na przykład bakterie, nieutrwalone komórki można zamknąć w grafenie dla EM36 , choć z inną tolerancją dawki elektronów. Ponadto białka nie są bezpośrednio wykrywalne, więc do wizualizacji białek potrzebne są QD. Metoda ta byłaby korzystna w przypadku mniejszych etykiet. Kwestią dyskusyjną jest to, czy to dobrze, czy źle, że ultrastruktura nie jest wyraźnie widoczna. Nasza metoda jest podobna do mikroskopii fluorescencyjnej, w której widoczne są tylko wybrane białka37. Zwiększenie widoczności ultrastruktury dodałoby również znacznie więcej informacji do obrazu, a następnie w pewnym momencie uniemożliwiłoby wykrycie poszczególnych pozycji etykiety. Co więcej, opisana tutaj metoda dotyczy jednego gatunku białka i potrzebne są dodatki do protokołu, aby móc znakować wiele białek. Wreszcie, metoda działa, gdy dostępna jest mała cząsteczka specyficznie wiążąca o wysokim powinowactwie, taka jak przeciwciało mimetic21 lub nanobody38 . Powszechnie stosowane przeciwciała są znacznie większe i uniemożliwiałyby wykrycie stanu funkcjonalnego podjednostek białkowych w oligomery.
Nasza metoda jest przydatna do badania funkcji białek w całych komórkach za pomocą EM przy jednoczesnym utrzymywaniu komórek w stanie uwodnionym. Łatwo można zbadać szereg komórek. Można również badać inne typy komórek i białek. Jeśli znakowanie białek nie jest potrzebne, podzbiór protokołu można wykorzystać do powlekania grafenem szerokiej gamy próbek biologicznych. Zdolność do badania całych komórek jest istotna w badaniach komórkowych dla zrozumienia korelacji funkcji białek błonowych na poziomie molekularnym.

Analiza funkcji białka błonowego jest niezbędna do badań biologicznych komórek i do opracowywania leków. Klasa ważnych eksperymentów obejmuje badanie pozycji białek błonowych w komórkach. Informacje te można wykorzystać do wyciągnięcia wniosków na temat składania białek w kompleksach białkowych i ich specyficznych lokalizacji w błonie komórkowej, która poprzez dynamiczne składanie i demontaż napędza szeroką gamę funkcji komórkowych. Do badania funkcji białek w komórkach wykorzystuje się między innymi mikroskopię świetlną (LM) i mikroskopię elektronową (EM). LM umożliwia analizę całych komórek w cieczy; Jednak rozdzielczość jest ograniczona do 200-300 nm dla konwencjonalnej i do 20 nm dla mikroskopii fluorescencyjnej w super rozdzielczości w warunkach praktycznych<klasa SUP="xref">1,<klasa SUP="Xref">2. EM zapewnia około 1 A rozdzielczości3, ale konwencjonalne przygotowanie próbki wymaga odwodnienia, barwienia metalu w celu zwiększenia kontrastu obrazu i zatopienia w substancji montażowej, takiej jak żywica, do transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)4. Aby zachować próbki biologiczne w bardziej natywnym środowisku, można zastosować techniki cryo-EM5,6. Próbki są szybko zamrażane w amorficznym lodzie i, w razie potrzeby, dzielone na sekcje. Inną opcją jest szczelinowanie zamrażające EM7.
EM techniki badania białek błonowych w nienaruszonych komórkach w ich naturalnym, płynnym stanie pojawiły się w ciągu ostatniej dekady8,9,10,11. Rozdzielczość przestrzenną 2 nm osiągnięto na białkach błonowych znakowanych kropkami kwantowymi (QD) w całych komórkach wyhodowanych na błonie SiN i otoczonych warstwą grafenu9.
Tutaj opisane są szczegóły protokołu znakowania białek i powlekania grafenem9,12. Celem tego protokołu jest analiza przestrzennego rozkładu HER2 w błonie całych, utrwalonych komórek, przy jednoczesnym zachowaniu komórek w stanie uwodnionym. Powłoka grafenem zapobiega wysychaniu komórek w próżni, a także zmniejsza uszkodzenia spowodowane promieniowaniem13. Metoda ta dostarcza informacji o znakowanych białkach błonowych w nienaruszonej błonie plazmatycznej, ale metoda ta nie jest przydatna do badania ultrastruktury komórkowej, jak to zwykle ma miejsce w przypadku EM.
Grafen jest najcieńszym znanym nanomateriałem i składa się z pojedynczego atomu węgla o grubości kryształu ułożonego w siatkę o strukturze plastra miodu14. Posiada unikalne właściwości, w tym wysoką elastyczność i wytrzymałość mechaniczną. Ostatnie badania wykazały, że grafen wolny od wad jest nieprzepuszczalny dla gazów i cieczy, ale defekty umożliwiają przenikanie wodoru15. Wyciek ten można zmniejszyć, stosując wielowarstwowy grafen, jaki jest tutaj stosowany. Grafen dwuwarstwowy okazał się ostatnio przydatny jako wsparcie dla próbek krio-EM, poprawiając jednorodność cienkiej warstwy lodu w porównaniu z tlenkiem grafenu, gdzie mogą powstawać tylko niejednorodne warstwy16. Wykazano również, że grafen zmniejsza uszkodzenia wiązki próbek biologicznych podczas mikroskopii elektronowej w fazie ciekłej13,17. Jako przykładowy eksperyment, HER2 wyrażany w linii komórkowej raka piersi SKBR3 ssaków został oznaczony QDs18, a jego rozkład przestrzenny zarejestrowany za pomocą STEM. Komórki zostały umieszczone na mikrochipie Si z przezroczystą elektronowo membraną SiN19. Mikroczipy zostały wybrane jako wsparcie, ponieważ są solidne, kompatybilne z LM i EM, a cała procedura etykietowania może być wykonana bezpośrednio na microchip19. Po przyłączeniu komórki, HER2 został oznaczony dwuetapowym protokołem etykietowania20. Po pierwsze, do HER2 przyłączono biotynylowany związek mimetyczny przeciwciała anty-HER221. Komórki zostały następnie chemicznie utrwalone, aby zapobiec grupowaniu receptorów wywołanym przez znacznik i zwiększyć stabilność ultrastruktury komórkowej. Odstępy QD pokryte streptawidyną powiązano następnie z kompleksem mimetycznym przeciwciał HER2. Jasny sygnał fluorescencyjny i gęste elektronowo jądro QD pozwoliły na korelacyjną mikroskopię fluorescencyjną i elektronową (CLEM)20. CLEM jest szczególnie przydatny, ponieważ regiony komórkowe będące przedmiotem zainteresowania do analizy STEM można wybrać z przeglądowych obrazów mikroskopii fluorescencyjnej, podkreślając lokalizację HER2 na komórkach. Komórki analizowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w celu zidentyfikowania regionów komórkowych o wysokim poziomie HER2. Następnie arkusz grafenu o grubości 3-5 warstw został przeniesiony na komórki w celu powlekania9,22. Następnie próbka została zamontowana w uchwycie na próbki EM. Dane STEM uzyskano za pomocą pierścieniowego detektora ciemnego pola (ADF), dostarczając informacji o przestrzennym rozkładzie HER2 na powierzchni komórki w stosunku do lokalizacji na powierzchni komórki, ale nie podając żadnych informacji na temat ultrastruktury komórki. Aby określić stabilność próbki pod wpływem promieniowania wiązką elektronów, próbki badano przy rosnącej dawce (D) w serii obrazów. Zbadano różnicę między próbkami pokrytymi grafenem a próbkami niepowlekanymi. Oceniono kilka rodzajów uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem.
Opisany tutaj protokół wykorzystuje linię komórkową raka piersi SKBR3 z nadekspresją HER2 jako model do kierowania na HER223. Protokół obejmuje przygotowanie dla porównania jednej próbki pokrytej grafenem i jednej podobnej próbki, ale bez powłoki grafenowej. Eksperyment jest przygotowywany w dwóch egzemplarzach, ponieważ okno SiN może się zepsuć raz na jakiś czas, a w większości przypadków w celu uzyskania duplikatu eksperymentalnego. Ogólna wydajność metody jest wysoka, co oznacza, że mikroczipy z komórkami pokrytymi grafenem są zwykle uzyskiwane z wyjątkowym błędem, mimo że nie całe okno SiN może być pokryte grafenem we wszystkich przypadkach. Duplikaty nie są opisane w protokole.
Protokół znakowania (kroki 1-5) jest porównywalny do protokołu znakowania receptora naskórkowego czynnika wzrostu w komórkach fibroblastów COS7 opublikowanego wcześniej24; szczegóły w tym artykule dotyczą obchodzenia się z mikroczipami i korzystania z płytek studzienkowych. Poniższy protokół jest zoptymalizowany pod kątem oznaczania HER2, powłoki grafenowej9 i badania tolerancji próbki na promieniowanie.

<table><tbody><tr><td>Aceton do HPLC (min. 99,8 %)</td><td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Niemcy</td><td>2626-1L</td><td></td></tr><tr><td>AL54 waga analityczna</td><td>Mettler-Toledo GmbH, Giessen, Niemcy</td><td>30029077</td><td></td></tr><tr><td>Frakcja albuminy V, bez biotyny, &ge; 98 %, dla biologii molekularnej</td><td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Niemcy</td><td>0163.2</td><td></td></tr><tr><td>Cząsteczka powinowactwa anty-HER2, biotyna sprzężona 20 &mikro; M</td><td>Affibody, Solna, Szwecja</td><td>10.0817.02.0001</td><td></td></tr> mikroskop <tr><td>analityczny o rozdzielczości atomowej JEM-ARM200F</td><td>JEOL (Germany) GmbH, Freising, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>B6768-500G</td><td></td></tr><tr><td>Kwas kakodylowy sól sodowa trójwodzian &ge; 98 %</td><td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Niemcy</td><td>5169.1</td><td></td></tr><tr><td>Kolby do hodowli komórkowych, PS, poddane obróbce, sterylne, Zakrętka filtra 50ml</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Niemcy</td><td>7696781</td><td></td></tr><tr><td>Kolby do hodowli komórkowych, PS, poddane obróbce, sterylne, Zakrętka filtra 250ml</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Niemcy</td><td>7696782</td><td></td></tr><tr><td>Płytki wielodołkowe do hodowli komórkowych, poddane obróbce, 24-dołkowe</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Niemcy</td><td>7696792</td><td></td></tr><tr><td>Płytki wielodołkowe do hodowli komórkowych, poddane obróbce, 96-dołkowe</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Niemcy</td><td>7696794</td><td></td></tr><tr><td>Kolby do hodowli komórkowych CELLSTAR poddane działaniu TC, 250 ml</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Niemcy</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>Płytki wielodołkowe do hodowli komórkowych CELLSTAR 96-dołkowe</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Niemcy</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe CELLSTAR 15 ml sterylne</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Niemcy</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>CELLview naczynie do hodowli komórkowych, PS, 35/10mm, szklane dno, 1 komora</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Niemcy</td><td>627861</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka 5418</td><td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Niemcy</td><td>5401000010</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe 50 ml sterylne</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Niemcy</td><td>7696705</td><td></td></tr><tr><td>Corning CellStripper nieenzymatyczny roztwór do dysocjacji komórek</td><td>Corning, NY, USA</td><td>25-056-CI</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-sacharoza min. 99,7 %, sproszkowana</td><td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Niemcy</td><td>9286.1</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowy hemocytometr C-Chip Neubauer ulepszony</td><td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Niemcy</td><td>PK36.1</td><td></td></tr><tr><td>Easypet</td><td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Niemcy</td><td></td><td></td>4430000018</tr><tr><td>pipety Eppendorf Research plus zmienne, 0,1 - 2,5 i mikro; l</td><td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Niemcy</td><td>3123000012</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus zmienna pipeta, 2 -20 i mikro; l</td><td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Niemcy</td><td>3123000039</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus zmienna pipeta, 10 - 100 i mikro; l</td><td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Niemcy</td><td>3123000047</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus zmienna pipety, 100 - 1000 i mikro; l</td><td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Niemcy</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Absolut etanolu do HPLC (min. 99,9 %)</td><td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Niemcy</td><td>2222-1L</td><td></td></tr><tr><td>Białko modyfikowane podobne do fibronektyny*poly mer-plus</td><td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Niemcy</td><td>F8141</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny Leica DMI6000</td><td>Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gibco Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), o wysokiej zawartości glukozy, suplement GlutaMAX, pirogronian</td><td>FisherScientific, Hampton, NH, USA</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Płodowa surowica cielęca (FCS)</td><td>FisherScientific, Hampton, NH, USA</td><td>10099141</td><td>numer partii: 1751893</td></tr><tr><td>Gibco Goat Serum, pochodzenie z Nowej Zelandii</td><td>FisherScientific, Hampton, NH, USA</td><td>16210064</td><td>numer partii: 1788320</td></tr><tr><td>Gibco Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS), pH 7,4</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, Stany Zjednoczone</td><td>10010015</td><td></td></tr><tr><td>Galaxy 48R Inkubator CO2</td><td>Nowy Brunszwik, Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Niemcy</td><td>CO48310001</td><td></td></tr><tr><td>Gatan Model 950 Solarus&mdash; Myjka plazmowa</td><td>Gatan GmbH, M&uuml; nchen, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór aldehydu glutarowego klasy I, 25% w H2O, specjalnie oczyszczony do stosowania jako utrwalacz do mikroskopii elektronowej</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna &ge; 98,5 % Ph.Eur., USP, BP</td><td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Niemcy</td><td>T873.1</td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop laboratoryjny Leica DM IL LED</td><td>Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Niemcy</td><td>DM IL LED</td><td></td></tr><tr><td>Płyta grzewcza</td><td>Heidolph Instruments GmbH & CO. KG, Schwabach, Niemcy</td><td>MR 3002</td><td></td></tr><tr><td>MEM endogenne aminokwasy (NEAA) 100x W/O L-Glutamine</td><td>Biowest, Nuaill&eacute;, Francja</td><td>X0557-100</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe 76 mm x 26 mm</td><td>DWK Life Sciences GmbH, Wertheim/Main</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mikroprobówki (1,5 ml, 2 ml) niesterylne</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Niemcy</td><td>1,5 ml: 7696751, 2 ml: 7696752</td><td></td></tr><tr><td>MSc-Advantage&mdash; Szafa bezpieczeństwa biologicznego klasy II</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ocean Microchips SiN okno 400x150 i mikro; m, dystans 200 nm</td><td>DENSsolutions, Delft, Holandia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Omnifix Jednorazowa strzykawka Luer Lock Solo (10 ml, 20 ml, 50 ml)</td><td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Niemcy</td><td>10 ml: C542.1 20 ml: T550.1</td><td>zakupiony za pośrednictwem Carl Roth GmbH&Co. KG, Karlsruhe</td></tr><tr><td>Oven</td><td>Memmert GmbH + Co. KG, Schwabach, Niemcy</td><td>VO 200</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR, Darmstadt, Niemcy</td><td>#291-0057</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 16 % roztwór, klasa EM</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences, Hatfield, PA, USA</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Perfekt-Kescher z uchwytem</td><td>Plano GmbH, Wetzlar, Niemcy</td><td>T5112</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet z barierą aerozolową w stojakach, niesterylne</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Niemcy</td><td>2-200&micro; l: 7695892</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet z barierą aerozolową w stojakach, sterylne</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Niemcy</td><td>0,1-10 &micro; l: 7695880 2-100 i mikro; l: 7695883 100-1000 i mikro; l: 7695886 1250 &mikro; l XL: 7695887</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna 0,01 % roztwór mol. WT.70.000 - 150.000</td><td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Niemcy</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Qdot 655 Streptawidyna sprzężona 1 &mikro; M</td><td>Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, Stany Zjednoczone</td><td>Q10121MP</td><td></td></tr><tr><td>Żyletka, Gem Uncoated 3 Fasci, Stalowy grzbiet, odtłuszczony</td><td>Personna, AccuTec Blades, Verona, VA, USA</td><td>94-0451</td><td></td></tr><tr><td>okrągła bibuła filtracyjna, bezpopiołowa, klasa 589/3 niebieska wstążka, średnica 150mm</td><td>Schleicher & Schuell, Dassel, Niemcy</td><td>300212</td><td></td></tr><tr><td>Rutynowy mikroskop stereoskopowy Leica M60</td><td>Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Niemcy</td><td>M60</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne ROTILABO, sterylne (1 ml, 2 ml, 10 ml)</td><td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Niemcy</td><td>1 ml: N231.1 2 ml: N236.1 10 ml: ET30.1</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne, sterylne, (1 ml, 2 ml, 10ml)</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Niemcy</td><td>1 ml: 7695550 2 ml: 7695551 10 ml: 7695553</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne, sterylne, (5 ml, 25 ml, 50 ml)</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Niemcy</td><td>5 mL: 7695552 25ml: 7695554 50ml: 7695555</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna z wytrząsaniem SW22</td><td>Julabo GmbH, Seelbach, Niemcy</td><td>9550322</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Niemcy</td><td>HN00.1</td><td></td></tr><tr><td>Kryształy chlorku sodu, rozszczepione 12 mm x 12 mm x 0,5-1 mm</td><td>International Crystal Laboratories, Garfield, NJ, USA</td><td>9750</td><td></td></tr><tr><td>Dekahydrat tetraboranu sodu, odczynnik ACS, &ge; 99,5 %</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>S9640-500G</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan sodu</td><td>carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Niemcy</td><td>4365.2</td><td></td></tr><tr><td>filtry strzykawkowe ROTILABO PES, sterylne 0,22 i mikro; m</td><td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Niemcy</td><td>P668.1</td><td></td></tr><tr><td>Trivial Transfer Graphene 3-5 warstw, 1 cm x 1 cm</td><td>materiał ACS, Pasadena, CA, USA</td><td>TTG30011</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta Dumoxel 03</td><td>Manufactures D' Outils Dumont SA, Montignez, Szwajcaria</td><td>0103-7-PO</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta Inox 02</td><td>Manufactures D' Outils Dumont SA, Montignez, Szwajcaria</td><td>0102-7-PO</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta, plastikowa wymienna końcówka</td><td>Ideal-tek SA, Balerna, Szwajcaria</td><td>5SVR.SA</td><td></td></tr><tr><td>Woda ROTISOLV HPLC klasa gradientu</td><td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Niemcy</td><td>A511.2</td><td></td></tr></tbody></table>

grafenowa obudowa chemicznie utrwalonych komórek ssaków do mikroskopii elektronowej w fazie ciekłej

Graphene Enclosure of Chemically Fixed Mammalian Cells for Liquid-Phase Electron Microscopy

Opisano protokół badania receptora ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2 (HER2) w nienaruszonej błonie plazmatycznej komórek raka piersi za pomocą skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej (STEM). Komórki ssaczego raka piersi z linii SKBR3 hodowano na mikroczipach krzemowych z okienkami z azotku krzemu (SiN). Komórki unieruchomiono chemicznie, a białka HER2 znakowano nanocząstkami kropek kwantowych (QD), stosując dwuetapowy protokół wiązania biotyny i streptawidyny. Komórki zostały pokryte wielowarstwowym grafenem w celu utrzymania stanu uwodnienia i ochrony przed uszkodzeniem wiązki elektronów podczas STEM. W celu zbadania stabilności próbek pod wpływem promieniowania wiązką elektronów przeprowadzono eksperyment z serią dawek. Porównano próbki pokryte grafenem i niepowlekane. Uszkodzenia wywołane wiązką, w postaci jasnych artefaktów, pojawiły się w przypadku niektórych próbek niepowlekanych przy zwiększonej dawce elektronów D, podczas gdy na próbkach powlekanych nie pojawiły się żadne artefakty.

Rysunek 1A przedstawia komórki wysiane w taki sposób, aby okno było pokryte, ale z zachowaniem wystarczającej przestrzeni pozwalającej im na rozpłaszczenie się i przywiernięcie, co prowadzi do uzyskania konfluencji na poziomie około 2/3B&R (Rycina 1B). W przypadku wysiania zbyt wielu komórek na mikroczipie (Rycina 1C), brakuje wystarczającej przestrzeni, aby wszystkie komórki mogły przytwierdzić się do mikrochipu. Rycina 1D przedstawia ten sam mikrochip po 24 h. Więcej niż połowa komórek nie spłaszczyło się. Z drugiej strony, jeśli wysiano zbyt mało komórek (Rysunek 1E), w oknie z SiN po 24 h powstanie duża pusta przestrzeń, co widać na Rysunek 1F. Rysunek 1G przedstawia obraz DIC komórek w Rysunek 1A i Rycina 1B. Rycina 1H przedstawia odpowiadający obraz fluorescencyjny z nadanym żółtym kolorem, co wskazuje na pomyślne znakowanie HER2.
Reprezentatywne dane STEM przedstawiono w Rysunek 4Zbadano komórki SKBR3 pokryte grafenem (lewa kolumna) oraz niepokryte (prawa kolumna). Rycina 4A,B pokaż M = obrazy komórek w widoku ogólnym przy powiększeniu 80x. Obszary przedstawione jako wstawki zostały zobrazowane przy M = 80 0x podczas serii dawek, patrz Rycina 4C,DKropki kwantowe (QD) są tutaj widoczne jako jasne punkty. Rysunek 4E i Rycina 4F wyświetl M = obrazy powiększone 50 0x, uzyskane w miejscach odpowiadających prostokątom w Rysunek 4C,D. Oba obrazy zarejestrowano po pobraniu serii dawek z D = (7,8 ± 0,4) x 103 e-/Å2Seria dawek została zarejestrowana przy powiększeniu M = 80 00x. Obszary naświetlone można zidentyfikować jako prostokąty; prostokąt był wyraźnie widoczny w przypadku próbki niepowlekanej (Rycina 4F).
Aby potwierdzić obecność grafenu, zarejestrowano obrazy dyfrakcyjne obszarów pozbawionych komórek, ale z grafenem lub bez niego na oknie z SiN. Sześciokątna struktura grafenu została zaobserwowana na obrazie dyfrakcyjnym próbki pokrytej grafenem (Rycyna 4G), natomiast nie wystąpiła w próbce niepokrytej (Rycyna 4H). Obraz dyfrakcyjny monokrystalicznego grafenu wykazuje symetrię sześciokrotną ze względu na wysoce uporządkowaną strukturę sześciokątną grafenu. Zatem stwierdzenie struktury sześciokątnej wskazuje na obecność grafenu na próbkach.
W celu zbadania wpływu naświetlania wiązką elektronów na próbkę, wykonano serię obrazów STEM z kumulującą się dawką elektronów. Reprezentatywne wyniki dla próbek niepowlekanych oraz powlekanych grafenem przedstawiono w Rysunek 5A-D i Rysunek 5E-Godpowiednio. Wszystkie dane pozyskano na krawędzi komórki, gdzie jest ona najcieńsza, a zatem obserwowana struktura znajduje się najbliżej membrany SiN. Ekspozycja próbek niepowlekanych doprowadziła do pojawienia się jasnych struktur na powierzchniach komórek przy D = (1,9 ± 0,1) x 103 e-/Å2 (Rycina 5B). Struktury te stawały się większe przy wyższych dawkach, dzięki czemu były wyraźnie widoczne na ostatnim obrazie w serii przy D = (7,8 ± 0,4) x 103 e-/Å2 (Rycina 5C,D). Plamki te nie pojawiły się na żadnej z próbek powleczonych grafenem (Rycina 5E-G).
Dodatkowe mikroczipy przygotowano i zbadano zgodnie z opisanym powyżej protokołem. Łącznie przebadano sześć próbek powlekanych i siedem niepowlekanych. Dwie z siedmiu próbek niepowlekanych wykazały te artefakty. W żadnej z próbek powlekanych nie zaobserwowano dodatkowych jasnych punktów.
Jako kolejny parametr uszkodzeń radiacyjnych zbadano odległości między kropkami kwantowymi (QD). W przypadku wystąpienia uszkodzeń strukturalnych należałoby oczekiwać zmian w odległościach między QD. Zmiany odległości mierzono dla różnych par QD przy kumulatywnej dawce D dla zakresu odległości między parami. Rysunek 5H pokazuje, że średnia względna zmiana odległości cząstek dla próbek niepowlekanych pozostała poniżej 1,3%, podczas gdy średnia względna odległość dla próbek powlekanych pozostała poniżej 0,8%. Można zatem wywnioskować, że powłoka grafenowa ustabilizowała próbkę, jednak próbki wysuszone bez powłoki grafenowej również wykazały znaczną stabilność.
<img alt="Analiza morfologii komórek za pomocą mikroskopii; porównanie ośmiopanelowe, skala 50 μm, wyniki eksperymentalne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1: Wysiew komórek na oknie z SiN krzemowego mikrochipa i znakowanie HER2. (A) Reprezentatywny obraz obszaru okna z SiN z komórkami SKBR3 5 minut po wysianiu na mikrochipie. (B) Te same komórki po 24 h rozprzestrzenione na tym samym oknie z SiN. (C) komórki SKBR3 na mikroczipie krzemowym (Si) 5 minut po wysianiu. (D) Te same komórki co w (C) po 24 h. Komórki nie rozpłaszczyły się prawidłowo z powodu zbyt wysokiej gęstości wysiewu komórek na chipach. (E) Komórki na mikroczipie 5 min po wysianiu. (FW okienku widoczne było tylko kilka komórek, ponieważ na mikroczipie wysiano zbyt małą liczbę komórek.G) Obraz DIC tych samych komórek SKBR3 po znakowaniu HER2 kropkami kwantowymi (QD). (H) Nałożony obraz DIC i odpowiadający mu obraz fluorescencyjny znakowanych komórek SKBR3 z HER2-QD65 (kolor sztuczny: żółty). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig01large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat procesu przenoszenia grafenu; metoda PMMA; etapy z użyciem wody, trawia, kryształu soli i acetonu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2: Czyszczenie i przenoszenie grafenu na kryształy NaCl. (A) PMMA-grafen na polimerze jest zanurzony w czystej wodzie w celu uwolnienia grafenu z PMMA. PMMA-grafen można przechwycić za pomocą szkiełka przedmiotowego. (BZanieczyszczenia miedzią usunięto poprzez trawienie roztworem nadsiarczanu sodu. W celu oczyszczenia grafenu przeniesiono go do zlewki zawierającej wodę dejonizowaną. Kroki te powtórzono 3 razy. Następnie PMMA-grafen przeniesiono do nasyconego roztworu NaCl w czystej wodzie. Do pobrania grafenu z roztworu soli wykorzystano kryształ NaCl.C) Próbkę PMMA-grafen na krysztale NaCl suszono przez 30 min w temperaturze pokojowej. PMMA usunięto poprzez inkubację bloku w acetonie przez 30 min. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig02large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat procesu przenoszenia grafenu: okno SiN, grafen pływający, powlekanie chipa, wyniki mikroskopowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Powłoka grafenowa komórek wysianych na mikrochipie krzemowym. (A) Procedura powlekania grafenem. Grafen znajdujący się na krysztale NaCl zostaje uwolniony na powierzchnię wody. Następnie fragment grafenu zostaje uchwycony za pomocą metalowej pętli i przeniesiony na mikrochip krzemowy (Si). (B) Mikrochip (2,0 x 2,6 mm) z oknem z SiN o wymiarach 40 x 160 μm bez grafenu. Komórki SKBR3 były widoczne jako ciemne punkty. (C) Grafen (czerwone koło) unoszący się na powierzchni zlewki wypełnionej wodą. (D) Grafen uchwycony metalową pętlą. (E) Mikroczip przytwierdzono do kropli wody w taki sposób, aby grafen znajdował się nad oknem z SiN. (F) Mikrochip po powłoce grafenowej. Grafen był widoczny jako fioletowy połysk. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig3v2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza mikrostruktury, obrazy z mikroskopii elektronowej ukazujące strukturę porowatą oraz obrazy dyfrakcyjne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig04v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rysunek 4: Obraz STEM komórek SKBR3 powleczonych grafenem i niepowleczonych na oknie z SiN. (A) obraz STEM próbki powlekanej grafenem, wykonany przy M = 800x. (B) obraz STEM próbki niepowlekanej uzyskany przy M = 800x. (C) M Obraz przy powiększeniu 80 0x zarejestrowany w pozycji oznaczonej niebieskim prostokątem w A. Żółte linie przedstawiają przykłady odległości zmierzonych w obrębie cząsteczki.D) M = obraz przy powiększeniu 80 0x zarejestrowany w miejscu zaznaczonym niebieskim prostokątem w B. Żółta linia przedstawia przykładowe odległości zmierzone w obrębie cząstek. (E) M = obraz tego samego obszaru co C przy powiększeniu 50 0x, poddany działaniu D = (7,8±0,4) x 103 e-/Å2. (F) M = obraz tego samego obszaru przy powiększeniu 50 0x D i poddano działaniu D = (7,8±0,4) x 103 e-/Å2Obszar odsłonięty był wyraźnie widoczny.G) Obraz dyfrakcyjny próbki powlekanej grafenem z obszaru bez komórek. Sześciokrotna symetria grafenu jest widoczna w postaci jasnych punktów. (H) Dyfraktogram próbki bez grafenu, niewykazujący sześciokrotnej symetrii jasnych plamek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig04large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza mikroskopowa grafenu; próbki A-G z dawką elektronów; wykres H przedstawia procentowe zmiany względne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig05.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rysunek 5: Artefakty pojawiające się na próbkach bez powłoki grafenowej. (A) Pierwsze obrazy obszarów na próbkach bez powłoki grafenowej wykonane przy M = 80 0x i poddano działaniu D = (0,39 ± 0,02) x 102 e-/Å2. (B) obrazy z pierwszymi artefaktami pojawiającymi się przy D = (1,94 ± 0,1) x 103 e-/Å2 (żółte strzałki). (C, D) Ostatni obraz z serii wykonany za pomocą D = (7,8 ± 0,4) x 103 e-/Å2Artefakty były widoczne jako jasne punkty.E-GPróbki powlekane grafenem bez powstających artefaktów.E) D = (0,39 ± 0,02) x 102 e-/Å2 (F) D = (1,94 ± 0,1) x 103 e-/Å2 (G) D = (7,8 ± 0,4) x 103 e-/Å2. (H) Względna zmiana odległości między cząsteczkami dla próbek powlekanych grafenem i niepowlekanych. Przeanalizowano dwie niepowlekane próbki wykazujące artefakty, z których jedna przedstawiona jest w (A-C), a ostatni obraz drugiej próbki w D, a także trzy próbki powlekane (jedną pokazano w E-G). W sumie w każdej próbce zbadano dziesięć par QD, których odległości mieściły się w zakresie od 250 nm do 3 µmZmiana względna odzwierciedla średnią ze wszystkich pomiarów w jednej grupie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig05large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Tabela uzupełniająca 1: Składy roztworów i buforów. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61458/Preparation_of_Solutions.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Prezentowany jest tutaj protokół oznaczania białek błonowych w komórkach ssaków i pokrywania próbki grafenem do skanowania w fazie ciekłej transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Za pomocą tego protokołu można również badać stabilność próbek w stosunku do uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem.

Grafenowa obudowa chemicznie utrwalonych komórek ssaków do mikroskopii elektronowej w fazie ciekłej

A protocol is described for investigating the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) in the intact plasma membrane of breast cancer cells using ...

Ta metoda utrzymuje próbki biologiczne w rodzimym środowisku i zmniejsza artefakt wywołany wiązką elektronów. Główną zaletą jest to, że technika ta ma zastosowanie do całych komórek. Dzięki temu komórki nie muszą być odwadniane, barwione ani dzielone na sekcje przed mikroskopią elektronową.Zdolność do obrazowania receptorów na komórkach nowotworowych w kontekście całej nienaruszonej błony plazmatycznej jest głównym aspektem, który może prowadzić do nowych podejść terapeutycznych i opracowania nowych leków przeciwnowotworowych. Zademonstruję pracę z komórkami, powlekanie grafenem i mikroskopię, a Sercan Keskin pokaże, jak przygotować grafen. Na początek dodaj 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do dwóch dołków 96-dołkowej płytki zawierającej mikroczipy pokryte PLL i FLP z membraną z azotku krzemu skierowaną do góry i 50 mikrolitrów pożywki bez surowicy.Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez pięć minut, aby umożliwić komórkom przyczepienie się do mikroczipa. Sprawdź gęstość komórek na mikrochipie za pomocą odwróconego mikroskopu i upewnij się, że komórki zakrywają okno wystarczającą ilością miejsca, aby spłaszczyć się i przylegać. Aby oznaczyć HER2 w komórkach, umieść mikroczipy w dołkach w pierwszym rzędzie płytki etykietowej.Następnie umyj mikroczipy za pomocą PBS BSA. Aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu mimetyku przeciwciała, należy inkubować mikroczipy z PBS BSA GS przez pięć minut. Następnie z mimetykiem przeciwciał 200 nanomolowych przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Aby usunąć grafen PMMA z polimeru, należy odpipetować kilka kropel wody na polimer wokół grafenu PMMA. Następnie zanurz go w wodzie pod kątem od 30 do 45 stopni, aby uwolnić grafen PMMA. Aby wytrawić zanieczyszczenia na bazie miedzi, należy przygotować 50-mililitrowy roztwór 0,42-molowego nadsiarczanu sodu w wodzie.Użyj standardowego szkiełka szkiełkowego, aby przenieść grafen PMMA do roztworu nadsiarczanu sodu stroną grafenową do dołu. Grafen PMMA unosi się na górze roztworu. Zostaw go tam na noc.Następnego dnia przenieś grafen PMMA z roztworu nadsiarczanu sodu do czystej wody. Pozwól mu unosić się w wodzie przez pół godziny. Powtórz mycie w sumie trzy razy, aby usunąć wszystkie pozostałości nadsiarczanu sodu z grafenu PMMA.Następnie przenieś grafen PMMA na kryształ chlorku sodu. Przygotuj nasycony roztwór chlorku sodu w wodzie na szalce Petriego i przenieś grafen PMMA na wierzch roztworu grafenem do dołu. Przytrzymaj kryształ chlorku sodu pęsetą i podnieś pływający grafen PMMA.Następnie przytrzymaj go pionowo przez dwie minuty, aby nadmiar wody wypłynął. Pozostaw do wyschnięcia do temperatury pokojowej na 30 minut i piecz w piekarniku w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 20 minut. Całkowicie usuń wodę.Rozgrzej aceton w szklanej szalce Petriego do około 50 stopni Celsjusza na płycie grzejnej w dygestorium. Uważnie obserwuj temperaturę, aby uniknąć pożaru. Zanurz grafen PMMA na soli na szalce Petriego wypełnionej acetonem i pozostaw do rozpuszczenia PMMA na 30 minut.Pozwól grafenowi na słonym powietrzu dokładnie wyschnąć przed użyciem go do przygotowania próbki. Umyj jeden przygotowany i oznakowany mikroczip w czystej wodzie, aby usunąć wszelkie pozostałości soli z buforu i umieść go na bibule filtracyjnej. Komórki powinny być widoczne jako ciemne plamy.Użyj żyletki, aby pociąć wielowarstwowy grafen na krysztale chlorku sodu na kawałek, który pasuje do okienka azotku krzemu mikrochipa. Usuń grafen z kryształu chlorku sodu, zanurzając go w zlewce z wodą, przechylając kryształ pod kątem 45 stopni w stosunku do powierzchni. Złap grafen metalową pętlą z powierzchni wody, a następnie dotknij górnej powierzchni mikroczipa dolną powierzchnią pętli, powodując przyklejenie się mikroczipa do metalowej pętli.Grafen można zobaczyć na górze mikrochipa. Pod mikroskopem stereoskopowym użyj bibuły filtracyjnej, aby usunąć pozostałą wodę z mikrochipa, tak aby grafen pokrył wszystkie komórki w oknie azotku krzemu. Umieść mikroczip na bibule filtracyjnej za pomocą pęsety.Grafen jest widoczny jako fioletowy połysk na mikrochipie. Przenieś mikroczip z papieru na szalkę Petriego w komorze na płytce Petriego. Odpipetuj kroplę wody do jednej z wolnych komór i zamknij pokrywę, aby zapewnić atmosferę nasyconą wodą.Następnie uszczelnij naczynie komory folią parafinową i przechowuj je w lodówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ustaw energię wiązki STEM na 200 kilowoltów za pomocą próbki wyrównującej dla rozmiaru sondy co najmniej 0,2 nanometra, regulując soczewki kondensatora. Ustaw prąd sondy na 180 pikoamperów i półkąt zbieżności wiązki na 13,2 miliradianu, wstawiając aperturę.Ustaw zakres półkąta otwarcia detektora ADF STEM na 68 do 280 miliradianów, dostosowując ustawienia obiektywu projektora. Następnie ustaw rozmiar obrazu STEM na 2048 na 2048 pikseli, a czas przebywania pikseli na sześć mikrosekund. Załaduj mikroczip z ogniwami pokrytymi grafenem do standardowego uchwytu na próbki w taki sposób, aby komórki były skierowane do góry i załaduj uchwyt do mikroskopu elektronowego.Uzyskaj obraz poglądowy w powiększeniu 800 razy. Następnie zidentyfikuj obszar zainteresowania i obraz nanocząstek kropek kwantowych w odległości 80 000 X i rozmiarze piksela 1,3 nanometra. Tutaj pokazano optymalnie wysiane komórki.Okno jest zasłonięte, ale jest wystarczająco dużo miejsca, aby umożliwić im spłaszczenie i przyleganie. Kiedy zbyt wiele komórek zostało umieszczonych na mikrochipie, nie było wystarczająco dużo miejsca, aby wszystkie komórki mogły przylgnąć. Po 24 godzinach ponad połowa komórek nie spłaszczyła się.Jeśli zostanie wysianych zbyt mało komórek, okno azotku krzemu po 24 godzinach skończy się dużą pustą przestrzenią. Pokazano tutaj obrazy DIC i fluorescencyjne optymalnie wysianych komórek, co dowodzi skutecznego znakowania HER2. STEM przeprowadzono na ogniwach SKBR3 pokrytych grafenem i niepokrytych.Wstawki na obrazach w powiększeniu 800 X zostały zobrazowane w 80 000 X. Nanocząstki kropek kwantowych są widoczne jako jasne plamy w powiększeniu 50 000X. Aby zbadać wpływ oświetlenia wiązką elektronów na próbkę, obrazy STEM uzyskano w serii obrazów z akumulującą dawką elektronów. Reprezentatywne wyniki dla próbek niepowlekanych i powlekanych grafenem przedstawiono tutaj.Ekspozycja próbek niepowlekanych doprowadziła do pojawienia się jasnych struktur na powierzchni komórek, co nie wystąpiło w przypadku żadnej z próbek pokrytych grafenem. Średnia względna zmiana odległości par cząstek pozostała poniżej 1,3% dla próbek niepowlekanych i poniżej 0,8% dla próbek powlekanych. Po tej procedurze można obrazować różne rodzaje białek błonowych na całych komórkach przy użyciu innych metod mikroskopowych.Technika ta umożliwia obrazowanie białek w nienaruszonej błonie plazmatycznej w celu uzyskania większej ilości informacji na temat organizacji błony plazmatycznej i interakcji między białkami.

graphene-enclosure-chemically-fixed-mammalian-cells-for-liquid-phase

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mikroskopia elektronowa z ciekłych komórek grafenowych może być używana do obserwacji dynamiki nanokryształów w środowisku ciekłym z większą rozdzielczością przestrzenną niż inne techniki mikroskopii elektronowej w ciekłych komórkach. Wytrawianie gotowych nanokryształów i śledzenie ich kształtu za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej z ciekłymi ogniwami grafenowymi może dostarczyć ważnych informacji mechanistycznych na temat przemian nanocząstek.

Wykorzystanie mikroskopii elektronowej transmisji ciekłych komórek grafenowych do badania trawienia nanokryształów in situ

Przedstawiono protokół przygotowania mikrodobitkowych komórek płynnych z grafenem do mikroskopii elektronowej in situ nanokryształów złota z roztworu prekursorowego HAuCl4. Ponadto przedstawiono procedurę analizy w celu ilościowego określenia obserwowanego trawienia i dynamiki wzrostu.

Przygotowanie ciekłych komórek mikrostudzienkowych na bazie grafenu do transmisyjnej mikroskopii elektronowej in situ

Tutaj opisujemy protokół stosowania pojedynczej monowarstwy grafenu na siatkach mikroskopii elektronowej i jak przygotować je do użycia w określaniu struktury krioEM.

Wytwarzanie jednowarstwowych siatek pokrytych grafenem do mikroskopii krioelektronowej

Zastosowanie warstw nośnych do siatek kriogenicznej mikroskopii elektronowej (cryoEM) może zwiększyć gęstość cząstek, ograniczyć interakcje z interfejsem powietrze-woda, zredukować ruch wywołany wiązką i poprawić rozkład orientacji cząstek. W artykule opisano solidny protokół powlekania siatek krioEM monowarstwą grafenu w celu lepszego przygotowania próbek kriogenicznych.

Zastosowanie jednowarstwowego grafenu w siatkach mikroskopii krioelektronowej do określania struktury w wysokiej rozdzielczości

Długoterminowe Imaging komórkach ssaków przy dużym polu Mikroskopia

Opisano metodę obserwacji pojedynczych cząsteczek DNA w żywych komórkach. Technika ta opiera się na wiązaniu białka represora lac znakowanego fluorescencyjnie do miejsc wiążących wprowadzonych do badanego DNA. Metodę tę można dostosować do śledzenia wielu rekombinowanych cząsteczek DNA w żywych komórkach w czasie.

Monitorowanie replikacji plazmidów w żywych komórkach ssaków na przestrzeni wielu pokoleń za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Zmienione wewnątrzkomórkowe poziomy hemu są związane z powszechnymi chorobami, takimi jak rak. W związku z tym istnieje potrzeba pomiaru poziomu biosyntezy hemu w różnych komórkach. Celem tego protokołu jest zapewnienie szybkiej i czułej metody pomiaru i porównywania poziomów syntezy hemu w różnych komórkach.

Pomiar poziomu syntezy hemu w komórkach ssaków

Uzyskanie wysokiej jakości obrazów z transmisyjnej mikroskopii elektronowej jest wyzwaniem, szczególnie w przypadku komórek roślinnych, które mają obfite duże wakuole wypełnione wodą i napowietrzone przestrzenie. Tandemowe zamrażanie wysokociśnieniowe i szybkie zastępowanie przez zamrażanie znacznie skracają czas przygotowania próbek roślinnych do TEM, jednocześnie wytwarzając próbki o doskonałej konserwacji ultrastrukturalnej.

Tandemowe zamrażanie wysokociśnieniowe i szybkie zamrażanie podstawiania tkanek roślinnych do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Ten protokół opisuje różne techniki niezbędne do transmisyjnej mikroskopii elektronowej, w tym barwienie ujemne, ultracienkie sekcje dla szczegółowej struktury i znakowanie immuno-złote w celu określenia pozycji określonych białek w egzosomach.

Przygotowanie próbek i obrazowanie egzosomów za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Przedstawiono instrument i metody do przygotowania objętości próbek o rozmiarach nanolitrów do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Nie są wymagane żadne etapy papierowego blottingu, co pozwala uniknąć szkodliwych konsekwencji, jakie może to mieć dla białek, znacznie zmniejszając utratę próbki i umożliwiając analizę lizatu pojedynczej komórki do wizualnej proteomiki.

Zminiaturyzowane przygotowanie próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Poznaj metodę obrazowania białek błonowych w komórkach ssaków przy użyciu mikroskopii STEM z grafenową obudową. Technika zachowuje rodzime środowisko próbek i minimalizuje artefakty wiązki elektronowej.

Grafenowa obudowa chemicznie utrwalonych komórek ssaków do mikroskopii elektronowej w fazie ciekłej

Przeglądaj więcej filmów