Name: Analiza metabolizmu ludzkich komórek NK (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Poznaj metodę pomiaru glikolizy i oddychania mitochondrialnego w ludzkich komórkach NK przy użyciu analizatora przepływu pozakomórkowego. Technika umożliwia badanie metabolizmu komórek NK w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Dr. Michaelowi N. Sackowi (National Heart, Lung, and Blood Institute) za wsparcie i dyskusję. Badanie to było wspierane przez Intramural Research Programs of the National Institutes of Health, National Cancer Institute oraz National Heart, Lung, and Blood Institute. JT jest wspierany przez program Ramon y Cajal (grant RYC2018-026050-I) MICINN (Hiszpania).

<ol><li>Long, E. O., Kim, H. S., Liu, D., Peterson, M. E., Rajagopalan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+natural+killer+cell+responses%3A+integration+of+signals+for+activation+and+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Controlling natural killer cell responses: integration of signals for activation and inhibition.</a> Annual Review of Immunology. 31, 227-258 (2013).</li>
<li>Caligiuri, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human natural killer cells.</a> Blood. 112 (3), 461-469 (2008).</li>
<li>Anton, O. M., Vielkind, S., Peterson, M. E., Tagaya, Y., Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+Cell+Proliferation+Induced+by+IL-15+Transpresentation+Is+Negatively+Regulated+by+Inhibitory+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">NK Cell Proliferation Induced by IL-15 Transpresentation Is Negatively Regulated by Inhibitory Receptors.</a> Journal of Immunology. 195 (10), 4810-4821 (2015).</li>
<li>Henney, C. S., Kuribayashi, K., Kern, D. E., Gillis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-2+augments+natural+killer+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interleukin-2 augments natural killer cell activity.</a> Nature. 291 (5813), 335-338 (1981).</li>
<li>Anton, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-endocytosis+of+intact+IL-15Ralpha-IL-15+complex+from+presenting+cells+into+NK+cells+favors+signaling+for+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Trans-endocytosis of intact IL-15Ralpha-IL-15 complex from presenting cells into NK cells favors signaling for proliferation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 522-531 (2020).</li>
<li>Marcais, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metabolic+checkpoint+kinase+mTOR+is+essential+for+IL-15+signaling+during+the+development+and+activation+of+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The metabolic checkpoint kinase mTOR is essential for IL-15 signaling during the development and activation of NK cells.</a> Nature Immunology. 15 (8), 749-757 (2014).</li>
<li>Mookerjee, S. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+Maximum+Glycolytic+Capacity+Using+Extracellular+Flux+Measurements%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Determining Maximum Glycolytic Capacity Using Extracellular Flux Measurements.</a> PloS One. 11 (3), 0152016(2016).</li>
<li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).</li>
<li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Proton+Leak+Plays+a+Critical+Role+in+Pathogenesis+of+Cardiovascular+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 982, 359-370 (2017).</li>
<li>Terren, I., Orrantia, A., Vitalle, J., Zenarruzabeitia, O., Borrego, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+Cell+Metabolism+and+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">NK Cell Metabolism and Tumor Microenvironment.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2278(2019).</li>
<li>Felices, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+treatment+with+IL-15+exhausts+human+NK+cells+via+a+metabolic+defect%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation+Insight%22%5BJournal%5D)">Continuous treatment with IL-15 exhausts human NK cells via a metabolic defect.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (3), 96219(2018).</li>
<li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+First-in-Human+Phase+I+Study+of+Subcutaneous+Outpatient+Recombinant+Human+IL15+%28rhIL15%29+in+Adults+with+Advanced+Solid+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A First-in-Human Phase I Study of Subcutaneous Outpatient Recombinant Human IL15 (rhIL15) in Adults with Advanced Solid Tumors.</a> Clinical Cancer Research. 24 (7), 1525-1535 (2018).</li>
<li>Conlon, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL15+by+Continuous+Intravenous+Infusion+to+Adult+Patients+with+Solid+Tumors+in+a+Phase+I+Trial+Induced+Dramatic+NK-Cell+Subset+Expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">IL15 by Continuous Intravenous Infusion to Adult Patients with Solid Tumors in a Phase I Trial Induced Dramatic NK-Cell Subset Expansion.</a> Clinical Cancer Research. 25 (16), 4945-4954 (2019).</li>
<li>Dubois, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL15+Infusion+of+Cancer+Patients+Expands+the+Subpopulation+of+Cytotoxic+CD56%28bright%29+NK+Cells+and+Increases+NK-Cell+Cytokine+Release+Capabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">IL15 Infusion of Cancer Patients Expands the Subpopulation of Cytotoxic CD56(bright) NK Cells and Increases NK-Cell Cytokine Release Capabilities.</a> Cancer Immunology Research. 5 (10), 929-938 (2017).</li>
<li>Traba, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fasting+and+refeeding+differentially+regulate+NLRP3+inflammasome+activation+in+human+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Fasting and refeeding differentially regulate NLRP3 inflammasome activation in human subjects.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4592-4600 (2015).</li>
<li>Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Optimized+Protocol+to+Analyze+Glycolysis+and+Mitochondrial+Respiration+in+Lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54918(2016).</li>
<li>Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+quantifying+mitochondrial+dysfunction+in+complex+diseases+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Journals+of+Gerontology.+Series+A%2C+Biological+Sciences+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging.</a> Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).</li>
<li>Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometry-based+Assay+for+the+Monitoring+of+NK+Cell+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), e54615(2016).</li>
<li>Theorell, J., Bryceson, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Intracellular+Ca%282%2B%29+Mobilization+in+Human+NK+Cell+Subsets+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Intracellular Ca(2+) Mobilization in Human NK Cell Subsets by Flow Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1441, 117-130 (2016).</li>
<li>Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+intracellular+rates+of+glycolytic+and+oxidative+ATP+production+and+consumption+using+extracellular+flux+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).</li>
<li>O'Brien, K. L., Finlay, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunometabolism+and+natural+killer+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunometabolism and natural killer cell responses.</a> Nature Reviews: Immunology. 19 (5), 282-290 (2019).</li>
<li>Ahn, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+mitochondrial+deacetylase+Sirt3+in+regulating+energy+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A role for the mitochondrial deacetylase Sirt3 in regulating energy homeostasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14447-14452 (2008).</li>
<li>Stram, A. R., Payne, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+in+mitochondria%3A+protein+signaling+in+the+powerhouse%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications in mitochondria: protein signaling in the powerhouse.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (21), 4063-4073 (2016).</li>
<li>Armstrong, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+alters+mitochondrial+bioenergetics+and+modifies+pancreatic+cell+death+independently+of+cyclophilin+D%2C+resulting+in+an+apoptosis-to-necrosis+shift%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress alters mitochondrial bioenergetics and modifies pancreatic cell death independently of cyclophilin D, resulting in an apoptosis-to-necrosis shift.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (21), 8032-8047 (2018).</li>
<li>Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contributions+of+respiration+and+glycolysis+to+extracellular+acid+production%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).</li>
<li>Mookerjee, S. A., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+and+Analysis+of+Extracellular+Acid+Production+to+Determine+Glycolytic+Rate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53464(2015).</li>
<li>Lichtshtein, D., Kaback, H. R., Blume, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+lipophilic+cation+for+determination+of+membrane+potential+in+neuroblastoma-glioma+hybrid+cell+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Use of a lipophilic cation for determination of membrane potential in neuroblastoma-glioma hybrid cell suspensions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 650-654 (1979).</li>
<li>Michelet, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+of+natural+killer+cells+in+obesity+limits+antitumor+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming of natural killer cells in obesity limits antitumor responses.</a> Nature Immunology. 19 (12), 1330-1340 (2018).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W tym artykule ustaliliśmy protokół skutecznego izolowania i hodowli czystych i żywotnych pierwotnych ludzkich komórek NK z krwi obwodowej. Zoptymalizowaliśmy również warunki pomiaru aktywności metabolicznej tych komórek NK ocenianej na podstawie wskaźnika zużycia tlenu i wskaźnika zakwaszenia zewnątrzkomórkowego za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego. W porównaniu z innymi metodami respirometrycznymi, analizator strumienia zewnątrzkomórkowego jest szybki, wymaga niewielkiej liczby komórek i umożliwia badan...

Komórki NK (Natural Killer) to wrodzone limfocyty, które pośredniczą w odpowiedziach przeciwnowotworowych i przeciwwirusowych. Komórki NK stanowią 5-15% wszystkich limfocytów w ludzkiej krwi obwodowej i można je również znaleźć w śledzionie, wątrobie, szpiku kostnym i węzłach chłonnych. Komórki NK nie wykazują ekspresji polimorficznych receptorów klonotypowych, takich jak receptory komórek T (TCR) lub receptory komórek B (BCR). W przeciwieństwie do tego, aktywacja ich funkcji cytolitycznych jest wywoływana przez zaangażowanie receptorów, które rozpoznają niezmienne ligandy na powierzchni komórki docelowej1,2.
Ludzkie komórki NK w stanie spoczynku, wyizolowane z krwi obwodowej, mogą przetrwać przez kilka dni w pożywce hodowlanej uzupełnionej ludzką surowicą. Aktywacja komórek NK przez cytokiny, takie jak IL-15 lub IL-2, napędza komórki do proliferacji i zwiększenia ich zdolności zabijania, między innymi3,4,5. Kilka badań wykazało bezpośrednią korelację między aktywacją komórek NK a zmianami w ich aktywności metabolicznej6. Te przemiany metaboliczne mają na celu zaspokojenie szczególnych potrzeb komórek w zakresie energii i biosyntezy.
Tlenowe komórki i organizmy pozyskują energię poprzez szereg reakcji chemicznych, które obejmują katabolizm i utlenianie węglowodanów, tłuszczów i białek. Poprzez połączenie glikolizy, cyklu kwasu trikarboksylowego (TCA) i fosforylacji oksydacyjnej, komórki eukariotyczne zaspokajają większość swojego zapotrzebowania na ATP i uzyskują produkty pośrednie wymagane jako elementy budulcowe makrocząsteczek niezbędnych do wzrostu i proliferacji komórek. Proces glikolizy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A) rozpoczyna się od wejścia glukozy do komórki. W cytozolu glukoza jest fosforylowana i przekształcana w pirogronian (z produkcją netto 2 cząsteczek ATP na cząsteczkę glukozy), który może zostać zredukowany do mleczanu lub przetransportowany do mitochondriów w celu przekształcenia w acetylo-CoA i wejścia w cykl TCA. Cykl TCA kontynuuje cykl napędzany większą liczbą cząsteczek acetylo-CoA i wytwarza CO2 (który ostatecznie dyfunduje na zewnątrz komórki i reagując zH2Ow pożywce, wytworzy kwas węglowy, który doprowadzi do zakwaszenia pożywki) i NADH, cząsteczkę odpowiedzialną za oddawanie elektronów do łańcucha transportu elektronów (ETC). Elektrony przemieszczają się przez różne kompleksy białkowe i są ostatecznie akceptowane przez tlen. Kompleksy te (I, III i IV) pompują również H+ z macierzy mitochondrialnej do przestrzeni międzybłonowej. W wyniku wygenerowanego gradientu elektrochemicznego, H+ ponownie wejdzie do matrycy przez kompleks V (syntazę ATP), inwestując zgromadzoną energię potencjalną w wytwarzanie ATP.
Zarówno glikoliza, jak i oddychanie mitochondrialne mogą być blokowane w różnych punktach za pomocą inhibitorów. Poznanie i zastosowanie tych inhibitorów było podstawą do opracowania testu strumienia zewnątrzkomórkowego. Mierząc dwa proste parametry w czasie rzeczywistym, takie jak pH i tlen, analizator strumienia zewnątrzkomórkowego wnioskuje o szybkości glikolizy i oddychania mitochondrialnego na 96-dołkowej płytce. Test stresu glikolizy przeprowadza się w podłożu podstawowym bez glukozy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B)7. Pierwsze pomiary stopnia zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) wskazują na zakwaszenie niezależne od glikolizy. Jest to określane jako zakwaszenie nieglikolityczne i koreluje z CO2 wytwarzanym przez TCA, który, jak wyjaśniono wcześniej, łączy się z H2O w pożywce, tworząc H+ (ECAR sprzężony z TCA). Pierwszym wstrzyknięciem jest glukoza w celu wywołania wykorzystania glukozy i zwiększenia glikolizy. Drugie wstrzyknięcie łączy ze sobą zarówno rotenon, inhibitor kompleksu I, jak i antymycynę A, inhibitor kompleksu III, w celu zablokowania ETC. Komórki reagują na ten dramatyczny spadek produkcji mitochondrialnego ATP poprzez aktywację glikolizy w celu utrzymania komórkowego poziomu ATP, a to reprezentuje ilość glikolizy, która nie jest wykorzystywana przez komórkę w stanie podstawowym, ale może być potencjalnie rekrutowana w odpowiedzi na wzrost zapotrzebowania na ATP (glikoliza kompensacyjna). Trzecim wstrzyknięciem jest analog glukozy 2-deoksyglukoza (DG), który konkuruje z glukozą jako substrat dla enzymu heksokinazy. Produkt tej fosforylacji, 2-deoksyglukozo-6-fosforan nie może zostać przekształcony w pirogronian, dlatego glikoliza jest blokowana, co obniża ECAR do minimum. ECAR mierzony w tym momencie obejmuje inne źródła zakwaszenia zewnątrzkomórkowego, które nie są przypisywane glikolizie lub aktywności oddechowej, a także wszelką glikolizę resztkową, która nie jest w pełni hamowana przez 2-DG (po zakwaszeniu 2-DG).
Test stresu mitochondrialnego jest wykonywany w pożywce z glukozą (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C)8. Pierwsze pomiary wskaźnika zużycia tlenu (OCR) odpowiadają podstawowej linii oddychania mitochondrialnego (oddychanie podstawowe). Pierwszym wstrzyknięciem jest oligomycyna, która hamuje powrót protonów przez syntazę ATP (kompleks V), blokując syntezę ATP, a tym samym gwałtownie hiperpolaryzując błonę mitochondrialną, co zapobiega dalszemu pompowaniu protonów przez kompleksy oddechowe i prowadzi do spadku OCR. Porównanie oddychania podstawowego z wartością wynikającą z dodania oligomycyny reprezentuje oddychanie sprzężone z ATP. Pozostała niewrażliwa na oligomycynę szybkość zużycia tlenu nazywana jest wyciekiem protonów, który reprezentuje przepływ protonów przez dwuwarstwę lipidową lub białka w wewnętrznej błonie mitochondrialnej, takie jak translokaza nukleotydu adeninowego9. Drugie wstrzyknięcie to rozprzęgacz 2,4-dinitrofenolu (DNP), jonoforu, który indukuje masowe wejście H+ do macierzy mitochondrialnej, co prowadzi do depolaryzacji błony mitochondrialnej i zakłócenia syntezy mitochondrialnego ATP. Komórki reagują na rozproszenie siły napędowej protonów, zwiększając szybkość transportu elektronów i zużycia tlenu do maksymalnych poziomów w daremnej próbie odzyskania potencjału błonowego (maksymalnej wydolności oddechowej). Różnica między maksymalną wydolnością oddechową a oddychaniem podstawowym polega na wolnej pojemności oddechowej komórki, która reprezentuje ilość oddechu, która nie jest wykorzystywana przez komórkę do generowania ATP w stanie podstawowym, ale może być potencjalnie rekrutowana w odpowiedzi na wzrost zapotrzebowania na ATP lub w warunkach stresu8. Trzecie wstrzyknięcie to połączenie rotenonu i antymycyny A. To wstrzyknięcie całkowicie zatrzymuje ETC, a OCR spada do najniższego poziomu, a pozostałe zużycie tlenu jest niemitochondrialne (spowodowane przez oksydazy NADPH itp.).
Zmiany w szlakach metabolicznych mogą jakoś przewidzieć funkcjonowanie komórek NK, ponieważ zasugerowano, że ciągła aktywacja komórek NK za pomocą cytokin in vitro może prowadzić do wyczerpania komórek NK poprzez badanie różnych szlaków metabolicznych10,11. Korelacja między stanem metabolicznym a funkcją komórek NK jest bardzo istotna z punktu widzenia immunoterapii nowotworów. W tej dziedzinie przetestowano aktywację komórek NK za pomocą infuzji IL-15, samodzielnie lub w połączeniu z monoklonalnymi przeciwciałami terapeutycznymi w celu poprawy zabijania komórek nowotworowych12,13,14. Wiedza na temat statusu metabolicznego komórek NK w odpowiedzi na te strategie leczenia dostarczyłaby cennego predyktora statusu aktywacji komórek NK i funkcji zabijania.
Opisano badanie szlaków metabolicznych w innych komórkach szpikowych i limfoidalnych, takich jak monocyty, limfocyty T i B15 i opublikowano zoptymalizowane metody16. W tym protokole zapewniamy metodę, która łączy zarówno protokół izolacji NK, który daje dużą liczbę czystych i żywotnych komórek NK, jak i zoptymalizowany protokół pomiaru aktywności metabolicznej za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego. Tutaj pokazujemy, że jest to ważna metoda badania zmian metabolicznych w spoczynkowych i aktywowanych przez IL-15 ludzkich komórkach NK. W przypadku testu strumienia zewnątrzkomórkowego parametry takie jak liczba komórek i stężenia leków zostały przetestowane i zoptymalizowane. W porównaniu z innymi metodami respirometrycznymi, analizator strumienia zewnątrzkomórkowego jest w pełni zautomatyzowany i zdolny do testowania w czasie rzeczywistym, przy bardzo małej liczbie komórek, do 92 próbek jednocześnie, a tym samym umożliwia badania przesiewowe o wysokiej przepustowości (z wieloma próbkami i powtórzeniami) w stosunkowo szybki sposób17.
Ta metoda może być używana przez badaczy zainteresowanych oceną funkcji komórek NK poprzez badanie metabolizmu komórek NK. Może być również stosowany do komórek aktywowanych przez inne cytokiny, przeciwciała lub bodźce rozpuszczalne.

<table><tbody><tr><td>2-Deoksy-D-glukoza (2-DG)</td><td>MiliporeSigma</td><td>D8375-5G</td><td>Glikoliza Test wysiłkowy Związek wtryskowy</td></tr><tr><td>2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP)</td><td>MilliporeRozłącznik Sigma</td><td>D198501</td><td>ETC / mitochondrialny test wysiłkowy Mieszanka wtryskiwacza</td></tr><tr><td>96 Well Cell Culture / Okrągłe dno z pokrywką</td><td>Costar</td><td>3799</td><td>Hodowla komórkowa NK</td></tr><tr><td>Antymycyna A</td><td>MiliporeSigma</td><td>A8674</td><td>Inhibitor kompleksu III / glikoliza i test stresu mitochondrialnego związek iniekcyjny</td></tr><tr><td>BD FACSDIVA Software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Akwizycja danych przepływu</td></tr><tr><td>BD LSR Fortessa</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Akwizycja danych przepływu</td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>Corning</td><td>354240</td><td>Klej komórkowy</td></tr><tr><td>Test proliferacji komórek CyQUANT</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C7026</td><td>Test proliferacji komórek do ilościowego oznaczania DNA. Zawiera bufor do lizy komórek i barwnik CyQUANT GR</td></tr><tr><td>EasySep Human CD3 Positive Selection Kit II</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>17851</td><td>Izolacja komórek NK z PBMC</td></tr><tr><td>Zestaw do wzbogacania ludzkich komórek NK EasySep</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>19055</td><td>Izolacja komórek NK z PBMC</td></tr><tr><td>Technologie EasySep Magnet</td><td>Stemcell</td><td>18001</td><td>Izolacja komórek NK z PBMC</td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M, pH 8</td><td>Jakość Biologiczny</td><td>10128-446</td><td>NK sprzedam separacyjny</td></tr><tr><td>probówki FACS</td><td>Falcon-Fisher Scientific</td><td>352235</td><td>Eksperyment cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Falcon 50 ml Probówki stożkowe</td><td>Falcon-Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Separacja komórek NK</td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu (FCS)</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td>Bufor do separacji komórek NK</td></tr><tr><td>FlowJo Software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Analiza danych przepływu</td></tr><tr><td></td><td>Glikokrzema MilliporeSigma</td><td>G8270</td><td>Składnik mitochondrialnej pożywki do testów wysiłkowych. Test stresu glikolizy Związek wtryskiwacza</td></tr><tr><td>Halt Protease Inhibitor Cocktail</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78429</td><td>Inhibitor proteazy 100X. Zastosowanie w buforze do lizy RIPA Ludzka</td></tr><tr><td>IL-15</td><td>Peprotech</td><td>200-15-50ug</td><td>Stymulacja komórek NK</td></tr><tr><td>Surowica ludzka (HS)</td><td>Valley Biomedical</td><td>9C0539</td><td>Pożywka do hodowli komórek NK</td></tr><tr><td>suplement IMDM</td><td>Gibco</td><td>12440053</td><td>komórka NK pożywka hodowlana</td></tr><tr><td>L-glutamina (200 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030-081</td><td>Składnik pożywki do testów warunków skrajnych</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Barin Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L34965</td><td>Barwnik żywotności do barwienia cytometrią przepływową</td></tr><tr><td>LSM</td><td>mpbio</td><td>50494X</td><td>PBMCs separacja od ludzkiej krwi</td></tr><tr><td>Mysz anty-ludzka CD3 BV711</td><td>BD Biosciences</td><td>563725</td><td>Barwienie cytometrią przepływową komórek T</td></tr><tr><td>Mysz anty-ludzka CD56 PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>555516</td><td>barwienie metodą cytometrii przepływowej NK</td></tr><tr><td>Mysz anty-ludzka NKp46</td><td>PE BD Pharmingen</td><td>557991</td><td>barwienie cytometrią przepływową NK</td></tr><tr><td>Oligomycyna</td><td>MilliporeSigma</td><td>75351</td><td>Inhibitor kompleksu V / mitochondrialny test wysiłkowy związek wtryskiwacza</td></tr><tr><td>PBS pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td>komórka NK Bufor separacyjny</td></tr><tr><td>Pierce BCA Zestaw do oznaczania białek</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td>Do oznaczania stężenia białka</td></tr><tr><td>Bufor RIPA</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-115</td><td>Liza komórek</td></tr><tr><td>Milipory</td><td>rotenonuSigma</td><td>R8875</td> Inhibitor kompleksu <td>II / glikoliza i test stresu mitochondrialnego Związek wtryskiwacza</td></tr><tr><td>Seahorse Wave Controller Software</td><td>Agilent</td><td></td><td>Kontroler do analizatora Seahorse XFe96</td></tr><tr><td>Oprogramowanie komputerowe Seahorse Wave</td><td>Agilent</td><td></td><td>Do analizy danych</td></tr><tr><td>Seahorse XF Base Medium</td><td>Agilent</td><td>102353-100</td><td>Pożywka bazowa do badania strumienia zewnątrzkomórkowego</td></tr><tr><td>Analizator Seahorse XFe96 Analizator</td><td>strumienia zewnątrzkomórkowego</td><td>Agilent</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak</td><td>Agilent</td><td>102416-100</td><td>Zawiera 20 płytek do hodowli komórkowych XF96, 18 wkładów z czujnikiem XFe96, prowadnice ładowania do przenoszenia związków do wkładu testowego oraz 1 butelkę roztworu kalibru (500 ml).</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>MilliporeSigma</td><td>S5761</td><td>Aby przygotować roztwór Cell-Tak</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu (100 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360-070</td><td>Składnik mitochondrialnej pożywki do testów wysiłkowych</td></tr></tbody></table>

analiza metabolizmu ludzkich komórek nk

Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism

Komórki NK (Natural Killer) pośredniczą głównie w wrodzonych przeciwnowotworowych i przeciwwirusowych odpowiedziach immunologicznych oraz reagują na różne cytokiny i inne bodźce, aby promować przetrwanie, proliferację komórek, produkcję cytokin, takich jak interferon gamma (IFNγ) i/lub programy cytotoksyczności. Aktywacja komórek NK poprzez stymulację cytokin wymaga znacznego przemodelowania szlaków metabolicznych w celu zaspokojenia ich wymagań bioenergetycznych i biosyntetycznych. Istnieje wiele dowodów sugerujących, że upośledzony metabolizm komórek NK jest związany z wieloma chorobami przewlekłymi, w tym otyłością i rakiem, co podkreśla kliniczne znaczenie dostępności metody określania metabolizmu komórek NK. W tym miejscu opisujemy zastosowanie analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego, platformy, która umożliwia pomiary glikolizy i zużycia tlenu w mitochondriach w czasie rzeczywistym, jako narzędzia do monitorowania zmian w metabolizmie energetycznym ludzkich komórek NK. Opisana tu metoda pozwala również na monitorowanie zmian metabolicznych po stymulacji komórek NK cytokinami takimi jak IL-15, układ, który jest obecnie badany w szerokim zakresie badań klinicznych.

Wyizolowanie komórek NK z krwi obwodowej zapewnia czystą i żywotną populację
Badanie przepływu zewnątrzkomórkowego opiera się na pomiarze stężenia H+ i O2 w dołku i nie pozwala na odróżnienie różnych populacji komórek ani ocenę ich żywotności. Z tego powodu uzyskanie wysoce czystej i żywotnej populacji komórek docelowych było kluczowym krokiem do powodzenia tych eksperymentów.
Wyizolowanie komórek NK z krwi obwodowej przeprowad...

W tym artykule opisujemy metodę pomiaru glikolizy i oddychania mitochondrialnego w pierwotnych ludzkich komórkach NK (Natural Killer) wyizolowanych z krwi obwodowej, w spoczynku lub po aktywacji wywołanej przez IL15. Opisany protokół można łatwo rozszerzyć na pierwotne ludzkie komórki NK aktywowane przez inne cytokiny lub rozpuszczalne bodźce.

Analiza metabolizmu ludzkich komórek NK

Natural Killer (NK) cells mediate mainly innate anti-tumor and anti-viral immune responses and respond to a variety of cytokines and other stimuli to ...

Metoda ta pozwala na określenie metabolizmu komórek NK (ang. natural killer cell metabolism). Kluczowy parametr w aktywacji poprzez pomiar zużycia tlenu i zmian pH w podłożu zewnątrzkomórkowym. Zaletą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego jest to, że jest w pełni zautomatyzowany i jest w stanie przetestować do 92 próbek w czasie rzeczywistym przy małej liczbie komórek.Pozwala to na tworzenie ekranów o wysokiej przepustowości. Prawidłowa metoda określania glikolizy i oddychania w atramentowych komórkach jest bardzo ważna w klinice. Ponieważ istnieje wiele chorób, w tym otyłość i rak, w których metabolizm komórek atramentowych jest upośledzony.Zacznij od odpipetowania 20 mililitrów pożywki do separacji limfocytów do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Trzymając probówkę pod kątem 30 stopni, delikatnie odpipetuj 20 mililitrów krwi na pożywce. Stworzenie widocznego i dobrze zdefiniowanego interfejsu między dwoma płynami.Wirować probówki przez 25 minut w temperaturze 1000 razy G. Następnie ostrożnie wyjmij probówki z wirówki i umieść je w stojaku. Sprawdź, czy na styku LSM i osocza znajduje się widoczna warstwa komórek. Delikatnie zassaj warstwę komórek jednojądrzastych za pomocą 10-mililitrowej plastikowej pipety i umieść ją w nowej stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów.Umyj komórki jednojądrzaste dwukrotnie 45 mililitrami PBS. I odwiruj je w temperaturze 800 razy G przez pięć minut. Aby wyizolować komórki lub ogniwa NK lub zaplecze, policz morza PVM i ponownie zawieś je w buforze separacyjnym NK raz od 10 do ośmiu komórek na mililitr.Następnie przenieś 10 mililitrów zawiesiny komórek do nowej 50-mililitrowej probówki. Dodaj 500 mikrolitrów mieszanki przeciwciał do izolacji komórek NK. I 10 mikrolitrów mieszaniny przeciwciał anty CD z dodatnią izolacją do PBMC.I inkubuj je w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Odwiruj kulki magnetyczne i dodaj jeden mililitr do PBMC i przeciwciał. Następnie inkubować MIGS przez 10 minut w temperaturze pokojowej, od czasu do czasu mieszając.Dodaj 35 mililitrów buforu izolacyjnego NK i umieść rurkę na magnesie na 15 minut. Ostrożnie zebrać supernatant za pomocą plastikowej pipety o pojemności 50 mililitrów, nie dotykając boków ani dna probówki. Policz komórki i odwiruj je w temperaturze 800 razy G przez pięć minut.Aby stymulować komórki NK rozpuszczalnym korytarzem 15, ponownie zawieś 750 000 komórek w 100 mikrolitrach IMDM zawierających 10% HS w dołku na płytce 96-dołkowej. Rozcieńczyć przejście dla ludzi od 15 do jednego mikrograma na mililitr w IMDM i 10% HS. I dodaj 100 mikrolitrów rozcieńczonego ludzkiego przejścia 15 do komórek.Napraw próbkę kontrolną z niestymulowanymi komórkami i umieść obie próbki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Stymuluj komórki przez 48 godzin, a następnie wykonaj test przepływu zewnątrzkomórkowego. Dzień przed eksperymentem włącz analizator i pozwól mu się rozgrzać do 37 stopni Celsjusza.Otwórz opakowanie naboju cenzurującego i oddziel nabój od tabliczki znamionowej. Następnie dodaj 200 mikrolitrów roztworu kalibru do każdej studzienki płytki użytkowej. I włóż centralny wkład z powrotem, upewniając się, że czujniki są całkowicie zanurzone.Aby uzyskać optymalne wyniki, należy inkubować wkład przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze bez dwutlenku węgla. Który odpowiednio nawilżony. Aby przygotować ostrze pokryte klejem, należy odpipetować 25 mikrolitrów roztworu kleju komórkowego do każdego dołka płytki.I inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Następnie usuń roztwór i umyj płytkę dwukrotnie 200 mikrolitrami sterylnej wody na studzienkę. Trzymaj płytkę otwartą przez 15 minut w kapturze do hodowli komórkowych, aby umożliwić wyschnięcie studzienek.Odwirować wcześniej wyizolowane komórki NK, dodawać 200 razy G przez pięć minut. Następnie usuń supernatanty i umyj komórki w podgrzanym mitochondrialnym pożywce do testów wysiłkowych lub pożywce do testów wysiłkowych glikolizy. Ponownie zagnieździć komórki i ponownie zawiesić je do preferowanego stężenia komórek w tym samym podłożu.Umieścić 180 mikrolitrów zawiesiny komórek na studzienkę na płytce testowej. Użyj studzienek A jeden, A 12 H jeden i H 12 jako studzienek kontrolnych do korekcji tła. Dodanie 180 mikrolitrów pożywki testowej do tych studzienek Inkubuj płytkę przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze bez dwutlenku węgla.Odwirować płytkę w temperaturze 200 razy G przez pięć minut. Następnie obserwuj komórki pod mikroskopem, aby sprawdzić, czy tworzą warstwę mano na dnie studzienki. Inkubuj komórki przez kolejne 25 minut.Ciepłe roztwory robocze do 37 stopni Celsjusza. I w razie potrzeby dostosuj ich pH do 7,4. Załaduj wcześniej przygotowane związki do testu wysiłkowego mitochondriów lub do testu stresu glikolizy na płytki A, B i C uwodnionego wkładu cenzorskiego Włóż załadowany wkład cenzora z powrotem do inkubatora podczas ustawiania programu.Aby skonfigurować protokół testu strumienia zewnątrzkomórkowego, otwórz oprogramowanie i użyj definicji grup w celu zdefiniowania warunków obróbki wstępnej. Zakładka Mapa płyt służy do wskazywania grup studni, które mają podobne warunki. Wskaż również korektę tła i puste studnie. Następnie ustaw program w zakładce protokoły.Uruchom program i umieść wkład czujnika i płytkę narzędziową na tacy. Po zakończeniu etapu kalibracji należy wymienić płytkę kalibru na płytkę testową na dołączone ogniwa. Po zakończeniu przebiegu pobierz dane i przeanalizuj je.W celu oceny czystości i żywotności komórek NK. Małe waty Aleca z mórz PVM i izolowanej populacji komórek NK wybarwiono i przeanalizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Czystość populacji komórek NK ustalono przez dwukrotne zatrzymanie przeciwko CD 3 i CD 56 lub NKP 46.Pokazano tutaj dużą szybkość zużycia tlenu przez mitochondrialne komórki NK. Zgodnie z oczekiwaniami numery komórek wyświetlały wyższe wartości OCR. Liczba komórek również korelowała liniowo z ilością DNA lub białka w studzience.Z drugiej strony, większa liczba komórek nie była optymalna. Ponieważ po dodaniu DNP stężenie tlenu w studni było całkowicie wyczerpane w każdym cyklu. Co uniemożliwiło dokładne obliczenie OCR.W ludzkich komórkach NK stwierdzono, że optymalna dawka wynosi 100 mikromolowych DNP. Typowy eksperyment z mitochondrialnym testem wysiłkowym z 750 000 komórek NK na studzienkę jest pokazany tutaj. W tym teście oligomycyna prowadzi do dramatycznego spadku zużycia tlenu.I wzrost ECAR. Co oznacza przejście na glikolizę i wysiłek w celu utrzymania komórkowego poziomu ATP. Aktywacja komórek NK przez korytarz 15 spowodowała wzrost zarówno zużycia tlenu w mitochondriach, jak i zakwaszenia zewnątrzkomórkowego.Zwiększone oddychanie podstawowe maksymalne i związane z ATP, ale nie wyciek protonów ani oddychanie niemitochondrialne. Ponadto wskaźnik OCR/ECA zmniejszył się, co wskazuje na przejście do metabolizmu glikolitycznego po stymulacji IL 15. Podczas wykonywania tego protokołu bardzo ważne jest uzyskanie czystej i zdrowej populacji komórek w celu określenia optymalnej liczby komórek i miareczkowania stężenia uncablerów.

analysis-of-human-natural-killer-cell-metabolism

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje metodę analizy metabolizmu energetycznego w aktywowanych ludzkich komórkach NK za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego. Różne inhibitory kompleksów łańcucha transportu elektronów wpływają na syntezę ATP, która jest mierzona za pomocą wskaźnika zużycia tlenu lub OCR, dostarczając wglądu w metabolizm komórkowy i bioenergetykę.

Monitorowanie metabolizmu energetycznego w ludzkich komórkach NK w czasie rzeczywistym za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego

Ten film demonstruje aktywność lityczną komórek NK w stosunku do komórek docelowych barwionych fluorescencyjnie. Metoda ta umożliwia pomiar cytotoksyczności indukowanej komórkami NK poprzez barwienie martwych komórek i użycie cytometru przepływowego do ilościowego określenia żywych i martwych komórek docelowych.

Test cytotoksyczności za pośrednictwem komórek NK Przygotowanie próbki do analizy cytometrycznej przepływowej

Prosta i niezawodna metoda jest tutaj opisana do analizy zestawu funkcji komórek NK, takich jak degranulacja, produkcja cytokin i chemokiny w różnych podzbiorach komórek NK.

Test oparty na cytometrii przepływowej do monitorowania funkcji komórek NK

Ta praca opisuje zaawansowany proces dokładnego i szybkiego określania liczby komórek NK (Natural Killer) i cytotoksyczności komórek NK w próbkach ludzkiej krwi.

Analiza cytometryczna przepływu aktywności litycznej komórek NK w ludzkiej krwi pełnej

Metoda oparta na cytometrii przepływowej do ilościowego określania aktywności cytotoksycznej ludzkich komórek NK jest pokazana tutaj.

Test cytotoksyczności oparty na cytometrii przepływowej do oceny aktywności ludzkich komórek NK

Unikanie eliminacji za pośrednictwem komórek NK przez komórki rakowe jest ważne dla inicjacji i progresji raka. Tutaj przedstawiamy dwa protokoły nieoparte na radioaktywności do oceny cytotoksyczności komórek NK w stosunku do komórek nowotworowych wątroby. Dodatkowo przedstawiono trzeci protokół do analizy migracji komórek NK.

Pomiar cytotoksyczności i migracji komórek NK w kontekście komórek nowotworowych wątroby

Protokół do badania zdarzeń wywołanych przez FcγRIIIa przez przeciwciała terapeutyczne w ludzkich komórkach NK jest opisany tutaj. Ta platforma sztucznej stymulacji umożliwia badanie dalszych funkcji efektorowych, takich jak degranulacja, produkcja chemokin/cytokin i szlaki sygnałowe, w których pośredniczą części FcγRIIIa i Fc przeciwciał zaangażowanych w wiązanie.

Ocena zdarzeń związanych z ludzkimi komórkami NK wywołanych zaangażowaniem FcγRIIIa w obecności przeciwciał terapeutycznych

Obecny protokół pokazuje, jak odróżnić komórki CD3−/CD45+CD56+ o łagodnej cytotoksyczności od ludzkich komórek macierzystych o rozszerzonym potencjale (hEPSC) zarówno w warunkach hodowli 3D, jak i 2D. Pozwala to na rutynową walidację fenotypową bez niszczenia złożonego mikrośrodowiska.

Generowanie komórek NK z ludzkich komórek macierzystych o rozszerzonym potencjale

Protokół ten opisuje bezznacznikową metodę szybkiej analizy liczby i aktywności komórek NK (Natural Cell ) bez użycia soczewek przy użyciu technologii obrazowania cieni bez soczewek. Metoda ta określa ilościowo zmiany morfologiczne w poszczególnych komórkach NK poprzez komputerową analizę ich wzorów dyfrakcyjnych.

Wdrażana w terenie platforma obrazowania bez soczewek do szybkiej analizy aktywacji komórek NK bez użycia znaczników

Ten protokół zapewnia zstandaryzowany in vitro przepływ pracy dla spójnego pomiaru naturalnej, chimerycznej receptora antygenowego–pośredniczonej i zależnej od przeciwciał cytotoksyczności ludzkich naturalnych komórek zwanych zbójcami przy użyciu żywego obrazu komórkowego i cytometrii przepływowej.

Kwantyfikacja cytotoksyczności komórek NK potencjowanej przez chimeryczne receptory antygenowe i przeciwciała terapeutyczne z wykorzystaniem obrazowania żywych komórek i cytometrii przepływowej

Poznaj metodę pomiaru glikolizy i oddychania mitochondrialnego w ludzkich komórkach NK przy użyciu analizatora przepływu pozakomórkowego. Technika umożliwia badanie metabolizmu komórek NK w czasie rzeczywistym.

Analiza metabolizmu ludzkich komórek NK

Przeglądaj więcej filmów