Izolowanie ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej i limfocytów T CD4+ od pacjentów z zespołem Sézary'ego w celu profilowania transkryptomicznego
14 października 2021
Przedstawiamy prosty protokół izolacji komórek jednojądrzastych krwi obwodowej z krwi pełnej uzyskanej od pacjentów, u których zdiagnozowano zespół Sézary'ego, a następnie selekcję limfocytów T CD4+, ich stymulację octanem forbolu12-mirystynian13 i jonoforem A23187 oraz przygotowanie RNA do profilowania transkryptomicznego.
Protokół ten daje nam możliwość izolowania limfocytów T od pacjentów z chorobą do badań, defektu molekularnego i defektu immunologicznego. Ta metoda pozwala nam wyizolować żywe komórki, komórki z nieprawidłowościami chorobowymi w celu oczyszczenia RNA, DNA i białka od tych pacjentów, a to pozwala nam scharakteryzować defekty molekularne, aby zrozumieć nieprawidłowości szlaków, które są ważne w patogenezie. Metoda ta jest cenna w izolacji krwi obwodowej, która może być dalej frakcjonowana w celu zbadania komórek krwi w stanie normalnym, a także komórek krwi z chorób z nieprawidłowościami immunologicznymi.
Tę procedurę zademonstruje Alanna, która jest studentką medycyny z mojego laboratorium. Po uzyskaniu próbki krwi obwodowej w pięciu 10-mililitrowych probówkach zawierających antykoagulant, przenieś od 10 do 15 mililitrów krwi do 50-mililitrowych probówek separacyjnych oznaczonych numerem podmiotu i rozcieńcz próbki co najmniej dwukrotnie, ale nie więcej niż 35 mililitrów na probówkę za pomocą HBSS. Ostrożnie i powoli należy podsypać krew około 13 mililitrami pożywki o gęstości na probówkę, przerywając pipetowanie, gdy pipeta jest prawie pusta, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków.
Powoli wyjmować pipetę, aby uniknąć mieszania warstw krwi i pożywki o gęstości, a następnie ostrożnie przenieść napełnione probówki separacyjne do wirówki, nie naruszając warstw. Po oddzieleniu komórek przez odwirowanie, usuń wszystkie oprócz ostatnich 10 mililitrów osocza zawierającego górną warstwę, a następnie ostrożnie i powoli zbierz kożuchową powłokę. Połącz płaszcz kożuchowy spomiędzy dwóch probówek separacyjnych do jednej oznakowanej sterylnej probówki o pojemności 50 mililitrów i rozcieńczyć PBMC co najmniej dwukrotnie świeżym HBSS, aż do łącznej ilości 50 mililitrów na probówkę.
Po zebraniu wszystkich kożuchów, należy rozpuść komórki przez odwirowanie i usuń jak najwięcej supernatantu z każdej probówki. Postukaj w dno probówki, aby poluzować osad i ponownie zawiesić granulki w jednym do dwóch mililitrów buforu do lizy ACK na oryginalną 10 mililitrów objętości próbki krwi na probówkę. Dokładnie po pięciu minutach zatrzymaj lizę w każdej probówce z równą lub większą objętością HBSS i dostosuj każdą objętość do 50 mililitrów.
Po odwirowaniu wyrzuć supernatant, połącz komórki z tego samego dawcy i zwiększ objętość do 50 mililitrów świeżym HBSS do kolejnego odwirowania. Następnie ponownie zawieś komórki w 10 mililitrach pożywki RP 10F o temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu zliczenia. W celu oczyszczenia komórek T CD4 + CD45RO + należy odwirować komórki i rozcieńczyć PBMC do pięć razy 10 do siódmych komórek na mililitr stężenia buforu selekcyjnego.
Przenieś komórki do pięciomililitrowej probówki z polistyrenu o okrągłym dnie i dodaj 50 mikrolitrów koktajlu przeciwciał na jeden mililitr próbki, delikatnie mieszając. Po pięciu minutach w temperaturze pokojowej wiruj cząstki magnetyczne z dużą prędkością przez 30 sekund, a następnie dodaj 50 mikrolitrów cząstek magnetycznych na jeden mililitr próbki do probówki z delikatnym mieszaniem. Doprowadź objętość do 2,5 mililitra za pomocą świeżego buforu selekcyjnego i delikatnego mieszania i umieść probówkę na magnesie na 2,5 minuty.
Pod koniec inkubacji podnieś magnes i odwróć probówkę jednym ciągłym ruchem, aby zdekantować wzbogaconą zawiesinę komórek do nowej sterylnej probówki. Aby zwiększyć regenerację komórek, dodaj 2,5 mililitra buforu selekcyjnego do probówki bez naruszania unieruchomionych kulek na kolejne 2,5-minutową inkubację na magnesie i dodaj płukanie do probówki zbiorczej, a następnie policz liczbę żywych komórek za pomocą hemocytometru i potwierdź czystość komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Aby aktywować komórki, dostosuj limfocyty T CD4 + CD45RO + do pięciu razy 10 do szóstych komórek na mililitr o stężeniu 37 stopni Celsjusza RP 10F i umieść komórki na szalkach hodowlanych o odpowiedniej wielkości.
Odpocznij komórki w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez noc. Następnego ranka zbierz wypoczęte komórki przez odwirowanie i ponownie zawieś osad w stężeniu pięć razy 10 do szóstych komórek na mililitr o średnim stężeniu 37 stopni Celsjusza RP 10F. Podzielić zawiesinę na pięć do 10 razy 10 do szóstych podwielokrotności komórek w każdej z trzech sterylnych probówek z nakrętką i stymulować komórki w probówce drugiej PMA i probówce trzeciej A23187 i delikatnie mieszając.
Dodać równą objętość sulfotlenku dimetylu do pierwszej probówki, która ma służyć jako kontrola nośnika, a następnie umieścić probówki z poluzowanymi nakrętkami w inkubatorze na odpowiedni okres aktywacji. Pod koniec inkubacji zebrać komórki przez odwirowanie i wyrzucić jak najwięcej supernatantu, nie naruszając osadu komórkowego. Następnie poddać komórki lizie zgodnie z zaleceniami dostępnego na rynku zestawu do izolacji RNA i wyizolować RNA zgodnie z instrukcją producenta.
Żywotność i czystość limfocytów T CD4 + CD45RO + uzyskanych za pomocą tego protokołu selekcji negatywnej jest niezmiennie wysoka. Wydajność limfocytów T CD4 + CD45RO + uzyskanych z komór systemu leukoredukcji z PBMC SS wynosi zwykle około 75% w porównaniu do około 16% z normalnych PBMC dawcy. Limfocyty T pamięci SS i SS PBMC słabo eksprymowane cytokiny i inne geny odpowiedzi immunologicznej w porównaniu z komórkami z normalnych limfocytów T dawcy i PBMC.
Ponadto wiele genów, które nie ulegają normalnej ekspresji w normalnych limfocytach T dawcy, ulega silnej ekspresji w limfocytach T SS zarówno w spoczynku, jak i po stymulacji. Dobra sterylna technika i konsekwentna rutyna są naprawdę ważne dla sukcesu tej techniki. Bardzo ważne jest również, aby podczas nakładania warstw Ficoll używał automatycznej pipety z precyzyjną kontrolą i naprawdę zwracał uwagę na prędkość, z jaką układasz Ficoll.
Komórki wyizolowane tą metodą będą żywotne i mogą być wykorzystywane do badań toksyczności, molekularnych badań biochemicznych do charakterystyki szlaków transdukcji sygnału, cytometrii przepływowej i badań ekspresji genów. Metoda może być stosowana do izolowania komórek od pacjentów z chorobami, w chorobach zapalnych, a także w innych chorobach, takich jak nowotwory, do badań bezpośrednich. Przykładami tych chorób są łuszczyca i atopowe zapalenie skóry.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje izolację mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC) od pacjentów z zespołem Sézary, ze szczególnym uwzględnieniem selekcji i stymulacji limfocytów T CD4+ w celu profilowania transkryptomicznego RNA.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Immunologia
- Biologia komórki
Wstęp
- Monocyty i limfocyty krwi obwodowej są kluczowe dla badania odpowiedzi immunologicznych.
- Zespół Sézary'ego charakteryzuje się nieprawidłowościami w obrębie układu odpornościowego.
- Zrozumienie funkcji limfocytów T jest niezbędne do poznania mechanizmów rozwoju choroby.
- Opisana metoda umożliwia oczyszczanie żywych komórek do dalszych analiz.
Cel badania
- Izolacja limfocytów T CD4+ od pacjentów z zespołem Sézary.
- Charakterystyka defektów molekularnych w limfocytach T.
- Ułatwienie badań nad szlakami odpowiedzi odpornościowej.
Zastosowane metody
- Izolacja PBMC za pomocą wirowania w gradiencie gęstości.
- Selekcja negatywna limfocytów T CD4+ przy użyciu koktajli przeciwciał.
- Stymulacja komórek forbolem 12-mirystynianem 13-octanem oraz jonoforem A23187.
- Izolacja RNA do analizy transkrypcyjnej.
Główne wyniki
- Wysoka wydajność i czystość izolowanych limfocytów T CD4+.
- Znaczące różnice w ekspresji genów pomiędzy limfocytami T pacjentów z SS a limfocytami T zdrowych dawców.
- Metoda wykazuje stałą żywotność komórek w zastosowaniach w dalszych etapach analiz.
- Komórki mogą być wykorzystane w różnych badaniach, w tym w badaniach toksyczności i charakterystyce molekularnej.
Wnioski
- Protokół ten pozwala na skuteczną izolację żywych limfocytów T do celów badawczych.
- Umożliwia on poznanie defektów immunologicznych występujących w zespole Sézary.
- Stosowanie odpowiednich technik sterylnych jest kluczowe dla osiągnięcia pomyślnych wyników.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Skuteczna izolacja i profilowanie transkrypcyjne limfocytów T CD4+ od pacjentów z zespołem Sézary odpowiada na krytyczną potrzebę mechanistycznego ograniczania ryzyka i walidacji celów terapeutycznych w nowotworach napędzanych przez limfocyty T. Niniejszy schemat umożliwia wysoką pewność identyfikacji istotnych dla choroby zmian w ekspresji genów, wspierając odkrywanie biomarkerów i ciągłość badań translacyjnych. Powtarzalność i adaptowalność protokołu sprawiają, że stanowi on fundamentalną możliwość dla programów badawczych w zakresie immuno-onkologii i chorób zapalnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie defektów molekularnych w limfocytach T pochodzących od pacjentów w celu wyjaśnienia szlaków sygnałowych.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez porównanie ekspresji genów w nowotworowych i prawidłowych limfocytach T.
- Ułatwia uzyskanie pewności prognostycznej w identyfikacji mechanizmów regulacyjnych napędzających rozwój choroby.
Przesiewy i opracowywanie analiz
- Zapewnia zwalidowane, żywe populacje limfocytów T do późniejszych analiz transkryptomicznych i funkcjonalnych.
- Gwarantuje powtarzalność analiz dzięki ustandaryzowanym protokołom izolacji i stymulacji komórek.
- Dostarcza ilościowe wyniki ekspresji genów, odpowiednie do skriningu i oceny biomarkerów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje wyniki analizy transkrypcyjnej z istotną dla choroby dysfunkcją odpornościową w zespole Sézary.
- Umożliwia zapewnienie ciągłości przejścia od profilowania molekularnego na etapie odkryć do opracowania modeli przedklinicznych.
- Wspiera dostosowane do ryzyka wdrażanie kandydackich biomarkerów oraz celów terapeutycznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół wpisuje się w continuum od odkryć do etapu przedklinicznego, dostarczając wysokiej jakości, istotne dla przebiegu choroby próbki limfocytów T do analiz transkrypcyjnych oraz badań mechanistycznych.
- Biologia odkrywcza: Rozwój testowania hipotez dotyczących defektów regulacji immunologicznej w komórkach pochodzących od pacjentów.
- Przesiewanie: Ustanowienie powtarzalnych, ilościowych analiz ekspresji genów do oceny kandydatów.
- Analityka: Generowanie zbiorów danych transkrypcyjnych umożliwiających statystyczne porównanie stanów stymulowanych i niestymulowanych.
- Badania translacyjne: Powiązanie odkryć molekularnych z walidacją przedkliniczną w modelach chorób immunologicznych.
- Zastosowania instytucjonalne: Możliwość adaptacji do badania ekspresji genów w limfocytach T w innych chorobach immunologicznych i onkologicznych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad immunoonkologią.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, skalowalne i powtarzalne przepływy pracy w zakresie izolacji i profilowania komórek.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz pozwala na priorytetyzację wysokowartościowych celów w dalszym rozwoju.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia dostosowaną do ryzyka selekcję i rozwój programów biomarkerowych oraz terapeutycznych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie izolacji komórek, cytometrii przepływowej oraz analiz transkrypcyjnych.
- Wymagany jest dostęp do specjalistycznej aparatury do sortowania komórek i profilowania RNA.
- Konieczne jest rygorystyczne przestrzeganie technik sterylności oraz standaryzacja protokołu we wszystkich zespołach.
- Metoda jest możliwa do dostosowania do różnych modeli chorób, lecz może wymagać optymalizacji dla poszczególnych typów komórek.
- Wynik zależy od wysokiej jakości próbek pacjentów oraz spójnego sposobu ich przetwarzania w celu zapewnienia integralności danych.
