Izolacja jąder z całej tkanki metodą bezdetergentową i enzymatyczną
24 czerwca 2020
Izolacja pojedynczych jąder opiera się na dysocjacji i przenikaniu błony komórkowej za pomocą detergentów, etapach, które wymagają optymalizacji i są podatne na wprowadzanie artefaktów technicznych. Demonstrujemy bezdetergentowy i bezenzymatyczny protokół szybkiej izolacji nienaruszonych jąder bezpośrednio z całej tkanki, uzyskując jądra odpowiednie do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra (snRNA-Seq) lub ATAC-seq.
Przygotowanie zawiesiny pojedynczej komórki lub pojedynczego jądra jest kluczowym krokiem dla wysokoprzepustowego profilowania transkryptomu i epigenomu. Nasz protokół zapewnia prostą, powtarzalną i uniwersalną metodę izolacji pojedynczych jąder. W przeciwieństwie do innych metod wymagających detergentu do izolacji jąder, nasz protokół jest oparty na kolumnach, które nie zawierają detergentów ani enzymów.
Umożliwia izolację jąder w czasie krótszym niż 30 minut. Nasz protokół upraszcza izolację jąder. Stanowi solidną metodę przygotowania zawiesiny pojedynczych jąder z trudnych do dysocjacji tkanek.
Na początek należy wstępnie schłodzić bufor A i B z zestawu do izolacji jąder bez detergentów, umieszczając je na lodzie na co najmniej 30 minut. Pokryj probówki i końcówki pipet 5% roztworem BSA, który usprawni regenerację jąder. Aby pokryć końcówki pipet, odpipetuj 5% roztwór BSA dwa do trzech razy i susz je na powietrzu przez dwie godziny.
Aby pokryć rurki, napełnij je BSA i odwróć je trzy razy. Usuń roztwór i wysusz probówki do góry nogami na czystej bibułce przez dwie godziny. Pokryj jedną probówkę zbiorczą i jedną probówkę o pojemności 1,5 mililitra na próbkę.
Użyj kleszczy, aby delikatnie rozbić czaszkę i usunąć tkanki miękkie, skórę i kości z brzusznej i grzbietowej strony czaszki. Następnie delikatnie przenieś mózg do 30-milimetrowego naczynia zawierającego lodowaty PBS i zmiel mózg na małe kawałki za pomocą żyletki. Aby wyizolować pojedyncze jądra, przenieś zmieloną tkankę do wkładu filtrującego znajdującego się w zestawie do izolacji jąder i usuń nadmiar roztworu i dodaj 200 mikrolitrów zimnego buforu A. Miel tkankę plastikowym prętem przez dwie minuty.
Dodać 300 mikrolitrów zimnego buforu A do wkładu filtrującego i inkubować go na lodzie z otwartą nakrętką przez 10 minut. Następnie zakryj wkład i ponownie wywiesić tkankę, odwracając rurkę pięć razy. Odwirować probówkę z próbką o masie 16 000 g przez 30 sekund, aby rozerwać komórki.
Przepływ zawiera nienaruszone jądra, które tworzą bezbarwną osadę na dnie rurki. Wyrzuć filtr, a następnie ponownie zawieś granulkę, energicznie wirując przez 10 sekund. Ponownie otopić jądra, odwirowując roztwór o stężeniu 500 razy g przez trzy minuty.
Następnie ostrożnie wyrzuć supernatant. Ponownie zawiesić osad w 0,8 mililitra zimnego buforu B, pipetując dwa do trzech razy i odwirować jądra przy 600 razy g przez 10 minut, co oddzieli je od resztek membrany. Ostrożnie wyrzucić supernatant.
Ponownie zawiesić wyizolowane jądra w 500 mikrolitrach PBS z 5% BSA i utrzymać zawiesinę na lodzie do FACS. Aby potwierdzić morfologię jądra za pomocą barwienia HEX, przenieś 100 mikrolitrów zawiesiny pojedynczych jąder do nowej probówki za pomocą końcówek pokrytych BSA. Wybarwić jądra, dodając 0,1 mikrolitra HEX i delikatnie wirując rurkę.
Przenieść zawiesinę jąder do naczynia ze szklanym dnem i obraz jąder za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z ustawieniem wzbudzenia laserowego 405 nanometrów. Przed wykonaniem FACS należy przefiltrować jądra za pomocą sitka komórkowego o średnicy 40 mikrometrów do probówki pokrytej BSA. Rozcieńczyć przefiltrowaną zawiesinę, dodając PBS z 5% BSA do końcowej objętości 1 000 mikrolitrów.
Oznaczyć dwie probówki FACS z okrągłym dnem jako kontrolne i barwione, a następnie przenieść 250 mikrolitrów zawiesiny jąder do probówki kontrolnej za pomocą końcówki pipety pokrytej BSA. Przenieś pozostałe 750 mikrolitrów roztworu do probówki FACS oznaczonej jako barwiona i dodaj jeden mikrolitr barwnika HEX w celu zabarwienia jąder. Następnie wymieszaj go przez powolne wirowanie.
Załaduj niebarwioną próbkę kontrolną do sortera komórek i zarejestruj 5 000 zdarzeń. Następnie załaduj wybarwioną próbkę i zarejestruj 5 000 zdarzeń. Narysuj bramki FACS do identyfikacji pojedynczych jąder.
Jądra można wybrać, porównując sygnał fluorescencyjny HEX między próbkami kontrolnymi i barwionymi. Następnie posortuj jądra HEX dodatnie z barwionej probówki do nowej 1,5 mililitrowej probówki zawierającej 50 mikrolitrów PBS z 5% BSA. Protokół ten wykorzystano do wytworzenia zawiesiny pojedynczego jądra bezpośrednio z tkanki mózgowej danio pręgowanego.
Wyizolowane jądra wybarwiono HEX i uwidoczniono za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Wydawały się nienaruszone, okrągłe i dobrze oddzielone. Co ważne, agregacja jądrowa była nieobecna.
Wzbogacanie izolowanych jąder przeprowadzono za pomocą cytometrii przepływowej poprzez bramkowanie na obecność sygnału fluorescencyjnego HEX. Jądra niebarwione wykazywały fluorescencję tła, podczas gdy jądra barwione wykazywały silny sygnał fluorescencyjny. Niebarwione i barwione jądra były dobrze posegregowane w kanale fioletowym.
Próbując tego protokołu, należy pamiętać, że pojedyncze jądra mają tendencję do przyklejania się do tworzywa sztucznego. Aby zapobiec potencjalnej utracie jąder i zwiększyć wydajność, zdecydowanie zaleca się podstawowe powlekanie tworzywa sztucznego. Izolowana zawiesina pojedynczych jąder może być dalej wykorzystywana do pojedynczych jąder RNA Ta technika wyjaśnia niejednorodność komórkową w złożonych systemach biologicznych i pomaga zdefiniować podtypy komórek i sieci genów.
Stosowanie metody bezdetergentowej i enzymatycznej rejestruje szum techniczny i odchylenia powstające podczas przygotowywania próbki. W ramach tej metody opracowano uproszczoną i logistyczną izolację pojedynczych jąder.
Przegląd
Niniejsze badanie dotyczy izolacji pojedynczych jąder komórkowych, co stanowi kluczowy etap w wysokoprzepustowym profilowaniu epigenomu i transkryptomu. Dzięki zastosowaniu prostego protokołu, pozbawionego detergentów i enzymów, metoda ta umożliwia szybką izolację nienaruszonych jąder z trudnych tkanek, co wykazano na przykładzie tkanki mózgowej ryb zebrafish.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Biologia komórki
- Epigenomika
- Analiza pojedynczych komórek
Wstęp
- Izolacja pojedynczych jąder komórkowych jest niezbędna do dokładnego profilowania w różnych badaniach biologicznych.
- Konwencjonalne metody często wprowadzają artefakty poprzez zastosowanie detergentów.
- Konieczna jest bardziej wydajna i powtarzalna technika izolacji, aby usprawnić dalsze etapy analizy.
Zastosowane metody
- Opracowano protokół izolacji oparty na kolumnach, bez użycia detergentów i enzymów.
- Tkanka mózgu danio pręgowanego posłużyła jako system biologiczny do walidacji metody.
- Cytometria przepływowa umożliwiła wzbogacenie wyizolowanych jąder na podstawie barwienia HEX.
Główne wyniki
- Protokół pozwolił na skuteczną izolację nienaruszonych, dobrze rozdzielonych jąder komórkowych.
- Barwienie potwierdziło integralność jąder, nie stwierdzono obecności agregatów.
- Zastosowana technika umożliwiła efektywne sortowanie jąder za pomocą FACS.
Wnioski
- Niniejsze badanie przedstawia uproszczone podejście do izolacji pojedynczych jąder komórkowych, które minimalizuje szum techniczny.
- Metoda ta zwiększa zrozumienie heterogeniczności komórkowej w złożonych tkankach.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Profilowanie wysokoprzepustowe wymaga nienaruszonych jąder komórkowych, aby uniknąć szumów technicznych wynikających z etapów dysocjacji i permeabilizacji. Ta kolumnowa metoda, pozbawiona detergentów i enzymów, umożliwia szybką i powtarzalną izolację jąder z trudnych do dysocjacji tkanek, takich jak mózg rybki zebrafish, w czasie 30 minut. Podejście to wspiera niezawodne sekwencjonowanie RNA i ATAC pojedynczych jąder (single-nuclei RNA-seq i ATAC-seq) poprzez zachowanie morfologii jąder i ograniczenie ich agregacji, co bezpośrednio poprawia jakość danych służących do walidacji celów oraz minimalizacji ryzyka mechanistycznego w procesach odkrywania leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez dostarczenie nienaruszonych jąder komórkowych do profilowania epigenomicznego i transkrypcyjnego.
- Wartość operacyjna: Redukuje zmienność wprowadzaną przez lizę opartą na detergentach, co poprawia powtarzalność eksperymentów.
- Wartość prognostyczna: Wspiera minimalizację ryzyka biologicznego dzięki wysokiej wierności izolacji jąder z tkanek złożonych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na otrzymanie zawiesin jąder komórkowych odpowiednich do dalszego wzbogacania metodą FACS oraz do zastosowań w zakresie multiomiki pojedynczych komórek.
- Wartość operacyjna: Eliminuje potrzebę dysocjacji enzymatycznej, co upraszcza proces i skraca czas pracy manualnej.
- Skalowalność: Format kolumnowy umożliwia równoległe przetwarzanie wielu próbek w celu przygotowania do analizy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Izolowane jądra zachowują integralność molekularną, co umożliwia powiązanie fenotypów odkrytych w badaniach ze szlakami mechanistycznymi.
- Korelacja biomarkerów: Wspiera profilowanie epigenomiczne, które może służyć do identyfikacji biomarkerów translacyjnych w systemach istotnych dla danej choroby.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Zmniejsza liczbę wyników fałszywie dodatnich wynikających z artefaktów preparatyki, zwiększając pewność w doborze celów przedklinicznych.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć – od testowania hipotez dotyczących celów terapeutycznych, przez identyfikację związków wiodących, aż po walidację przedkliniczną – dostarczając wysokiej jakości materiału jądrowego do profilowania omicznego.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia wyjaśnianie szlaków sygnałowych i walidację celów poprzez bezstronne profilowanie jąder komórkowych z nienaruszonych tkanek.
- Przesiewanie: Pozwala na otrzymanie standaryzowanych zawiesin jąder komórkowych kompatybilnych z wzbogacaniem opartym na FACS oraz omicznymi przepływami pracy przygotowanymi do analizy na płytkach.
- Analityka: Umożliwia ilościową ocenę wydajności i czystości jąder za pomocą cytometrii przepływowej i bramkowania opartego na HEX.
- Badania translacyjne: Wspiera ciągłość w modelach przedklinicznych poprzez zachowanie sygnatur epigenomicznych wskazujących na stany komórkowe.
- Zastosowanie w przedsiębiorstwie: Protokół oparty na kolumnach i kompatybilny z zestawami pozwala na standaryzację między laboratoriami i projektami w celu zapewnienia spójnego przygotowania próbek.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcji poprzez minimalizację szumu indukowanego podczas przygotowania danych epigenomicznych i transkryptomicznych.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i wydajność dzięki ustandaryzowanej izolacji bez użycia enzymów.
- Wartość strategiczna: Poprawia niezawodność decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez redukcję fałszywych sygnałów wynikających z artefaktów próbek.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka dzięki czystszym i łatwiejszym do interpretacji profilom omicznym.
Kwestie dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obsłudze tkanek oraz w protokołach barwienia jąder komórkowych.
- Zależne od dostępu do wirówki, wortexera, mikroskopu fluorescencyjnego oraz sortera FACS.
- Wymaga powlekania probówek i końcówek BSA w celu zapobiegania przyleganiu jąder do powierzchni plastikowych.
- Może być konieczna optymalizacja dla typów tkanek innych niż mózg zebrafish, w szczególności dla tkanek włóknistych lub tłuszczowych.
- Ograniczone do zastosowań związanych z jądrami komórkowymi; nieprzydatne do izolacji nienaruszonych pojedynczych komórek wymagających zachowania zawartości cytoplazmy.
