Name: Izolacja jąder z całej tkanki metodą bezdetergentową i enzymatyczną (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Naucz się izolacji jąder z tkanek trudnych do rozpuszczenia metodą bezdetergentową i bezenzymatyczną. Protokół kolumnowy umożliwia szybkie uzyskanie nienaruszonych jąder z mózgu Danio rerio w mniej niż 30 minut.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom laboratorium dr Sabine Costagliola i Singha za komentarze do manuskryptu. Prace te były wspierane przez Fonds de la Recherche Scientifique-FNRS w ramach grantu nr 34772792 – MISU dla S.P.S.

Wszystkie procedury przedstawione poniżej zostały wykonane zgodnie z instytucjonalnymi (Université Libre de Bruxelles (ULB)) oraz krajowymi wytycznymi etycznymi i regulacjami dotyczącymi dobrostanu zwierząt, które zostały zatwierdzone przez komitet etyczny ds. dobrostanu zwierząt (CEBEA) z Université Libre de Bruxelles (protokoły 578N-579N).
1. Przygotowanie przed sekcją tkanek
<ol>
	<li>Przygotuj 0,2% roztwór trikainy w PBS do eutanazji danio pręgowanego. Schłodzić roztwór na lodzie.</li>
	<li>Przygotuj szalkę Petriego o średnicy 30 mm do rozdrobnienia tkanki.</li>
	<li>Przygotuj lodowato zimny 1x PBS (10 ml na próbkę tkanki).</li>
	<li>Schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C.</li>
	<li>Do izolacji jąder należy użyć zestawu do izolacji jąder bez detergentów (tabela materiałów).</li>
	<li>Przed rozpoczęciem protokołu należy wstępnie schłodzić A i B znajdujące się w zestawie, umieszczając je na lodzie na co najmniej 30 minut przed izolacją jąder.</li>
	<li>W przypadku pracy z wyizolowanymi jądrami należy pokryć odczynniki z tworzywa sztucznego, takie jak probówki i końcówki pipet, 5% roztworem BSA. W tym celu należy przygotować roztwór, rozpuszczając 2 g BSA w 40 ml PBS. Powlekanie przedmiotów z tworzyw sztucznych 5% BSA zmniejsza przywieranie jąder do plastiku. Ten etap zwiększa regenerację izolowanych jąder.</li>
	<li>Pokryj końcówki pipet, pipetując 5% roztwór BSA 2-3 razy. Suszyć końcówki na powietrzu przez 2 godziny. Przygotuj 10 końcówek z tworzywa sztucznego na próbkę.</li>
	<li>Pokryj probówki do pobierania jąder, wypełniając je 5% BSA. Odwróć rurki 3 razy, aby zapewnić wydajną powłokę. Usuń roztwór i wysusz probówki do góry nogami na czystej bibułce przez 2 godziny. Na każdą próbkę należy pokryć jedną probówkę zbiorczą dostarczoną w zestawie. Dodatkowo przygotować powlekane probówki o pojemności 1,5 ml do pobierania jąder po FACS. 
	UWAGA: Szklane końcówki są zdecydowanie zalecaną alternatywą dla plastikowych końcówek do pipet, aby zminimalizować przywieranie.</li>
</ol>
2. Sekcja mózgu danio pręgowanego
<ol>
	<li>Do eutanazji danio pręgowanego przygotuj szalkę Petriego o średnicy 90 mm z 25 ml lodowatego roztworu trikainy.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij danio pręgowanego ze zbiornika za pomocą sieci rybackiej i umieść go na szalce Petriego.</li>
	<li>Poddaj rybę eutanazji, pozostawiając ją w Tricaine na 5 minut.</li>
	<li>Odetnij głowę zwierzęcia ostrą żyletką.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy delikatnie rozbij czaszkę i usuń tkanki miękkie, skórę i kości z brzusznej i grzbietowej strony czaszki.</li>
	<li>Delikatnie przenieś mózg do świeżego 30-milimetrowego naczynia zawierającego lodowaty PBS.</li>
	<li>Zmiel mózg na małe kawałki za pomocą żyletki, aby ułatwić ładowanie próbki na kolumnę wirową.</li>
</ol>
3. Izolacja pojedynczych jąder
<ol>
	<li>Przenieść zmieloną tkankę do wkładu filtracyjnego znajdującego się w zestawie do izolacji jąder i dodać 200 μl zimnego buforu A w celu uwrażliwienia tkanki. Miel chusteczkę za pomocą plastikowej pałeczki dołączonej do zestawu przez 2 minuty.</li>
	<li>Dodać 300 μl zimnego buforu A i inkubować wkład filtra na lodzie z otwartą nakrętką przez 10 minut.</li>
	<li>Zakryj wkład i ponownie zawiesić tkankę, odwracając probówkę 5 razy.</li>
	<li>Wirować przy 16 000 x g przez 30 s. Na tym etapie komórki są pękane podczas przechodzenia przez filtr i przykładana jest siła odśrodkowa o dużej prędkości. Przepływ zawiera nienaruszone jądra, które osadzają się na dnie rurki.</li>
	<li>Wyrzuć filtr i ponownie zawieś granulkę, energicznie wirując przez 10 sekund.</li>
	<li>Osadzać jądra, odwirowując roztwór o stężeniu 500 x g przez 3 minuty. Supernatant należy ostrożnie wyrzucić, ponieważ osad jądra jest bezbarwny.</li>
	<li>Zawiesić osad w 0,8 ml zimnego buforu B i odwirować przy 600 x g przez 10 minut. Na tym etapie jądra są oddzielane od resztek błony. Otrzymany bezbarwny osad zawiera izolowane jądra.</li>
	<li>Zawiesić wyizolowane jądra w 500 μl PBS z 5% BSA. Zawiesinę jąder należy utrzymywać na lodzie, aby wykonać FACS po oznaczaniu ilościowym.</li>
</ol>
4. Wizualizacja morfologii jąder
<ol>
	<li>Potwierdź morfologię jądra przez barwienie Hoechsta. W tym celu należy usunąć 100 μl zawiesiny pojedynczych jąder w nowej probówce za pomocą końcówek pokrytych BSA. Aby wybarwić jądra, dodać 0,1 μl Hoechst (1 mg/ml). Delikatnie przekręć rurkę wirowo.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę jąder do naczynia o szklanym dnie w celu obrazowania.</li>
	<li>Zobrazuj jądra za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z ustawieniami wzbudzenia laserowego o długości fali ~405 nm (fioletowej).</li>
</ol>
5. Wzbogacanie jąder w oparciu o FACS
<ol>
	<li>Przed wykonaniem FACS przefiltruj jądra za pomocą sitka komórkowego 40 μm do probówki pokrytej BSA.</li>
	<li>Rozcieńczyć przefiltrowaną zawiesinę, dodając PBS z 5% BSA do końcowej objętości 1 000 μl.</li>
	<li>Oznacz dwie probówki FACS z okrągłym dnem jako "kontrolne" i "poplamione". Probówka "kontrolna" będzie zawierała niebarwione jądra, podczas gdy probówka "barwiona" będzie zawierała jądra barwione Hoechstem.</li>
	<li>Przenieść 250 μl zawiesiny jąder do probówki "kontrolnej" za pomocą końcówki do pipety pokrytej BSA.</li>
	<li>Przenieść pozostałe 750 μl roztworu do probówki FACS oznaczonej jako "barwiona" i dodać 1 μl barwnika Hoechst w celu zabarwienia jąder. Mieszaj przez powolne wirowanie.</li>
	<li>Załaduj niebarwioną próbkę kontrolną do sortownika komórek. Rekord 5000 wydarzeń.</li>
	<li>Załaduj poplamione próbki i zarejestruj 5000 zdarzeń.</li>
	<li>Narysuj bramki FACS, które umożliwiają identyfikację pojedynczych jąder. Jądra można wybrać, porównując sygnał fluorescencji Hoechsta między próbką kontrolną a próbką barwioną.</li>
	<li>Sortować jądra Hoechsta dodatnie z barwionej probówki do nowej probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 50 μl PBS z 5% BSA. 
	UWAGA: Izolowane jądra mogą być zbierane do pożądanego podłoża zgodnie z wymaganiami dalszej aplikacji.</li>
</ol>

<ol><li>Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, M., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+digestion+strategies+on+characteristics+and+differentiation+potential+of+human+dental+pulp+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells.</a> Archives of Oral Biology. 93, 74-79 (2018).</li>
<li>Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispase%2C+a+neutral+protease+from+Bacillus+polymyxa%2C+is+a+powerful+fibronectinase+and+type+IV+collagenase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase.</a> Journal of Investigative Dermatology. 93 (2), 287-290 (1989).</li>
<li>Khan, M. R., Chandrashekran, A., Smith, R. K. W., Dudhia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotypic+characterization+of+ovine+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Immunophenotypic characterization of ovine mesenchymal stem cells.</a> Cytometry Part A. 89 (5), 443-450 (2016).</li>
<li>Cavanagh, T. J., Lakey, J. R. T., Wright, M. J., Fetterhoff, T., Wile, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crude+collagenase+loses+islet-isolating+efficacy+regardless+of+storage+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Crude collagenase loses islet-isolating efficacy regardless of storage conditions.</a> Transplantation Proceedings. 29 (4), 1942-1944 (1997).</li>
<li>Massoni-Badosa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sampling+artifacts+in+single-cell+genomics+cohort+studies%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Sampling artifacts in single-cell genomics cohort studies.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Van Den Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li>
<li>O'Flanagan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+solid+tumour+tissues+with+cold+active+protease+for+single-cell+RNA-seq+minimizes+conserved+collagenase-associated+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Bioarxiv%22%5BJournal%5D)">Dissociation of solid tumour tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses.</a> Bioarxiv. 683227, (2019).</li>
<li>Bakken, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+compared+in+matched+cortical+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types.</a> Plos One. 13 (12), 0209648(2018).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-nucleus+RNA-sequencing+pipeline+to+decipher+the+molecular+anatomy+and+pathophysiology+of+human+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys.</a> Nature Communications. 10 (1), (2019).</li>
<li>Rajbhandari, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+reveals+immune+cell-adipocyte+crosstalk+regulating+the+transcription+of+thermogenic+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis reveals immune cell-adipocyte crosstalk regulating the transcription of thermogenic adipocytes.</a> eLife. 8, (2019).</li>
<li>Hagberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometry+of+Mouse+and+Human+Adipocytes+for+the+Analysis+of+Browning+and+Cellular+Heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity.</a> Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).</li>
<li>Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+single-nucleus+over+single-cell+RNA+sequencing+of+adult+kidney%3A+Rare+cell+types+and+novel+cell+states+revealed+in+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: Rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 30 (1), 23-32 (2019).</li>
<li>Lacar, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+RNA-seq+of+single+neurons+reveals+molecular+signatures+of+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation.</a> Nature Communications. 7 (1), 1-13 (2016).</li>
<li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Div-Seq%3A+Single-nucleus+RNA-Seq+reveals+dynamics+of+rare+adult+newborn+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons.</a> Science. 353 (6302), 925-928 (2016).</li>
<li>Thrupp, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+nucleus+sequencing+fails+to+detect+microglial+activation+in+human+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Single nucleus sequencing fails to detect microglial activation in human tissue.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Selewa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Comparison+of+High-throughput+Single-Cell+and+Single-Nucleus+Transcriptomes+during+Cardiomyocyte+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Systematic Comparison of High-throughput Single-Cell and Single-Nucleus Transcriptomes during Cardiomyocyte Differentiation.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+strategy+for+single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+confirms+accuracy+in+predicted+cell-type+expression+from+nuclear+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-8 (2017).</li>
<li>Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neuroscience. 9, 42(2008).</li>
<li>Krishnaswami, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+single+nuclei+for+RNA-seq+to+capture+the+transcriptome+of+postmortem+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons.</a> Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).</li>
<li>Birnie, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Nuclei+from+Animal+Cells+in+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of Nuclei from Animal Cells in Culture.</a> Methods in Cell Biology. 17, 13-26 (1978).</li>
<li>Dounce, A. L., Witter, R. F., Monty, K. J., Pate, S., Cottone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+isolating+intact+mitochondria+and+nuclei+from+the+same+homogenate%2C+and+the+influence+of+mitochondrial+destruction+on+the+properties+of+cell+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biophysical+and+Biochemical+Cytology%22%5BJournal%5D)">A method for isolating intact mitochondria and nuclei from the same homogenate, and the influence of mitochondrial destruction on the properties of cell nuclei.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 1 (2), 139-153 (1955).</li>
<li>Hymer, W. C., Kuff, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Nuclei+From+Mammalian+Tissues+Through+the+Use+of+Triton+X-100%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation of Nuclei From Mammalian Tissues Through the Use of Triton X-100.</a> The journal of Histochemistry and Cytochemistry. 12, 359-363 (1964).</li>
<li>Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergents%3A+Triton+X-100%2C+Tween-20%2C+and+More%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+and+Methods%22%5BJournal%5D)">Detergents: Triton X-100, Tween-20, and More.</a> Materials and Methods. 3, (2013).</li>
<li>Sikorskaite, S., Rajamäki, M. L., Baniulis, D., Stanys, V., Valkonen, J. P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol%3A+Optimised+methodology+for+isolation+of+nuclei+from+leaves+of+species+in+the+Solanaceae+and+Rosaceae+families%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Protocol: Optimised methodology for isolation of nuclei from leaves of species in the Solanaceae and Rosaceae families.</a> Plant Methods. 9 (1), 31(2013).</li>
<li>Graham, J., Rickwood, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGraham%2C+J+%22Subcellular+fractionation%3A+a+practical+approach%22">Subcellular fractionation: a practical approach</a>. , IRL Press. (1997).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów. Płatność za udostępnienie artykułu w otwartym dostępie została dokonana przez Invent Biotechnologies Inc., USA.

Profilowanie transkryptomu i epigenomu w rozdzielczości pojedynczej komórki zrewolucjonizowało badanie systemów biologicznych. Badania nad rozdzielczością pojedynczej komórki dla tkanki stałej zależą od dysocjacji narządu na pojedyncze komórki lub jądra. Dysocjacja jest destrukcyjną procedurą, która może wprowadzić artefakty techniczne, które mogą uniemożliwić opracowanie dokładnej reprezentacji systemu 5,6. Na przykład dysocjacja enzymatyczna może uszkadzać komórki o złożonej morfologii, takie jak neurony lub podocyty, i może indukować ekspresję genów stresu i reakcji na szok cieplny 7,12. Dodatkowo, użycie detergentu podczas dysocjacji może spowodować pęknięcie błony jądrowej i doprowadzić do agregacji23,25. W związku z tym optymalizacja dysocjacji w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki lub jąder o najwyższej jakości ma kluczowe znaczenie dla powodzenia wysokoprzepustowych eksperymentów profilowania.
W tym miejscu demonstrujemy metodę izolacji jąder bez detergentów i enzymów, która umożliwia ekstrakcję nienaruszonych jąder z mózgu danio pręgowanego w czasie krótszym niż 20 minut. W wyniku protokołu powstają jądra o typowej morfologii i solidnej integralności (ryc. 2). Z pojedynczego mózgu danio pręgowanego o wadze 6 mg protokół daje w sumie 60 000 jąder określonych za pomocą hemocytometru. Wyizolowane jądra mogą być wykorzystywane do wielu dalszych zastosowań, w tym do sekwencjonowania snRNA, sekwencjonowania ATAC i barwienia immunologicznego. Izolowane jądra mogą zawierać zanieczyszczenie krzyżowe frakcjami cytoplazmatycznymi, w szczególności składnikami retikulum endoplazmatycznego i mitochondriów. W przypadku wysokoprzepustowych eksperymentów profilowania zdecydowanie zaleca się usuwanie resztek komórkowych, zwłaszcza mitochondriów. Cytometria przepływowa (ryc. 3) stanowi realną opcję oczyszczania jąder. Alternatywnie, gradient sacharozy może być również wykorzystany do usuwania zanieczyszczeń.
Protokół został przetestowany na tarczycy myszy (dane nie pokazane) i zapewnia wyniki podobne do tkanki mózgowej danio pręgowanego. Ogólnie rzecz biorąc, protokół zapewnia solidną, powtarzalną i uniwersalną metodę przygotowania zawiesiny pojedynczego jądra, pomagając uprościć logistykę eksperymentów profilowania o wysokiej przepustowości.

Jednokomórkowe sekwencje RNA (scRNA-Seq) i ATAC-seq są wszechstronnymi narzędziami do badania złożonych systemów biologicznych w rozdzielczości pojedynczej komórki. Są one szeroko stosowane do definiowania podtypów i stanów komórek, sieci genów oraz do oceny heterogeniczności komórek. Warunkiem wstępnym do przeprowadzenia sekwencjonowania scRNA jest przygotowanie zawiesiny pojedynczej komórki przez dysocjację tkankową. Ze względu na różnice w składzie i właściwościach mechanicznych macierzy zewnątrzkomórkowej, poszczególne tkanki wymagają optymalizacji protokołu dysocjacji w celu przygotowania zawiesiny pojedynczej komórki.
Dysocjacja tkanek na pojedyncze komórki zazwyczaj wiąże się z leczeniem enzymami trawiennymi, w tym kolagenazą, dyspasą lub trypsyną, w temperaturze 37 °C1,2,3,4. Ponieważ maszyneria transkrypcyjna pozostaje aktywna w temperaturze 37 °C, dysocjacja enzymatyczna może wprowadzać artefakty ekspresji mRNA i szum5,6. Warto zauważyć, że przedłużona inkubacja może indukować geny reagujące na stres i reakcję na szok cieplny w niejednorodny sposób – co prowadzi do technicznej zmienności w eksperymencie7.
Kolejną wadą generowania zawiesiny pojedynczej komórki jest trudność w uzyskaniu żywotnych i nienaruszonych typów komórek o skomplikowanej morfologii. W szczególności neurony, adipocyty i podocyty są trudne do wyizolowania8,9,10,11. Na przykład Wu i współpracownicy wykazali brak podocytów kłębuszkowych w profilach scRNA dorosłej myszy nerki12. Podobne nieoptymalne obserwacje zostały poczynione w odniesieniu do odzyskiwania połączonych neuronów z tkanki mózgowej8,13,14. Podsumowując, protokoły dysocjacji mogą wprowadzać błąd wykrywania w kierunku łatwiejszej do dysocjacji typów komórek, prowadząc do błędnego przedstawienia architektury komórkowej narządu.
Aby przezwyciężyć techniczny szum i stronniczość wprowadzoną podczas przygotowywania próbki w scRNA-Seq., izolacja i profilowanie jądra stanowi atrakcyjną alternatywę. Ponieważ morfologia jądrowa jest podobna u różnych typów komórek, izolacja jąder omija problem izolowania nienaruszonych i żywotnych komórek o złożonej morfologii. Na przykład Wu i współpracownicy wykazali skuteczne profilowanie podocytów kłębuszkowych za pomocą jednojądrowego RNA-Seq. (Sekwencja snRNA) nerki dorosłej myszy, której brakowało w scRNA-Seq12. Co ciekawe, badania porównawcze między sekwencją RNA pojedynczej komórki i pojedynczego jądra sugerują spadek indukcji genów odpowiedzi na stres i szok cieplny za pomocą snRNA-Seq12. Badania sugerują ponadto wysoką korelację między genami wykrytymi za pomocą tych dwóch metod. Jednak niedawne badanie nad ludzkim mikroglejem nie wykryło aktywacji genetycznej w chorobie Alzheimera15. Tak więc w pewnych kontekstach snRNA-Seq jest odpowiednią alternatywą dla scRNA-Seq16,17. Dodatkowo, izolacja jądrowa może być wykorzystana do jednokomórkowego ATAC-Seq., dostarczając informacji o regionach otwartej chromatyny w poszczególnych komórkach.
Protokół izolacji jąder składa się z trzech głównych etapów: i) lizy błony komórkowej opartej na detergentach w celu uwolnienia jądra; ii) homogenizacja tkanek za pomocą homogenizatora Dounce; oraz iii) wzbogacanie jąder i usuwanie resztek komórkowych za pomocą wirowania gradientowego lub cytometrii przepływowej18,19,20,21,22. Wśród nich pierwsze dwa kroki zależą od rodzaju tkanki i muszą być empirycznie zoptymalizowane. Łagodny detergent prowadzi do częściowego pęknięcia błony komórkowej i nieefektywnego pobierania jąder z tkanki23. Z drugiej strony, wysoki poziom detergentu i ostra homogenizacja prowadzą do pęknięcia błony jądrowej i ich utraty24,25. Pęknięte jądra mają tendencję do zlepiania się ze sobą i tworzenia agregatów, które, jeśli nie zostaną usunięte, mogą prowadzić do artefaktów w dalszym eksperymencie profilowania.
Aby obejść problemy związane z optymalizacją detergentów do izolacji jąder, wprowadzamy protokół izolowania nienaruszonych jąder od świeżych próbek przy użyciu metody wolnej od detergentów i opartej na kolumnie wirowej. Protokół daje jądra z całego narządu w ciągu 20 minut, ograniczając indukcję transkrypcji artefaktów. Wyizolowane jądra mogą być wzbogacone o FACS dla pojedynczych jąder RNA-Seq. oraz ATAC-seq, zapewniając prostą i uniwersalną metodę, która umożliwia niezawodne i powtarzalne profilowanie o wysokiej przepustowości.

<table><tbody><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Carl Roth</td><td>90604-29-8</td><td>Frakcja albuminy V</td></tr><tr><td>Sortownik komórek</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>FACSAria III</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Sartorius</td><td>A-14C</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Eppendorfa (1,5 ml)</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>Falcon (15 mL)</td><td>Corning</td><td>352096</td><td>Probówki wirówkowe z polipropylenu</td></tr><tr><td>Falcon (5 ml ) Corning</td><td></td> <td>352052</td><td>Polistyrenowe probówki z okrągłym dnem</td></tr><tr><td>Cienkie kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek Flowmi (40 &mu; m)</td> <td>Sigma</td><td>BAH136800040</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Leica</td><td>DMI6000 B</td><td></td></tr><tr><td>Szklana butelka (250 ml)</td><td>VWR</td><td>215-1593</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie ze szklanym dnem</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD3510-100</td><td>Fluorodish 35 mm</td></tr><tr><td>Szklane pipety Pasteura</td><td>VWR</td><td>612-1701</td><td></td></tr><tr><td>Szklane gniazdo do pipet</td><td>Carl Roth</td><td>388.1</td><td>Pi-pump 2500</td></tr><tr><td>Roztwór barwnika barwiącego Hoechst</td><td>Abcam</td><td>ab228551</td><td>Hoechst 33342</td></tr><tr><td>Minutowy zestaw do izolacji jąder bez detergentów</td><td>Invent Biotechnologies</td><td>NI-024</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X)</td><td>Szalka Petriego ThermoFisher</td><td>70011069</td><td></td></tr><tr><td>(30 mm)</td><td>FisherScientific</td><td>11333704</td><td>Pyrex</td></tr><tr><td>szalka Petriego (90 mm)</td><td>Corning</td><td>758-10178-CS</td><td>Gosselin</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet</td><td>VWR</td><td>89079</td><td>10 &mu; L, 200 &mu; L, 1000 &mu; L</td></tr><tr><td>Pipety</td><td>Gilson</td><td>F167380</td><td>Pipetman</td></tr><tr><td>Żyletka</td><td>Swann-Morton</td><td>7981809</td><td></td></tr><tr><td>Trikaina metan sulfonian</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna wirowa</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td>Vortex-Genie 2</td></tr></tbody></table>

izolacja jąder z całej tkanki metodą bezdetergentową i enzymatyczną

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

Wysokoprzepustowe profilowanie transkryptomu i epigenomu wymaga przygotowania zawiesiny pojedynczej komórki lub pojedynczego jądra. Przygotowanie zawiesiny z nienaruszoną komórką lub jądrami obejmuje dysocjację i przepuszczalność, etapy, które mogą wprowadzić niepożądany hałas i niepożądane uszkodzenia. W szczególności niektóre typy komórek, takie jak neurony, są trudne do dysocjacji na poszczególne komórki. Ponadto przepuszczalność błony komórkowej w celu uwolnienia jąder wymaga optymalizacji metodą prób i błędów, co może być czasochłonne, pracochłonne i nieopłacalne finansowo. Aby zwiększyć solidność i powtarzalność przygotowania próbki do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, opisano metodę szybkiej izolacji jąder opartych na kolumnach bez enzymów i detergentów. Protokół umożliwia skuteczną izolację jąder z całego mózgu danio pręgowanego w ciągu 20 minut. Izolowane jądra wykazują nienaruszoną morfologię jądrową i niską skłonność do agregacji. Co więcej, cytometria przepływowa umożliwia wzbogacenie jąder i usunięcie resztek komórkowych do dalszego zastosowania. Protokół, który powinien działać na tkankach miękkich i hodowanych komórkach, zapewnia prostą i dostępną metodę przygotowania próbki, którą można wykorzystać do profilowania o wysokiej przepustowości, upraszczając kroki wymagane do udanych eksperymentów z sekwencją RNA pojedynczych jąder i sekwencją ATAC.

--Opisany powyżej protokół został zastosowany do przygotowania zawiesiny pojedynczych jąder bezpośrednio z tkanki mózgu rybki danio-ostrokrzewca. Izolacja trwa zazwyczaj 20 minut i pozwala uniknąć zastosowania detergentów lub enzymów trawiennych. Schemat podsumowujący poszczególne kroki protokołu przedstawiono na Rysunku 1, który można wydrukować i wykorzystać jako instrukcję.
<img alt="Schemat przetwarzania tkanek ryb; obejmuje homogenizację, wirowanie i postępowanie z nadsączem." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61471/61471fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat metody izolacji jąder komórkowych z wykorzystaniem kolumn wirówkowych bez użycia detergentów. 
Graficzna reprezentacja poszczególnych etapów przeprowadzonych podczas ekstrakcji jąder komórkowych ze świeżej tkanki mózgowej rybek danio pręgowanych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61471/61471fig01large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej figury.</a>
Wizualizacja morfologii jąder komórkowych
W celu jakościowego potwierdzenia morfologii jąder, wyizolowane jądra zabarwiono barwnikiem Hoechst i zobrazowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Jądra były nienaruszone, okrągłe i dobrze oddzielone od siebie (Rysunek 2). Co istotne, nie stwierdzono agregacji jąder, która byłaby oznaką przerwania błony jądrowej.
<img alt="Obraz mikroskopowy fluorescencyjnych jąder komórkowych; pasek skali 10 µm; barwienie na niebiesko; wizualizacja biologii komórki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61471/61471fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2: Izolacja pojedynczych jąder komórkowych z mózgu zebrafish. 
Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej obrazujący jądra barwione barwnikiem Hoechst, wykazujące nienaruszoną morfologię. Pasek skali: 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61471/61471fig02large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Wzbogacanie nienaruszonych jąder komórkowych metodą FACS
Wzbogacenie wyizolowanych jąder i usunięcie resztek komórkowych przeprowadzono za pomocą cytometrii przepływowej poprzez bramkowanie na obecność sygnału fluorescencyjnego Hoechst. Sygnał Hoechst wykrywano po wzbudzeniu laserem fioletowym o długości fali 405 nm (Brilliant Violet 421 – BV421). Niebarwione jądra wykazywały fluorescencję tła (Rysunek 3A, Rysunek uzupełniający 1A), natomiast jądra barwione wykazywały silny sygnał fluorescencyjny (Rysunek 3B, Rysunek uzupełniający 1B). Jak pokazano na Rysunku 3C, niebarwione i barwione Hoechst jądra były wyraźnie rozdzielone w kanale fioletowym.
<img alt="Histogramy cytometrii przepływowej; analiza danych; liczba zdarzeń BV421-A; porównanie eksperymentalne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61471/61471fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3: Izolowane jądra wykazują silny i specyficzny sygnał fluorescencyjny barwnika Hoechst w cytometrii przepływowej. 
Wykresy histogramowe dla zawiesiny pojedynczych jąder wykazujące rozkład barwienia Hoechst. Hoechst jest wzbudzany fioletowym laserem o długości fali 405 nm (Brilliant Violet 421 – BV421). Próbka niebarwiona (A) wykazuje sygnał w zakresie 100-103, natomiast barwione Hoechst jądra (B) emitują sygnał w zakresie 103-105 zakres. Nałożenie intensywności fluorescencji emitowanej przez próbki niebarwione (szare) i barwione (niebieskie) (C) wykazuje wyraźne rozdzielenie dwóch populacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61471/61471fig03large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza cytometryczna z wykorzystaniem wykresów kropkowych i histogramów; identyfikacja jąder komórkowych, porównywanie danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61471/61471supfig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina uzupełniająca 1: Strategia bramkowania w cytometrii przepływowej dla wyizolowanych jąder. Reprezentatywne wykresy przepływowe dla zawiesiny wyizolowanych jąder. Wyizolowane jądra analizowano z wykorzystaniem rozpraszania w przód (forward scatter) oraz lasera fioletowego BV421, który wzbudza Hoechst przy 405 nm. Próbka niebarwiona (A) wyświetlony sygnał BV421 w 100-103 zakres. Spośród 13 130 zdarzeń, 141 zdarzeń zidentyfikowano jako pojedyncze jądra na podstawie FSC-A (1,07% całkowitej liczby), a 0 zdarzeń jako jądra niebarwione na podstawie sygnału BV421 (0% całkowitej liczby). Jądra zabarwione Hoechst (B) wyświetlony sygnał BV421 w 103-105 zakres. Z 50 0 zdarzeń, 2418 zdarzeń zidentyfikowano jako pojedyncze jądra na podstawie FSC-A (4,84% całkowitej liczby), a 2414 zdarzeń jako jądra Hoechst-dodatnie na podstawie sygnału BV421 (4,83% całkowitej liczby). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61471/61471supfig01.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę rycinę.</a>

Izolacja pojedynczych jąder opiera się na dysocjacji i przenikaniu błony komórkowej za pomocą detergentów, etapach, które wymagają optymalizacji i są podatne na wprowadzanie artefaktów technicznych. Demonstrujemy bezdetergentowy i bezenzymatyczny protokół szybkiej izolacji nienaruszonych jąder bezpośrednio z całej tkanki, uzyskując jądra odpowiednie do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra (snRNA-Seq) lub ATAC-seq.

Izolacja jąder z całej tkanki metodą bezdetergentową i enzymatyczną

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...

Przygotowanie zawiesiny pojedynczej komórki lub pojedynczego jądra jest kluczowym krokiem dla wysokoprzepustowego profilowania transkryptomu i epigenomu. Nasz protokół zapewnia prostą, powtarzalną i uniwersalną metodę izolacji pojedynczych jąder. W przeciwieństwie do innych metod wymagających detergentu do izolacji jąder, nasz protokół jest oparty na kolumnach, które nie zawierają detergentów ani enzymów.Umożliwia izolację jąder w czasie krótszym niż 30 minut. Nasz protokół upraszcza izolację jąder. Stanowi solidną metodę przygotowania zawiesiny pojedynczych jąder z trudnych do dysocjacji tkanek.Na początek należy wstępnie schłodzić bufor A i B z zestawu do izolacji jąder bez detergentów, umieszczając je na lodzie na co najmniej 30 minut. Pokryj probówki i końcówki pipet 5% roztworem BSA, który usprawni regenerację jąder. Aby pokryć końcówki pipet, odpipetuj 5% roztwór BSA dwa do trzech razy i susz je na powietrzu przez dwie godziny.Aby pokryć rurki, napełnij je BSA i odwróć je trzy razy. Usuń roztwór i wysusz probówki do góry nogami na czystej bibułce przez dwie godziny. Pokryj jedną probówkę zbiorczą i jedną probówkę o pojemności 1,5 mililitra na próbkę.Użyj kleszczy, aby delikatnie rozbić czaszkę i usunąć tkanki miękkie, skórę i kości z brzusznej i grzbietowej strony czaszki. Następnie delikatnie przenieś mózg do 30-milimetrowego naczynia zawierającego lodowaty PBS i zmiel mózg na małe kawałki za pomocą żyletki. Aby wyizolować pojedyncze jądra, przenieś zmieloną tkankę do wkładu filtrującego znajdującego się w zestawie do izolacji jąder i usuń nadmiar roztworu i dodaj 200 mikrolitrów zimnego buforu A. Miel tkankę plastikowym prętem przez dwie minuty.Dodać 300 mikrolitrów zimnego buforu A do wkładu filtrującego i inkubować go na lodzie z otwartą nakrętką przez 10 minut. Następnie zakryj wkład i ponownie wywiesić tkankę, odwracając rurkę pięć razy. Odwirować probówkę z próbką o masie 16 000 g przez 30 sekund, aby rozerwać komórki.Przepływ zawiera nienaruszone jądra, które tworzą bezbarwną osadę na dnie rurki. Wyrzuć filtr, a następnie ponownie zawieś granulkę, energicznie wirując przez 10 sekund. Ponownie otopić jądra, odwirowując roztwór o stężeniu 500 razy g przez trzy minuty.Następnie ostrożnie wyrzuć supernatant. Ponownie zawiesić osad w 0,8 mililitra zimnego buforu B, pipetując dwa do trzech razy i odwirować jądra przy 600 razy g przez 10 minut, co oddzieli je od resztek membrany. Ostrożnie wyrzucić supernatant.Ponownie zawiesić wyizolowane jądra w 500 mikrolitrach PBS z 5% BSA i utrzymać zawiesinę na lodzie do FACS. Aby potwierdzić morfologię jądra za pomocą barwienia HEX, przenieś 100 mikrolitrów zawiesiny pojedynczych jąder do nowej probówki za pomocą końcówek pokrytych BSA. Wybarwić jądra, dodając 0,1 mikrolitra HEX i delikatnie wirując rurkę.Przenieść zawiesinę jąder do naczynia ze szklanym dnem i obraz jąder za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z ustawieniem wzbudzenia laserowego 405 nanometrów. Przed wykonaniem FACS należy przefiltrować jądra za pomocą sitka komórkowego o średnicy 40 mikrometrów do probówki pokrytej BSA. Rozcieńczyć przefiltrowaną zawiesinę, dodając PBS z 5% BSA do końcowej objętości 1 000 mikrolitrów.Oznaczyć dwie probówki FACS z okrągłym dnem jako kontrolne i barwione, a następnie przenieść 250 mikrolitrów zawiesiny jąder do probówki kontrolnej za pomocą końcówki pipety pokrytej BSA. Przenieś pozostałe 750 mikrolitrów roztworu do probówki FACS oznaczonej jako barwiona i dodaj jeden mikrolitr barwnika HEX w celu zabarwienia jąder. Następnie wymieszaj go przez powolne wirowanie.Załaduj niebarwioną próbkę kontrolną do sortera komórek i zarejestruj 5 000 zdarzeń. Następnie załaduj wybarwioną próbkę i zarejestruj 5 000 zdarzeń. Narysuj bramki FACS do identyfikacji pojedynczych jąder.Jądra można wybrać, porównując sygnał fluorescencyjny HEX między próbkami kontrolnymi i barwionymi. Następnie posortuj jądra HEX dodatnie z barwionej probówki do nowej 1,5 mililitrowej probówki zawierającej 50 mikrolitrów PBS z 5% BSA. Protokół ten wykorzystano do wytworzenia zawiesiny pojedynczego jądra bezpośrednio z tkanki mózgowej danio pręgowanego.Wyizolowane jądra wybarwiono HEX i uwidoczniono za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Wydawały się nienaruszone, okrągłe i dobrze oddzielone. Co ważne, agregacja jądrowa była nieobecna.Wzbogacanie izolowanych jąder przeprowadzono za pomocą cytometrii przepływowej poprzez bramkowanie na obecność sygnału fluorescencyjnego HEX. Jądra niebarwione wykazywały fluorescencję tła, podczas gdy jądra barwione wykazywały silny sygnał fluorescencyjny. Niebarwione i barwione jądra były dobrze posegregowane w kanale fioletowym.Próbując tego protokołu, należy pamiętać, że pojedyncze jądra mają tendencję do przyklejania się do tworzywa sztucznego. Aby zapobiec potencjalnej utracie jąder i zwiększyć wydajność, zdecydowanie zaleca się podstawowe powlekanie tworzywa sztucznego. Izolowana zawiesina pojedynczych jąder może być dalej wykorzystywana do pojedynczych jąder RNA Ta technika wyjaśnia niejednorodność komórkową w złożonych systemach biologicznych i pomaga zdefiniować podtypy komórek i sieci genów.Stosowanie metody bezdetergentowej i enzymatycznej rejestruje szum techniczny i odchylenia powstające podczas przygotowywania próbki. W ramach tej metody opracowano uproszczoną i logistyczną izolację pojedynczych jąder.

nuclei-isolation-from-whole-tissue-using-detergent-enzyme-free

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Jądra komórek serca są izolowane metodą sedymentacji gęstościowej i znakowane immunologicznie przeciwciałami przeciwko materiałowi pericentriolarnemu 1 (PCM-1) w celu identyfikacji i sortowania jąder kardiomiocytów za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja jąder kardiomiocytów z tkanki pośmiertnej

Ten film opisuje protokół izolacji pojedynczych jąder ze świeżo zamrożonej tkanki glejaka. Wyizolowane pojedyncze jądra mogą być wykorzystane jako próbki do technik sekwencjonowania, takich jak sekwencjonowanie RNA pojedynczego jądra (snRNA) i test pojedynczych jąder do sekwencjonowania chromatyny dostępnej dla transpozazy (snATAC) w celu uzyskania głębszego wglądu w niejednorodność między- i wewnątrznowotworową obserwowaną w glejaku ośrodkowych tkanek nerwowych.

Izolacja jąder ze świeżo mrożonych tkanek glejaka: metoda uzyskiwania nienaruszonych jąder z próbek guza glejaka

Ten film demonstruje procedurę izolowania i sortowania jąder ze świeżo zamrożonej ludzkiej tkanki mózgowej za pomocą sortowania jąder aktywowanych fluorescencją (FANS), które umożliwia badanie różnych populacji komórek dla różnych zastosowań neurologicznych.

Izolowanie populacji komórek z tkanki mózgowej za pomocą sortowania jąder aktywowanych fluorescencją

Tkanki Drosophila często zawierają niejednorodną mieszaninę typów komórek. Aby zbadać ekspresję genów w określonych typach komórek z danej tkanki, jądra mogą być genetycznie znakowane, a następnie izolowane przy użyciu podejścia opartego na powinowactwie. Wyizolowane jądra mogą być wykorzystywane do dalszych zastosowań, takich jak analiza ekspresji genów i immunoprecypitacja chromatyny.

Izolacja oznaczonych jąder z tkanek Drosophila w oparciu o powinowactwo do analizy ekspresji genów

Tutaj prezentujemy protokół szybkiego izolowania wysokiej jakości jąder ze świeżej lub zamrożonej tkanki do dalszego masowo równoległego sekwencjonowania RNA. Uwzględniamy opcje detergencyjno-mechanicznego i hipotoniczno-mechanicznego rozbijania tkanek oraz lizy komórek, które można wykorzystać do izolacji jąder.

Izolacja dorosłych jąder rdzenia kręgowego do masowo równoległego sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra

Niejednorodność wewnątrznowotworowa jest nieodłączną cechą nowotworów, w tym glejaków. Opracowaliśmy prosty i wydajny protokół, który wykorzystuje kombinację i wirowania gradientowego do izolowania pojedynczych jąder ze świeżo mrożonych tkanek glejaka do badań sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra i ATAC.

Izolacja jąder ze świeżo zamrożonych guzów mózgu dla sekwencji RNA pojedynczego jądra i sekwencji ATAC

Tutaj prezentujemy protokół izolowania wysokiej jakości jąder z zamrożonych nerek myszy, który poprawia reprezentację typów komórek rdzeniastych nerek i pozwala uniknąć artefaktów ekspresji genów spowodowanych dysocjacją enzymatyczną tkanki.

Izolacja jąder z nerki dorosłej myszy w celu sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra

Tutaj prezentujemy protokół opisujący przygotowanie jąder komórkowych. Po mikrodysekcji i enzymatycznej dysocjacji tkanki serca na pojedyncze komórki, komórki progenitorowe zamrożono, a następnie wyizolowano czyste żywe komórki, które wykorzystano do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra i testu pojedynczego jądra dla chromatyny dostępnej dla transpozazy z wysokoprzepustowymi analizami sekwencjonowania.

Izolacja jąder z komórek progenitorowych serca myszy w celu profilowania epigenomu i ekspresji genów w rozdzielczości pojedynczej komórki

Badanie opisuje prosty, szybki i częściowo zautomatyzowany protokół izolowania wysokiej jakości jąder z zamrożonych tkanek ssaków do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder.

Prosty, szybki i częściowo zautomatyzowany protokół izolacji pojedynczych jąder z zamrożonych tkanek ssaków w celu sekwencjonowania pojedynczego jądra

Biologia międzymięśniowej tkanki tłuszczowej (IMAT) jest w dużej mierze niezbadana ze względu na ograniczoną dostępność tkanek ludzkich. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół izolacji jąder i przygotowania biblioteki zamrożonego ludzkiego IMAT do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder w celu identyfikacji składu komórkowego tego unikalnego magazynu tłuszczu.

Izolacja jąder z ludzkiej międzymięśniowej tkanki tłuszczowej i sekwencjonowanie RNA pojedynczych jąder w dół

Próbki tkanek po endarterektomii wieńcowej zostały przetworzone w celu wyizolowania pojedynczych jąder przy użyciu zoptymalizowanego protokołu dysocjacji. Integralność izolowanych jąder została zweryfikowana za pomocą trzech uzupełniających się podejść: barwienia trypanowym wykluczającym do oceny integralności błony, mikroskopii konfokalnej opartej na DAPI do potwierdzenia morfologii jądrowej oraz cytometrii przepływowej do ilościowej oceny wydajności i czystości jądrowej.

Izolacja pojedynczego jądra od tkanki po endarterektomii wieńcowej pacjentów poddanych przeszczepowi tętnic wieńcowych

Naucz się izolacji jąder z tkanek trudnych do rozpuszczenia metodą bezdetergentową i bezenzymatyczną. Protokół kolumnowy umożliwia szybkie uzyskanie nienaruszonych jąder z mózgu Danio rerio w mniej niż 30 minut.

Izolacja jąder z całej tkanki metodą bezdetergentową i enzymatyczną

Przeglądaj więcej filmów