Name: Wkład pompy Na+/K+ w rytmiczne pękanie, badany za pomocą modelowania i dynamicznych analiz zacisków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Odkryj rolę pompy Na⁺/K⁺ w rytmicznym pękaniu neuronów serca pijawki przy użyciu techniki dynamicznego zacisku. Ta metoda pozwala badaczom kontrolować prądy jonowe w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Christianowi Erxlebenowi za wstępne eksperymenty z dynamicznym zaciskiem na neuronach HN(7), które wykazały ich zdolność do pękania. Angela Wenning pomogła w eksperymentach, udzielając porad ekspertów. Dziękujemy NIH za finansowanie tych prac poprzez Grant 1 R21 NS111355 dla GSC i RLC.

UWAGA: Bezkręgowce wykorzystywane jako obiekty doświadczalne nie podlegają regulacjom NIH ani uniwersytetów Emory i Georgia State. Niemniej jednak podjęto wszelkie środki w celu zminimalizowania cierpienia pijawek użytych w tej pracy.
1. Przygotowanie wyizolowanego zwoju 7 z nerwu brzusznego pijawki
<ol>
	<li>Utrzymywać pijawki Hirudo verbana w sztucznej wodzie stawowej (zawierającej 0,05% w/v soli morskiej) rozcieńczonej w wodzie dejonizowanej w temperaturze 16 °C w cyklu światło-ciemność 12:12.</li>
	<li>Przygotować pijawki do sekcji poprzez znieczulenie zimnem w kruszonym lodzie przez &#62;10 min, aż do momentu unieruchomienia.</li>
	<li>Napełnić czarną, wyłożoną żywicą szalkę sekcyjną do głębokości ~1 cm schłodzonym roztworem soli zawierającym 115 mM NaCl, 4 mM KCl, 1,7 mM CaCl2, 10 mM D-glukozy i 10 mM HEPES w wodzie dejonizowanej; pH skorygować do 7,4 za pomocą 1 M NaOH. Przypiąć pijawkę stroną grzbietową do góry w czarnej komorze wyłożonej żywicą (o wymiarach co najmniej 20 cm x 10 cm i głębokości co najmniej 2 cm powyżej warstwy żywicy, która musi mieć co najmniej 2 cm grubości).</li>
	<li>Pod stereomikroskopem przy powiększeniu 20x z oświetleniem za pomocą skośnego prowadnika światła, wykonać cięcie podłużne o długości co najmniej 3 cm za pomocą 5 mm nożyczek sprężynowych przez ścianę ciała w przedniej 1/3ciej części ciała. Użyć szpilek, aby odsunąć ścianę ciała i odsłonić organy wewnętrzne. 
	UWAGA: Wszelkie zgromadzone pokarmy z krwi można usunąć za pomocą ssania pipetą Pasteura wypalaną ogniowo.</li>
	<li>Wyizolować pojedynczy zwoj średni ciała 7 (siódmy wolny zwoj segmentowy położony za mózgiem).
	<ol>
		<li>Otworzyć zatokę, w której znajduje się sznur nerwowy, używając 5 mm nożyczek sprężynowych. Należy upewnić się, że zatoka została rozcięta grzbietowo i brzusznie, pozostawiając&#160;dwa pasma zatoki. Użyć ostrych pęsety nr 5, aby pomóc w prowadzeniu cięcia i przytrzymać zatokę.</li>
		<li>Pozostawić zatokę przytwierdzoną do każdego z dwóch bocznych korzeni nerwowych wychodzących ze zwoju (przylega ona ściśle do każdego korzenia), aby wykorzystać te pasma zatoki do przypięcia zwoju.</li>
		<li>Usunąć zwoj z ciała, przecinając rostralne i kaudalne wiązki nerwów łączących zwoje (tak daleko od 7mego zwoju, jak to możliwe) oraz pasma zatoki, a następnie przeciąć korzenie bocznie od miejsca ich wychodzenia z zatoki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przypiąć zwoj (używając starych, stępionych pęset nr 5) za pomocą skróconych szpilek entomologicznych typu minuten, stroną brzuszną do góry, w przezroczystych, wyłożonych żywicą szalkach Petriego. Wbić szpilki w pasma zatoki i luźną tkankę przylegającą do korzeni oraz łączników rostralnych i kaudalnych, jak najdalej od zwoju. 
	UWAGA: Żywica nie może być grubsza niż 3 mm, jeśli podczas rejestracji ma być zapewnione dobre oświetlenie od dołu. Należy upewnić się, że zwoj jest napięty zarówno podłużnie, jak i poprzecznie.</li>
	<li>Zwiększyć powiększenie stereomikroskopu do 40x lub więcej i dostosować oświetlenie skośne tak, aby ciała komórek neuronalnych były łatwo widoczne na powierzchni brzusznej zwoju, tuż pod perineurium.</li>
	<li>Usunąć perineurium zwoju (odpowiekać) za pomocą mikronożyczek.
	<ol>
		<li>Rozpocząć odpowiekanie od przecięcia luźnej osłonki między korzeniami po jednej stronie, a następnie kontynuować cięcie bocznie na drugą stronę, dbając o to, aby ostrza nożyczek pozostawały powierzchowne i nie uszkodziły ciał komórek neuronalnych znajdujących się bezpośrednio pod osłonką.</li>
		<li>Wyonać podobne powierzchowne cięcie w kierunku kaudalnym od cięcia bocznego wzdłuż linii środkowej.</li>
		<li>Następnie chwycić kaudaloboczną klapę osłonki po jednej stronie za pomocą cienkiej pęsety nr 5, odciągnąć ją od zwoju i odciąć mikronożyczkami.</li>
		<li>Powtórzyć czynność po drugiej stronie; procedura ta odsłania oba neurony HN(7) do rejestracji za pomocą mikroelektrod.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić szalkę z preparatem w układzie rejestrującym i poddać superfuzji roztworem soli z przepływem 5&#160;mL/min w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
2. Identyfikacja i rejestracja interneuronów serca pijawki za pomocą mikroelektrod ostrych
<ol>
	<li>Przez cały czas rejestracji neuronu HN(7) (rejestracje trwają od 30 do 60 min), należy pozyskiwać i digitalizować ślady prądu i napięcia wewnątrzkomórkowego za pomocą elektrometru neurofizjologicznego z częstotliwością próbkowania 5 kHz, wykorzystując cyfrowy system akwizycji danych (analogowo-cyfrowy, A do D) i stymulacji (cyfrowo-analogowy, D do A), a następnie wyświetlać je na ekranie komputera. 
	UWAGA: Do akwizycji danych (A do D) można użyć dowolnego komercyjnego lub dedykowanego oprogramowania oraz karty A do D/D do A. System D do A i dedykowane oprogramowanie są wymagane do zastosowania dynamicznego zaciskania (dynamic clamp).</li>
	<li>Pod stereomikroskopem z powiększeniem 50-100x i ciemnym polem oświetlenia od dołu, należy wstępnie zidentyfikować neuron HN(7) z pary bilateralnej na podstawie jego kanonicznej lokalizacji w pozycji tylno-bocznej w siódmym zwoju środkowego ciała.</li>
	<li>Następnie należy dążyć do penetracji domniemanego neuronu HN(7) ostrą mikroelektrodą wypełnioną 2 M octanem potasu i 20 mM KCl, używając mikromanipulatora.
	<ol>
		<li>Umieścić mikroelektrodę bardzo blisko ciała komórki docelowej.</li>
		<li>Stale obserwować rejestrowany potencjał za pomocą elektrometru i ustawić ten potencjał na 0 mV przed penetracją neuronu.</li>
		<li>Przebić neuron mikroelektrodą, powoli&#160;wprowadzając&#160;elektrodę wzdłuż jej osi długiej za pomocą manipulatora. Używając funkcji impulsu (buzz) elektrometru, ustawionej na czas trwania 100 ms, aż do momentu zaobserwowania ujemnego przesunięcia potencjału błony i intensywnej aktywności impulsowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustawić elektrometr w trybie nieciągłego zaciskania prądowego (DCC) ≥ 3 kHz, aby jednocześnie rejestrować potencjał błony&#160;i prąd przechodzący za pomocą pojedynczej mikroelektrody (kompensację pojemności ustawić tuż poniżej poziomu oscylacji, a następnie zmniejszyć o 10%).
	<ol>
		<li>Monitorować stabilizację elektrody podczas DCC na oscyloskopie.</li>
		<li>Wstrzyknąć stały prąd -0,1 nA za pomocą wstrzykiwacza prądu stałego elektrometru przez minutę lub dwie, aby ustabilizować pomiar.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ostatecznie zidentyfikować neuron HN(7) po charakterystycznym kształcie impulsu i słabej aktywności seryjnej (bursting) (Rycina 1Ci).</li>
	<li>Wszelkie analizy danych przeprowadzić w trybie offline po zakończeniu eksperymentu i zapisać wszystkie dane na dysku.</li>
</ol>
3. Budowa neuronu HN czasu rzeczywistego lub innego modelu neuronu
<ol>
	<li>Stworzenie dedykowanego oprogramowania z wykorzystaniem płyty do cyfrowego przetwarzania sygnałów (DSB; przetwornik cyfrowo-analogowy i analogowo-cyfrowy) w komputerze stacjonarnym w celu implementacji w czasie rzeczywistym prądów modelowych opisanych w2,4 lub inne prądy modelowe dla pozostałych neuronów bądź eksperymentów.
	<ol>
		<li>Należy stosować równania w stylu Hodgkina-Huxleya, ponieważ są one powszechnie preferowaną metodą reprezentowania prądów modelowych.</li>
		<li>Zobacz7 w celu uzyskania szczegółowego opisu implementacji modelu HN w czasie rzeczywistym oraz dynamicznego zacisku przed dodaniem prądu pompowego. Opis prądów oraz wewnątrzkomórkowego Na należy znaleźć w sekcji wstępnej+ stężenia oraz przewodnościของ&#160;żywy neuron HN(7) w modelu HN.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Implementacja i modyfikacja dynamicznych przewodności/prądów w metodzie dynamic clamp
<ol>
	<li>Użyj dedykowanego oprogramowania dynamic clamp dla DSB, aby zaimplementować i zmieniać w czasie rzeczywistym dowolny parametr dynamic clamp w graficznym interfejsie użytkownika (Rysunek 3dostępne przez interfejs graficzny użytkownika (GUI), zaprogramowane konduktancje i prądy modelu czasu rzeczywistego HN dla neuronu HN(7). 
	UWAGA: Przypominamy, że <img alt="Równanie 5" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg" /> i <img alt="Równanie 6" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg" />&#160;maksymalne przewodnictwo trwałego prądu Na+ aktualny (IP) oraz maksymalny prąd pompy (Ipompa), odpowiednio.</li>
	<li>Aby wprowadzić zmiany w trakcie działania modelu, należy skorzystać z pól wprowadzania w interfejsie graficznym (GUI) oprogramowania w <img alt="Równanie 7" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg" /> (pudełko PumpMaxL) i <img alt="Równanie 8" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg" /> &#8203;(pudełko GpinHNLive) (Rycina 3). 
	UWAGA: Pola wprowadzania w interfejsie graficznym użytkownika (GUI) przyjmują wartości wpisywane z klawiatury; zaleca się stosowanie kroków o wartości 0,1 nA dla <img alt="Równanie 9" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg" /> or zaleca się stosowanie kroków o wartości 1 nS dla <img alt="Równanie 12" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg" />.
	<ol>
		<li>Dodaj niewielkie ilości <img alt="Równanie 10" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg" /> i <img alt="Równanie 11" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg" /> z wykorzystaniem dynamicznego zacisku (dynamic clamp) w celu stabilizacji aktywności seryjnej (bursting) neuronu HN(7),&#160;co zostaje osłabione przez wyciek wywołany mikroelektrodą, jak pokazano w Rycina 1Cii. 
		UWAGA: Przebicie błony ostrą mikroelektrodą powoduje jej uszkodzenie, które objawia się zwiększoną przewodnością przeciekową lub zmniejszoną rezystancją wejściową.</li>
		<li>Zacznij od dodania wartości <img alt="Równanie 13" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg" /> o wartości 0,1–0,2 nA, co kompensuje wyciek wywołany mikroelektrodą, lecz obniża pobudliwość, a następnie stopniowo zwiększać <img alt="Równanie 14" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg" />, co zwiększa pobudliwość, aż do wystąpienia regularnych wyładowań seryjnych (burstingu), zazwyczaj przy <img alt="Równanie 15" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg" /> wynoszącej od ok. 1 do 4 nS (Rycina 4A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Systematycznie zmieniaj te prądy (w przyrostach 0,1 nA dla <img alt="Równanie 16" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg" /> oraz 1 nS dla <img alt="Równanie 17" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg" />) do zarejestrowanego neuronu HN(7) z zastosowaniem clampu dynamicznego (Rycina 3), a następnie ocenić ich wpływ na charakterystykę serii impulsów (bursts): częstotliwość impulsów (f: odwrotność średniego odstępu międzyimpulsowego w obrębie serii), odstęp między seriami (IBI: czas od ostatniego impulsu w jednej serii do pierwszego impulsu w następnej serii), czas trwania serii (BD: czas od pierwszego do ostatniego impulsu w obrębie serii) oraz okres serii (T: czas od pierwszego impulsu w jednej serii do pierwszego impulsu w serii następnej).
	<ol>
		<li>Zmień wartości <img alt="Równanie 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg" /> i <img alt="Równanie 19" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg" />tak jak w demonstracji wideo, aby zapoznać się z techniką, a następnie przystąpić do samodzielnych działań.
		<ol>
			<li>Przytrzymać <img alt="Równanie 20" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg" /> przy konkretnej stałej wartości i przesuwaniu w przyrostach 1 nS w zakresie <img alt="Równanie 21" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg" /> wspierające regularną aktywność seryjną.</li>
			<li>Teraz należy zwiększyć wartość stałą dla <img alt="Równanie 22" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg" /> o 0,1 nA, a następnie ponownie przeprowadzić skanowanie w zakresie <img alt="Równanie 23" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg" /> &#8203;podtrzymując regularną aktywność seryjną.</li>
			<li>Dla każdej zaimplementowanej pary parametrów należy zebrać dane zawierające co najmniej 8 serii wyładowań (bursts), aby umożliwić wiarygodny pomiar średnich wartości f, IBI, BD oraz T.</li>
			<li>Kontynuuj serie pomiarów tak długo, jak neuron pozostaje żywy, co ocenia się na podstawie silnego generowania potencjałów czynnościowych oraz stabilnego potencjału spoczynkowego oscylacji.</li>
			<li>Zbierz dane z kilku neuronów (pochodzących od różnych zwierząt), aby wygenerować wykres zbiorczy (Rycina 5).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Cymbalyuk, G. S., Gaudry, Q., Masino, M. A., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bursting+in+leech+heart+interneurons%3A+cell-autonomous+and+network-based+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Bursting in leech heart interneurons: cell-autonomous and network-based mechanisms.</a> Journal of Neuroscience. 22, 10580-10592 (2002).</li>
<li>Hill, A. A., Lu, J., Masino, M. A., Olsen, O. H., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+a+segmental+oscillator+in+the+leech+heartbeat+neuronal+network%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A model of a segmental oscillator in the leech heartbeat neuronal network.</a> Journal of Computational Neuroscience. 10, 281-302 (2001).</li>
<li>Tobin, A. E., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myomodulin+increases+Ih+and+inhibits+the+NA%2FK+pump+to+modulate+bursting+in+leech+heart+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Myomodulin increases Ih and inhibits the NA/K pump to modulate bursting in leech heart interneurons.</a> Journal of Neurophysiology. 94, 3938-3950 (2005).</li>
<li>Kueh, D., Barnett, W. H., Cymbalyuk, G. S., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%28%2B%29%2FK%28%2B%29+pump+interacts+with+the+h-current+to+control+bursting+activity+in+central+pattern+generator+neurons+of+leeches%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Na(+)/K(+) pump interacts with the h-current to control bursting activity in central pattern generator neurons of leeches.</a> eLife. 5, 19322(2016).</li>
<li>Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+clamp%3A+computer-generated+conductances+in+real+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 69, 992-995 (1993).</li>
<li>Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+clamp+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The dynamic clamp comes of age.</a> Trends in Neuroscience. 27, 218-224 (2004).</li>
<li>Barnett, W., Cymbalyuk, G. Hybrid systems analysis: real-time systems for design and prototyping of neural interfaces and prostheses. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarnett%2C+W+%22Biohybrid+systems%3A+nerves%2C+interfaces%2C+and+machines%22">Biohybrid systems: nerves, interfaces, and machines</a>. Jung, R. , Wiley VCH Verlag. Weinheim. 115-138 (2011).</li>
<li>Sorensen, M., DeWeerth, S., Cymbalyuk, G., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+hybrid+neural+system+to+reveal+regulation+of+neuronal+network+activity+by+an+intrinsic+current%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Using a hybrid neural system to reveal regulation of neuronal network activity by an intrinsic current.</a> Journal of Neuroscience. 24, 5427-5438 (2004).</li>
<li>Olypher, A., Cymbalyuk, G., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+systems+analysis+of+the+control+of+burst+duration+by+low-voltage-activated+calcium+current+in+leech+heart+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Hybrid systems analysis of the control of burst duration by low-voltage-activated calcium current in leech heart interneurons.</a> Journal of Neurophysiology. 96, 2857-2867 (2006).</li>
<li>Calabrese, R. L., Prinz, A. A. Realistic modeling of small neuronal networks. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCalabrese%2C+RL+%22Computational+Modeling+Methods+for+Neuroscientists%22">Computational Modeling Methods for Neuroscientists</a>. DeSchutter, E. , MIT Press. MA, USA. 285-316 (2010).</li>
<li>Rybak, I. A., Molkov, Y. I., Jasinski, P. E., Shevtsova, N. A., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhythmic+bursting+in+the+pre-B%C3%B6tzinger+complex%3A+mechanisms+and+models%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Rhythmic bursting in the pre-Bötzinger complex: mechanisms and models.</a> Progress in Brain Research. 209, 1-23 (2014).</li>
<li>Picton, L. D., Nascimento, F., Broadhead, M. J., Sillar, K. T., Miles, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+pumps+mediate+activity-dependent+changes+in+mammalian+motor+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Sodium pumps mediate activity-dependent changes in mammalian motor networks.</a> Journal of Neuroscience. 37, 906-921 (2017).</li>
</ol>

Modelowanie, zacisk dynamiczny i wynikające z niego analizy są użytecznymi technikami do badania, w jaki sposób poszczególne i grupy przewodnictwa/prądów jonowych przyczyniają się do aktywności elektrycznej neuronów (Rysunek 1, Rysunek 2, Rysunek 4 i Rysunek 5). Zastosowanie tych technik pokazuje, w jaki sposób prąd pompy Na+/K+ (pompa I) oddziałuje z prądami bramkowanymi napięciem, w szczególności z trwałym prądem Na+ (I P), aby promować solidne pękanie w rdzeniu generatora wzorców bicia serca pijawki. Łącząc dynamiczne eksperymenty cęgowe i modelowanie, możliwe jest testowanie modeli bardziej bezpośrednio niż jest to możliwe przy użyciu zwykłych technik zapisu napięcia i cęgów prądowych. Wyniki uzyskane z eksperymentów z zaciskiem dynamicznym (rysunek 5) zostaną wykorzystane do dalszego udoskonalenia modelu HN. Podstawowa metoda dynamicznego zaciskania zademonstrowana tutaj może być dostosowana tak, aby odzwierciedlała właściwości dowolnego badanego neuronu, jeśli można określić matematyczny model prądów neuronalnych za pomocą eksperymentów z cęgami napięciowymi.
Pomyślne zakończenie eksperymentów typu pokazanego tutaj wymaga starannego nabicia HN lub innego neuronu przy użyciu ostrej mikroelektrody, ponieważ silne pękanie jest ograniczane przez penetrację elektrody1. (Techniki rejestrowania łatek w całych komórkach, które minimalizują wprowadzony wyciek, mają również zastosowanie do innych neuronów, ale nie działają dobrze na neuronach pijawek). Bardzo ważne jest, aby przebicie neuronu HN spowodowało minimalne uszkodzenie neuronu (dodatkowy wyciek), a rezystancja wejściowa powinna być monitorowana i musi mieścić się w zakresie 60-100 MOhms dla udanych eksperymentów4.
Zacisk dynamiczny jest potężną techniką, ale ma ograniczenia narzucone przez geometrię neuronalną, ponieważ sztuczne przewodnictwa są realizowane w miejscu elektrody rejestrującej - zwykle w ciele komórki - a nie w miejscu, w którym prądy generujące rytm są zwykle zlokalizowane 5,6,10. W neuronach HN pijawek ciało komórki znajduje się elektrycznie blisko strefy integracji (głównego neurytu) neuronu, w której zlokalizowane są najbardziej aktywne prądy i inicjowane są kolce.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61473">Contribution of the Na+/K+ Pump to Rhythmic Bursting, Explored with Modeling and Dynamic Clamp Analyses</a>. An author name was updated.
The&#160;name of the first author was updated from:
Ricardo Javier Erazo Toscano
to:
Ricardo Javier Erazo-Toscano

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61473">Contribution of the Na+/K+ Pump to Rhythmic Bursting, Explored with Modeling and Dynamic Clamp Analyses</a>. An author name was updated.

Erratum: Contribution of the Na+/K+ Pump to Rhythmic Bursting, Explored with Modeling and Dynamic Clamp Analyses

Bicie serca u pijawek jest sterowane przez CPG składający się z 9 bilateralnych par interneuronów serca (HN) rozmieszczonych w odpowiadającej im liczbie zwojów segmentowych w części środkowej ciała. Rdzeniem CPG są wzajemnie hamujące pary interneuronów zlokalizowane w 3rd oraz 4th zwoje segmentalne tworzące oscylatory półcentrum (HCO) (Rycina 1A). Neurony te nadal wykazują aktywność seryjną (bursting) po farmakologicznej izolacji synaptycznej z użyciem bikukulinu1Inni, jak para w 7th zwoje segmentalne (będące przedmiotem niniejszego protokołu) są również komórkami typu burster, zdolnymi do generowania aktywności seryjnej (bursting) w warunkach izolacji synaptycznej. Nie są one ze sobą połączone i otrzymują jedynie sygnały zstępujące, w związku z czym można je łatwo odizolować poprzez oddzielenie zwoju od reszty sznura nerwowego. Ta niezależna aktywność seryjna jest wrażliwa na wprowadzony prąd upływu, wywołany penetracją za pomocą ostrych mikroelektrod rejestrujących.&#160;ale&#160;gwałtownie pękają podczas rejestracji metodą luźnego patcha (loose patch)1.
Zarówno pojedyncze neurony HN, jak i HN HCO&#160;zostały zamodelowane (modele pojedynczego przedziału izopotencjalnego neuronów HN oparte na modelu Hodgkina-Huxleya, zawierające wszystkie eksperymentalnie zidentyfikowane prądy synaptyczne i bramkowane napięciem), a wszystkie charakterystyki seryjnych wyładowań (burst) żywego układu zostały pomyślnie odwzorowane2. Myomodulina, endogenny neuropeptyd u pijawek, wyraźnie skraca okres (T) rytmu wyładowań izolowanych neuronów HN oraz HN HCO. Modulator ten działa poprzez zwiększenie prądu h (prądu wewnątrzkomórkowego aktywowanego hiperpolaryzacją, Ih) i zmniejszenie Ipump3. Obserwacja ta doprowadziła do zbadania, w jaki sposób Ipump oddziałuje z Ih oraz jak ich wspólna modulacja wpływa na aktywność rytmiczną neuronów HN. Aktywacja pompy poprzez zwiększenie [Na+]i (z użyciem jonoforu monensyny) przyspiesza rytm wyładowań HN zarówno w HN HCO, jak i w izolowanych neuronach HN4. Przyspieszenie to było zależne od Ih.&#160;W przypadku zablokowania Ih (2 mM Cs+), okres wyładowania nie uległ zmianie przy tej metodzie aktywacji pompy; jednak czas trwania wyładowania (BD) uległ skróceniu, a odstęp między wyładowaniami (IBI) uległ wydłużeniu zarówno w HN HCO, jak i w izolowanych neuronach HN4.
W niniejszym protokole wszystkie prądy żywego neuronu HN(7), w tym prąd pompy, Ipump, zostały włączone do modelu HN w następujący sposób:
<img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/61473/61473eq01v2.jpg" /> (1)
gdzie C to pojemność błony (w nF), V to potencjał błonowy (w V), a t to czas (w s). Szczegółowe opisy i równania prądów jonowych zostały przedstawione w innych opracowaniach2,4. Kompletny neuron w modelu HN pracuje w czasie rzeczywistym (Ryc. 2). Oprogramowanie zostanie udostępnione w serwisie GitHub po publikacji i będzie odpowiednie do uruchomienia na płytce cyfrowego przetwarzania sygnałów opisanej w Tabeli materiałów. W niniejszym badaniu przedmiotem analizy jest prąd pompy Na+/K+ (Ipump) oraz prądy bramkowane napięciem, które wnoszą istotny wkład w strumień Na+: szybki prąd Na+ (INa) oraz trwały prąd Na+ (IP). Maksymalne przewodności tych prądów wynoszą odpowiednio&#160;<img alt="Równanie 1a" src="/files/ftp_upload/61473/61473eq1a.jpg" /> oraz <img alt="Równanie 1b" src="/files/ftp_upload/61473/61473eq1b.jpg" />. Pompa Na+/K+ wymienia trzy wewnątrzkomórkowe jony Na+ na dwa zewnątrzkomórkowe jony K+, generując tym samym wypadkowy prąd wychodzący. Co ważne, pompa usuwa z neuronu 3 razy więcej Na+, niż wskazuje ten prąd, co jest istotne przy obliczaniu wewnątrzkomórkowego stężenia Na+.
Prąd pompy Na+/K+ zależy od wewnątrzkomórkowych stężeń Na+ i jest wyrażony następującą funkcją sigmoidalną:
<img alt="Równanie 2" src="/files/ftp_upload/61473/61473eq02.jpg" /> (2)
gdzie [Na]i&#160; to wewnątrzkomórkowe stężenie Na+,&#160;<img alt="Równanie 4" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg" /> to maksymalny prąd pompy Na+/K+, [Na]ih to wewnątrzkomórkowe stężenie Na+ dla połowy aktywacji pompy Na+/K+, a [Na]is to czułość pompy Na+/K+ na [Na]i. [Na]i&#160; wzrasta w wyniku napływu Na+ przenoszonego przez IP oraz INa i jest zmniejszane przez odpływ Na+ realizowany przez pompę Na+/K+. Wkład Ih i ILeak do całkowitego strumienia Na+ jest niewielki i nie jest uwzględniany w modelu czasu rzeczywistego.
<img alt="Równanie 3" src="/files/ftp_upload/61473/61473eq03.jpg" /> (3)
gdzie v to objętość (~6,7 pL) wewnątrzkomórkowego rezerwuaru Na+, F to stała Faradaya, a pozakomórkowe stężenie Na+ pozostaje stałe.
Przewodności bramkowane napięciowo i przewodności przecieku – które reagują na potencjał błonowy – zostały odróżnione od prądu pompy, regulowanego przez obliczone wewnątrzkomórkowe stężenie Na+ ([Na+]i). [Na+]i narasta poprzez napływ Na+ za pośrednictwem szybkiego prądu Na+ (INa), który generuje potencjały czynnościowe (kolce), oraz trwałego prądu Na+ (IP), który zapewnia depolaryzację wspierającą generowanie kolców. [Na+]i jest z kolei redukowane przez działanie pompy poprzez usuwanie Na+ na zewnątrz. Przyjęto bazowe wartości dla żywych HN wynoszące <img alt="Równanie 1a" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg" />(5nS) oraz <img alt="Równanie 1a" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgna.jpg" />(150 nS), a dodatkowo uwzględniamy każdą dodaną przewodność dynamic clamp <img alt="Równanie 1a" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg" />.
Celem opisanego tutaj protokołu jest precyzyjne i odwracalne manipulowanie Ipump w czasie rzeczywistym, aby zbadać, w jaki sposób oddziałuje ono z prądami sterowanymi napięciem (w obecnym protokole jest to trwały prąd Na+), kontrolując rytmiczne serie potencjałów w pojedynczych HNs. Aby osiągnąć ten cel, zastosowano metodę dynamic clamp, która na żądanie sztucznie wprowadza precyzyjną wartość dowolnego prądu obliczanego w trakcie działania modelu. Metoda ta ma przewagę nad manipulacją farmakologiczną pompą, która wpływa na całą tkankę, może wywoływać efekty pozatarczycowe, często trudne do odwrócenia, i nie pozwala na precyzyjne sterowanie. Dynamic clamp5,6 odczytuje napięcie rejestrowanego neuronu w czasie rzeczywistym (Rysunek 1B), a następnie oblicza i wstrzykuje w czasie rzeczywistym wartość dowolnego prądu na podstawie równań modelu oraz wartości ustawionych dla <img alt="Równanie 1a" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgx.jpg" /> lub <img alt="Równanie 1a" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimx.jpg" />. Podobne metody można łatwo zastosować do każdego neuronu, z którego można rejestrować aktywność wewnątrzkomórkową. Należy jednak przeskalować parametry do wybranego neuronu, a sam neuron powinien zostać odizolowany od wpływów synaptycznych, np. farmakologicznie.

<table><tbody><tr><td><silny>ZWIERZĘTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hirudo verbanaLeech.com</td><td>, https://www.leech.com/collections/live-leeches</td><td></td><td>żywe pijawki 2-3 gramy</td></tr><tr><td><silne>CHEMIKALIA</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SZTUCZNA WODA</td><td></td><td></td><td></td>W STAWIE</tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5670-100G</td><td>1,8 mM dodać jako ostatni po dostosowaniu pH</td></tr><tr><td>glukozy</td><td>Sigma</td><td>Aldrich G7021-100G</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034-100G</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Instant Ocean (sól morska)</td> <td>Spectrum Brands Inc., Madison, WI</td><td></td><td>0,05% (w/v) rozcieńczony w wodzie dejonizowanej</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td>4 mM</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653-250G</td><td>115 mM</td></tr><tr><td>NaOH 0,1 N Roztwór</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2105-50ML</td><td>Dostosuj do pH 7,4 za pomocą NaOH</td></tr><<tr><td>mocne>MIKROELEKTRODY</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>K Acetat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1190-100G</td><td>2 M</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td>20 mM</td></tr><tr><td>sól fizjologiczna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><mocny>SPRZĘT</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>#5 Kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej Dumont</td><td>11251-30 LUB 11251-20</td><td>Do ogólnego rozwarstwiania pijawek</td></tr><tr><td>AxoClamp 2A/2B Elektrometr DCC</td><td>Axon Instruments Urządzenia molekularne</td><td>2A/2B</td><td>Do rejestracji potencjału błony neuronalnej i nieciągłego cęgów prądowych</td></tr><tr><td>żywica</td><td>Dow Sylguard</td><td>170</td><td>Linie Ogólne naczynie preparacyjne</td></tr><tr><td>Szkło kapilarne 1 mm średnica zewnętrzna, 0,75 mm średnica wewnętrzna</td><td>A-M Systems</td><td>615000</td><td>Do wytwarzania ostrych mikroelektrod</td></tr><tr><td>Przezroczysta żywica</td><td>Dow Sylguard</td><td>184</td><td>Lines Szalka Petriego służąca do montażu ganglionu do elektrofizjologii</td></tr><tr><td>Kondensor ciemnego pola</td><td>Nikon</td><td>Dry 0,95-0,80 MBL 1210</td><td>Do oświetlania preparatu ganglionu podczas nabijania komórki</td></tr><tr><td>Digidata 1440A</td><td>Axon CNS Molecular Devices</td><td>1440A</td><td>Wykonuje pomiary od A do D i od D do A w celu akwizycji danych i stymulacji podczas elektrofizjologii Cyfrowa</td></tr><tr><td>płytka przetwarzania sygnału</td><td>dSpace</td><td>CLP1104</td><td>Nasze oprogramowanie implementuje wszystkie przewodności/prądy w naszym modelu neuronu HN na płycie kontrolera PPC DS1103 dSPACE w czasie rzeczywistym z częstotliwością 20 kHz za pomocą graficznego interfejsu użytkownika ControlDesk (dSPACE, Paderborn, Niemcy)9.&nbsp;</td></tr><tr><td>Falming/Brown Microelectrode Puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td>Do wytwarzania ostrych mikroelektrod</td></tr><tr><td>Oświetlacz o wysokiej intensywności Fiber-Lite</td><td>Dolan Jenner Industries</td><td>170D</td><td>Do oświetlania ogólnej sekcji i do oświetlania preparatu ganglionu podczas wbijania komórek</td></tr><tr><td>Wzmacniacz czołowy do AxoClamp 2A</td><td>Axon Instruments</td><td>HS-2A Wzmocnienie: 0,1LU</td><td>Teraz część Molecular Devices do rejestracji potencjału błony neuronalnej i nieciągłego cęgowania prądu</td></tr><tr><td>Światłowód</td><td>Dolan Jenner Industries</td><td>Rev R 38 08 3729107</td><td>Do oświetlania ogólnego rozwarstwienia oraz do oświetlania preparatu ganglionu podczas napalania komórek</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-385</td><td>Mikromanipulator do nabijania komórek za pomocą mikroelektrod</td></tr><tr><td>Mikromanipulator kontroler</td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-200</td><td>Steruje mikromanipulatorami do nabijania komórek za pomocą mikroelektrod</td></tr><tr><td>Szpilki Minuten</td><td>BioQuip</td><td>Średnica 0,15 mm 1208SA</td><td>Należy skrócić przez curtting do ~5 mm</td></tr><tr><td>Optyczna płytka stykowa 3' x 5' x 8"</td><td>Newport</td><td>Przestarzały</td><td>Z 4 poniższymi izolatorami pneumatycznymi używanymi do budowy wolnej od wibracji przestrzeni roboczej do elektrofizjologii</td></tr><tr><td>Oscyloskop</td><td>HAMEG Instruments</td><td>HM303-6</td><td>Do monitorowania osadzania elektrod podczas DCC</td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Pascheff-Wolff</td><td>Moria</td><td></td><td>Dostarczone przez Fine Science Tools (Foster City, CA) katalog # 15371-92</td></tr><tr><td>pClamp 9 Oprogramowanie</td><td>Axon Instruments</td><td>9</td><td>Teraz część Moleculear Devices wykorzystuje Digidata 1440 do akwizycji danych i stymulacji podczas elektrofizjologii</td></tr><tr><td>Izolatory pneumatyczne 28"</td><td>Newport</td><td>Przestarzały</td><td>Z optyczną płytką stykową służącą do budowy wolnej od wibracji przestrzeni roboczej do elektrofizjologii</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Simulink / MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>2006 (przestarzałe)</td><td>Implementuje dynamiczny zacisk na płytce cyfrowego przetwarzania sygnału</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Wild</td><td>M5A</td><td>10x Okulary używane do preparowania pijawki oraz usuwania i usuwania zwojów nerwowych</td></tr><tr><td>Steromikroskop</td><td>Dzikie</td> okulary <td>M5</td><td>20x używane w stacji elektrofizjologicznej do wizualizacji neuronu do penetracji mikroelektrod</td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Student Vannas</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>91500-09</td><td>Do ogólnego rozwarstwiania pijawek</td></tr></tbody></table>

wkład pompy na+/k+ w rytmiczne pękanie, badany za pomocą modelowania i dynamicznych analiz zacisków

Contribution of the Na+/K+ Pump to Rhythmic Bursting, Explored with Modeling and Dynamic Clamp Analyses

Pompa Na+/K+, często uważana za funkcję tła w aktywności neuronalnej, dostarcza prąd na zewnątrz (pompa I), który reaguje na wewnętrzne stężenie Na+ ([Na+]i). W neuronach pękających, takich jak te znajdujące się w sieciach neuronalnych centralnego generatora wzorców (CPG), które wytwarzają rytmiczne ruchy, można oczekiwać, że [Na+]i, a tym samym pompa I, będą się zmieniać w trakcie cyklu impulsu. Ta reakcja na aktywność elektryczną, w połączeniu z niezależnością od potencjału błonowego, nadaje pompie I właściwości dynamiczne, które nie są typowe dla prądów opartych na kanałach (np. kanały bramkowane napięciem lub nadajnikiem lub nieszczelne). Co więcej, w wielu neuronach aktywność pompy jest modulowana przez różne modulatory, co jeszcze bardziej zwiększa potencjalną rolę pompy I w rytmicznym wybuchu. W tym artykule pokazano, jak wykorzystać kombinację metod modelowania i dynamicznego zacisku w celu określenia, w jaki sposób pompuję i jego interakcja z trwałym prądem Na+ wpływa na rytmiczną aktywność w CPG. W szczególności w tym artykule skupimy się na protokole dynamicznego zacisku i metodach modelowania obliczeniowego w interneuronach serca pijawek lekarskich.

Modelowanie z uwzględnieniem Ipump4 pozwoliło dokładniej przeanalizować wyniki eksperymentalne przedstawione w sekcji wstępnej i rozpoczęło wyjaśnianie mechanizmu burstingu wspomaganego pompą. Przedstawiony tutaj model w czasie rzeczywistym został dostrojony (<img alt="Równanie 30" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgx.jpg" />&#160;oraz dobrano parametry <img alt="Równanie 31" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimx.jpg" />) w taki sposób, aby generował regularną aktywność rytmiczną mieszczącą się w granicach normalnej aktywności zaobserwowanej w eksperymentach – f, IBI, BD, T&#160;– i nadal generował taką aktywność, gdy parametry modulowane przez myomodulinę <img alt="Równanie 32" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg" /> (maksymalny prąd pompy) oraz <img alt="Równanie 33" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgh.jpg" /> (maksymalna przewodność prądu h) są zmieniane lub współzmieniane w modelu. Wyznaczone wartości parametrów mogą służyć jako punkt odniesienia lub zestaw kanoniczny dla eksperymentów modelowych. W tych instancjach modelu Ipump oscyluje w trakcie cyklu burstingu wraz z [Na+]i wokół poziomu bazowego. Ipump przyczynia się do zakończenia burstingu podczas fazy burstu, a wywoływana przez nią hiperpolaryzacja aktywuje Ih podczas IBI; zwróć uwagę na maksymalny poziom Ih w pobliżu inicjacji burstu (Rycina 2).
Mimo że model HN w czasie rzeczywistym posiada zaimplementowane wszystkie prądy2,4 dostępne do dynamicznej klamrowania, w niniejszej pracy skupiono się na <img alt="Równanie 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg" /> i <img alt="Równanie 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg" />, które można zmieniać podczas działania modelu w interfejsie graficznym (GUI) dynamic clamp (Rycina 3). Dynamic clamp umożliwia eksperymentatorowi dodanie (lub odjęcie za pomocą ujemnego <img alt="Równanie 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgx.jpg" /> lub <img alt="Równanie 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimx.jpg" />) dowolną konduktancję lub prąd w neuronie w sposób sztuczny, który naśladuje zależność od napięcia i jonów rzeczywistej konduktancji lub prądu. W ten sposób możliwe jest pełne zbadanie, w jaki sposób konkretna konduktancja/prąd oddziałuje z endogennymi konduktancjami/prądami wewnątrz komórek (Rysunek 1). Model HN w czasie rzeczywistym wskazuje, że uporczywy Na+ bieżący (IP) w neuronach HN odpowiada za znaczną część Na+ silny wpływ napływu [Na++]i (Rysunek 2) a tym samym, IpompaPonieważ IP jest aktywny przy stosunkowo ujemnych potencjałach błonowych i przeciwdziała Ipompa nawet podczas IBI.
Obserwacje te wskazują, że pożyteczne jest zbadanie oddziaływań pomiędzy <img alt="Równanie 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimx.jpg" /> a <img alt="Równanie 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg" /> w izolowanych neuronach HN z wykorzystaniem dynamic clamp, zgodnie z wcześniejszymi rozważaniami8,9,10. Eksperymenty te (obecnie w toku) są prowadzone z wykorzystaniem rejestracji mikroelektrodami ostrymi w pojedynczych, synaptycznie izolowanych neuronach HN(7) (siódmy zwoj odcięty od sznura nerwowego). Do tej pory eksperymenty te wykazały, że intensywne serie impulsów (bursting) zostają przywrócone w tonicznie aktywnych neuronach HN (w których penetracja mikroelektrodą spowodowała wprowadzenie prądu przecieku) poprzez jednoczesne dodanie IP i Ipump za pomocą dynamic clamp (Rysunek 4). Jest to istotna obserwacja wskazująca, że w tych neuronach (nawet przy zaburzeniach prądu przecieku) istnieje mechanizm generowania serii impulsów wynikający z oddziaływania Ipump i IP. Wstępne wyniki wskazują na ich silne i złożone oddziaływanie, które można badać w modelu oraz w eksperymentach (Rysunek 5).
Podsumowując, Ipump w odpowiedzi na okresowe wzrosty [Na+]i podczas aktywności seryjnej (bursting) przyczynia się do rytmu serii poprzez zakończenie serii (zmniejszenie BD). Interakcja IP i Ipump stanowi mechanizm wystarczający do podtrzymania endogennej aktywności seryjnej; mechanizm ten może przywrócić stabilne serie w interneuronach HN rejestrowanych wewnątrzkomórkowo w zwoju 7. Interakcja między IP a Ipump poprzez [Na+]i wpływa w sposób niemonotoniczny na okres serii HN i zapewnia stabilność autonomicznego procesu seryjnego. Wnioski te są zgodne z eksperymentami i modelowaniem w systemach kręgowców11,12.
<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61473/61473fig01.jpg" /> 
Rycina 1: Aktywność elektryczna interneuronów serca pijawki oraz implementacja Ipump i IP za pomocą dynamic clamp. (A) Normalna aktywność seryjna (bursting) zarejestrowana jednocześnie zewnątrzkomórkowo (góra) i wewnątrzkomórkowo (dół) w oscylatorze półcentrum (HCO) serca pijawki z trzeciego zwoju; po prawej schemat zarejestrowanych neuronów i ich wzajemnie hamujących połączeń synaptycznych. (B) Schemat dynamic clamp podczas rejestracji interneuronu HN(7) w izolowanym zwoju 7; należy zauważyć brak interakcji synaptycznej między dwoma interneuronami HN(7). (Ci) Aktywność seryjna w interneuronie HN(7) z upośledzoną szczelnością błony (leak-compromised). (Cii) Silniejszą aktywność seryjną można uzyskać poprzez dodanie dynamic clamp Ipump (<img alt="Równanie 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg" />&#160;= 0.1 nA), który rekompensuje przeciek wywołany mikroelektrodą, ale obniża pobudliwość, oraz <img alt="Równanie 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg" /> (1 nS), który zwiększa pobudliwość. Czarne przerywane linie wskazują wartości bazowe. Skróty: HN = interneuron serca; HCO = oscylator półcentrum; Ipump = prąd wychodzący; IP = trwały prąd Na+; <img alt="Równanie 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg" /> = maksymalny prąd pompy Na+/K+; <img alt="Równanie 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg" /> = maksymalna przewodność trwałego prądu Na+; Vm = potencjał błonowy; [Na+]i = wewnątrzkomórkowe stężenie Na+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61473/61473fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61473/61473fig02.jpg" /> 
Rysunek 2: Model pojedynczego interneuronu HN przedstawiający przebiegi potencjału błonowego (Vm), Ih, Ipump, [Na+]i oraz IP. Zewnętrzne prądy hiperpolaryzujące są ujemne, a wewnętrzne prądy depolaryzujące są dodatnie. Czarne przerywane linie wskazują wartości bazowe. Skróty: HN = interneuron serca; Ipump = prąd zewnętrzny; IP = trwały prąd Na+; <img alt="Równanie 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg" /> = maksymalny prąd pompy Na+/K+;&#160;Ih =&#160;wewnętrzny prąd aktywowany hiperpolaryzacją; <img alt="Równanie 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg" /> = maksymalna przewodność trwałego prądu Na+; <img alt="Równanie 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgh.jpg" /> = maksymalna przewodność wewnętrznego prądu aktywowanego hiperpolaryzacją; Vm = potencjał błonowy; [Na+]i = wewnętrzne stężenie Na+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61473/61473fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61473/61473fig03.jpg" /> 
Rycina 3: Graficzny interfejs użytkownika modelu interneuronu serca (HN) w czasie rzeczywistym oraz zacisku dynamicznego (dynamic clamp) zaimplementowanego na płytce cyfrowego przetwarzania sygnałów. Górny lewy róg: czerwone pola Math to pola parametrów określanych przez użytkownika dla modelu w czasie rzeczywistym, natomiast niebieskie pola Live to pola parametrów określanych przez użytkownika stosowane w zacisku dynamicznym. El = potencjał odwrócenia prądu przecieku; Gl = przewodnictwo przecieku; Gh = maksymalne przewodnictwo prądu h; Gp = maksymalne przewodnictwo prądu P; GCaS = maksymalne przewodnictwo wolnego prądu wapniowego; PumpMax = maksymalny prąd pompy; [GSyn2 maksymalne przewodnictwo synaptyczne do odpowiedniego neuronu; ThreshSyn2 próg przekroczenia kolca dla pośredniczenia w potencjale synaptycznym – używane do stworzenia hybrydowego (żywego/modelowego) oscylatora półcentrycznego, który nie jest tutaj przedstawiony.]. Dolny lewy róg dla zacisku dynamicznego. Po lewej stronie znajduje się 5 obliczonych wartości zmiennych zacisku dynamicznego: Ipump = wstrzyknięty prąd pompy; Ih = wstrzyknięty prąd h (tutaj nieużywany); IP = wstrzyknięty prąd P; NaI = obliczone wewnętrzne stężenie Na+; ENa = obliczony potencjał odwrócenia sodu. Dolny lewy róg dla zacisku dynamicznego. Po prawej stronie od zmiennych obliczonych znajduje się 6 pól parametrów określanych przez użytkownika: GNa = przyjęte endogenne maksymalne przewodnictwo szybkiego sodu użyte do obliczenia strumienia Na+ związanego z potencjałami czynnościowymi; PumpMaxL = maksymalny prąd pompy do wstrzyknięcia przez zacisk dynamiczny; Naih patrz równanie (2); Gh = maksymalne przewodnictwo do określenia prądu h do wstrzyknięcia przez zacisk dynamiczny; Gp = przyjęte endogenne maksymalne przewodnictwo prądu P&#160;użyte do obliczenia strumienia Na+ związanego z endogennym prądem P; GpinHNLive = maksymalne przewodnictwo do określenia prądu P do wstrzyknięcia przez zacisk dynamiczny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61473/61473fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61473/61473fig04.jpg" /> 
Rysunek 4: Analiza dynamic clamp niezależnego wyładowywania seryjnego (bursting) HN(7). Zwiększenie <img alt="Równanie 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg" /> z (A) 4.0 nS do (B) 9.0 nS spowalnia rytm niezależnych wyładowań seryjnych HN. Ślady eksperymentalne pokazują rytmiczne wyładowania seryjne w izolowanym neuronie HN(7) z zastosowaniem dynamic clamp. Zakresy oscylacji [Na+]i oraz Vm zwiększają się wraz ze zwiększeniem <img alt="Równanie 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg" />. Ślady od góry do dołu: zarejestrowane Vm, wstrzyknięty Ipump, obliczone [Na+]i oraz wstrzyknięty IP. Czarne przerywane linie wskazują wartości bazowe. Skróty: HN = interneuron serca; Ipump = prąd wychodzący; IP = trwały prąd Na+; <img alt="Równanie 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg" /> = maksymalny prąd pompy Na+/K+; <img alt="Równanie 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg" /> = maksymalna przewodność trwałego prądu Na+; Vm = potencjał błonowy; [Na+]i = wewnątrzkomórkowe stężenie Na+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61473/61473fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61473/61473fig05.jpg" /> 
Rysunek 5: Analiza dynamic clamp niezależnego wyładowywania seryjnego (bursting) neuronu HN(7). Uregulowanie w górę <img alt="Równanie 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg" /> wykazuje tendencję do spadku, po którym następuje wydłużenie okresu wyładowań HN. W poszczególnych eksperymentach (punkty połączone liniami) z wykorzystaniem techniki dynamic clamp, wartości <img alt="Równanie 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg" /> były zmieniane, podczas gdy <img alt="Równanie 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg" /> pozostawało stałe. Kolory reprezentują różne stałe poziomy dodanego <img alt="Równanie 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg" /> zastosowane w różnych eksperymentach. Skróty: HN = interneuron sercowy; <img alt="Równanie 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg" /> = maksymalny prąd pompy Na+/K+; <img alt="Równanie 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg" /> = maksymalna przewodność trwałego prądu Na+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61473/61473fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Przedstawiona tutaj jest metoda badania roli pompy Na+/K+ i stałego prądu Na+ w interneuronach serca pijawek za pomocą dynamicznego zacisku.

Wkład pompy Na+/K+ w rytmiczne pękanie, badany za pomocą modelowania i dynamicznych analiz zacisków

The Na+/K+ pump, often thought of as a background function in neuronal activity, contributes an outward current (Ipump) that responds to the internal ...

Dynamiczne zaciskanie może modyfikować lub wprowadzać dowolny prąd błonowy do neuronu. Wprowadzamy i modyfikujemy pompę sodowo-potasową i stały prąd sodowy do żywego interneuronu serca pijawki. Korzystanie z dynamicznej lampy pozwala na pełną kontrolę za naciśnięciem dynamiki i amplitudy dowolnego prądu wprowadzanego do neuronu w czasie rzeczywistym.Rozwój interaktywnych systemów działających w czasie rzeczywistym, takich jak zacisk dynamiczny, stanowi podstawę wszystkich badań BMI. Wszystkie aspekty badań komórkowych nad aktywnością elektryczną neuronów i sieci mogą potencjalnie skorzystać na zastosowaniu dynamicznego zacisku. Głównymi wyzwaniami związanymi z tą techniką jest opracowanie modeli w czasie rzeczywistym w neuronach i kalibracja dynamicznych regulacji skurczów do neuronu wybranego do badania.W celu wyizolowania ganglionu 7 ze sznura nerwowego pijawki, napełnij czarną żyłkę preparacyjną około jednego centymetra schłodzonego roztworu soli fizjologicznej uzupełnionego chlorkiem sodu, chlorkiem potasu, chlorkiem wapnia, D-glukozą i HEPES w wodzie dejonizowanej i włóż zimną, znieczuloną pijawkę grzbietową stroną do góry w komorze. Użyj mikroskopu stereoskopowego o 20-krotnym powiększeniu z ukośnym oświetleniem światłowodowym i pięciomilimetrowymi nożyczkami sprężynowymi, aby wykonać podłużne cięcie o długości co najmniej trzech centymetrów przez ścianę ciała w trzeciej części ciała. Użyj szpilek, aby rozerwać tkankę ściany ciała, aby odsłonić narządy wewnętrzne i odkurzyć krew, aby uzyskać lepszy widok.Wyizoluj pojedynczy ganglion środkowej części ciała 7. Używając ostrych kleszczy numer pięć, aby pomóc w prowadzeniu cięcia i przytrzymaniu zatoki, użyj nożyczek, aby otworzyć zatokę, w której znajduje się rdzeń nerwowy, uważając, aby rozciąć zatokę grzbietowo i brzusznie. Utrzymując zatokę przyczepioną do każdego z dwóch obustronnych korzeni nerwowych, które wyłaniają się ze zwoju, przetnij rostralne i ogonowe wiązki nerwów łącznych, aby usunąć ganglion z ciała i przeciąć korzenie boczne do miejsca, w którym wyłaniają się z zatoki.Użyj starych, stępionych kleszczy numer pięć, aby zabezpieczyć paski zatok i luźną tkankę za pomocą skróconych szpilek owadów Minutien brzuszną stroną do góry na przezroczystych szalkach Petriego wyłożonych żywicą. Przypnij łączniki rostralne i ogonowe jak najdalej od zwoju i bezpiecznie przypnij korzenie. Zwiększ powiększenie mikroskopu stereoskopowego do 40X lub więcej i dostosuj ukośne oświetlenie tak, aby ciała komórek nerwowych można było łatwo zaobserwować po brzusznej stronie zwoju tuż pod kroczem.Za pomocą mikronożyczek zacznij przecinać luźną osłonę strzałkową między korzeniami po jednej stronie ganglionu, kontynuując cięcie na bok na drugą stronę i upewniając się, że ostrze nożyczek jest powierzchowne, nie uszkadzając ciał komórek nerwowych bezpośrednio pod osłonką. Wykonaj podobne powierzchowne cięcie doogonowo od bocznego cięcia wzdłuż linii środkowej i użyj cienkich kleszczy numer pięć, aby odciągnąć jedną boczną klapę pochewki ogonowej od ganglionu na raz, aby umożliwić wycięcie każdego z nich. Po usunięciu obu płatów oba interneurony serca powinny być odsłonięte.Umieść naczynie w urządzeniu do nagrywania i przelej próbkę solą fizjologiczną przy natężeniu przepływu pięciu mililitrów na minutę w temperaturze pokojowej. Aby zidentyfikować interneurony na konfiguracji nagrywania, wybierz powiększenie od 50 do 100x z oświetleniem ciemnego pola poniżej i zlokalizuj neuron HN 7 pary obustronnej według jego kanonicznej lokalizacji w pozycji tylno-bocznej w zwoju 7 środkowej części ciała. Następnie za pomocą mikromanipulatora umieść ostrą mikroelektrodę wypełnioną dwoma molowymi octanami potasu i 20-milimolową mikroelektrodą chlorku potasu bardzo blisko ciała komórki docelowej i użyj elektrometru neurofizjologicznego do ciągłej obserwacji zarejestrowanego potencjału.Ustaw ten potencjał na zero miliwoltów i penetruj neuron za pomocą mikroelektrody za pomocą manipulatora, aby powoli napędzać elektrodę wzdłuż jej długiej osi. Użyj 100-milisekundowej funkcji brzęczenia elektrometru, aż zaobserwuje się ujemne przesunięcie potencjału błony i energiczną aktywność impulsową. Ustaw elektrometr na co najmniej trzy kiloherce w trybie cęgów nieciągłego prądu, aby jednocześnie rejestrować potencjał błony podczas przekazywania prądu do neuronu.Użyj oscyloskopu, aby monitorować ustawienie elektrody i użyj iniektora o stałym prądzie, aby wstrzyknąć stały prąd o natężeniu minus 0,1 nanoampera przez jedną do dwóch minut, aby ustabilizować nagranie. Neuron HN 7 można rozpoznać po charakterystycznym kształcie kolca i słabej aktywności pękania. Aby uzyskać dynamiczną przewodność cęgową i implementację prądu, otwórz program oprogramowania do dynamicznego cęgowania zbudowany specjalnie dla płytki cyfrowego przetwarzania sygnału.A podczas pracy modelu ustaw maksymalny prąd pompy na 0,1 do 0,2 nanoampera i stopniowo zwiększaj maksymalną przewodność utrzymującego się prądu sodowego, aż nastąpi regularne pękanie. Systematycznie zmieniaj te prądy w krokach co 0,1 nanoampera dla maksymalnej mocy wyjściowej prądu pompy i w przyrostach jednego nanosiemensa dla maksymalnej przewodności stałego prądu sodu i oceń wpływ tych wzrostów na częstotliwość skoków, interwał między impulsami, czas trwania impulsu i okres impulsu. Utrzymuj maksymalną przewodność prądu sodu na określonej ustalonej wartości i przemiataj w krokach co jeden nanoamper w zakresie maksymalnych prądów pompy, aby wspierać regularną aktywność rozrywającą, zanim zwiększysz stałą wartość przewodności sodu o jeden nanosiemens i przemiatasz przez drugi zakres maksymalnych prądów pompy.Dla każdej zaimplementowanej pary parametrów należy zebrać dane zawierające co najmniej osiem serii, aby można było dokonać wiarygodnych średnich pomiarów częstotliwości skoków, interwałów między impulsami, czasu trwania serii i okresu serii. Następnie zbierz dane z kilku dodatkowych neuronów, jak właśnie pokazano, aby wygenerować złożony wykres. Korzystając z tego modelu, prąd pompy wychodzącej oscyluje przez cały cykl impulsu jako wewnętrzne stężenie sodu wokół poziomu podstawowego.Ten prąd pompy przyczynia się do zakończenia impulsu podczas fazy impulsu. Hiperpolaryzacja wytwarzana przez prąd pompy aktywuje hiperpolaryzację aktywowaną prądem wewnętrznym w okresie między wybuchami. Model interneuronów serca w czasie rzeczywistym wskazuje, że utrzymujący się prąd sodu w interneuronach serca przyczynia się do znacznej części wnikania sodu, silnie wpływając na wewnętrzne stężenie sodu, a tym samym na prąd pompy.Ponieważ stały prąd sodowy jest aktywny przy stosunkowo ujemnych potencjałach błonowych, przeciwstawia się prądowi pompy zarówno w przerwach między impulsami, jak i między wybuchami. Jak pokazano na ilustracji, silne pękanie jest przywracane w tonicznie aktywnych interneuronach serca przez dodanie trwałych prądów pompy sodowej i sodowo-potasowej z dynamicznym zaciskiem. Wstępne wyniki wskazują na silną, skomplikowaną interakcję między tymi dwoma prądami, którą można dalej badać za pomocą modelu.Udany eksperyment zależy od dobrego usunięcia osłony ganglionu i starannie ukierunkowanego kierowania, penetracji i brzęczenia mikroelektrody. Rozszerzamy zacisk dynamiczny, wdrażając prąd pompy zależny od sodu, który jest obliczany poprzez oszacowanie wewnątrzkomórkowego stężenia jonu. Takie szacunki można wykorzystać do wstrzyknięcia dowolnego prądu zależnego od jonów do neuronu.

contribution-na-k-pump-to-rhythmic-bursting-explored-with-modeling

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten artykuł wideo ilustruje przygotowanie, procedury łatania ciał komórkowych oraz sposób implementacji dynamicznych zapisów zaciskowych z komórek zwojowych w całych siatkówkach myszy. Technika ta pozwala na zbadanie dokładnego udziału pobudzających i hamujących wejść synaptycznych oraz ich względnej wielkości i czasu na impulsy neuronalne.

Implementacja dynamicznego zacisku z przewodnictwem synaptycznym i sztucznym w komórkach zwojowych siatkówki myszy

Dokładny, oparty na przyczynowości kwantyfikacja globalnej funkcji rozkurczowej została osiągnięta dzięki opartej na modelowaniu kinematycznym analizie przepływu rozkurczowego za pomocą formalizmu Parametryzowanego Wypełnienia Rozkurczowego (PDF). PDF generuje unikalne parametry sztywności, relaksacji i obciążenia oraz wyjaśnia "nową" fizjologię, dostarczając jednocześnie czułych i specyficznych wskaźników dysfunkcji.

Kwantyfikacja globalnej funkcji rozkurczowej za pomocą analizy przepływu transmisyjnego opartej na modelowaniu kinematycznym za pomocą sparametryzowanego formalizmu wypełnienia rozkurczowego

Tutaj zademonstrowany jest nowatorski protokół analizy interesujących regionów, oparty na sortowaniu najlepiej dopasowanych elips przypisanych do regionów pozytywnego sygnału w dwuwymiarowych sekwencjach obrazów poklatkowych. Algorytm ten może umożliwić badaczom kompleksową analizę fizjologicznych sygnałów Ca2 + przy minimalnym wkładzie użytkownika i stronniczości.

Automatyczna analiza dynamicznych sygnałów Ca2+ w sekwencjach obrazów

Szybko-skanująca cykliczna woltamperometria może monitorować in vivo neurotransmisję dopaminy w kontekście leków, chorób i innych eksperymentalnych manipulacji. W niniejszej pracy opisano implementację QNsim1.0, oprogramowania do modelowania elektrycznie stymulowanych odpowiedzi dopaminy zgodnie z ilościowym modelem neurobiologicznym w celu ilościowego oszacowania dynamiki uwalniania i wychwytu zwrotnego dopaminy.

Modelowanie danych szybkiego skanowania woltamperometrii cyklicznej na podstawie elektrycznie stymulowanych danych neurotransmisji dopaminy przy użyciu QNsim1.0

Wewnątrzkomórkowy recykling wapnia odgrywa kluczową rolę w regulacji funkcji skurczowej i rozkurczowej w kardiomiocytach. W tym miejscu opisujemy protokół oceny rezerwy Ca2 + retikulum sarkoplazmatycznego i rozkurczowej funkcji usuwania wapnia w kardiomiocytach za pomocą systemu obrazowania wapnia.

Ocena rezerwy wapniowej retikulum sarkoplazmatycznego i wewnątrzkomórkowego rozkurczowego usuwania wapnia w izolowanych kardiomiocytach komorowych

Zaproponowano szybką i niezawodną technikę kontrolowania oscylacji kształtu pojedynczej, uwięzionej bańki akustycznej, która opiera się na technice koalescencji między dwoma bąbelkami. Oscylacje kształtu pęcherzyków w stanie ustalonym, kontrolowane symetrią umożliwiają analizę przepływu płynu generowanego w pobliżu granicy faz pęcherzyków.

Indukcja mikrostrumieniowania przez niesferyczne oscylacje pęcherzykowe w systemie lewitacji akustycznej

Szybkie rozluźnienie mięśnia sercowego i serca jest niezbędne dla normalnej fizjologii. Obecnie wiadomo, że mechaniczne mechanizmy relaksacji są zależne od szybkości odkształcania. Protokół ten zawiera przegląd pozyskiwania i analizy eksperymentów w celu dalszego badania mechanicznej kontroli relaksacji.

Mechaniczna kontrola relaksacji za pomocą nienaruszonych beleczków serca

Urządzenie do ssania bez składników odżywczych (NNS) może łatwo zbierać i określać ilościowo cechy NNS za pomocą smoczka podłączonego do przetwornika ciśnienia i rejestrowanego przez system akwizycji danych i laptopa. Kwantyfikacja parametrów NNS może dostarczyć cennych informacji na temat obecnego i przyszłego rozwoju neurologicznego dziecka.

Pomiary parametrów ssania nieodżywczego za pomocą niestandardowego systemu przetworników ciśnienia

Protokół ten przedstawia skrzynkę behawioralną opartą na mikrokontrolerze do oceny hamowania przedimpulsowego (PPI) poprzez zbieranie danych o przyspieszeniu z czujnika znajdującego się pod skrzynką. Dane te oceniają deficyty bramkowania sensorycznego u społecznie izolowanych szczurów, z dodatkową metodą synchronizacji danych z aktywnością neuronalną w celu przyspieszenia badań neurofizjologicznych nad zaburzeniami zachowania.

Opracowanie pudełka behawioralnego do oceny hamowania prepulsu i aktywności neuronalnej w psychiatrycznych modelach zwierzęcych

Dynamiczna elektrofizjologia zaciskowa może ustalić związki przyczynowe między deficytami wyładowania neuronów a dysfunkcją kanału jonowego. Opisujemy metody i protokoły dynamicznego zaciskania w myszowych neuronach Purkinjego w móźku, zwracając uwagę na przydatne zasoby i kwestie techniczne. W badaniu reprezentatywnym dodaliśmy modelowaną przewodność sodu do neuronów Tsc1-/- Purkinje, aby zapobiec powtarzalnemu wyładowaniu.

Metody dynamicznego zacisku do badania upośledzonej pobudliwości neuronów związanych z autyzmem

Przedstawiono protokół eksperymentalny do składania, stymulacji elektrycznej i analizy kropli dwuwarstwy lipidowych zmodyfikowanych gramicydyną A. Relacje struktura-funkcja lipidów i białek są ilościowo określane poprzez pomiar zmian w obszarze błony, przepływie jonowym i przewodnictwie pojedynczego kanału oraz odniesienie tych reakcji do zmian przypominających plasticzne zmiany w przewodnictwie jonowym w modelu błony inspirowanym synapsami elektrycznymi.

Charakterystyka struktury i funkcji błony lipidowo-białkowej z wykorzystaniem warstw dwubiegunowych interfejsu kropelkowego

Odkryj rolę pompy Na⁺/K⁺ w rytmicznym pękaniu neuronów serca pijawki przy użyciu techniki dynamicznego zacisku. Ta metoda pozwala badaczom kontrolować prądy jonowe w czasie rzeczywistym.

Wkład pompy Na⁺/K⁺ w rytmiczne pękanie, badany za pomocą modelowania i dynamicznych analiz zacisków

Przeglądaj więcej filmów