Wkład pompy Na⁺/K⁺ w rytmiczne pękanie, badany za pomocą modelowania i dynamicznych analiz zacisków

Dynamiczne zaciskanie może modyfikować lub wprowadzać dowolny prąd błonowy do neuronu. Wprowadzamy i modyfikujemy pompę sodowo-potasową i stały prąd sodowy do żywego interneuronu serca pijawki. Korzystanie z dynamicznej lampy pozwala na pełną kontrolę za naciśnięciem dynamiki i amplitudy dowolnego prądu wprowadzanego do neuronu w czasie rzeczywistym.

Rozwój interaktywnych systemów działających w czasie rzeczywistym, takich jak zacisk dynamiczny, stanowi podstawę wszystkich badań BMI. Wszystkie aspekty badań komórkowych nad aktywnością elektryczną neuronów i sieci mogą potencjalnie skorzystać na zastosowaniu dynamicznego zacisku. Głównymi wyzwaniami związanymi z tą techniką jest opracowanie modeli w czasie rzeczywistym w neuronach i kalibracja dynamicznych regulacji skurczów do neuronu wybranego do badania.

W celu wyizolowania ganglionu 7 ze sznura nerwowego pijawki, napełnij czarną żyłkę preparacyjną około jednego centymetra schłodzonego roztworu soli fizjologicznej uzupełnionego chlorkiem sodu, chlorkiem potasu, chlorkiem wapnia, D-glukozą i HEPES w wodzie dejonizowanej i włóż zimną, znieczuloną pijawkę grzbietową stroną do góry w komorze. Użyj mikroskopu stereoskopowego o 20-krotnym powiększeniu z ukośnym oświetleniem światłowodowym i pięciomilimetrowymi nożyczkami sprężynowymi, aby wykonać podłużne cięcie o długości co najmniej trzech centymetrów przez ścianę ciała w trzeciej części ciała. Użyj szpilek, aby rozerwać tkankę ściany ciała, aby odsłonić narządy wewnętrzne i odkurzyć krew, aby uzyskać lepszy widok.

Wyizoluj pojedynczy ganglion środkowej części ciała 7. Używając ostrych kleszczy numer pięć, aby pomóc w prowadzeniu cięcia i przytrzymaniu zatoki, użyj nożyczek, aby otworzyć zatokę, w której znajduje się rdzeń nerwowy, uważając, aby rozciąć zatokę grzbietowo i brzusznie. Utrzymując zatokę przyczepioną do każdego z dwóch obustronnych korzeni nerwowych, które wyłaniają się ze zwoju, przetnij rostralne i ogonowe wiązki nerwów łącznych, aby usunąć ganglion z ciała i przeciąć korzenie boczne do miejsca, w którym wyłaniają się z zatoki.

Użyj starych, stępionych kleszczy numer pięć, aby zabezpieczyć paski zatok i luźną tkankę za pomocą skróconych szpilek owadów Minutien brzuszną stroną do góry na przezroczystych szalkach Petriego wyłożonych żywicą. Przypnij łączniki rostralne i ogonowe jak najdalej od zwoju i bezpiecznie przypnij korzenie. Zwiększ powiększenie mikroskopu stereoskopowego do 40X lub więcej i dostosuj ukośne oświetlenie tak, aby ciała komórek nerwowych można było łatwo zaobserwować po brzusznej stronie zwoju tuż pod kroczem.

Za pomocą mikronożyczek zacznij przecinać luźną osłonę strzałkową między korzeniami po jednej stronie ganglionu, kontynuując cięcie na bok na drugą stronę i upewniając się, że ostrze nożyczek jest powierzchowne, nie uszkadzając ciał komórek nerwowych bezpośrednio pod osłonką. Wykonaj podobne powierzchowne cięcie doogonowo od bocznego cięcia wzdłuż linii środkowej i użyj cienkich kleszczy numer pięć, aby odciągnąć jedną boczną klapę pochewki ogonowej od ganglionu na raz, aby umożliwić wycięcie każdego z nich. Po usunięciu obu płatów oba interneurony serca powinny być odsłonięte.

Umieść naczynie w urządzeniu do nagrywania i przelej próbkę solą fizjologiczną przy natężeniu przepływu pięciu mililitrów na minutę w temperaturze pokojowej. Aby zidentyfikować interneurony na konfiguracji nagrywania, wybierz powiększenie od 50 do 100x z oświetleniem ciemnego pola poniżej i zlokalizuj neuron HN 7 pary obustronnej według jego kanonicznej lokalizacji w pozycji tylno-bocznej w zwoju 7 środkowej części ciała. Następnie za pomocą mikromanipulatora umieść ostrą mikroelektrodę wypełnioną dwoma molowymi octanami potasu i 20-milimolową mikroelektrodą chlorku potasu bardzo blisko ciała komórki docelowej i użyj elektrometru neurofizjologicznego do ciągłej obserwacji zarejestrowanego potencjału.

Ustaw ten potencjał na zero miliwoltów i penetruj neuron za pomocą mikroelektrody za pomocą manipulatora, aby powoli napędzać elektrodę wzdłuż jej długiej osi. Użyj 100-milisekundowej funkcji brzęczenia elektrometru, aż zaobserwuje się ujemne przesunięcie potencjału błony i energiczną aktywność impulsową. Ustaw elektrometr na co najmniej trzy kiloherce w trybie cęgów nieciągłego prądu, aby jednocześnie rejestrować potencjał błony podczas przekazywania prądu do neuronu.

Użyj oscyloskopu, aby monitorować ustawienie elektrody i użyj iniektora o stałym prądzie, aby wstrzyknąć stały prąd o natężeniu minus 0,1 nanoampera przez jedną do dwóch minut, aby ustabilizować nagranie. Neuron HN 7 można rozpoznać po charakterystycznym kształcie kolca i słabej aktywności pękania. Aby uzyskać dynamiczną przewodność cęgową i implementację prądu, otwórz program oprogramowania do dynamicznego cęgowania zbudowany specjalnie dla płytki cyfrowego przetwarzania sygnału.

A podczas pracy modelu ustaw maksymalny prąd pompy na 0,1 do 0,2 nanoampera i stopniowo zwiększaj maksymalną przewodność utrzymującego się prądu sodowego, aż nastąpi regularne pękanie. Systematycznie zmieniaj te prądy w krokach co 0,1 nanoampera dla maksymalnej mocy wyjściowej prądu pompy i w przyrostach jednego nanosiemensa dla maksymalnej przewodności stałego prądu sodu i oceń wpływ tych wzrostów na częstotliwość skoków, interwał między impulsami, czas trwania impulsu i okres impulsu. Utrzymuj maksymalną przewodność prądu sodu na określonej ustalonej wartości i przemiataj w krokach co jeden nanoamper w zakresie maksymalnych prądów pompy, aby wspierać regularną aktywność rozrywającą, zanim zwiększysz stałą wartość przewodności sodu o jeden nanosiemens i przemiatasz przez drugi zakres maksymalnych prądów pompy.

Dla każdej zaimplementowanej pary parametrów należy zebrać dane zawierające co najmniej osiem serii, aby można było dokonać wiarygodnych średnich pomiarów częstotliwości skoków, interwałów między impulsami, czasu trwania serii i okresu serii. Następnie zbierz dane z kilku dodatkowych neuronów, jak właśnie pokazano, aby wygenerować złożony wykres. Korzystając z tego modelu, prąd pompy wychodzącej oscyluje przez cały cykl impulsu jako wewnętrzne stężenie sodu wokół poziomu podstawowego.

Ten prąd pompy przyczynia się do zakończenia impulsu podczas fazy impulsu. Hiperpolaryzacja wytwarzana przez prąd pompy aktywuje hiperpolaryzację aktywowaną prądem wewnętrznym w okresie między wybuchami. Model interneuronów serca w czasie rzeczywistym wskazuje, że utrzymujący się prąd sodu w interneuronach serca przyczynia się do znacznej części wnikania sodu, silnie wpływając na wewnętrzne stężenie sodu, a tym samym na prąd pompy.

Ponieważ stały prąd sodowy jest aktywny przy stosunkowo ujemnych potencjałach błonowych, przeciwstawia się prądowi pompy zarówno w przerwach między impulsami, jak i między wybuchami. Jak pokazano na ilustracji, silne pękanie jest przywracane w tonicznie aktywnych interneuronach serca przez dodanie trwałych prądów pompy sodowej i sodowo-potasowej z dynamicznym zaciskiem. Wstępne wyniki wskazują na silną, skomplikowaną interakcję między tymi dwoma prądami, którą można dalej badać za pomocą modelu.

Udany eksperyment zależy od dobrego usunięcia osłony ganglionu i starannie ukierunkowanego kierowania, penetracji i brzęczenia mikroelektrody. Rozszerzamy zacisk dynamiczny, wdrażając prąd pompy zależny od sodu, który jest obliczany poprzez oszacowanie wewnątrzkomórkowego stężenia jonu. Takie szacunki można wykorzystać do wstrzyknięcia dowolnego prądu zależnego od jonów do neuronu.