Name: Jednokomórkowy zbiór komórek trofoblastu w zarodkach ludzkich w okresie okołoimplantacyjnym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Poznaj metodę jednokomórkowej analizy trofoblastu w ludzkich zarodkach okołoimplantacyjnych. Technika ta pozwala badać mechanizmy implantacji i wczesnego rozwoju łożyska, przyczyniając się do zrozumienia poronień i niepowodzeń implantacyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować wielu pacjentkom z Colorado Center for Reproductive Medicine (CCRM), którzy łaskawie oddali swoje embriony do badań. Chcielibyśmy również podziękować Karen Maruniak i laboratorium klinicznemu w CCRM za pomoc w przetwarzaniu próbek hCG, a także Sue McCormick i jej klinicznemu zespołowi embriologii IVF w CCRM za pomoc w pobieraniu, przechowywaniu, śledzeniu i dawstwie zarodków. Finansowanie zostało zapewnione wewnętrznie przez CCRM.

Wszystkie ludzkie embriony zostały oddane za zgodą do wykorzystania w badaniach. Protokoły dotyczące rozszerzonej hodowli ludzkich embrionów zostały zatwierdzone przez Zachodnią Instytucjonalną Komisję Rewizyjną (badanie nr 1179872) i są zgodne z międzynarodowymi wytycznymi. Jakiekolwiek wykorzystanie ludzkich embrionów musi zostać zweryfikowane przez odpowiednie organy etyczne i zarządzające związane z instytucją badawczą stosującą niniejszy protokół.
1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę i płytki regeneracyjne na jeden dzień przed ogrzaniem zarodków w sterylnym kapturze z przepływem laminarnym.
	<ol>
		<li>Przygotować 2 ml pożywki do hodowli blastocyst (BM) z 10% v/v substytutem białka surowicy (SPS). 
		UWAGA: Pożywki do hodowli blastocyst mogą, ale nie muszą, zawierać dodatek białka. Tutaj użyliśmy pożywki, którą należy uzupełnić o 10% wskazanego białka albuminowego. Zapoznaj się ze wskazówkami producenta, aby uzyskać informacje na temat zmian w tej suplementacji. Wszystkie podłoża należy przefiltrować za pomocą sterylnego filtra 0,22 μM dołączonego do sterylnej strzykawki przed wyrównaniem.</li>
		<li>Napełnij dwa naczynia do mycia narządów w studzience centralnej 500 μl BM z 10% v/v SPS pokrytym 500 μl oleju do hodowli zarodków.</li>
		<li>W naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 60 mm ułóż warstwę 8 ml oleju z hodowli zarodków, a następnie zakotwicź 20 μl kropli BM z 10% v/v SPS na dnie płytki hodowlanej. Przygotuj 1 kroplę na każdy podgrzany zarodek. 
		UWAGA: W razie potrzeby można przygotować więcej mediów, kropli i umyć naczynia. Krople można również dodawać do potrawy przed nałożeniem warstwami oleju. Zakotwiczenie kropli pod olejem pomoże zmniejszyć parowanie i wszelkie późniejsze zmiany osmolalności.</li>
		<li>Zrównoważyć BM z 10% v/v SPS wash naczynia i płytką odzysku w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 6% CO2, 5% O2 przez co najmniej 4 godziny.</li>
		<li>Rozmrozić jedną fiolkę z pierwszym etapem pożywki o przedłużonej pożywce hodowlanej (IVC1) w temperaturze 4 °C lub na stole laboratoryjnym.</li>
		<li>Przygotuj jedno naczynie do mycia 500 μl IVC1 bez nakładki olejowej. Podwielokrotność porcji około 4 ml IVC1 do probówki z nakrętką zatrzaskową o pojemności 5 ml.</li>
		<li>Równoważyć naczynie do mycia IVC1 i małą rurkę zatrzaskową IVC1 w temperaturze 37 °C, 6% CO2 i atmosferycznym O2 przez co najmniej 4 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj rozszerzone płytki hodowlane na jeden dzień przed ogrzaniem zarodka w sterylnym kapturze z przepływem laminarnym.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć fibronektynę z ludzkiej surowicy w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do 30 μg/ml. Do pokrycia komór potrzeba 250 μl 30 μg/ml fibronektyny na zarodek.</li>
		<li>Otwórz pakiet szkiełek nakrywkowych z 8 studniami pod maską, uważając, aby nie dotknąć studzienek. Delikatnie odpipetować 250 μl 30 μg/ml fibronektyny do każdego dołka.</li>
		<li>Włożyć pokrywkę z powrotem do szkiełka nakrywkowego z komorą i umieścić w temperaturze 4 °C na 20-24 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj przedłużoną płytkę hodowlaną rano po rozgrzaniu zarodka.
	<ol>
		<li>Pobrać szkiełko nakrywkowe z fibronektyną i umieścić w kapturze z przepływem laminarnym. Usunąć mieszaninę fibronektyny za pomocą pipety o pojemności 1 ml i wyrzucić do pojemnika na odpady.</li>
		<li>Pobrać podgrzaną, zrównoważoną pożywkę IVC1 z małej probówki z zatrzaskiem o pojemności 5 ml.</li>
		<li>Odpipetować 300 μl zrównoważonego IVC1 do każdego dołka. Uważaj, aby żaden płyn nie dotknął pokrywy, ponieważ zwiększy to ryzyko zanieczyszczenia.</li>
		<li>Umieścić szkiełko nakrywkowe w komorze z IVC1 do inkubacji w temperaturze 37 °C, 6% CO2 i O2 w atmosferze aż do usunięcia osłonki przejrzystej w kroku 4.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ocieplanie zeszklonych embrionów ludzkich D5
UWAGA: Inni producenci mogą mieć nieco inne protokoły zgodnie z ich własną technologią witryfikacji. W stosownych przypadkach zapoznaj się z instrukcją obsługi producenta.
<ol>
	<li>Podgrzać 3,0 ml roztworu do rozmrażania (TS) w naczyniu o średnicy 35 mm do temperatury 37 °C. Doprowadzić 300 μl roztworu rozcieńczającego (DS) i dwie studzienki po 300 μl roztworu myjącego (WS) na płytce 6-dołkowej do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy ostrożnie zdejmij rękaw urządzenia kriogenicznego, upewniając się, że zeszklony zarodek zawsze pozostaje pod ciekłym azotem.</li>
	<li>Szybko przenieś kriourządzenie z ciekłego azotu i zanurz końcówkę kriourządzenia w TS w temperaturze 37 °C. Ustaw timer na 1 minutę i trzymaj kriourządzenie zanurzone, aż zarodek odłączy się od TS. 
	UWAGA: Ogrzewaj zarodki pojedynczo, aby śledzić tożsamość zarodków, ponieważ mogą one odnosić się do informacji demograficznych pacjenta w dalszej analizie.</li>
	<li>Podczas 1-minutowej inkubacji w TS ostrożnie wyjmij urządzenie kriogeniczne i delikatnie podnieś zarodek i przejdź na przeciwną stronę szalki TS. 
	UWAGA: W przypadku hodowli wielu zarodków należy dołożyć wszelkich starań, aby zachować zarodki oddzielnie, aby zapewnić zachowanie właściwej tożsamości.</li>
	<li>Po 1 minucie delikatnie nabierz zarodek z niewielką ilością TS, około 2 μl. Przenieś zarodek na dno studzienki 300 μl DS, pokrywając zarodek cienką warstwą TS z pipety. Ustaw minutnik na 3 minuty i umieść 6-dołkową płytkę na blacie stołu w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po 3 minutach pobrać zarodek z niewielką ilością DS, około 2 μl, i przenieść zarodek na dno następnego dołka zawierającego 300 μl WS. Ponownie delikatnie nanieść niewielką ilość DS z pipety na zarodek. Ustaw minutnik na 5 minut i wróć na blat.</li>
	<li>Po 5 minutach pobrać zarodek z minimalną objętością WS i przenieść do górnej części ostatniej studzienki o pojemności 300 μL WS. Zarodek powoli opadnie i przemyje się przez WS na dno. Usunąć resztki WS z pipety do pustego dołka.</li>
	<li>Zebrać zarodek o minimalnej objętości i powrócić do górnej części tego samego dołka WS o pojemności 300 μl. Zarodek po raz kolejny spadnie na dno studni. Ustaw minutnik na 1 minutę i umieść 6-dołkową płytkę na blacie stołu.</li>
</ol>
3. Odzyskiwanie ogrzanych zarodków
<ol>
	<li>Pojedynczo przenieś podgrzane zarodki do naczynia na tkanki narządowe z centralną studzienką zawierającą 500 μl zrównoważonego BM z 10% v/v SPS pod 500 μl zrównoważonego oleju do hodowli zarodków.</li>
	<li>Umyj zarodki, podnosząc każdy zarodek i przenosząc je do kilku miejsc w naczyniu, jednocześnie wydmuchując stare media między ruchami. Weź zarodek i przenieś go do pojedynczej kropli hodowlanej o pojemności 20 μl zrównoważonego BM z 10% v/v SPS pod olejem.</li>
	<li>Pozostawić ogrzane zarodki do regeneracji przez 2 godziny w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 6% CO2 i 5% O2 .</li>
</ol>
4. Usuwanie Zona
<ol>
	<li>Po 2 godzinach rekonwalescencji oceń zarodki pod kątem ponownej ekspansji i zrób zdjęcia każdego zarodka.</li>
	<li>Przenieść zarodki pojedynczo w 500 μl pożywki buforowanej kwasem 3-(N-morfolino)-propanosulfonowym (MOPS) z 5% (v/v) płodową surowicą cielęcą (FCS) przed poddaniem działaniu kwaśnego roztworu Tyrode.</li>
	<li>Przenieś szybko jeden zarodek przez 300 μl podgrzanego kwaśnego roztworu Tyrode'a, aktywnie obserwując przez mikroskop. Osłonka przejrzysta wizualnie zacznie się rozpuszczać. Zajmie to około 5 sekund.</li>
	<li>Natychmiast przenieś zarodek z rozpuszczoną strefą do 300 μl podgrzanego buforowanego podłoża MOPS, aby ugasić kwaśny roztwór Tyrode'a.</li>
	<li>Przenieść zarodek z minimalną objętością buforowanej pożywki MOPS do naczynia na tkanki narządowe z dołkiem centralnym zawierającego 500 μl zrównoważonego BM z 10% v/v SPS pod 500 μl zbilansowanego oleju do hodowli zarodków do przemycia.</li>
	<li>Przywróć zarodek do kropli regeneracyjnej 20 μl z kroku 3.2. 
	UWAGA: Po oględzinach po usunięciu zoni, wszelkie zarodki z zatrzymanymi osłonkami przejrzystymi mogą być w razie potrzeby poddawane dalszemu leczeniu kwaśnym roztworem Tyrode, powtarzając kroki 4.2-4.6. Pożądane jest zminimalizowanie narażenia na roztwór Tyrode.</li>
</ol>
5. Rozszerzona hodowla blastocysty
<ol>
	<li>Przenieś zarodki pojedynczo do naczynia do mycia ze zrównoważonym podłożem IVC1 z kroku 1.1.6. Ostrożnie przenieść jeden zarodek do jednego dołka w komorze szkiełka nakrywkowego ze zrównoważonym IVC1 i zachować identyfikację zarodka. 
	UWAGA: Ten krok należy zakończyć tak szybko, jak to możliwe, aby zminimalizować parowanie medium.</li>
	<li>Szkiełko nakrywkowe z komorą należy umieścić w inkubatorze nastawionym na 37 °C, 6% CO2 i atmosferycznymO2 na 2 dni. 
	UWAGA: Należy pamiętać o rozmrożeniu i zrównoważeniu mediów w temperaturze 37 °C, 6% CO2 i temperaturze atmosferycznej O2 dla wymiany mediów 4 godziny wcześniej.</li>
	<li>Przy wyrastaniu D2 (D7 po zapłodnieniu) dokładnie zbadaj przyczepienie zarodków pod mikroskopem i dokonaj wymiany pożywki.
	<ol>
		<li>Zwróć uwagę, który zarodek jest przyczepiony do naczynia przed wymianą pożywki. Delikatnie postukaj w płytkę i sprawdź, czy zarodek bezpiecznie przyczepił się do płytki pod mikroskopem.</li>
		<li>Zdejmij pokrywkę i ostrożnie wyjmij 150 μl IVC1 i wyrzuć, nie naruszając przyczepionego zarodka. Jeśli zarodek nie przyczepił się jeszcze do płytki, nie należy wymieniać pożywki, ponieważ surowica zawarta w IVC1 pomoże w przyczepieniu zarodka.</li>
		<li>Powoli odpipetować 150 μl zrównoważonych rozszerzonych pożywek hodowlanych, IVC2, do każdej studzienki i umieścić pokrywkę z powrotem w komorze na szkiełku nakrywkowym. 
		UWAGA: Upewnij się, że zdejmowanie pokrywki z komory szkiełka nakrywkowego jest zminimalizowane, aby uniknąć parowania medium.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ostrożnie włóż szkiełko nakrywkowe z komorą do inkubatora, nie rozpryskując żadnych pożywek na pokrywę. Powtarzaj wymianę pożywki i kontrolę przyłączenia każdego dnia rozszerzonej hodowli, aż zarodki będą gotowe do utrwalenia lub trawienia pojedynczych komórek.</li>
</ol>
6. Opcjonalna kolekcja zużytych nośników
<ol>
	<li>Opcjonalnie należy zebrać zużyte pożywki podczas wymiany pożywek hodowlanych po D7 lub dowolnego dnia po nim. W kroku 5.3.2, zamiast wyrzucać pożywkę, należy zamrozić 150 μl usuniętego IVC1 w sterylnej probówce o niskiej zawartości wiązania 0,5 ml do przyszłej analizy.</li>
</ol>
7. Opcjonalna fiksacja dla immunofluorescencji
<ol>
	<li>Użyj pipety o pojemności 200 μl, aby przemyć zarodki za pomocą 1/2 pożywki wymiany PBS przez 3x przed utrwaleniem, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia zewnątrzkomórkowe. Wypłukanie nadmiaru zanieczyszczeń i białka pomoże zoptymalizować klarowność i zmniejszyć tło na obrazach uzyskanych za pomocą immunofluorescencji.</li>
	<li>Usuń wszystkie podłoża i powoli dodaj 200 μl 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS do studzienki. Zarodek będzie chciał przykleić się do powierzchni płynu. Wielokrotne płukanie 150 μl z 4% PFA przed usunięciem całego płynu pomoże zminimalizować wszelkie uszkodzenia zarodka.</li>
	<li>Inkubować zarodki w 4% PFA przez 20 minut w celu utrwalenia.</li>
	<li>Myj zarodki 3x przez 10 minut na mycie 200 μl 0,1% v/v polisorbatu 20 w świeżym PBS.</li>
	<li>Utrwalone zarodki należy przechowywać w 0,1% v/v polisorbat 20 w PBS w temperaturze 4 °C przed przystąpieniem do protokołu immunofluorescencji.</li>
</ol>
8. Trawienie jednokomórkowe za pomocą trypsyny
UWAGA: Świeże (nie stałe) zarodki są używane do trawienia pojedynczych komórek.
<ol>
	<li>Umyj zarodek raz 200 μl PBS i dodaj 200 μl roztworu trypsyny do każdego dołka. Umieścić szkiełko nakrywkowe z komorą z powrotem w inkubatorze na 5 minut.</li>
	<li>Wyjąć szkiełko nakrywkowe z komorą z inkubatora i zbadać zarodki pod stereoskopem. Komórki na obrzeżach zarodka zaczną się wycofywać, a MTB powinien być nadal przymocowany do płytki, w miejscu, w którym znajdują się w odległości od zarodka.</li>
	<li>Użyj małej pipety lub drobno wyciągniętej pipety doustnej, aby pobrać pojedynczy MTB przed rozbiciem całego zarodka. Przejdź od razu do kroku 9.1, aby zapisać MTB i wróć do kroku 8.4 po kroku 9.3.</li>
	<li>Użyj ręcznej pipety do mikromanipulacji lub pipety doustnej, aby delikatnie oddzielić zarodek poprzez zasysanie w górę iw dół.</li>
	<li>Komórki zaczną oddzielać się od całego zarodka. Kontynuuj delikatne i wielokrotne odsysanie zarodka za pomocą końcówki pipety o mniejszej średnicy lub pipety doustnej, aż zarodek będzie inkubowany w trypsynie przez łącznie 10 minut.</li>
</ol>
9. Wybór pojedynczej komórki i pobieranie próbek
<ol>
	<li>Przy minimalnej ilości trypsyny przenieś zdysocjowane komórki przez trzy krople do płukania po 20 μl PBS + 0,1% poliwinylopirolidonu (PVP) pod olejem z hodowli zarodków, uważając, aby nie stracić żadnych komórek.</li>
	<li>Po umyciu komórek użyj drobno wyciągniętej szklanej pipety, aby wybrać jedną komórkę. Ostrożnie odpipetuj pojedynczą komórkę do sterylnej probówki o pojemności 0,2 ml o niskim poziomie wiązania i minimalnej objętości PBS+0,1% PVP.</li>
	<li>Szybkie zamrażanie pojedynczych komórek w ciekłym azocie (LN2) i przechowywanie w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.</li>
</ol>

<ol><li>Carter, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+placentation--a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Animal models of human placentation--a review.</a> Placenta. , Suppl A 41-47 (2007).</li>
<li>Carter, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+placentation+and+animal+models%3A+patterns+of+trophoblast+invasion+--+a+workshop+report%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion -- a workshop report.</a> Placenta. 27, 30-33 (2006).</li>
<li>Pijnenborg, R., Robertson, W. B., Brosens, I., Dixon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+article%3A+trophoblast+invasion+and+the+establishment+of+haemochorial+placentation+in+man+and+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Review article: trophoblast invasion and the establishment of haemochorial placentation in man and laboratory animals.</a> Placenta. 2, 71-91 (1981).</li>
<li>Edwards, R. G., Bavister, B. D., Steptoe, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+stages+of+fertilization+in+vitro+of+human+oocytes+matured+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Early stages of fertilization in vitro of human oocytes matured in vitro.</a> Nature. 221 (5181), 632-635 (1969).</li>
<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li>
<li>O'Leary, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+progression+of+the+human+inner+cell+mass+during+embryonic+stem+cell+derivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Tracking the progression of the human inner cell mass during embryonic stem cell derivation.</a> Nature Biotechnology. 30 (3), 278-282 (2012).</li>
<li>O'Leary, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+using+a+post-inner+cell+mass+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Derivation of human embryonic stem cells using a post-inner cell mass intermediate.</a> Nature Protocols. 8 (2), 254-264 (2013).</li>
<li>Shahbazi, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+the+human+embryo+in+the+absence+of+maternal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues.</a> Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).</li>
<li>Deglincerti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+the+in+vitro+attached+human+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organization of the in vitro attached human embryo.</a> Nature. 533 (7602), 251-254 (2016).</li>
<li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+the+transcriptome+and+DNA+methylome+landscapes+of+human+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation.</a> Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).</li>
<li>Lv, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+RNA+sequencing+reveals+regulatory+mechanism+or+trophoblast+cell-fate+divergence+in+human+peri-implantation+conceptuses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Single cell RNA sequencing reveals regulatory mechanism or trophoblast cell-fate divergence in human peri-implantation conceptuses.</a> PLoS Biology. 17 (10), 3000187(2019).</li>
<li>West, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+trophoblast+differentiation+in+peri-implantation-stage+human+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Nationals+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dynamics of trophoblast differentiation in peri-implantation-stage human embryos.</a> Proceedings of the Nationals Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22635-22644 (2019).</li>
<li>Xiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+landscape+of+3D-cultured+human+pre-gastrulation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos.</a> Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).</li>
<li>Mall, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Report+upon+the+collection+of+human+embryos+at+the+johns+hopkins+university%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Report upon the collection of human embryos at the johns hopkins university.</a> The Anatomical Record. 5 (7), 343-357 (1911).</li>
<li>Buettner, K. A. Franklin Paine Mall (1862-1917). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuettner%2C+KA+%22Embryo+Project+Encyclopedia%22">Embryo Project Encyclopedia</a>. , (2007).</li>
<li>Carnegie Institution of Washington. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Contributions+to+embryology%22">Contributions to embryology</a>. , Carnegie Institution of Washington. Washington, D.C. (1915).</li>
<li>Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+description+of+34+human+ova+within+the+first+17+days+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">A description of 34 human ova within the first 17 days of development.</a> American Journal of Anatomy. 98 (3), 435-493 (1956).</li>
<li>Logsdon, D. M., Ermisch, A. F., Kile, R., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egg+cylinder+development+during+in+vitro+extended+embryo+culture+predicts+the+post+transfer+developmental+potential+of+mouse+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Assisted+Reproduction+and+Genetics%22%5BJournal%5D)">Egg cylinder development during in vitro extended embryo culture predicts the post transfer developmental potential of mouse blastocysts.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (4), 747-752 (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opracowanie protokołu hodowli ludzkich embrionów poprzez implantację pozwoliło naukowcom na zbadanie wcześniej niezbadanego okresu rozwoju 8,9. W tym przypadku używamy rozszerzonego systemu hodowli do hodowli ludzkich embrionów i badamy wczesne różnicowanie trofoblastów przed utworzeniem kosmkowego łożyska. Opisane tutaj metody pozwalają nam zebrać różne podlinie gruźlicy do wykorzystania w dalszej analizie pojedynczych komórek. Prace te dają społeczności naukowe...

Ludzka implantacja i pojawienie się wczesnego łożyska są historycznie trudne do zbadania i pozostają w dużej mierze nieznane, ponieważ ludzkie tkanki są niedostępne na tym etapie, kiedy ciąża jest klinicznie niewykrywalna. Modele zwierzęce są nieodpowiednie, ponieważ ludzkie łożysko ma swoje unikalne cechy w porównaniu z innymi ssakami eutheriańskimi. Na przykład ludzkie łożysko wnika głęboko w decidua, a niektóre komórki trofoblastu docierają co najmniej do wewnętrznej jednej trzeciej mięśniówki macicy, podczas gdy inne komórki przebudowują tętnice spiralne macicy. Nawet nasi najbliżsi ewolucyjni przodkowie, naczelne inne niż ludzie, wykazują różnice w morfologii łożyska i interakcjach trofoblastu z matczynymi tkankami dziesiętnymi1,2,3. Uzyskanie przedimplantacyjnych ludzkich embrionów in vitro nie było możliwe aż do lat 80-tych, kiedy kliniczne zapłodnienie in vitro (IVF) zaczęło być rutynową praktyką leczenia niepłodności4. Obecnie ludzkie blastocysty mogą być hodowane in vitro, aby umożliwić selekcję bardziej żywotnych zarodków do transferu, a także umożliwić bezpieczne badania genetyczne. Udoskonalenie technik hodowli zarodków, a także coraz powszechniejsze stosowanie zapłodnienia in vitro zaowocowało wieloma nadwyżkami blastocyst, które pozostają po zakończeniu cykli leczenia pacjenta. Za zgodą pacjenta, zgodą IRB i z pewnymi ograniczeniami, te blastocysty mogą być wykorzystywane do badań naukowych. Stały się one nieocenionym zasobem, który został wykorzystany do wyprowadzenia ludzkich embrionalnych komórek macierzystych5, zrozumienie przejścia wewnętrznej masy komórkowej do embrionalnych komórek macierzystych6,7, a ostatnio zostały z powodzeniem wyhodowane do dnia (D) 13 w celu przebudowy ludzkiej implantacji8,9. Wykorzystując niedawno opracowane metody omiki pojedynczych komórek, dostęp do tkanek ludzkich embrionów w stadium implantacji dał unikalne możliwości opisania mechanizmów molekularnych, które regulują ten wysoce dynamiczny proces różnicowania komórek, które wcześniej były niemożliwe do zbadania10,11,12,13.
Tutaj opisujemy metody użyte w naszej ostatniej publikacji charakteryzującej dynamikę różnicowania trofoblastów podczas implantacji u ludzi12. Protokół ten obejmuje ogrzewanie zeszklonych blastocyst, rozszerzoną hodowlę zarodków do D12 po IVF, trawienie enzymatyczne zarodka na pojedyncze komórki oraz pobieranie komórek do dalszych testów (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1). Ten rozszerzony system hodowli wspiera rozwój ludzkiego zarodka w fazie okołoimplantacyjnej bez udziału matki i podsumowuje różnicowanie trofoblastów, które wydaje się zgodne z obserwacjami poczynionymi na podstawie próbek histologicznych wiele lat temu14,15,16,17. Podczas implantacji populacja trofoblastów składa się z co najmniej dwóch typów komórek: monojądrowego cytotrofoblastu progenitorowego (CTB) i terminalnie zróżnicowanego, wielojądrowego syncytiotrofoblastu (STB). Po trawieniu trypsyny CTB są małymi, okrągłymi komórkami, które są morfologicznie nie do odróżnienia od innych linii komórkowych (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A, lewy panel). Oddzielenie CTB od innych linii komórkowych, takich jak epiblast i pierwotna endoderma, można osiągnąć dzięki ich odrębnym profilom transkryptomicznym ujawnionym przez sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki. Komórki syncytiotrofoblastu można łatwo zidentyfikować jako struktury o nieregularnych kształtach, które są znacznie większe niż inne typy komórek i znajdują się głównie na obrzeżach zarodka (<silna klasa="xfig">Ryc. 2A, środkowy panel; <silna klasa="xfig">Rysunek 2B, lewy panel). Migrujące komórki trofoblastu (MTB) to kolejna podlinia trofoblastu znaleziona podczas rozszerzonej hodowli zarodka i może być rozpoznana jako pozornie oddalająca się od głównego ciała zarodka (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A, prawy panel, <silna klasa = "xfig" >Figura 2B, prawy panel). Trofoblast wędrowny, mimo że wykazuje ekspresję wielu tych samych markerów, co trofoblast kosmkowy (EVT), nie powinien być określany jako EVT, ponieważ struktury kosmkowe w łożysku nie pojawiły się na tym bardzo wczesnym etapie rozwoju.
Eksperymentalnie, udało nam się zebrać małe CTB i duże STB, które są łatwo rozróżnialne po strawieniu zarodków na pojedyncze komórki w D8, D10 i D12 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A,B). Trofoblasty wędrowne powstają w późniejszych stadiach rozszerzonej hodowli zarodków i mogą być zebrane w D12 przed enzymatycznym trawieniem całego zarodka (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A,B). Poprzez fenotypowe oddzielenie tych trzech podlinii trofoblastu przed analizą pojedynczych komórek, możemy zidentyfikować specyficzne markery transkryptomiczne i określić biologiczną rolę każdego typu komórki. Cytotrofoblast jest wysoce proliferacyjny i działa jako komórki progenitorowe w zaopatrywaniu zróżnicowanych linii STB i MTB10,11,12,13. Syncytiotrofoblast bierze udział w produkcji hormonów łożyskowych w celu utrzymania ciąży i może być również odpowiedzialny za zarodki zagrzebujące się w błonie śluzowej macicy10,11,12,13. Trofoblast wędrowny ma jeszcze silniejsze cechy inwazyjnego, migrującego fenotypu i prawdopodobnie jest odpowiedzialny za głębszą i bardziej rozległą kolonizację endometrium macicy10,11,12,13. Po zdefiniowaniu sygnatury transkryptomicznej każdego typu komórki, analizy grupowania ujawniły również dwa dodatkowe podzbiory komórek, które były morfologicznie nie do odróżnienia od CTB i miały transkryptomy o cechach odpowiednio STB i MTB12. Te komórki w stadium pośrednim są prawdopodobnie w procesie różnicowania się od CTB do podlinii MTB lub STB i zostałyby pominięte, gdyby zarodki były trawione na ślepo, a komórki były rozdzielane przez sam transkryptom.
Opisany tutaj protokół wykorzystuje dwuwymiarowy (2D) system hodowli i może nie być optymalny do wspierania trójwymiarowego (3D) rozwoju strukturalnego, jak sugeruje niedawna publikacja opisująca nowo opracowany system hodowli 3D13. Niemniej jednak w tym systemie 2D zróżnicowanie wczesnego trofoblastu wydaje się być zgodne z obserwacjami poczynionymi na podstawie próbek in vivo14,15,16,17. Protokół ten może być również łatwo zaadaptowany do użycia w niedawno opisanym systemie hodowli 3D13 przy minimalnych zmianach. Wszystkie kroki wykonuje się za pomocą ręcznej pipety do mikromanipulacji z dostępnymi w handlu jednorazowymi końcówkami lub pipety doustnej z drobno wyciągniętej szklanej pipety przymocowanej do gumowej rurki, filtra i ustnika.

<table><tbody><tr><td>Sterylna strzykawka NORM JECT Luer Lock</td><td>VWR</td><td>53548-019</td><td>Opakowanie 100</td></tr><tr><td>inkubatorów CO2 z płaszczem wodnym 3130 lub 3110 Forma Series II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-998-078</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Naczynie do hodowli tkankowych Corning Primaria</td><td>VWR</td><td>62406-038</td><td>Opakowanie 500</td></tr><tr><td>probówek zatrzaskowych 5 ml</td><td>VWR</td><td>60819-295</td><td>Opakowanie 25</td></tr><tr><td>60 mm tkanek Corning Primaria naczynie hodowlane</td><td>VWR</td><td>25382-687</td><td>Etui na 200</td></tr><tr><td>6-dołkowych naczyń</td><td>Agtech Inc.</td><td>D18</td><td>Opakowanie zawierające 1, 10 lub 50</td></tr><tr><td>kwaśnych roztworów Tyrode'a</td><td>Millipore Sigma</td><td>T1788</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Biotix 1250 &micro; L końcówki do pipet</td><td>VWR</td><td>76322-156</td><td>Zestaw 960</td></tr><tr><td>Blast, pożywka do hodowli blastocyst</td><td>Origio</td><td>83060010</td><td>10 ml</td></tr><tr><td>roztworu do rozcieńczania</td><td>Kitazato</td><td>VT802</td><td>1 x 4 ml</td></tr><tr><td>Jednorazowe pipety Pasteura ze szkła borokrzemianowego</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1367820D</td><td>5,75 cala. (146 mm); 720/Cs</td></tr><tr><td>Dulbecco's Sulbecco's Phosphate Buffered Saline</td><td>Millipore Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Olej parafinowy do hodowli zarodków OvOil</td><td>Vitrolife</td><td>10029</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>probówki Eppendorf PCR 0,2 ml</td><td>VWR</td><td>47730-598</td><td>Opakowanie 1 000</td></tr><tr><td>probówek Eppendorf PCR 0,5 ml</td><td>VWR</td><td>89130-980</td><td>Opakowanie 500</td></tr><tr><td>Fibronectin z ludzkiego osocza. Płynny roztwór .1%</td><td>Millipore Sigma</td><td>F0895</td><td>1</td></tr><tr><td>mg Gilson 1 ml Pipeta</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F123602G</td><td>1 Pipeta 200-1000 &mikro; L</td></tr><tr><td>Gilson 20 i mikro; L Pipeta</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F123602G</td><td>1 Pipeta 2-20 & mikro; L</td></tr><tr><td>Gilson 200 & mikro; L Pipeta</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F123602G</td><td>1 Pipeta 50-200 &mikro; L</td></tr><tr><td>G-MOPS Podłoża manipulacyjne</td><td>Vitrolife</td><td>10129</td><td>125 ml</td></tr><tr><td>Podłoża manipulacyjne</td><td>Origio</td><td>83100060</td><td>60 ml</td></tr><tr><td>Ibidi 8 dobrze komorowe szkiełko nakrywkowe</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>15 szkiełek w pudełku</td></tr><tr><td>IVC1/IVC2</td><td>Systemy naprowadzania komórek</td><td>M11-25/ M12-25</td><td>5-5 ml podwielokrotności</td></tr><tr><td>K System T47 Płyta grzewcza</td><td>Cooper Surgical</td><td>23054</td><td></td></tr><tr><td>MilliporeSigma Millex Sterylne filtry strzykawkowe z membraną Durapore PVFD</td><td>Fisher Scientific SLGVR33RS</td><td></td><td>Zestaw 50</td></tr><tr><td>ustników</td><td>Sklep IVF</td><td>MP-001-Y</td><td>100 sztuk</td></tr><tr><td>Miska ze studnią środkową Oosafe</td><td></td><td>OOPW-CW05-1</td><td>Etui 500</td></tr><tr><td>Quinn's Advantage SPS</td><td>Origio</td><td>ART-3010</td><td>12x 12 mL</td></tr><tr><td>Gumowa rurka lateksowa do ustników</td><td>Sklep IVF</td><td>IVFS-NRL-B-5</td><td>5 stóp</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Nikon</td><td>SMZ1270</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do ściągania izolacji</td><td>Cooper Surgical</td><td>MXL3-275</td><td>20/pk 275 &micro; </td></tr><tr><td>m Roztwór do rozmrażania</td><td>Kitazato</td><td>VT802</td><td>2 x 4 ml</td></tr><tr><td>Mikropipeter do strippingu</td><td>Cooper Surgical</td><td>MXL3-STR</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1X), bez czerwieni fenolowej</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12604013</td><td>1 x 100 ml</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1379-25ML</td><td>Butelka 25 ml</td></tr><tr><td>VWR 1-20 &micro; L Końcówki do pipet</td><td>VWR</td><td>76322-134</td><td>Zestaw 960</td></tr><tr><td>VWR 1-200 &micro; L końcówki do pipet</td><td>VWR</td><td>89174-526</td><td>Opakowanie 960 roztworu</td></tr><tr><td>myjącego</td><td>Kitazato</td><td>VT802</td><td>1 x 4 ml</td></tr></tbody></table>

jednokomórkowy zbiór komórek trofoblastu w zarodkach ludzkich w okresie okołoimplantacyjnym

Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos

Ludzka implantacja, przyleganie i przyleganie do nabłonka powierzchni macicy, a następnie inwazja blastocysty do matczynego decidua, jest krytycznym, ale enigmatycznym wydarzeniem biologicznym, które było historycznie trudne do zbadania ze względu na ograniczenia techniczne i etyczne. Zagnieżdżenie jest inicjowane przez rozwój trofektodermy do wczesnego trofoblastu, a następnie różnicowanie się w odrębne podlinie trofoblastu. Nieprawidłowe wczesne różnicowanie trofoblastów może prowadzić do niepowodzenia implantacji, patologii łożyska, nieprawidłowości płodu i poronienia. Ostatnio opracowano metody, które pozwalają ludzkim embrionom rosnąć do 13 dnia po zapłodnieniu in vitro przy braku tkanek matczynych, czyli w okresie obejmującym okres implantacji u ludzi. Dało to naukowcom możliwość zbadania implantacji u ludzi i podsumowania dynamiki różnicowania trofoblastów w tym krytycznym okresie bez zakłócania wpływów matczynych i unikania nieodłącznych przeszkód w badaniu wczesnych zdarzeń różnicowania zarodków in vivo. Aby scharakteryzować różne podlinie trofoblastu podczas implantacji, przyjęliśmy istniejące dwuwymiarowe (2D) metody rozszerzonej hodowli i opracowaliśmy procedurę enzymatycznego trawienia i izolowania różnych typów komórek trofoblastu do dalszych testów. Zarodki hodowane w warunkach 2D mają stosunkowo spłaszczoną morfologię i mogą być nieoptymalne w modelowaniu in vivo trójwymiarowych (3D) architektur embrionalnych. Wydaje się jednak, że różnicowanie trofoblastów jest mniej zaburzone, o czym świadczą przewidywane zmiany morfologii i ekspresji genów w trakcie rozszerzonej hodowli. Różne podlinie trofoblastu, w tym cytotrofoblast, syncytiotrofoblast i trofoblast wędrowny, można rozdzielić według wielkości, lokalizacji i czasowego pojawienia się i wykorzystać do dalszej charakterystyki lub eksperymentów. Badania tych wczesnych komórek trofoblastu mogą być pomocne w zrozumieniu implantacji u ludzi, leczeniu powszechnych patologii łożyska i łagodzeniu częstości utraty ciąży.

Zdrowe zarodki wykazywały ciągłą proliferację w trakcie przedłużonej hodowli (Rysunek 2B). Zarodki nieprawidłowe zaczęły kurczyć się od zewnętrznych krawędzi i ulegać dezintegracji (Rysunek 2C). Z naszego doświadczenia wynika, że około 75% zarodków przytwierdziło się do dna naczynia pokrytego fibronektyną po 48 h, a stopień przytwierdzenia wzrósł do około 90% do 72 h hodowli. Na sukces przytwierdzenia zarodków może w dużej mierze wpływać początkowa jakość blasto...

Tutaj opisujemy metodę ogrzewania zeszklonych ludzkich blastocyst, hodowli ich przez okres implantacji in vitro, trawienia ich do pojedynczych komórek i zbierania wczesnych komórek trofoblastu do dalszych badań.

Jednokomórkowy zbiór komórek trofoblastu w zarodkach ludzkich w okresie okołoimplantacyjnym

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a ...

Wiele ciąż kończy się niepowodzeniem na wczesnym etapie rozwoju ludzkiego embrionu, około siódmego lub ósmego roku życia po zapłodnieniu. Protokół ten daje badaczom możliwość hodowania ludzkich koncepcji in vitro podczas tego tajemniczego okna implantacji. Pozwala nam to zrozumieć mechanizmy, które leżą u podstaw sukcesu implantacji u człowieka i wczesnego tworzenia się łożyska.Wykorzystanie rozszerzonego systemu hodowli do hodowli ludzkich embrionów in vitro w fazie okołoimplantacyjnej jest prawdopodobnie jedynym sposobem na uzyskanie autentycznych materiałów do badania implantacji i wczesnego różnicowania trofoblastów. Ta prosta technika jest potężnym narzędziem, które pozwala nam odpowiedzieć na wiele fundamentalnych pytań dotyczących wczesnego rozwoju człowieka. Badania prowadzone z wykorzystaniem tego protokołu w dużej mierze przyczynią się do zrozumienia zjawiska wczesnej utraty ciąży, nawracających niepowodzeń implantacyjnych oraz patologii łożyska.Procedurę zademonstruje Deirdre Logsdon, doktorantka z laboratorium. Na dzień przed ociepleniem zarodków należy przygotować pożywkę i płytki regeneracyjne w sterylnym kapturze z przepływem laminarnym. Napełnij dwie naczynia do mycia narządów w środkowej studzience 500 mikrolitrami BM z 10% SPS, a następnie przykryj BM 500 mikrolitrami oleju do hodowli zarodków.W 16-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowej ułóż osiem mililitrów oleju z hodowli zarodków i zakotwicź 20 mikrolitrowych kropli BM z 10% SPS na dnie. Umyte naczynia i płytkę regeneracyjną należy zrównoważyć w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 6% dwutlenku węgla i 5% tlenu przez co najmniej cztery godziny. Porcję około czterech mililitrów IVC 1 do pięciomililitrowej tubki z zatrzaskiem i przygotowanie jednego naczynia do mycia z 500 mikrolitrami IVC 1 bez nakładki olejowej.Utrzymuj szalkę i rurkę w inkubatorze przez co najmniej cztery godziny. Rozcieńczyć fibronektynę z ludzkiej surowicy w PBS do 30 mikrogramów na mililitr. Otwórz opakowanie szkiełek nakrywkowych z ośmioma studniami, uważając, aby nie dotknąć studzienek, a następnie delikatnie odpipetuj 250 mikrolitrów fibronektyny do każdej studzienki.Załóż pokrywkę na szkiełko nakrywkowe i inkubuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 do 24 godzin. Przygotuj rozszerzoną płytkę hodowlaną rano w dniu rozgrzania zarodka. Wyjmij szkiełko nakrywkowe z fibronektyną i umieść je w kapturze z przepływem laminarnym.Następnie usuń mieszaninę fibronektyny za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra i wyrzuć ją. Odpipetować 300 mikrolitrów zrównoważonego IVC 1 do każdej studzienki i umieścić szkiełko nakrywkowe w inkubatorze do czasu usunięcia osłonki przejrzystej. Po podgrzaniu i odzyskaniu ludzkich zarodków D5 oceń je pod kątem ponownej ekspansji i zrób zdjęcia każdego zarodka.Przenieś każdy zarodek do 500 mikrolitrów buforowanej pożywki MOPS z 5% FCS. Następnie potraktuj go kwaśnym roztworem Tyrode, jak opisano w rękopisie tekstu. Natychmiast przenieś zarodek z rozpuszczającą się strefą do 300 mikrolitrów podgrzanego bufora MOPS, aby ugasić roztwór Tyrode.Następnie przenieś zarodek do naczynia na tkanki narządu centralnego zawierającego zrównoważony BM z 10% SPS pod olejem do hodowli zarodków. Następnie przywróć zarodek do kropli regeneracyjnej o pojemności 20 mikrolitrów. Indywidualnie przenieś zarodki do naczynia do mycia ze zrównoważonym podłożem IVC 1, a następnie ostrożnie przenieś każdy zarodek do dołka w komorze nakrywkowej, upewniając się, że śledzisz identyfikację zarodka.Umieść szkiełko nakrywkowe z komorą w inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza, 6% dwutlenku węgla i tlenu atmosferycznego na dwa dni. W drugim dniu wzrostu dokładnie zbadaj przyczepienie zarodków pod mikroskopem i wymień pożywkę. Dowiedz się, który zarodek jest przymocowany do naczynia, delikatnie stukając w płytkę.Aby zmienić pożywkę, zdejmij pokrywkę i ostrożnie odessaj 150 mikrolitrów IVC 1, uważając, aby nie naruszyć przyczepionego zarodka. Jeśli zarodek nie zdążył się jeszcze przymocować do płytki, nie należy wymieniać pożywki, ponieważ surowica zawarta w IVC 1 pomoże w przyczepieniu. Powoli odpipetować 150 mikrolitrów zrównoważonych rozszerzonych pożywek hodowlanych, IVC 2 do każdej studzienki i założyć pokrywkę na szkiełko nakrywkowe.Ostrożnie włożył szkiełko nakrywkowe z komorą do inkubatora. Powtarzaj wymianę pożywki i kontrolę przyłączenia codziennie, aż zarodki będą gotowe do utrwalenia lub trawienia jednokomórkowego. Jeśli do dalszej analizy konieczne jest zebranie zużytych pożyw, należy zamknąć 150 mikrolitrów usuniętego IVC 1 w sterylnej probówce o pojemności 0,5 mililitra o niskiej zawartości wiązania.Umyj każdy zarodek raz 200 mikrolitrami PBS, a następnie dodaj 200 mikrolitrów roztworu trypsyny do każdej studzienki. Umieścić szkiełko nakrywkowe z komorą w inkubatorze na pięć minut. Użyj małej pipety lub drobno wyciągniętej pipety doustnej, aby podnieść pojedynczy MTB, a następnie użyj większej pipety, aby delikatnie oddzielić zarodek poprzez zasysanie w górę iw dół.Kontynuuj delikatne i wielokrotne zasysanie zarodka za pomocą końcówki pipety o mniejszej średnicy, aż zarodek będzie inkubowany przez łącznie 10 minut w trypszynie. Aby przeprowadzić selekcję pojedynczych komórek, przenieś zdysocjowane komórki przez 320 mikrolitrowych kropli PBS i 0,1% PVP pod olejem do hodowli zarodków, uważając, aby nie stracić żadnych komórek. Po umyciu komórek użyj drobno wyciągniętej szklanej pipety, aby wybrać jedną komórkę.Ostrożnie odpipetuj pojedynczą komórkę do sterylnej probówki o pojemności 0,2 mililitra o niskiej zawartości wiązania z minimalną objętością PBS i PVP. Uwolnij pojedyncze komórki w ciekłym azocie i przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do dalszego wykorzystania. Zdrowe zarodki wykazywały ciągłą proliferację w trakcie przedłużonej hodowli, podczas gdy nieprawidłowe zarodki zaczęły wycofywać się ze swoich zewnętrznych krawędzi i rozpadać się.W ósmym dniu po zapłodnieniu większość komórek w zarodkach była cytotrofoblastem lub CTB, które były dodatnie dla markera trofoblastu GATA-3. Na obrzeżach zarodka CTB różnicowały się już w wielojądrowe syncytiotrofoblasty, które miały wygląd podobny do arkusza i były zabarwione dodatnio dla ludzkiego CGB. W dniu 10 tworzenie migrujących komórek trofoblastu CGB było maksymalne, co zostało potwierdzone przez gwałtowny wzrost produkcji HCG w tym czasie.Trofoblasty wędrowne, które wykazały dodatnie zabarwienie na obecność HLA-G, również zaczęły się wyłaniać i migrować z dala od ciała zarodka. Do 12 dnia różnicowanie STB spadało, a produkcja MTB stała się bardziej widoczna, co sugeruje przesunięcie nacisku z produkcji hormonów w dniu 10 na migrację komórek w dniu 12. Zmiany te można zaobserwować na filmie poklatkowym z okresu okołoimplantacyjnego.Film pokazuje upadek blastocele, powstanie STB oraz ostateczne różnicowanie i migrację MTB. Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas wykonywania tej procedury, jest to, że pracujesz z żywymi zarodkami, które są wrażliwe na zmiany temperatury, osmolalności i pH. Zminimalizowanie czasu, w którym szalki pozostają poza inkubatorem, ma kluczowe znaczenie dla utrzymania zdrowia zarodków.Po zakończeniu tej procedury badacze mogą wykorzystać izolowane pojedyncze komórki do dalszych testów omicznych pojedynczych komórek, takich jak sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki i sekwencjonowanie wodorosiarczynów całego genomu, aby lepiej zrozumieć zmiany epigenetyczne i transkryptomiczne podczas implantacji człowieka i wczesnego tworzenia łożyska.

single-cell-collection-trophoblast-cells-peri-implantation-stage

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym filmie prezentujemy izolację blastocyst myszy oraz wyprowadzenie komórek macierzystych trofoblastu z blastocyst. Opisujemy również warunki utrzymania właściwości macierzystych komórek, a także indukcję ich różnicowania w hodowli.

Wytwarzanie mysich komórek macierzystych trofoblastu z blastocyst

W niniejszym protokole opisujemy sekcję łożysk myszy w 10,5 dniu ciąży, a następnie izolację komórek trofoblastycznych z wykorzystaniem gradientu Percoll. Następnie demonstrujemy zastosowanie wyizolowanych komórek w teście inwazji na Matrigelu.

Izolacja pierwotnych komórek trofoblastów myszy oraz test inwazji trofoblastów

Ten protokół opisuje metodę efektywnej transfekcji siRNA w świeżo wyizolowanych ludzkich cytotrofoblastach kosmkowych za pomocą mikroporacji i identyfikacji kompleksów DNA-białko w tych komórkach. Transfekowane komórki mogą być monitorowane za pomocą analiz Western blot i EMSA podczas 4-dniowego czasu hodowli.

Transfekcja siRNA i analizy EMSA na świeżo wyizolowanych ludzkich cytotrofoblastach kosmkowych

Tutaj prezentujemy protokół bezpośredniej konwersji mysich fibroblastów embrionalnych w pełni funkcjonalne i stabilne komórki macierzyste trofoblastu przez dziesięciodniową nadekspresję Tfap2c, Gata3, Eomes i Ets2.

Protokół bezpośredniej konwersji mysich fibroblastów embrionalnych w komórki macierzyste trofoblastu

Olbrzymie komórki trofoblastu (TGC) odgrywają kluczową rolę w łożysku, zapewniając zdrową ciążę. Przedstawiamy protokół oceny statusu transkrypcyjnego genów w TGC poprzez powstającą fluorescencyjną hybrydyzację in situ na skriostatach zarodków poimplantacyjnych lub krótkoterminowych hodowlach embrionalnych czopków ektołożyskowych dnia 7.

Analiza transkrypcyjna za pomocą powstającego RNA FISH gigantycznych komórek trofoblastu in vivo lub krótkoterminowe hodowle in vitro eksplantatów czopków ektołożyskowych

Tutaj prezentujemy protokół efektywnego generowania ludzkich komórek trofoblastycznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu białka morfogennego kości 4 i inhibitorów szlaków aktywinowych/węzłowych. Metoda ta jest odpowiednia do skutecznego różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i może generować duże ilości komórek do manipulacji genetycznej.

In vitro Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki trofoblastyczne

Prezentowany tutaj jest protokół pobierania próbek ludzkiej tkanki kosmków łożyskowych, a następnie izolacji cytotrofoblastów do pierwotnej hodowli komórek. Leczenie trofoblastów TNFα podsumowuje stan zapalny w środowisku wewnątrzmacicznym otyłości i ułatwia odkrycie celów molekularnych regulowanych przez stan zapalny w łożyskach z otyłością matczyną.

Podstawowy model ludzkiego trofoblastu do badania wpływu stanu zapalnego związanego z otyłością matki na regulację autofagii w łożysku

Ten protokół demonstruje metodę izolacji pierwotnych ludzkich komórek dziesiętnych pobranych z błon płodowych łożysk terminowych, które mogą być używane do różnych zastosowań (np. immunocytochemia, cytometria przepływowa, itp.), mając na celu zbadanie roli różnych populacji komórek w komplikacjach ciąży.

Izolacja pierwotnych ludzkich komórek liściastych z błon płodowych łożysk donoszonych

Tutaj prezentujemy wysoce przystępny protokół oceny ruchu komórek w ludzkich komórkach trofoblastu za pomocą trzech testów in vitro: testu zadrapania, testu inwazji transwell i testu proliferacji komórek.

Testy in vitro w celu oceny migracji, inwazji i proliferacji unieśmiertelnionych ludzkich linii komórkowych trofoblastu w pierwszym trymestrze ciąży

Obecny protokół pozwala na odzyskanie struktur przypominających rurki powstałych w klasycznym teście angiogenezy in vitro, gdzie komórki, takie jak komórki trofoblastu, organizują się w struktury podobne do naczyń włosowatych na warstwie zewnątrzkomórkowej macierzy błony podstawnej. Odzyskane struktury są wykorzystywane do izolacji RNA i białek do różnych analiz biochemicznych.

Odzyskiwanie komórek trofoblastu z testu tworzenia rurki angiogenezy do analizy ekspresji markerów różnicowania

Ten protokół umożliwia oczyszczanie, charakteryzację i hodowlę pierwotnych trophoblastów pozabłonowych HLA-G+ (EVT) z łożyska podstawnego i błony kosmówkowej ludzkich łożysk końcowych. Pierwotne kultury EVT utrzymują żywotność przez 96 h, co pozwala na współhodowlę z dopasowanymi do próbek komórkami układu odpornościowego matki oraz następcze analizy przepływowe cytometryczne i molekularne ich interakcji.

Oczyszczanie pozabłonkowych trofoblastów HLA-G+ z ludzkich tkanek łożyska w okresie ciąży do fenotypowań i analizy funkcjonalnej

Poznaj metodę jednokomórkowej analizy trofoblastu w ludzkich zarodkach okołoimplantacyjnych. Technika ta pozwala badać mechanizmy implantacji i wczesnego rozwoju łożyska, przyczyniając się do zrozumienia poronień i niepowodzeń implantacyjnych.

Jednokomórkowy zbiór komórek trofoblastu w zarodkach ludzkich w okresie okołoimplantacyjnym

Przeglądaj więcej filmów