Interferencja RNA u chrząszczy wodnych jako potężne narzędzie do manipulowania ekspresją genów w określonych punktach rozwojowych

Mimo że edycja genów stała się popularna w badaniu genetyki molekularnej organizmów niemodelowych, RNAi pozostaje potężnym narzędziem synergicznym. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją stosować na różnych etapach rozwoju. Ponadto częściowy knockdown może być wykorzystany do badania całych tych genów.

Powodzenie procedury zależy od wstrzyknięcia DSR i zminimalizowania szkód. Wymaga to praktyki, więc nie zniechęcaj się, jeśli zajmie to kilka prób. Aby przygotować zarodki we wczesnym stadium do mikroiniekcji, najpierw wlej wrzącą 20% agarozę do małej szalki Petriego i umieść trzy plastikowe rurki o szerokości od jednego do dwóch milimetrów na powierzchni płynnej agarozy, zanim zastygnie.

Gdy agaroza zastygnie, użyj pary kleszczyków, aby usunąć rurki i przykryj powstałe wgłębienia 500 mikrolitrami wody destylowanej w autoklawie. Gdy pojemnik do zbierania jest gotowy, użyj cienkiego pędzla do malowania z naturalnego włosia, aby przenieść pięć ośmiogodzinnych zarodków T.marmoratus z miejsc gniazdowania chrząszczy do szklanego naczynia wypełnionego wodą destylowaną w autoklawie pod mikroskopem stereoskopowym. Za pomocą mikroskopu i cienkich kleszczyków preparacyjnych chwyć kosmówkę każdego zarodka z obu stron i rozerwij kosmówkę, pozwalając zarodkowi delikatnie wysunąć się z tkanki.

Po usunięciu obu warstw kosmówki ze wszystkich pobranych zarodków, za pomocą pędzla ostrożnie przenieś zarodki ze szklanej płytki do rowków przygotowanej płytki agarozowej. Aby wstrzyknąć zarodki we wczesnym stadium z dwuniciowym RNA specyficznym dla genu, najpierw przygotuj igły do mikroiniekcji na pulpule igłowej i użyj mikroskopu stereoskopowego i znajdź kleszcze, aby złamać każdą końcówkę na ostrą krawędź. Po wrzuceniu oczyszczonego dwuniciowego RNA na lód, dodaj jeden mikrolitr 10-krotnego buforu iniekcyjnego do otrzymanego roztworu i użyj podwójnie destylowanej wody, aby zwiększyć objętość roztworu winylu do 10 mikrolitrów.

Za pomocą pipety P10 wypełnij jedną z przygotowanych igieł do mikroiniekcji działającym dwuniciowym roztworem RNA i załaduj igłę do uchwytu na mikroigłę podłączonego do systemu mikroiniekcji, który wykorzystuje technologię wyrzutu ciśnieniowego. Włącz system mikroiniekcji i dopływ powietrza pod ciśnieniem i użyj mikrozaworu w systemie mikroiniekcji, aby ustawić ciśnienie wtrysku na 15 funtów ciśnienia na cal kwadratowy, a następnie użyj pokrętła regulacji czasu, aby ustawić czas wtrysku na sekundy. Aby skalibrować igłę do wstrzykiwań, należy ocenić objętość pęcherzyka płynu, który tworzy się na końcu igły podczas wstrzykiwania do powietrza w przypadku zarodka T. marmoratus, należy użyć optymalnego rozmiaru pęcherzyka od 100 do 200 mikronów.

Igła do wstrzykiwań jest dobrej jakości, jeśli optymalne pęcherzyki można uzyskać przy ciśnieniu 15 funtów na cal kwadratowy przy czasie wstrzyknięcia wynoszącym około trzech sekund. Gdy ustawienie igły jest gotowe, ustaw igłę na płytce agarozowej zarodków tak, aby igła zbliżała się do zarodków pod kątem 45 do 60 stopni. Użyj mikromanipulatora, aby powoli przesunąć mikroigłę, aż końcówka dotknie powierzchni środka jednego zarodka, a następnie ostrożnie przesuń igłę do przodu, aż przebije powierzchnię zarodka.

Gdy igła znajdzie się w zarodku, ostrożnie naciśnij przycisk wstrzykiwania mikrowstrzykiwacza, aby dostarczyć od jednego do dwóch nanolitrów dwuniciowego RNA do zarodka. Gdy całe RNA zostanie dostarczone, powoli wycofaj igłę z zarodka, nie powodując pęknięcia zarodka. Pomyślnie wstrzyknięte zarodki można rozpoznać po obecności kolorowej plamki w miejscu wstrzyknięcia.

Po wstrzyknięciu wszystkich zarodków ostrożnie umieść naczynie w komorze wilgotnościowej w inkubatorze o temperaturze 25 stopni Celsjusza, ustawionym na 14-godzinny cykl światła i 10-godzinny cykl ciemności przez cztery do pięciu dni. Codziennie monitoruj postęp rozwoju zarodka pod mikroskopem stereoskopowym, aby zidentyfikować morfologicznie widoczne fenotypy knockdown. Wykorzystanie aparatu cyfrowego o wysokiej rozdzielczości do dokumentowania procesu rozwoju.

Należy usunąć wszelkie martwe zarodki i codziennie uzupełniać wodę na płytce agarozy, aby uniknąć wysuszenia i rozprzestrzeniania się skażenia mikrobiologicznego na inne zarodki, które przeżyły, w okresie inkubacji. Przed zebraniem larwy najpierw dodaj 60 do 70 stopni Celsjusza 2% płynnej agarozy na małą szalkę Petriego. Gdy agaroza zastygnie, użyj kleszczy, aby zrobić jedną płytką grupę na larwę, która ma zostać wstrzyknięta do agarozy i delikatnie spuść wodę z kubków kultury larw.

Po znieczuleniu użyj kleszczyków z miękkimi końcówkami, aby ostrożnie umieścić larwę na płytce unieruchamiającej, tak aby szyje i ciała znajdowały się w rowkach, ale ogon znajdował się nad powierzchnią agarozy. Kiedy wszystkie larwy zostaną umieszczone, przykryj każdą lawę grubą warstwą agarozy, która jest nadal płynna, ale nie jest niebezpiecznie gorąca i uwolnij wszelkie opowieści, które zostały przypadkowo przykryte w razie potrzeby. w przypadku mikroiniekcji dwuniciowego RNA należy załadować mikroigłę roztworem roboczym dwuniciowego RNA specyficznym dla genu, który jest przedmiotem zainteresowania, jak pokazano.

Ponownie przeciągnąć tłok ręcznie sterowanej strzykawki do mikroiniekcji i załadować igłę do systemu mikroiniekcji. Unieruchomioną larwę umieścić pod mikroskopem stereoskopowym w taki sposób, aby miejsce wstrzyknięcia było wyrównane z trajektorią igły do mikroiniekcji pod stosunkowo płaskim kątem. Za pomocą mikromanipulatora ostrożnie wsunąć końcówkę igły w larwę i powoli i ostrożnie wywierać nacisk na strzykawkę, dostosowując ciśnienie wstrzyknięcia zgodnie z ruchem kolorowego płynu iniekcyjnego w igle, jeśli to konieczne.

Po wstrzyknięciu całego RNA użyj miękkich kleszczy, aby uwolnić larwę z agarozy i umieść larwę w nowym pojemniku z wodą o temperaturze pokojowej o temperaturze od 25 do 28 stopni Celsjusza i 14-godzinnym lekkim, 10-godzinnym cyklu ciemności. W tej reprezentatywnej analizie trzy różne geny zostały powalone na różnych etapach rozwoju chrząszcza nurkującego T. marmoratus. Interferencja RNA odbywa się, jak wykazano przez wstrzyknięcie dwuniciowego RNA na bardzo wczesnym etapie embriogenezy.

Niektóre zarodki nie przeżywają tego procesu i przechodzą w martwicę. Na tych obrazach kontrolują one poszczególne osoby i można zaobserwować osobę o nieco jaśniejszym kolorze oczu. U tego osobnika można zaobserwować poważniejszy nokdaun, w którym bardziej brzuszne części klastra są całkowicie niepigmentowane, ale u sojuszników nadal widać pewną pigmentację.

Tutaj pokazano przykład innej osoby z zasadniczo całkowitą utratą pigmentu we wszystkich oczach. Lac2 powalony przez larwy skutkuje mniej pigmentowanym naskórkiem, uzyskano również jaśniejsze dorosłe osobniki z nieco zdeformowanymi skrzydłami, prawdopodobnie z powodu niezwykłej miękkości tkanki. Pamiętaj, aby uważnie obserwować zwierzęta, którym wstrzyknięto coś na co dzień i natychmiast usunąć wszelkie martwe osobniki.

Siła tej techniki polega na tym, że można ją zastosować do genów wielu różnych organizmów. Technika ta została również szeroko i z powodzeniem zastosowana w ewolucyjnej biologii rozwoju.