Name: Interferencja RNA u chrząszczy wodnych jako potężne narzędzie do manipulowania ekspresją genów w określonych punktach rozwojowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Poznaj technikę RNAi u chrząszczy wodnych Thermonectus marmoratus do badania funkcji genów w różnych etapach rozwojowych. Metoda mikroinjekcji dsRNA umożliwia analizę struktury i zachowania organizmów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Dr. Joshowi Benoit za pomoc w bioinformatyce, Hailey Tobler za pomoc w hodowli Sunburst Diving Beetles oraz Tamarze Pace za pomoc redakcyjną. Badania te były wspierane przez National Science Foundation w ramach grantów IOS-1456757 i IOS-1856341 dla EKB i IOS1557936 dla YT.

<ol><li>Muller, B., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+organisms+-+A+historical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Model organisms - A historical perspective.</a> Journal of Proteomics. 73, 2054-2063 (2010).</li>
<li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Mediated+Modular+RNA-Guided+Regulation+of+Transcription+in+Eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes.</a> Cell. 154, 442-451 (2013).</li>
<li>Westerman, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aristaless+Controls+Butterfly+Wing+Color+Variation+Used+in+Mimicry+and+Mate+Choice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Aristaless Controls Butterfly Wing Color Variation Used in Mimicry and Mate Choice.</a> Current Biology. 28, 3469(2018).</li>
<li>Perry, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+logic+behind+the+three-way+stochastic+choices+that+expand+butterfly+colour+vision%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular logic behind the three-way stochastic choices that expand butterfly colour vision.</a> Nature. 535, 280(2016).</li>
<li>Boettcher, M., McManus, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+the+Right+Tool+for+the+Job%3A+RNAi%2C+TALEN%2C+or+CRISPR%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR.</a> Molecular Cell. 58, 575-585 (2015).</li>
<li>Meister, G., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+gene+silencing+by+double-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA.</a> Nature. 431, 343-349 (2004).</li>
<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li>
<li>Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+dsRNA-mediated+genetic+interference+to+demonstrate+that+frizzled+and+frizzled+2+act+in+the+wingless+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway.</a> Cell. 95, 1017-1026 (1998).</li>
<li>Mello, C. C., Conte, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+world+of+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Revealing the world of RNA interference.</a> Nature. 431, 338-342 (2004).</li>
<li>Agrawal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference%3A+Biology%2C+mechanism%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">RNA interference: Biology, mechanism, and applications.</a> Microbiol. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67, 657(2003).</li>
<li>Gu, L. Q., Knipple, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+RNA+interference+research+in+insects%3A+Implications+for+future+insect+pest+management+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+Protection%22%5BJournal%5D)">Recent advances in RNA interference research in insects: Implications for future insect pest management strategies.</a> Crop Protection. 45, 36-40 (2013).</li>
<li>Ravisankar, P., Lai, Y. T., Sambrani, N., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+developmental+analysis+of+Drosophila+and+Tribolium+reveals+conserved+and+diverged+roles+of+abrupt+in+insect+wing+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparative developmental analysis of Drosophila and Tribolium reveals conserved and diverged roles of abrupt in insect wing evolution.</a> Developmental Biology. 409, 518-529 (2016).</li>
<li>Tomoyasu, Y., Wheeler, S. R., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrabithorax+is+required+for+membranous+wing+identity+in+the+beetle+Tribolium+castaneum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrabithorax is required for membranous wing identity in the beetle Tribolium castaneum.</a> Nature. 433, 643-647 (2005).</li>
<li>Tomoyasu, Y., Arakane, Y., Kramer, K. J., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+Co-options+of+Exoskeleton+Formation+during+Wing-to-Elytron+Evolution+in+Beetles%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Repeated Co-options of Exoskeleton Formation during Wing-to-Elytron Evolution in Beetles.</a> Current Biology. 19, 2057-2065 (2009).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+Drosophila+retinal+determination+gene+network+in+Tribolium+%28II%29%3A+The+Pax6+genes+eyeless+and+twin+of+eyeless%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (II): The Pax6 genes eyeless and twin of eyeless.</a> Developmental Biology. 333, 215-227 (2009).</li>
<li>ZarinKamar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pax+gene+eyegone+facilitates+repression+of+eye+development+in+Tribolium%5BTitle%5D)+AND+%22Evodevo%22%5BJournal%5D)">The Pax gene eyegone facilitates repression of eye development in Tribolium.</a> Evodevo. 2, 15(2011).</li>
<li>Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M., Borras-Castells, F., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Larval+RNA+Interference+in+the+Red+Flour+Beetle%2C+Tribolium+castaneum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum.</a> Journal of Visualized Experiments. , e52059(2014).</li>
<li>Stahl, A., S, B. R., Cook, T. A., Buschbeck, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+lens+for+a+complex+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+and+Comparative+Biology%22%5BJournal%5D)">A complex lens for a complex eye.</a> Integrative and Comparative Biology. 57, 1071-1081 (2017).</li>
<li>Yeku, O., Frohman, M. A. Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYeku%2C+O+%22RNA%2C+Methods+In+Molecular+Biology%22">RNA, Methods In Molecular Biology</a>. , Springer. 107-122 (2011).</li>
<li>Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+Systemic+RNA+Interference+in+the+Red+Flour+Beetle+Tribolium+castaneum%3A+Parameters+Affecting+the+Efficiency+of+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Dissecting Systemic RNA Interference in the Red Flour Beetle Tribolium castaneum: Parameters Affecting the Efficiency of RNAi.</a> Plos One. 7, (2012).</li>
<li>Tomoyasu, Y., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Larval+RNAi+in+Tribolium+%28Coleoptera%29+for+analyzing+adult+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development.</a> Development Genes and Evolution. 214, 575-578 (2004).</li>
<li>Philip, B. N., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPhilip%2C+BN+%22Molecular+Methods+for+Evolutionary+Genetics%22">Molecular Methods for Evolutionary Genetics</a>. Orgogozo, V., Rockman, M. V. , Humana Press. 471-497 (2011).</li>
<li>Mackenzie, S. M., Howells, A. J., Cox, G. B., Ewart, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-cellular+localisation+of+the+White%2FScarlet+ABC+transporter+to+pigment+granule+membranes+within+the+compound+eye+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetica%22%5BJournal%5D)">Sub-cellular localisation of the White/Scarlet ABC transporter to pigment granule membranes within the compound eye of Drosophila melanogaster.</a> Genetica. 108, 239-252 (2000).</li>
<li>Arakane, Y., Muthukrishnan, S., Beeman, R. W., Kanost, M. R., Kramer, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laccase+2+is+the+phenoloxidase+gene+required+for+beetle+cuticle+tanning%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Laccase 2 is the phenoloxidase gene required for beetle cuticle tanning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 11337-11342 (2005).</li>
<li>Werner, S., Buschbeck, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+step-wise+eye+growth+in+molting+diving+beetle+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rapid and step-wise eye growth in molting diving beetle larvae.</a> Journal of Comparative Physiology. 201, 1091-1102 (2015).</li>
<li>Prpic, N. M., Schoppmeier, M., Damen, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Silencing+via+Embryonic+RNAi+in+Spider+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">Gene Silencing via Embryonic RNAi in Spider Embryos.</a> Cold Spring Harbor protocols. 3, 1-4 (2008).</li>
<li>Sagi, A., Manor, R., Ventura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Silencing+in+Crustaceans%3A+From+Basic+Research+to+Biotechnologies%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Gene Silencing in Crustaceans: From Basic Research to Biotechnologies.</a> Genes. 4, 620-645 (2013).</li>
<li>Zhu, K. Y., Palli, S. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhu%2C+KY+%22Annual+Review+of+Entomology%22">Annual Review of Entomology</a>. Douglas, A. E. 65, Annual Reviews. 293-311 (2020).</li>
<li>Bauke, A. C., Sasse, S., Matzat, T., Klaembt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptional+network+controlling+glial+development+in+the+Drosophila+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A transcriptional network controlling glial development in the Drosophila visual system.</a> Development. 142, 2184(2015).</li>
<li>Lin, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+analysis+of+doublesex1+expression+in+Daphnia+pulex+Leydig%2C+1860+%28Cladocera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Crustaceana%22%5BJournal%5D)">RNAi analysis of doublesex1 expression in Daphnia pulex Leydig, 1860 (Cladocera).</a> Crustaceana. 92, 137-154 (2019).</li>
<li>Nguyen, D. V., Christiaens, O., Bossier, P., Smagghe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+in+shrimp+and+potential+applications+in+aquaculture%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Aquaculture%22%5BJournal%5D)">RNA interference in shrimp and potential applications in aquaculture.</a> Reviews in Aquaculture. 10, 573-584 (2018).</li>
<li>Dijkstra, K. D. B., Monaghan, M. T., Pauls, S. U. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDijkstra%2C+KDB+%22Annual+Review+of+Entomology%22">Annual Review of Entomology</a>. Berenbaum, M. R. 59, Annual Reviews. 143-163 (2014).</li>
<li>Crumiere, A. J. J., Khila, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hox+genes+mediate+the+escalation+of+sexually+antagonistic+traits+in+water+striders%5BTitle%5D)+AND+%22Biology.+Letters%22%5BJournal%5D)">Hox genes mediate the escalation of sexually antagonistic traits in water striders.</a> Biology. Letters. 15, 5(2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Naszym celem jest, aby ta kompilacja metod sprawiła, że RNAi stanie się szeroko dostępny, zwłaszcza że narzędzie to pozostaje potężną techniką synergiczną do edycji genów opartej na CRISPR/Cas9, z tą zaletą, że można je zastosować do pożądanych etapów rozwoju badanych organizmów. Aby zilustrować tę siłę, wstrzyknęliśmy dsRNA do zarodków i do różnych stadiów larwalnych. Wstrzyknięcia do jaj wpływały na rozwój zarodków (ryc. 2), wstrzyknięcia do drugiego stadium larwalnego miały wyraźny wpływ na trzecie stadium larwalne (ryc. 4 i ryc. 6), a wstrzyknięcia do trzeciego stadium larwalnego wykazały efekty u dorosłych (ryc. 5). Chociaż dokładny czas musi być ustalony eksperymentalnie, zazwyczaj zastrzyki zaczynają działać w ciągu kilku dni. Na powodzenie tego procesu może mieć wpływ długość sekwencji dsRNA. Tutaj przedstawiliśmy przykłady z użyciem nieco ponad 200 pb do ponad 800 pz. Z reguły preferowane są sekwencje od 100 do 600 pz w celu ograniczenia efektów niedocelowych, ale sekwencje do 1000 pz dają dobre wyniki22. Jednym z pytań dotyczących RNAi jest czas trwania knockdownu, który można osiągnąć za pomocą tej techniki. Ponieważ fenotypy były terminalne na każdym etapie, nie możemy komentować tej kwestii na podstawie przedstawionych przez nas wyników. Jednak wcześniej zauważono, że efekty RNAi są na ogół stosunkowo długotrwałe, a wyższe stężenia prowadzą do dłużej utrzymujących się knockdownów20.
Jednym z ograniczeń tej techniki jest to, że działa ona lepiej dla niektórych organizmów niż dla innych i wydaje się, że nie ma bezpośredniego sposobu na przewidzenie, jak dobrze będzie działać a priori. Niemniej jednak stwierdzono, że działa dobrze w przypadku wielu różnych organizmów. Wśród stawonogów obejmuje to pajęczaki26, skorupiaki27 i różne owady, ze szczególnie wysokimi wskaźnikami powodzenia u chrząszczy28. Kolejną komplikacją jest to, że różnice w nasileniu fenotypu często występują między osobnikami pomimo zastosowania tej samej ilości dsRNA. Jak pokazano na rysunku 2B, zmienność może wystąpić nawet w obrębie pojedynczej osoby. W naszych badaniach RNAi ukierunkowanych na różne geny zaangażowane w rozwój larwalnego oka T. marmoratus często stwierdzaliśmy, że niektóre oczy są dotknięte bardziej poważnie niż inne. Zjawisko to może być związane ze stosunkowo gęstą tkanką klastra oka, przy czym dsRNA jest w stanie lepiej dotrzeć do niektórych jednostek.
Dla pomyślnego przeprowadzenia eksperymentów z RNAi kluczowe znaczenie ma optymalizacja kilku parametrów dla genu docelowego. Na przykład stężenie dsRNA i długość docelowego genu mogą silnie wpływać na wynik20. Innym krytycznym parametrem jest sposób wykonywania zastrzyków, ponieważ proces ten może znacznie wpłynąć na wskaźnik przeżycia. W przypadku zarodków najlepsze wyniki osiągnęliśmy, celując w środek zarodka. Dobrze rozłożona płytka pozwala na wstrzyknięcie 100 lub więcej zarodków podczas jednej sesji. W przypadku larw bardzo ważne jest wprowadzenie igły iniekcyjnej między segmenty. Te zastrzyki wymagają więcej dsRNA, a w oparciu o dostępność larw, nasze zestawy iniekcyjne zazwyczaj składały się tylko z kilku zwierząt na raz. W przypadku wszystkich wstrzyknięć bardzo ważne jest, aby zapobiec przedostawaniu się powietrza do organizmu.
W niektórych przypadkach pętle sprzężenia zwrotnego sieci regulacyjnej genów i redundancja genetyczna mogą wpływać na penetrację fenotypów RNAi, pomimo konsekwentnych knockdownów. Wydaje się, że tak jest w przypadku naszych obserwacji behawioralnych larw z bardzo udanym knockdownem wybitnego białka soczewki, Lens318. Chociaż zweryfikowaliśmy wysoką skuteczność tych knockdownów za pomocą qPCR, zaobserwowano znaczną zmienność w powiązanych fenotypach. Wynik ten podkreśla konieczność prawidłowego ilościowego określenia knockdownów RNAi (szczegółowe informacje na temat opcji znajdują się w22). Jeśli nie ma jasnych oczekiwań a priori w odniesieniu do otrzymanych fenotypów, dobrym sposobem kontrolowania efektów RNAi poza celem jest celowanie w ten sam gen z dwiema nienakładającymi się sekwencjami dsRNA i ocena wyników dla wspólnych fenotypów.
W przeciwieństwie do technik edycji genów, RNAi jest również potężnym narzędziem do badania genów letalnych, a można to zrobić na dwa sposoby. Na przykład, jeśli ktoś jest zainteresowany funkcjonalnym wkładem genu, o którym wiadomo, że utrata funkcji na wczesnym etapie rozwoju jest śmiertelna, funkcjonalne badanie takiego genu można osiągnąć, po prostu pozwalając zwierzęciu normalnie się rozwijać, a następnie niszcząc gen za pomocą RNAi w późniejszym okresie rozwoju (tj. u osoby dorosłej). Alternatywnie, gen, o którym wiadomo, że całkowita utrata funkcji jest śmiertelna, może być badany poprzez częściowe knockdown, które można osiągnąć poprzez wstrzyknięcie szeregu stężeń dsRNA. Niektóre z naszych wyników wskazują na powalanie lac2, o którym wiadomo, że jest śmiertelne, jeśli naskórek owadów staje się zbyt miękki24. Nawet chrząszcz lac2 RNAi przedstawiony na rysunku 5 prawdopodobnie nie miałby szans na przetrwanie poza warunkami laboratoryjnymi. Inny śmiertelny gen zostaje wycięty, który koduje czynnik transkrypcyjny, który ma fundamentalne znaczenie dla specyfikacji losu komórki w różnych układach narządów u stawonogów i został powiązany z rozwojem gleju w układzie wzrokowym Drosophila 29. Opierając się na naszych doświadczeniach z ciętym RNAi w zarodkach T. marmoratus , możemy wywołać informacyjne fenotypy oka u zarodków, które są w stanie zakończyć swój embrionalny rozwój oka (obserwacje niepublikowane). W tym przypadku wyższe dawki wydają się prowadzić do wyższych wskaźników śmiertelności, podczas gdy niższe dawki skutkują obserwowalnymi i pouczającymi fenotypami.
Nasz protokół nie tylko wymienia niezbędne kroki, które badacz musi podjąć, aby przeprowadzić eksperymenty RNAi na T. marmoratus, jak pokazano na ilustracji, ale także ma ogólne zastosowanie do innych organizmów, zwłaszcza organizmów wodnych. Wśród organizmów wodnych istnieje już kilka przykładów wśród skorupiaków, takich jak rozwielitki Daphnia30 i krewetki (niedawny przegląd znajduje się w odnośniku31). Owady wodne mają wiele możliwości, ponieważ szacuje się, że stanowią one około 6% całej różnorodności owadów, z prawdopodobnymi ponad 200 000 gatunków32. Co więcej, RNAi zostało już przeprowadzone na wędrowcach wodnych, które mają tendencję do zamieszkiwania powierzchni środowisk wodnych33. Jeśli nie ma genomu, transkryptom może zostać złożony de novo. Tak długo, jak proces ten ujawnia kontigi kilkuset nukleotydów, można zaprojektować dsRNA przeciwko określonym genom. Nasz protokół unieruchamiania owadów w agarozie prawdopodobnie będzie również przydatny w innych procedurach, zwłaszcza w przypadku organizmów miękkich, plastycznych i wodnych. Podsumowując, RNAi pozostaje potężną techniką manipulowania ekspresją genów w zróżnicowanej grupie organizmów, nawet jeśli nie są dostępne żadne inne narzędzia molekularne i genetyczne.

Pytanie o to, jak konkretne geny przyczyniają się do ewolucji różnorodnych cech, jest ekscytującym tematem w biologii. W ciągu ostatnich kilku dekad poczyniono znaczne postępy w zakresie analizy genetycznych podstaw procesów rozwojowych w kilku organizmach modelowych, takich jak nicienie Caenorhabditis elegans, muszka owocowa Drosophila melanogaster i mysz domowa Mus musculus1. Niedawno, wynalezienie potężnych technik edycji genów, takich jak zgrupowane regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR)/Cas92, umożliwiło zmianę kodu genetycznego organizmów niemodelowych (na przykład zobacz3,4). W rezultacie nastąpił gwałtowny wzrost badań genetycznych nad różnymi organizmami, do których wcześniej nie podchodzono za pomocą technik molekularnych. Biorąc pod uwagę ogromną różnorodność naszego królestwa zwierząt, z wieloma interesującymi cechami lub różnicami cech, które są reprezentowane tylko u określonych gatunków, postęp ten sprawił, że jest to ekscytujący czas dla prac związanych z biologią ewolucyjno-rozwojową ("evo-devo"). Jednak techniki edycji genomu, które są dostępne dla organizmów niemodelowych, są stosunkowo ograniczone w odniesieniu do punktów czasowych rozwoju, do których można je zastosować, co utrudnia rozpoznanie właściwości czasowych związanych z rolą, jaką określone geny odgrywają w dowolnej cesze. Ponadto techniki transgeniczne są często ograniczone do genów, które nie są niezbędne do przeżycia (tj. których nokaut nie powoduje śmiertelności). Dlatego, chociaż techniki edycji genów zaczęły stawać się popularne, nadal istnieje zapotrzebowanie na skuteczne techniki, które można zastosować do wielu różnych organizmów w określonych punktach czasowych rozwoju i ułatwiają częściowe knockdowny (a nie całkowitą utratę funkcji). W tym miejscu zwracamy uwagę na interferencję RNA (RNAi), nieco przestarzałą, ale potężną technikę knockdown genów5, która jest szczególnie cenna jako synergiczne podejście do edycji genów. W szczególności opracowaliśmy procedury, które pozwalają na zastosowanie RNAi do wodnych chrząszczy nurkujących jako przykład, który ilustruje realizację tej techniki, od uzyskania niezbędnych sekwencji molekularnych po udane wstrzyknięcie dwuniciowego RNA (dsRNA) do jaj i larw.
Knockdown genu oparty na RNAi wykorzystuje wrodzony mechanizm obronny organizmów, w którym cząsteczki dsRNA ułatwiają wyciszanie inwazyjnych sekwencji kwasów nukleinowych, takich jak wirusy i transpozony6. Krótko mówiąc, dsRNA jest pobierane do komórki, gdzie jest cięte na 20-25 fragmentów nukleotydowych przez enzym Dicer. Fragmenty te następnie aktywują tworzenie kompleksu wyciszającego indukowanego RNA (RISC), który hamuje docelowe mRNA poprzez wiązanie się z nim w określonych miejscach za pomocą nici prowadzącej. Proces ten ostatecznie prowadzi do degradacji mRNA, a tym samym zakłóca translację mRNA do odpowiedniego białka6. Przedstawiona tutaj technika knockdownu genów oparta na RNAi opiera się zatem na wstrzyknięciu dsRNA. W przypadku modeli zwierzęcych technika ta została pierwotnie opracowana w C. elegans7 i D. melanogaster8, ale od tego czasu pojawiła się jako potężne funkcjonalne narzędzie genetyczne w organizmach niemodelowych9,10. Ze względu na swoją wysoką skuteczność u niektórych owadów, RNAi może być nawet stosowany w ochronie przed szkodnikami11.
Jako narzędzie badawcze, RNAi zostało wykorzystane do zbadania, jak funkcjonują kluczowe szlaki molekularno-rozwojowe w nietradycyjnych modelach owadów. Na przykład RNAi w chrząszczu mącznym Tribolium castaneum odegrało zasadniczą rolę w określeniu, jak głęboko konserwatywne geny przyczyniają się do określonych cech tego chrząszcza, czego przykładem jest rozwój skrzydeł o specyficznym kształcie12,13,14 i eyes15,16. Techniki, które leżą u podstaw manipulacji u T. castaneum, zostały dobrze opisane17 i opierają się na zdolności do unieruchamiania stosunkowo suchych jaj i larw na lepkiej powierzchni. Takie unieruchomienie nie jest jednak możliwe w przypadku mokrych form rozwojowych organizmów wodnych, takich jak chrząszcz nurkujący Sunburst Thermonectus marmoratus. Podobnie jak w przypadku wielu nietradycyjnych organizmów modelowych, brakuje mu genomu z adnotacjami. Aby manipulować ekspresją genów w dowolnym organizmie bez genomu, rozsądnym i opłacalnym pierwszym krokiem jest wygenerowanie transkryptomów i zidentyfikowanie przypuszczalnych sekwencji nukleotydowych eksprymowanych genów w oparciu o podobieństwo sekwencji do spokrewnionych, ale bardziej ugruntowanych organizmów modelowych, w tym przypadku głównie genów Tribolium (Coleoptera) i Drosophila.
Tutaj, aby pokazać, jak RNAi może być użyte na organizmach wodnych, najpierw omawiamy protokoły i oprogramowanie do ekstrakcji RNA oraz generowania i łączenia transkryptomu, które pozwalają na identyfikację specyficznych sekwencji genów docelowych. Następnie podsumowujemy niezbędne kroki do syntezy dsRNA specyficznego dla genu. Następnie pokazujemy, w jaki sposób jaja mogą być wstrzykiwane do środowiska wodnego i demonstrujemy protokoły inkubacji do hodowli rozwijających się zarodków. Ponadto pokazujemy, w jaki sposób żel agarozowy może być używany do całkowitego unieruchomienia larw podczas procesu wstrzykiwania, techniki, która jest ogólnie przydatna podczas różnych zabiegów i może być stosowana do różnych stawonogów. Aby zademonstrować, w jaki sposób RNAi może być stosowane na różnych etapach rozwoju, podajemy przykład, w którym wyciszyliśmy gen pigmentacji oka na biało w zarodkach. Ponadto opisujemy przykład, w którym gen garbarstwa lakkaza2 (lac2) został wyciszony zarówno w drugim stadium larwalnym (w celu wpływu na larwy w trzecim stadium larwalnym), jak i w trzecim stadium larwalnym (w celu doprowadzenia do dorosłych). Na koniec wykazujemy, że wstrzyknięcie niższego stężenia dsRNA prowadzi do częściowego knockdownu, co pokazuje, że technika ta może być również stosowana do genów, o których wiadomo, że utrata funkcji jest śmiertelna.

<table><tbody><tr><td><silny>1. Izolacja RNA i montaż transkryptomu de novo</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ciekły azot</td><td>Magazyn</td><td></td> uniwersytecki <td>Zazwyczaj lokalnie dostępne w instytucjach badawczych</td></tr><tr><td>końcówki do pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>zależne od rozmiaru</td><td>Produkty od innych dostawców będą działać równie dobrze</td></tr><tr><td>Mini zestaw tkanki lipidowej RNeasy (zestaw do izolacji RNA)</td><td>Qiagen</td><td>74804</td><td>Szczegółowy specyficzny protokół jest dostarczany z zestawem</td></tr><tr><td>spektrofotometru (NnanoDrop)</td><td>Thermo Fisher</td><td>9836674</td><td>Inne modele będą działać równie dobrze</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.2. De novo transcriptom assembly.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BUSCO.v3</td><td>https://busco.ezlab.org/</td><td></td> <td>Do oceny kompletności trasncriptomu można użyć dowolnego ogólnodostępnego oprogramowania.</td></tr><tr><td>Środowisko pracy CLC Genomics</td><td>Qiagen</td><td>832021</td><td>Dostępne są również inne równoważne pakiety oprogramowania</td></tr><tr><td>Galaxy Workbench</td><td>https://usegalaxy.org/</td><td></td> <td>Internetowy potok montażu i adnotacji transkryptomu</td></tr><tr><td>NCBI BLASTx</td><td>o otwartym</td> kodzie źródłowym https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?LINK_LOC=blasthome&PAGE_TYPE=BlastSearch&PROGRAM=blastx <td></td><td>Internetowy potok</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> wyrównywania i adnotacji typu <tr><td>open source2. synteza cDNA, klonowanie i Izolacja Miniprep</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ampicillin sól sodowa</td><td>Gibco</td><td>11593-027</td><td>Produkty od innych dostawców będą działać równie dobrze</td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-500</td><td>Produkty od innych dostawców będą działać równie dobrze</td></tr><tr><td>Rosół LB</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426-500</td><td>Produkty od innych dostawców będą działać równie dobrze</td></tr><tr><td>Zestaw Omniscript RT (odwrotna transnscencja)</td><td>Qiagen</td><td>205111</td><td>Szczegółowy protokół jest dostarczany z zestawem</td></tr><tr><td>One Shot&trade; TOP10 Chemicznie kompetentny E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>C404010</td><td>Szczegółowy szczegółowy protokół jest dostarczany z zestawem</td></tr><tr><td>szalki Petriego</td><td>Fisher Scientific FB0875713</td><td></td><td>Produkty innych dostawców będą działać równie dobrze</td></tr><tr><td>PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit</td><td>ThermoFischer</td><td>771471</td><td>Szczegółowy protokół jest dostarczany z zestawem</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Szczegółowy szczegółowy protokół jest dostarczany z zestawem</td></tr><tr><td>wytrząsarka-inkubator</td><td>Labnet</td><td>211DS</td><td>Inne modele będą działać równie dobrze</td></tr><tr><td>spektrofotometr (NnanoDrop)</td><td>Thermo Fisher</td><td>9836674</td><td>Inne modele będą działać równie dobrze</td></tr><tr><td>termocykler do PCR</td><td>BioRad</td><td>T100</td><td>Inne modele będą działać równie dobrze</td></tr><tr><td>TOPO TA Zestaw do klonowania</td><td>Invitrogen</td><td>1845069</td><td>Szczegółowy protokół jest dostarczany z zestawem</td></tr><tr><td>X-Gal Solution</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0941</td><td>Produkty innych dostawców będą działać równie dobrze</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.2 PCR amplifikacja i synteza in vitro dsRNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Fisher Scientific</td><td>accuSpin Micro 17R</td><td>Inne modele będą działać równie dobrze</td></tr><tr><td>etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4094</td><td>Produkty innych dostawców będą działać równie dobrze</td></tr><tr><td>FastTaq DNA Polymerase, dNTPack</td><td>Roche</td><td>13873432</td><td>Ten zestaw zawiera wszystkie odczynniki niezbędne do</td></tr><tr><td>czyszczenia PCR MEGAclear Transcriiption</td><td>ThermoFischer</td><td>AM1908</td><td>Szczegółowy szczegółowy protokół jest dostarczany z zestawem</td></tr><tr><td>Zestaw do transkrypcji MEGAscript T7</td><td>ThermoFischer</td><td>AM1334</td><td>Szczegółowy szczegółowy protokół jest dostarczany z zestawem</td></tr><tr>woda<td>wolna od nukleaz</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9932</td><td>Produkty innych dostawców będą działać równie dobrze</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Szczegółowy protokół jest dostarczany z zestawem</td></tr><tr><td>octan sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td>Zrób roztwór roboczy 3M</td></tr><tr><td>Spektrofotometr (NnanoDrop)</td><td>Thermo Fisher</td><td>9836674</td><td>Inne modele będą działać równie dobrze</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><mocny>3. Pobieranie i przygotowanie zarodków T. marmoratus we wczesnym stadium do wstrzyknięć dsRNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>agaroza</td><td>Fisher Scientific</td><td>9012-36-6</td><td>Produkty od innych dostawców sprawdziłyby się równie dobrze</td></tr> woda <tr><td>destylowana</td><td>Fisher Scientific</td><td>9180</td><td>Produkty od innych dostawców sprawdziłyby się równie dobrze</td></tr><tr><td>kleszcze (Dumon #4 Biologia)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11242-40</td><td>Produkty od innych dostawców sprawdziłyby się równie dobrze</td></tr><tr><td>naczynie ze szklaną wnęką (naczynie 3-dołkowe)</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-243-43</td><td>Produkty od innych dostawców sprawdziłyby się równie dobrze</td></tr><tr><td>Kuchenka mikrofalowa</td><td>Gramofon</td><td>Welbilt</td><td>Inne modele sprawdziłyby się równie dobrze</td></tr><tr><td>pędzel do włosów naturalnych</td><td>Amazon</td><td></td><td>Każdy cienki pędzel zrobi</td></tr><tr><td>P1000 mikropipeter</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td>Inne modele sprawdziłyby się równie dobrze</td></tr><tr><td>Szalki Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>Produkty innych dostawców będą działać równie dobrze</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy Centralna</td><td>10446293</td><td>Każdy dobry mikroskop stereoskopowy będzie działał</td><td></td></tr><tr><td>Pipety transferowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-200-109</td><td>Produkty innych dostawców będą działać równie dobrze</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><silny>4. mikroiniekcje dsRNA we wczesnym stadium zarodków T. marmoratus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>aparat cyfrowy</td><td>Optyka Edmunda (Qimaging)</td><td>Retiga 2000R</td><td>Inne modele sprawdziłyby się równie dobrze</td></tr><tr><td>etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4094</td><td>Produkty od innych dostawców sprawdziłyby się równie dobrze barwnik</td></tr><tr><td>spożywczy</td><td>Kroger</td><td></td><td>Każdy dostępny barwnik spożywczy powinien praca</td></tr><tr><td>komora</td><td></td><td></td> wilgotności <td>fine weź dowolne plastikowe pudełko z pokrywką, wysterylizuj je 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia</td></tr><tr><td>inkubator</td><td>Labline</td><td>203</td><td>Inne modele będą działać równie dobrze</td></tr><tr><td>bufor</td><td></td><td></td> do wstrzykiwań <td>Przygotowany na 1 ml zgodnie z odniesieniem #22 : Wymieszaj 10 i mikro; L 0,1 M buforu fosforanu sodu, 100 &mikro; L 0,5 M roztworu chlorku potasu, 100 &mikro; L barwnika spożywczego i 790 &mikro; L wody podwójnie destylowanej. Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>wewnątrzkomórkowe systemy mikroiniekcyjne (Picospritzer)</td><td>Parker</td><td>052-0500-900</td><td>Obecnie dostępny jest model III, ale w starszych modelach działa również</td></tr><tr><td>uchwyt na mikroigły</td><td>Systemy A-M 672441</td><td></td><td>Równie dobrze sprawdzą się inne produkty</td></tr><tr><td>igły do mikroiniekcji (1,2 mm x 0,68 mm, 4 cale)</td><td>Systemy A-M</td><td>603000</td><td>Inne modele sprawdziłyby się równie dobrze</td></tr><tr><td>mikromanipulator</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-024-R</td><td>Każdy wysokiej jakości mikromanipulator będzie działał</td></tr><tr><td>fosforan sodu</td><td>Fischer scientific</td><td>7558-80-7</td><td>Aby przygotować 10 ml 1 M roztworu roboczego: Dodaj 1,2 g proszku fosforanu sodu do 10 ml podwójnie destylowanej wody i mieszaj, aż do uzyskania klarownego roztworu</td></tr><tr><td>P-1000 Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td>Ustawienia ściągacza: Ciepło 575, Ciąg 60, Prędkość 75, Opóźnienie 110, Ciśnienie 700.</td></tr><tr><td>Mikropipeter P10</td><td>Gilson</td><td>F144802</td><td>Inne modele sprawdziłyby się równie dobrze</td></tr><tr><td>Mikropipeter P1000</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td>Inne modele sprawdziłyby się równie dobrze</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Fischer scientific</td><td>7447-40-7</td><td>Aby przygotować 100 ml 0,5 M roztworu chlorku potasu: Dodać 3,73 g kryształów chlorku potasu do 100 ml podwójnie destylowanej wody i mieszać do uzyskania klarownego roztworu.</td></tr><tr><td>Bufor fosforanu sodu (0,1 M)</td><td></td><td></td><td>Aby przygotować 10 ml z 0,1 M tego buforu: Zmieszać 8,5 ml 1 M roztworu dwuzasadowego fosforanu sodu z 1,5 ml 1 M roztworu fosforanu monosodowego. Sprawdź pH za pomocą pH-metru i dostosuj odpowiednio do pH 7,6 w temperaturze pokojowej.</td></tr><tr><td>fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Fischer scientific</td><td>7558-79-4</td><td>Aby przygotować 10 ml 1 M roztworu roboczego: Dodać 1,42 g dwuzasadowego fosforanu sodu w proszku do 10 ml podwójnie destylowanej wody i mieszać do uzyskania klarownego roztworu</td></tr> mikroskop <tr><td>stereoskopowy</td><td>10446293</td><td>Centralny</td> Każdy <td>dobry mikroskop stereoskopowy będzie działał</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><silny>5. Przygotowanie larw T. marmoratus do wstrzyknięć dsRNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>agaroza</td><td>Fisher Scientific</td><td>9012-36-6</td><td>Produkty od innych dostawców sprawdziłyby się równie dobrze</td></tr><tr><td>kleszcze (Dumon #4 Biology)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11242-40</td><td>Produkty od innych dostawców sprawdziłyby się równie dobrze</td></tr><tr><td>szalki Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>Równie dobrze</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> sprawdzą się produkty innych dostawców<tr><td><mocne>6. Mikroiniekcje dsRNA w larwy T. marmoratus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bufor do iniekcji (10x)</td><td></td><td></td><td>Patrz rozdział 4</td></tr><tr><td>igły do mikroiniekcji (1,2 mm x 0,68 mm, 4 cale)</td><td>Systemy AM</td><td>603000</td><td>Inne modele sprawdziłyby się równie dobrze</td></tr><tr><td>mikroiniekcja strzykawka</td><td>A-M Systems</td><td>603000</td><td>Inne modele będą działać równie dobrze</td></tr> uchwyt <tr><td>na mikroigły</td><td>Systemy AM</td><td>672441</td><td>Inne produkty będą działać równie dobrze</td></tr><tr><td>P-1000 Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td>Ustawienia ściągacza: Heat 575, Pull 60, Velocity 75, Delay 110, Pressure 700.</td></tr><tr><td>mikroskop stereoskopowy</td><td>Mikroskop Centralny</td><td>10446293</td><td>Każdy dobry mikroskop stereoskopowy będzie działał</td></tr></tbody></table>

interferencja rna u chrząszczy wodnych jako potężne narzędzie do manipulowania ekspresją genów w określonych punktach rozwojowych

RNA Interference in Aquatic Beetles as a Powerful Tool for Manipulating Gene Expression at Specific Developmental Time Points

Interferencja RNA (RNAi) pozostaje potężną techniką, która pozwala na celowe zmniejszenie ekspresji genów poprzez degradację mRNA. Technika ta ma zastosowanie do wielu różnych organizmów i jest bardzo skuteczna w bogatym gatunkowo rzędzie Coleoptera (chrząszcze). Tutaj podsumowujemy niezbędne kroki do opracowania tej techniki w nowym organizmie i ilustrujemy jej zastosowanie do różnych etapów rozwojowych wodnego chrząszcza nurkującego Thermonectus marmoratus. Docelowe sekwencje genów można uzyskać w sposób ekonomiczny poprzez składanie transkryptomów z bliskim krewnym o znanym genomie lub de novo. Klonowanie genów kandydujących wykorzystuje specyficzny wektor klonujący (plazmid pCR4-TOPO), który umożliwia syntezę dwuniciowego RNA (dsRNA) dla dowolnego genu przy użyciu jednego wspólnego startera. Zsyntetyzowane dsRNA można wstrzykiwać zarówno do zarodków we wczesnych procesach rozwojowych, jak i larw do późniejszych procesów rozwojowych. Następnie ilustrujemy, w jaki sposób RNAi można wstrzykiwać do larw wodnych za pomocą immobilizacji w agarozie. Aby zademonstrować tę technikę, podajemy kilka przykładów eksperymentów z RNAi, generujących specyficzne knockdowny z przewidywanymi fenotypami. W szczególności RNAi dla genu garbowania lakkazy2 prowadzi do rozjaśnienia naskórka zarówno u larw, jak i dorosłych, a RNAi dla genu pigmentacji oka na biało powoduje rozjaśnienie/brak pigmentacji w rurkach ocznych. Ponadto powalenie kluczowego białka soczewki prowadzi do powstania larw z brakami optycznymi i zmniejszoną zdolnością do polowania na zdobycz. W połączeniu wyniki te ilustrują moc RNAi jako narzędzia do badania zarówno wzorców morfologicznych, jak i cech behawioralnych w organizmach dysponujących jedynie transkryptomicznymi bazami danych.

Stosując opisany powyżej protokół, wyciszyliśmy trzy różne geny, mianowicie white, laccase2 (lac2) oraz Lens3 (Tabela 1), na różnych etapach rozwoju chrząszcza pływającego T. marmoratus. Przeprowadziliśmy RNAi u T. marmoratus poprzez wstrzyknięcie dsRNA na bardzo wczesnym etapie embriogenezy (Rysunek 1A). Ponieważ niektóre embriony nie przeżywają tego procesu i ulegają nekrozie (Rysunek 1B), należy je usunąć, aby utrzymać pozostałe embriony w dobrym stanie. Przedstawiono tutaj przykład wstrzykiwań dsRNA przeciwko genowi white. Gen ten jest dobrze znany u Drosophila jako jeden z trzech transporterów ABC (ATP-binding cassette) zaangażowanych w pobieranie i magazynowanie prekursorów pigmentu oka23. W związku z tym, jego utrata funkcji skutkuje fenotypem oczu białych, pozbawionych pigmentu. Nasze wyniki pokazują, że wstrzyknięcia dsRNA celujące w ortologiczny gen white w embrionach T. marmoratus prowadzą do utraty pigmentacji oczu u nowo wyklutych larw. W tym przypadku larwy typu dzikiego charakteryzują się silnie pigmentowanymi oczami, a wyciszenie genu white za pomocą RNAi prowadzi do różnego stopnia redukcji, a nawet całkowitej eliminacji pigmentu oka. Ogólnie zaobserwowaliśmy co najmniej pewną redukcję zabarwienia oczu u 34% przeżywających embrionów (n = 35). Rysunek 2A porównuje osobnika kontrolnego z osobnikiem o nieco jaśniejszym kolorze oczu. Rysunek 2B ilustruje silniejsze wyciszenie u osobnika, u którego bardziej brzuszne oczy (Oczy 2–5) z grupy są całkowicie pozbawione pigmentu, podczas gdy oczy grzbietowe nadal wykazują pewną pigmentację. Różnice te podkreślają, jak efektywność wyciszenia może się różnić regionalnie, co prawdopodobnie wiąże się z różnicami w skuteczności penetracji dsRNA w gęstej tkance. Inny osobnik wykazuje niemal całkowitą utratę pigmentu we wszystkich oczach (Rysunek 2C).
Aby zbadać skuteczność RNAi w stadium larwalnym T. marmoratusnastępnie wstrzyknięto dsRNA celujące w gen tannic lac2 do larw drugiego stadium kilka dni przed planowaną linią zrzucenia powłoki i przejściem w trzecie stadium (Rycina 3) i oceniono wpływ na zabarwienie kutykuli larw trzeciego stadium. Lac2 jest rodzajem fenoloooksydazy, która utlenia i sprzęga białka, czyniąc je nierozpuszczalnymi, twardszymi i ciemniejszymi. Wyciszenie ekspresji w chrząszczu mącznym T. castaneum wykazano, że w niskich dawkach prowadzi do powstania osobników o jaśniejszym zabarwieniu, natomiast w wysokich dawkach jest uważane za letalne24. Rycina 4 wykazuje, że traktowanie to prowadzi również do uzyskania larw pływaków o jaśniejszym zabarwieniu. Konkretnie, w tym doświadczeniu 75% przeżyjących larw po iniekcji (n = 12) wykazywało zredukowaną pigmentację (w porównaniu do 0% w grupie kontrolnej). Rycina 4A przedstawia osobę z względnie łagodną depigmentacją, podczas gdy Rysunek 4C przedstawia głowę T. marmoratus larwa, u której ciemne zabarwienie kutykuli jest niemal nieobecne. Depigmentacja była szczególnie wyraźna w odniesieniu do centralnego ciemnego wzoru typowego dla tych larw, podczas gdy wzór ten pozostał wyraźnie widoczny u osobnika z grupy kontrolnej (Rycina 4B). Ponadto zaobserwowano rozjaśnienie tchawicy ogonowej, co przedstawiono w Rycina 4DW przypadku, gdy lac2 Wstrzyknięto dsRNA larwom trzeciego stadium, w wyniku czego otrzymano lżejsze osobniki dorosłe (Rycina 5). Należy zauważyć, że skrzydła chrząszcza z wyciszonym genem są nieco zdeformowane, co prawdopodobnie wynika z jego nietypowej miękkości.
Oprócz modyfikowania cech morfologicznych, RNAi można wykorzystać do celowania w geny wpływające na zachowanie. Aby to zademonstrować, przeprowadziliśmy RNAi przeciwko kluczowemu genowi kodującemu białko soczewki, Lens318, i wstrzyknęliśmy je do larw w drugim stadium rozwojowym, aby wpłynąć na właściwości optyczne oczu larw w trzecim stadium. Wszelkie zaobserwowane tutaj efekty w obrębie soczewki wynikają prawdopodobnie z faktu, że oczy larw T. marmoratus przechodzą intensywny wzrost w tym okresie przejścia, co wiąże się również z istotnymi zmianami optycznymi soczewki25. Wyciszenie za pomocą RNAi w tym eksperymencie było wysoce efektywne. Weryfikacja za pomocą qPCR wykazała 100% skuteczności; spośród 13 badanych osobników u 12 wyciszono ekspresję do poziomu poniżej 10% w stosunku do osobników kontrolnych, natomiast u pozostałego osobnika poziom ekspresji wyniósł 17% poziomu kontrolnego (niepublikowana obserwacja). Na poziomie fenotypowym tylko niektóre osobniki były poważnie upośledzone lub niezdolne do chwytania ofiary, co zilustrowano na Rysunku 6 dla osobnika, który wielokrotnie zbliżał się do ofiary z bardzo małej odległości, ale konsekwentnie ją mijał.
Tabela 1: Sekwencje starterów i amplikonów dla białek white, lac2 oraz Lens3. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61477/Table1.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
<img alt="Eksperyment dotyczący rozwoju embrionu rośliny; wyniki w szalce Petriego, pokazujące próbki żywych i martwych embrionów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Ilustracja iniekcji embrionów. (A) Dechorionowane embriony ułożone w rzędzie na płytce agarozowej i iniektywne w pobliżu ich centrum za pomocą igły do mikroiniekcji wypełnionej dsRNA oraz buforem do iniekcji zawierającym barwnik spożywczy. Pasek skali reprezentuje 500 μm. (B) Jednostka z silniejszym efektem knockdown. Iniektywne embriony są przechowywane w komorze wilgotnościowej i monitorowane codziennie w celu oceny fenotypów oraz usuwania martwych osobników (które brązowieją). Pasek skali reprezentuje 5 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat efektu RNAi; ekspresja genu white, próbki kontrolne i traktowane RNAi, analiza mikroskopowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Przykład w pełni rozwiniętych embrionów, którym wstrzyknięto dsRNA przeciwko white. (A) Porównanie osobnika z redukcją pigmentacji oczu (lewo) oraz osobnika kontrolnego po wstrzyknięciu (prawo). E1–E6 oznaczają oczy 1–6. (B) Osobnik z silniejszym fenotypem knockdown, co obrazuje, że niekiedy niektóre oczy w klastrze są silniej dotknięte wyciszeniem genu niż inne. (C) Osobnik z niemal całkowitą utratą pigmentacji oczu. Pasek skali reprezentuje 200 μm; panele B i C przedstawiono w tej samej skali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Sekwencja mikroiniekcji zarodków danio pręgowanego; proces wstrzykiwania barwnika; szczegółowy schemat eksperymentu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Ilustracja iniekcji u larw. (A) Kilka larw unieruchomionych poprzez zatopienie w 2% agarozie, z pozostawionymi wolnymi od agarozy przedsionkami ogonowymi. (B) Mikroelektroda zawierająca roztwór do iniekcji umieszczona tak, aby jej końcówka mogła przeniknąć przez cienką błonę między dwoma segmentami. (C) Niebieski barwnik iniekcyjny widoczny w miejscu wstrzyknięcia po wykonaniu zabiegu. Paski skali reprezentują 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Efekt RNAi na larwy owadów; obrazy mikroskopowe porównujące kontrolę z wyciszeniem lac2 w odniesieniu do wzrostu i morfologii." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: RNAi dla laccase2 zastosowane u larw drugiego stadium, skutkujące zmniejszeniem zabarwienia kutykuli u larw trzeciego stadium.(A) Stosunkowo łagodna utrata zabarwienia u osobnika z RNAi lac2 (dół) w porównaniu z osobnikiem po wstrzyknięciu kontrolnym (góra). Pasek skali reprezentuje 5 mm. (B) Głowa osobnika kontrolnego wykazująca charakterystyczny ciemny wzór w centrum głowy. (C) Stosunkowo silny knockdown lac2 prowadzący do niemal całkowitej utraty zabarwienia centralnej części głowy. (D) Utrata zabarwienia w głównej części kutykuli ogona u osobnika z RNAi lac2 (dół) w porównaniu z osobnikiem po wstrzyknięciu kontrolnym (góra). Paski skali na B‒D reprezentują 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wpływ RNAi na wzór owada, traktowanie RNAi Lac2 w porównaniu z kontrolą, eksperyment ekspresji genetycznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig05.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: RNAi dla laccase2 zastosowane u larwy trzeciego stadium, skutkujące zmniejszeniem zabarwienia kutykuli u osobnika dorosłego. Osobnik z wyciszeniem genu (lewo) charakteryzuje się również bardzo miękkimi pokrywami w porównaniu z kontrolą (prawo). Pasek skali reprezentuje 5 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza behawioralna RNAi, seria zdjęć przedstawiająca zbliżanie się, przeoczenie celu i powrót u C. elegans." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig06.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Wyciszenie ekspresji głównego białka soczewki prowadzące do deficytów w chwytaniu ofiary.(A–C). Trzy przykłady, w których larwa chrząszcza z rodzaju Sunburst Diving Beetle, u której wywołano deficyty optyczne poprzez RNAi, nie była w stanie schwytać ofiary (larwy komara). Wybrano reprezentatywne klatki z nagrania wideo charakterystycznych prób chwytania ofiar. (D) Larwa kontrolna chwytająca ofiarę. Wszystkie paski skali reprezentują 2 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Interferencja RNA jest szeroko stosowaną, potężną techniką manipulowania ekspresją genów na określonych etapach rozwoju. Tutaj opisujemy niezbędne kroki do wdrożenia tej techniki u wodnego chrząszcza nurkującego Thermonectus marmoratus, od nabycia sekwencji genów po knockdown genów wpływających na strukturę lub zachowanie.

Interferencja RNA u chrząszczy wodnych jako potężne narzędzie do manipulowania ekspresją genów w określonych punktach rozwojowych

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is ...

Mimo że edycja genów stała się popularna w badaniu genetyki molekularnej organizmów niemodelowych, RNAi pozostaje potężnym narzędziem synergicznym. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją stosować na różnych etapach rozwoju. Ponadto częściowy knockdown może być wykorzystany do badania całych tych genów.Powodzenie procedury zależy od wstrzyknięcia DSR i zminimalizowania szkód. Wymaga to praktyki, więc nie zniechęcaj się, jeśli zajmie to kilka prób. Aby przygotować zarodki we wczesnym stadium do mikroiniekcji, najpierw wlej wrzącą 20% agarozę do małej szalki Petriego i umieść trzy plastikowe rurki o szerokości od jednego do dwóch milimetrów na powierzchni płynnej agarozy, zanim zastygnie.Gdy agaroza zastygnie, użyj pary kleszczyków, aby usunąć rurki i przykryj powstałe wgłębienia 500 mikrolitrami wody destylowanej w autoklawie. Gdy pojemnik do zbierania jest gotowy, użyj cienkiego pędzla do malowania z naturalnego włosia, aby przenieść pięć ośmiogodzinnych zarodków T.marmoratus z miejsc gniazdowania chrząszczy do szklanego naczynia wypełnionego wodą destylowaną w autoklawie pod mikroskopem stereoskopowym. Za pomocą mikroskopu i cienkich kleszczyków preparacyjnych chwyć kosmówkę każdego zarodka z obu stron i rozerwij kosmówkę, pozwalając zarodkowi delikatnie wysunąć się z tkanki.Po usunięciu obu warstw kosmówki ze wszystkich pobranych zarodków, za pomocą pędzla ostrożnie przenieś zarodki ze szklanej płytki do rowków przygotowanej płytki agarozowej. Aby wstrzyknąć zarodki we wczesnym stadium z dwuniciowym RNA specyficznym dla genu, najpierw przygotuj igły do mikroiniekcji na pulpule igłowej i użyj mikroskopu stereoskopowego i znajdź kleszcze, aby złamać każdą końcówkę na ostrą krawędź. Po wrzuceniu oczyszczonego dwuniciowego RNA na lód, dodaj jeden mikrolitr 10-krotnego buforu iniekcyjnego do otrzymanego roztworu i użyj podwójnie destylowanej wody, aby zwiększyć objętość roztworu winylu do 10 mikrolitrów.Za pomocą pipety P10 wypełnij jedną z przygotowanych igieł do mikroiniekcji działającym dwuniciowym roztworem RNA i załaduj igłę do uchwytu na mikroigłę podłączonego do systemu mikroiniekcji, który wykorzystuje technologię wyrzutu ciśnieniowego. Włącz system mikroiniekcji i dopływ powietrza pod ciśnieniem i użyj mikrozaworu w systemie mikroiniekcji, aby ustawić ciśnienie wtrysku na 15 funtów ciśnienia na cal kwadratowy, a następnie użyj pokrętła regulacji czasu, aby ustawić czas wtrysku na sekundy. Aby skalibrować igłę do wstrzykiwań, należy ocenić objętość pęcherzyka płynu, który tworzy się na końcu igły podczas wstrzykiwania do powietrza w przypadku zarodka T. marmoratus, należy użyć optymalnego rozmiaru pęcherzyka od 100 do 200 mikronów.Igła do wstrzykiwań jest dobrej jakości, jeśli optymalne pęcherzyki można uzyskać przy ciśnieniu 15 funtów na cal kwadratowy przy czasie wstrzyknięcia wynoszącym około trzech sekund. Gdy ustawienie igły jest gotowe, ustaw igłę na płytce agarozowej zarodków tak, aby igła zbliżała się do zarodków pod kątem 45 do 60 stopni. Użyj mikromanipulatora, aby powoli przesunąć mikroigłę, aż końcówka dotknie powierzchni środka jednego zarodka, a następnie ostrożnie przesuń igłę do przodu, aż przebije powierzchnię zarodka.Gdy igła znajdzie się w zarodku, ostrożnie naciśnij przycisk wstrzykiwania mikrowstrzykiwacza, aby dostarczyć od jednego do dwóch nanolitrów dwuniciowego RNA do zarodka. Gdy całe RNA zostanie dostarczone, powoli wycofaj igłę z zarodka, nie powodując pęknięcia zarodka. Pomyślnie wstrzyknięte zarodki można rozpoznać po obecności kolorowej plamki w miejscu wstrzyknięcia.Po wstrzyknięciu wszystkich zarodków ostrożnie umieść naczynie w komorze wilgotnościowej w inkubatorze o temperaturze 25 stopni Celsjusza, ustawionym na 14-godzinny cykl światła i 10-godzinny cykl ciemności przez cztery do pięciu dni. Codziennie monitoruj postęp rozwoju zarodka pod mikroskopem stereoskopowym, aby zidentyfikować morfologicznie widoczne fenotypy knockdown. Wykorzystanie aparatu cyfrowego o wysokiej rozdzielczości do dokumentowania procesu rozwoju.Należy usunąć wszelkie martwe zarodki i codziennie uzupełniać wodę na płytce agarozy, aby uniknąć wysuszenia i rozprzestrzeniania się skażenia mikrobiologicznego na inne zarodki, które przeżyły, w okresie inkubacji. Przed zebraniem larwy najpierw dodaj 60 do 70 stopni Celsjusza 2% płynnej agarozy na małą szalkę Petriego. Gdy agaroza zastygnie, użyj kleszczy, aby zrobić jedną płytką grupę na larwę, która ma zostać wstrzyknięta do agarozy i delikatnie spuść wodę z kubków kultury larw.Po znieczuleniu użyj kleszczyków z miękkimi końcówkami, aby ostrożnie umieścić larwę na płytce unieruchamiającej, tak aby szyje i ciała znajdowały się w rowkach, ale ogon znajdował się nad powierzchnią agarozy. Kiedy wszystkie larwy zostaną umieszczone, przykryj każdą lawę grubą warstwą agarozy, która jest nadal płynna, ale nie jest niebezpiecznie gorąca i uwolnij wszelkie opowieści, które zostały przypadkowo przykryte w razie potrzeby. w przypadku mikroiniekcji dwuniciowego RNA należy załadować mikroigłę roztworem roboczym dwuniciowego RNA specyficznym dla genu, który jest przedmiotem zainteresowania, jak pokazano.Ponownie przeciągnąć tłok ręcznie sterowanej strzykawki do mikroiniekcji i załadować igłę do systemu mikroiniekcji. Unieruchomioną larwę umieścić pod mikroskopem stereoskopowym w taki sposób, aby miejsce wstrzyknięcia było wyrównane z trajektorią igły do mikroiniekcji pod stosunkowo płaskim kątem. Za pomocą mikromanipulatora ostrożnie wsunąć końcówkę igły w larwę i powoli i ostrożnie wywierać nacisk na strzykawkę, dostosowując ciśnienie wstrzyknięcia zgodnie z ruchem kolorowego płynu iniekcyjnego w igle, jeśli to konieczne.Po wstrzyknięciu całego RNA użyj miękkich kleszczy, aby uwolnić larwę z agarozy i umieść larwę w nowym pojemniku z wodą o temperaturze pokojowej o temperaturze od 25 do 28 stopni Celsjusza i 14-godzinnym lekkim, 10-godzinnym cyklu ciemności. W tej reprezentatywnej analizie trzy różne geny zostały powalone na różnych etapach rozwoju chrząszcza nurkującego T. marmoratus. Interferencja RNA odbywa się, jak wykazano przez wstrzyknięcie dwuniciowego RNA na bardzo wczesnym etapie embriogenezy.Niektóre zarodki nie przeżywają tego procesu i przechodzą w martwicę. Na tych obrazach kontrolują one poszczególne osoby i można zaobserwować osobę o nieco jaśniejszym kolorze oczu. U tego osobnika można zaobserwować poważniejszy nokdaun, w którym bardziej brzuszne części klastra są całkowicie niepigmentowane, ale u sojuszników nadal widać pewną pigmentację.Tutaj pokazano przykład innej osoby z zasadniczo całkowitą utratą pigmentu we wszystkich oczach. Lac2 powalony przez larwy skutkuje mniej pigmentowanym naskórkiem, uzyskano również jaśniejsze dorosłe osobniki z nieco zdeformowanymi skrzydłami, prawdopodobnie z powodu niezwykłej miękkości tkanki. Pamiętaj, aby uważnie obserwować zwierzęta, którym wstrzyknięto coś na co dzień i natychmiast usunąć wszelkie martwe osobniki.Siła tej techniki polega na tym, że można ją zastosować do genów wielu różnych organizmów. Technika ta została również szeroko i z powodzeniem zastosowana w ewolucyjnej biologii rozwoju.

rna-interference-aquatic-beetles-as-powerful-tool-for-manipulating

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Mikroiniekcja jest uznaną i skuteczną metodą wprowadzania obcych substancji do zapłodnionych embrionów danio pręgowanego. W niniejszej pracy prezentujemy niezawodną technikę mikroiniekcji służącą do przeprowadzania badań nad nadekspresją mRNA oraz wyciszaniem genów za pomocą morfolino oligonukleotydów u danio pręgowanego.

Mikroiniekcja mRNA i morfolinoowych oligonukleotydów antysensownych w embriony ryb danio pręgowanych.

Wykazano, że interferencja RNA jest bardzo skuteczną metodą analizy funkcji genów w rozwoju tchawki Drosophila. Przedstawiono szczegółowy protokół stosowany w laboratorium Jiang do wstrzykiwania dsRNA do embrionów muchy w celu wyciszenia ekspresji genów. Technika ta daje możliwość przesiewania genów niezbędnych do rozwoju tkanek i narządów u Drosophila.

Interferencja RNAi poprzez wstrzykiwanie dsRNA do embrionów Drosophila

RNA (RNAi) są podstawą badań nad Tribolium. W tym miejscu przedstawiamy przegląd naszej techniki RNAi larwalnych w Tribolium castaneum. Larwalne RNAi to prosta, ale potężna technika, która zapewnia szybki dostęp do fenotypów utraty funkcji, umożliwiając naukowcom badanie funkcji genów w różnych kontekstach.

Interferencja larwalnego RNA u chrząszcza mącznego (Tribolium castaneum)

Transgeniczne manipulacje i edycja genomu są kluczowe dla funkcjonalnego testowania ról genów i elementów cis-regulatorowych. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół mikroiniekcji w celu generowania modyfikacji genomowych (w tym fluorescencyjnych konstruktów transgenów reporterowych za pośrednictwem Tol2, TALEN-ów i CRISPR) dla wyłaniającej się ryby modelowej, ciernika trójkolcowego.

Mikroiniekcja do transgenezy i edycji genomu u cierników trójgrzbietowych

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli chrząszcza pośredniego zarodka, Dermestes maculatus (D. maculatus) w laboratorium. Udostępniamy również protokoły dla embrionalnego i rodzicielskiego RNAi oraz metody analizy fenotypów embrionalnych w celu zbadania funkcji genów u tego gatunku.

Hodowla i knockdown genów za pośrednictwem dwuniciowego RNA u chrząszcza skórnego, Dermestes maculatus

Ten artykuł wideo szczegółowo opisuje prostą metodologię in vivo, która może być używana do systematycznego i efektywnego charakteryzowania składników złożonych szlaków sygnałowych i sieci regulacyjnych w wielu zarodkach bezkręgowców.

Siła prostoty: zarodki jeżowców jako modele rozwojowe in vivo do badania złożonych interakcji sieci sygnalizacyjnych między komórkami

Tutaj prezentujemy protokół do analizy transferu informacji oscylacyjnych między komórkami za pomocą kontroli optogenetycznej i monitorowania ekspresji genów na żywo. Podejście to stanowi unikalną platformę do testowania funkcjonalnego znaczenia programów dynamicznej ekspresji genów w systemach wielokomórkowych.

Metoda optogenetyczna do kontroli i analizy wzorców ekspresji genów w interakcjach międzykomórkowych

Udostępniamy szczegółowy protokół hodowli, mikroiniekcji jaj i efektywnego krycia ognika Thermobia domestica w celu wytworzenia i utrzymania zmutowanych szczepów po edycji genomu.

Mikroiniekcja jaj i skuteczne krycie w celu edycji genomu u Firebrat Thermobia domestica

Tutaj opisujemy metody efektywnych iniekcji poczwarek i dorosłych osobników w Nasonia vitripennis jako dostępne alternatywy dla mikroiniekcji zarodków, umożliwiając funkcjonalną analizę interesujących genów za pomocą wyciszania RNA poprzez interferencję RNA (RNAi) lub nokautowania genów za pomocą edycji genomu CRISPR/Cas9.

Zastrzyki z poczwarek i dorosłych osobników do edycji genów RNAi i CRISPR w nosonia vitripennis

Udostępniamy szczegółowy protokół interferencji RNA za pośrednictwem elektroporacji u owadów z rzędu Odonata (ważki i ważki) przy użyciu ważki niebieskoogoniastej (Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Zygoptera) i ważki srokatej (Pseudothemis zonata: Libellulidae: Anisoptera).

Metoda interferencji RNA za pośrednictwem elektroporacji w Odonata

Poznaj technikę RNAi u chrząszczy wodnych Thermonectus marmoratus do badania funkcji genów w różnych etapach rozwojowych. Metoda mikroinjekcji dsRNA umożliwia analizę struktury i zachowania organizmów.

Interferencja RNA u chrząszczy wodnych jako potężne narzędzie do manipulowania ekspresją genów w określonych punktach rozwojowych (Wideo) | JoVE Journal

Interferencja RNA u chrząszczy wodnych jako potężne narzędzie do manipulowania ekspresją genów w określonych punktach rozwojowych

Przeglądaj więcej filmów