Wykrywanie Phytophthora capsici w wodzie do nawadniania za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli

Wykrywanie fitopatogenów jest kluczowym krokiem w zwalczaniu chorób roślin. Protokół ten zapewnia metodę szybkiego wykrywania zanieczyszczenia wody do nawadniania spowodowanego powszechnym patogenem bojowym przenoszonym przez wodę. Dzięki tej technice można przetworzyć i szybko wykryć konkretny patogen, taki jak Phytophthora capcici, z naszej dużej ilości wody do nawadniania, pozostając na miejscu.

Procedurę zademonstrują Owen Hudson, student studiów magisterskich z mojego laboratorium, oraz Sumyya Waliullah, doktor habilitowany z laboratorium dr Pingxi G, którzy skonfigurują pompę i filtr do wykrywania Phytophthora capcici w wodzie do nawadniania. Podłączyć kolbę filtracyjną do rurki podłączonej do pompy ręcznej i dopasowanego lejka Buchnera do gumowego korka w otworze kolby filtrującej. Następnie wlej do lejka kawałek bibuły filtracyjnej o odpowiedniej wielkości z retencją 15 mikronów.

Aby uzyskać próbki wody, należy pobrać wodę do nawadniania z docelowego źródła. Woda może zawierać niewielkie ilości gruzu, ale nie znaczne osady lub glebę. Powoli wlej od 50 do 1000 mililitrów wody testowej na bibułę filtracyjną wewnątrz lejka, używając pompki ręcznej do wytworzenia ssania, aby przeciągnąć wodę przez lejek.

Gdy cała woda zostanie przefiltrowana, użyj kleszczyków, aby usunąć bibułę filtracyjną z lejka. I użyj sterylnych nożyczek, aby pociąć papier na małe kawałki. Zanurz od ośmiu do 12 kawałków papieru w 400 mikrolitrach buforu ekstrakcyjnego w probówce o pojemności 1,5 mililitra na pięciominutową inkubację w temperaturze pokojowej.

Wiruj lub w inny sposób mieszaj papier przez 10 sekund raz na minutę. Pod koniec inkubacji użyj kleszczy, aby usunąć papier z jak najmniejszą ilością buforu. I powtórz licencję z następnym zestawem kawałków bibuły filtracyjnej.

W celu ekstrakcji DNA z próbek bibuły filtracyjnej dodaj do próbki 20 mikrolitrów proteinazy K i 10 mikrolitrów 10 nanogramów na mikrolitr RNA i inkubuj roztwór w temperaturze pokojowej przez 15 minut z wirowaniem lub wstrząsaniem co trzy minuty. Pod koniec inkubacji dodać do próbki 500 mikrolitrów kulek magnetycznych w buforze wiążącym i dobrze wymieszać przez wstrząsanie. Po pięciu minutach w temperaturze pokojowej umieścić probówkę i stojak separatora magnetycznego na dwie minuty przed wyjęciem i wyrzuceniem supernatantu.

Wyjmij rurkę z separatora magnetycznego i energicznie ponownie zawieś kulki w 500 mikrolitrach buforu do płukania. Po 30 sekundach zwróć probówkę do magnesu i odczekaj dwie minuty przed wyrzuceniem supernatantu. Powtórz pranie z 500 mikrolitrami buforu do płukania i 500 mikrolitrami 80% etanolu, jak właśnie pokazano.

I napędzaj powietrzem granulkę kulki magnetycznej przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji ponownie zawiesić kulki w 50 mikrolitrach buforu elucyjnego z pipetowaniem na jedną minutę, a następnie umieścić probówkę z powrotem na magnesie na dwie minuty, aby umożliwić zebranie supernatantu. Po przygotowaniu mieszanki starterów LAMP, jak wskazano w tabeli, dodaj do 2,5 mikrolitra mieszanki startera, 12,5 mikrolitra mieszanki lawowej LAMP mastermix, jeden mikrolitr wyekstrahowanego DNA i dziewięć mikrolitrów podwójnie destylowanej wody do probówki PCR i ustaw jedną kontrolę dodatnią i jedną ujemną.

inkubować wszystkie próbki w cieple 64 stopni Celsjusza przez 45 minut lub za pomocą instrumentu do amplifikacji Genie Three pod koniec inkubacji, załadować pięć mikrolitrów każdej amplifikowanej próbki na 1% żel agarozowy i zobrazować powstałe pasma na maszynie do obrazowania w ultrafiolecie. Jeśli użyto barwnika kalorymetrycznego, view zmiana koloru, aby określić wyniki jako dodatnie lub negatywne. Jeśli użyto przenośnego przyrządu do amplifikacji, view wykres amplifikacji na ekranie, aby określić wyniki.

Czas optyczny uruchamiania testu LAMP w temperaturze 64 stopni wynosi 45 minut, ponieważ najniższe stężenia, które były dodatnie do wykrywania, nie są wzmacniane do 40 minut, podczas gdy wyższe stężenia są wzmacniane po 20 minutach. Amplifikację można potwierdzić na 1% żelu agarozowym oznaczonym barwnikiem kwasu nukleinowego. Jak pokazano, konwencjonalny PCR jest 40 razy mniej czuły niż LAMP.

Wykrywanie 4,8 razy 10 do trzeciej zoospor na mililitr stężeń w najniższym. W tej analizie pobrano próbki wody z siedmiu stawów wykorzystywanych do komercyjnej produkcji warzyw w hrabstwie Tift w stanie Georgia. Trzy z nich wykazały pozytywne wyniki LAMP.

Jednak gdy próbki były testowane za pomocą konwencjonalnego PCR, zoospory wykryto tylko w jednej z trzech próbek dodatnich. W tej tabeli podsumowano różnice między metodami wykrywania wykorzystującymi takie zmienne jak czułość, czas, wymagane przygotowanie, materiały i koszt. LAMP jest najtańszą metodą spośród badanych metod, a także najszybszą, wymagającą tylko 30 do 60 minut na amplifikację w porównaniu z konwencjonalną amplifikacją PCR.

Korzystając z tego protokołu, DNA wyekstrahowane z blisko spokrewnionych patogenów nasion UMI nie powoduje wykrycia żadnej z próbek, co potwierdza specyficzność starterów. Upewnij się, że nie nalewasz próbki wody zbyt szybko i zachowaj ostrożność podczas dodawania wyekstrahowanego DNA do probówek LAMP, aby ograniczyć zanieczyszczenie. Po opracowaniu specyficznych zestawów starterów dla innych patogenów przenoszonych przez wodę, metody filtracji i kwasów lampowych można dostosować do innych patogenów.