Name: Kwantyfikacja spontanicznych strumieni Ca2+ i ich dalszych skutków w pierwotnych neuronach śródmózgowia myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji strumieni wapniowych w pierwotnych neuronach śródmózgowia myszy przy użyciu obrazowania GCaMP6f. Protokół umożliwia badanie apoptozy zależnej od wapnia w neuronach dopaminergicznych oraz przesiewanie związków neuroprotekcyjnych w kontekście choroby Parkinsona.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wspierane przez granty z American Parkinson Disease Association (APDA) i NIH R01NS115809-01 dla RS. Dziękujemy Texas A&M Institute for Genomic Medicine (TIGM) za zapewnienie ciężarnych myszy w czasie w celu wygenerowania pierwotnych kultur dopaminergicznych.

<ol><li>Marras, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+Parkinson%27s+disease+across+North+America%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Parkinson%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Prevalence of Parkinson's disease across North America.</a> NPJ Parkinson's Disease. 4, 21(2018).</li>
<li>Poewe, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Parkinson disease.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17013(2017).</li>
<li>Mehta, A., Prabhakar, M., Kumar, P., Deshmukh, R., Sharma, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitotoxicity%3A+bridge+to+various+triggers+in+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Excitotoxicity: bridge to various triggers in neurodegenerative disorders.</a> European Journal of Pharmacology. 698 (1-3), 6-18 (2013).</li>
<li>Ambrosi, G., Cerri, S., Blandini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+further+update+on+the+role+of+excitotoxicity+in+the+pathogenesis+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Transmission+%28Vienna%29%22%5BJournal%5D)">A further update on the role of excitotoxicity in the pathogenesis of Parkinson's disease.</a> Journal of Neural Transmission (Vienna). 121 (8), 849-859 (2014).</li>
<li>Dong, X. X., Wang, Y., Qin, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+excitotoxicity+and+their+relevance+to+pathogenesis+of+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmaceutica+Sinica+B%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of excitotoxicity and their relevance to pathogenesis of neurodegenerative diseases.</a> Acta Pharmaceutica Sinica B. 30 (4), 379-387 (2009).</li>
<li>Vieira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitotoxicity+through+Ca2%2B-permeable+AMPA+receptors+requires+Ca2%2B-dependent+JNK+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Excitotoxicity through Ca2+-permeable AMPA receptors requires Ca2+-dependent JNK activation.</a> Neurobiology of Disease. 40 (3), 645-655 (2010).</li>
<li>Sebe, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%2B%29-Permeable+AMPARs+Mediate+Glutamatergic+Transmission+and+Excitotoxic+Damage+at+the+Hair+Cell+Ribbon+Synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ca(2+)-Permeable AMPARs Mediate Glutamatergic Transmission and Excitotoxic Damage at the Hair Cell Ribbon Synapse.</a> Journal of Neuroscience. 37 (25), 6162-6175 (2017).</li>
<li>Brickley, S. G., Farrant, M., Swanson, G. T., Cull-Candy, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNQX+increases+GABA-mediated+synaptic+transmission+in+the+cerebellum+by+an+AMPA%2Fkainate+receptor-independent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">CNQX increases GABA-mediated synaptic transmission in the cerebellum by an AMPA/kainate receptor-independent mechanism.</a> Neuropharmacology. 41 (6), 730-736 (2001).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smoking-Relevant+Nicotine+Concentration+Attenuates+the+Unfolded+Protein+Response+in+Dopaminergic+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).</li>
<li>Henley, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+Identification+of+Living+Dopaminergic+Neurons+in+Midbrain+Cultures+Using+RNA+Sequencing+and+TH-promoter-driven+eGFP+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e54981(2017).</li>
<li>Douhou, A., Troadec, J. D., Ruberg, M., Raisman-Vozari, R., Michel, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+promotion+of+mesencephalic+dopaminergic+neurons+by+depolarizing+concentrations+of+K%2B+requires+concurrent+inactivation+of+NMDA+or+AMPA%2Fkainate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Survival promotion of mesencephalic dopaminergic neurons by depolarizing concentrations of K+ requires concurrent inactivation of NMDA or AMPA/kainate receptors.</a> Journal of Neurochemistry. 78 (1), 163-174 (2001).</li>
<li>Lavaur, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+noble+gas+xenon+provides+protection+and+trophic+stimulation+to+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">The noble gas xenon provides protection and trophic stimulation to midbrain dopamine neurons.</a> Journal of Neurochemistry. 142 (1), 14-28 (2017).</li>
<li>Kritis, A. A., Stamoula, E. G., Paniskaki, K. A., Vavilis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Researching+glutamate+-+induced+cytotoxicity+in+different+cell+lines%3A+a+comparative%2Fcollective+analysis%2Fstudy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Researching glutamate - induced cytotoxicity in different cell lines: a comparative/collective analysis/study.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 91(2015).</li>
<li>Gupta, K., Hardingham, G. E., Chandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor-dependent+glutamate+excitotoxicity+in+human+embryonic+stem+cell-derived+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor-dependent glutamate excitotoxicity in human embryonic stem cell-derived neurons.</a> Neuroscience Letters. 543, 95-100 (2013).</li>
<li>Surmeier, D. J., Obeso, J. A., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+neuronal+vulnerability+in+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Selective neuronal vulnerability in Parkinson disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (2), 101-113 (2017).</li>
<li>Ramirez, J. M., Tryba, A. K., Pena, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pacemaker+neurons+and+neuronal+networks%3A+an+integrative+view%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Pacemaker neurons and neuronal networks: an integrative view.</a> Current Opinion in Neurobiology. 14 (6), 665-674 (2004).</li>
<li>Guzman, J. N., Sanchez-Padilla, J., Chan, C. S., Surmeier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+pacemaking+in+substantia+nigra+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Robust pacemaking in substantia nigra dopaminergic neurons.</a> Journal of Neuroscience. 29 (35), 11011-11019 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisujemy długoterminowy pierwotny system hodowli komórek śródmózgowia brzusznego (VM) do analizy wysokiej zawartości apoptozy za pośrednictwem glutaminianu w neuronach. W badaniach wykorzystano pierwotne kultury dopaminergiczne śródmózgowia w celu wyjaśnienia mechanizmów ekscytotoksycznych w kontekście modeli PD 11,12. W tym badaniu stosujemy podejście kombinatoryczne przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników wapnia (GECI) do pomiaru aktywności Ca2 + i dalszego powiązania tej aktywności z dalszymi zmianami molekularnymi, takimi jak inicjacja apoptotycznych kaskad sygnalizacyjnych4. Metoda ta ma wiele zalet w porównaniu z innymi podobnymi systemami hodowli komórkowych. Ponieważ jesteśmy szczególnie zainteresowani ekscytotoksycznością w kontekście choroby Parkinsona, stosowanie pierwotnych kultur komórkowych VM jest idealne. Stosując różne techniki relokacji pola, takie jak szkiełka nakrywkowe z siatką lub zmotoryzowany stolik mikroskopu XY w połączeniu z barwieniem immunologicznym TH, możemy bezpośrednio badać specyficzne dla typu komórki efekty apoptozy za pośrednictwem glutaminianu w neuronach brzusznej śródmózgowia. Dodatkowo, 3-tygodniowy model hodowli komórkowej pozwala neuronom rozwinąć ich pełny, dojrzały profil molekularny, odzwierciedlający dorosłe neurony DA9. Poprzednie metody koncentrowały się głównie na zmianach molekularnych zachodzących po ekscytotoksyczności za pośrednictwem glutaminianu13,14. Model ten jest wyjątkowy ze względu na jego zdolność do korelowania ostrych zmian w fizjologii neuronów z dalszymi zdarzeniami molekularnymi w zidentyfikowanych typach komórek. Jednym z ograniczeń modelu hodowli pierwotnej jest to, że technika preparacji obejmuje całe brzuszne śródmózgowie, w tym neurony DA i GABA-ergiczne, a także neurony z SNc i VTA. Dowody sugerują, że neurony DA SNc mają selektywną podatność na wapń i ostateczną śmierć komórek w porównaniu z neuronami DA sąsiedniego VTA15. Niestety, odróżnienie SNc od neuronów VTA w kulturach embrionalnych okazało się trudne, ponieważ istnieje niewiele anatomicznych punktów orientacyjnych do zdefiniowania tych struktur w mózgu embrionalnym.
Pokazujemy, że technika hodowli pierwotnej pozwala na ilościowe określenie niejednorodnej spontanicznej aktywności Ca2 + (ryc. 1). Dlatego jest to idealny model systemu hodowli komórkowej do badania komórek aktywnych tonicznie, takich jak neurony dopaminergiczne śródmózgowia, neurony kory nowej i neurony GABA-ergiczne jądra nadskrzyżowaniowego (SCN)16,17. W większości zastosowań obrazowanieCa2+ nie osiąga takiej samej rozdzielczości czasowej jak elektrofizjologia. Dlatego jest prawdopodobne, że pojedyncze zdarzenie Ca2+ jest analogiczne do wybuchu neuronalnych potencjałów czynnościowych. Można to interpretować w ten sposób, że obrazowanie Ca2 + pozwala na stosunkowo dokładne pomiary nieprawidłowej aktywności pękania w komórkach stymulujących i dlatego jest odpowiednie do badania przesiewowego o wysokiej zawartości śmierci komórek ekscytotoksycznej za pośrednictwem Ca2 +.
Aby osiągnąć i utrzymać spontaniczną aktywnośćCa2+, ważne jest, aby zająć się dwoma kluczowymi punktami w protokole. Pierwszą z nich jest gęstość posiewu komórek po rozbiorze. W przypadku pierwotnych neuronów VM w poprzednich badaniach wykorzystano około 100 000 komórek/cm2 9,10. Dostosowaliśmy protokół do płytki o gęstości 200 000 komórek/cm2, co tworzy niejednorodny zakres spontanicznej aktywności i zwiększa liczbę dopaminergicznych neuronów VM obecnych na każdym szkiełku nakrywkowym. Ponieważ różne neurony stymulujące mają różne właściwości wypalania16, gęstość posiewu musi być dostosowana do badanego typu komórki i zoptymalizowana, aby osiągnąć idealny poziom spontanicznej aktywności. Drugi to czas inkubacji po zakażeniu wirusowym AAV. Podobnie jak gęstość posiewu, będzie to zależało od konkretnego kontekstu pytania badawczego i rodzaju użytego AAV. W przypadku zastosowanego tutaj specyficznego AAV, 5 dni inkubacji po infekcji wirusowej jest idealne do osiągnięcia pożądanych poziomów ekspresji białka, co pozwala na dynamiczne zmiany fluorescencji GCaMP w celu zarejestrowania aktywnościCa2+. Wiele czynników decyduje o tym, jak szybko i skutecznie AAV wyrazi swój ładunek, z których wiele wykracza poza zakres tej metody, ale pokrótce, ważne jest, aby wziąć pod uwagę aktywność promotora i tempo, w jakim białko ładunku dojrzewa i fałduje się.
Kolejną zaletą tej metody jest to, że pozwala ona na znaczną elastyczność w zakresie formatu, wektorów ekspresji, wykorzystania sprzętu do obrazowania oraz zakresu pytań naukowych, na które można odpowiedzieć. Ponadto metoda ta umożliwia badanie szerokiego zakresu szczegółowych pytań, które dotyczą ekscytotoksyczności za pośrednictwem glutaminianu w PD i innych modelach dysfunkcji układu nerwowego. Na przykład ekscytotoksyczność za pośrednictwem glutaminianu obejmuje wiele receptorów i kaskad sygnałowych5. Stosując tę metodę, jak wykazano w przypadku blokera AMPAR, NBQX na rycinie 1, możliwe jest wypreparowanie określonych składników odpowiedzi ekscytotoksycznego glutaminianu na poziomie fizjologicznym i molekularnym. Niewykluczone, że podobne podejście z wykorzystaniem inhibitorów systemów drugiego przekaźnika mogłoby zostać wykorzystane do określenia ich udziału w ekscytotoksyczności. Ponadto zastosowane tutaj AAV mogą być przystosowane do ekspresji GECI za pomocą promotorów specyficznych dla komórki lub czujników optogenetycznych wyrażonych przez AAV, które można wykorzystać do pomiaru innych parametrów, takich jak uwalnianie neuroprzekaźników.
Oprócz pierwotnych sekcji zarodków i obrazowania konfokalnego, większość protokołu wykorzystuje podstawowe umiejętności laboratoryjne, które nie wymagają specjalistycznego szkolenia. W związku z tym ograniczenia modelu obejmują trudność techniki preparacji embrionalnej, czas, w którym komórki muszą być hodowane, aby osiągnąć dojrzałość, oraz dostęp do mikroskopu konfokalnego lub podobnego aparatu do obrazowania. Wiele korzyści i elastyczność metody przeważają nad tymi ograniczeniami, co czyni ją idealnym modelem do badania roli ekscytotoksyczności za pośrednictwem glutaminianu w zaburzeniach układu nerwowego. Wreszcie, model ten może być skutecznym narzędziem do badań przesiewowych nowych związków pod kątem działania antyapoptotycznego i ich zdolności do zachowania zdrowia neuronów DA.

Choroba Parkinsona (PD) jest drugą najczęstszą chorobą neurodegeneracyjną na świecie, na którą nie ma lekarstwa. Szacunki sugerują, że częstość występowania PD będzie nadal rosła i przewiduje się, że do roku 2030 przekroczy 1 milion diagnoz w samych Stanach Zjednoczonych1. Ponieważ obecnie dostępnych jest niewiele skutecznych metod leczenia choroby Parkinsona, istnieje pilna potrzeba opracowania skuteczniejszych terapii. PD charakteryzuje się szybką i postępującą utratą neuronów dopaminy śródmózgowia (DA)2. Mechanizmy leżące u podstaw neurodegeneracji w chorobie Parkinsona są słabo poznane. Dowody wskazują na prawdopodobną zbieżność wielu mechanizmów, takich jak stres oksydacyjny i dysfunkcja mitochondriów itp., które przyczyniają się do inicjacji apoptotycznych kaskad sygnalizacyjnych i ostatecznej śmierci komórki3.
Jeden z takich zbieżnych mechanizmów, ekscytotoksyczność za pośrednictwem glutaminianu, jest zamieszana w wiele chorób neurodegeneracyjnych, w tym PD4. Podczas gdy uważa się, że ekscytotoksyczność za pośrednictwem glutaminianu działa głównie poprzez stymulację receptorów NMDA poprzez nadmierny wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia Ca2 + i ostateczną inicjację apoptozy, receptory AMPA przepuszczalne dla Ca2 + są również zaangażowane w odpowiedź ekscytotoksyczną5,6,7. Dlatego interesujące jest określenie udziału receptorów AMPA w apoptozie za pośrednictwem glutaminianu w modelu PD. Można to osiągnąć za pomocą NBQX, blokera AMPA i kainianu, który przy stężeniach mikromolowych jest selektywny dla receptorów AMPA8. Ekscytotoksyczność za pośrednictwem glutaminianu i kaskady sygnalizacji apoptotycznej są idealnym celem do pomiaru zakresu śmierci komórki i potencjalnym celem interwencji terapeutycznej. W związku z tym opracowanie metody o wysokiej zawartości do oceny modulacji aktywności wapnia za pośrednictwem glutaminianu i związanej z tym sygnalizacji w dół strumienia w pierwotnych neuronach brzusznego śródmózgowia (VM) byłoby cenne dla badań przesiewowych nowych metod leczenia ich zdolności do zachowania zdrowia neuronów.
Tutaj opracowaliśmy protokół, w którym wyrażamy genetycznie kodowany wskaźnik wapnia (GECI), GCaMP6f, używając AAV2/5 z promotorem ludzkiej synapsyny (hSyn) do pomiaru aktywności Ca2+ mysich pierwotnych neuronów VM w odpowiedzi na aplikację glutaminianu, który może być mierzony na poziomie fizjologicznym i molekularnym. To badanie przesiewowe o wysokiej zawartości można dostosować do odkrywania farmaceutyków lub metod leczenia, które modulują aktywność Ca2 + w celu zachowania zdrowia neuronów VM. Sugerujemy, że ten model hodowli pierwotnej jest skutecznym sposobem badań przesiewowych pod kątem nowych interwencji w chorobie Parkinsona, w oparciu o ich zdolność do zachowania zdrowia neuronów VM i łagodzenia progresji PD.

<table><tbody><tr><td>10% Formalina/PBS</td><td>VWR</td><td>100496-506</td><td></td></tr><tr><td>10X NA 0,3 Obiektyw zanurzeniowy</td><td>w wodzie Olympus</td><td>UMPLFLN10XW</td><td></td></tr><tr><td>12 mm okrągłe szkło osłonowe nr 1</td><td>Phenix Research Products</td><td>MS20-121</td><td></td></tr><tr><td>20X NA 0,85 Obiektyw zanurzeniowy w oleju</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO20XO</td><td></td></tr><tr><td>35 mm niepowlekane plastikowe naczynia do hodowli komórkowych</td><td>VWR</td><td>25382-348</td><td></td></tr><tr><td>40X NA 0,3 obiektyw zanurzeniowy</td><td>w wodzie Olympus</td><td>LUMPLFLN40XW</td><td></td></tr><tr><td>60X NA 1,35 obiektyw zanurzeniowy w oleju</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO60XO</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina (sód)</td><td>Gold Bio</td><td>A-301-25</td><td></td></tr><tr><td>B-27 suplement</td><td>ThermoFisher</td><td>17504044</td><td>50x kolba</td></tr><tr><td>Mikroskop lornetkowy</td><td>Kent Scientific</td><td>KSCXTS-1121</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia (CaCl2), bezwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>Kurczak poliklonalny anty-tyrozynowy Hydroksylaza</td><td>Abcam</td><td>ab76442</td><td></td></tr><tr><td>Deoksyrybonukleaza I (DNaza)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza, andydrow</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RDD016</td><td></td></tr><tr><td>DMEM + GlutaMAX medium</td><td>ThermoFisher</td><td>10569010</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Surowica dla koni</td><td>Termoaktywowany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iluminator światłowodowy 26050088 ThermoFisher, 100 V</td><td>Kent Scientific</td><td>KSC5410</td><td></td></tr><tr><td>Filter System, PES 22UM 250ML</td> Mikroskop konfokalny <td>VWR</td><td>28199-764</td><td></td></tr><tr><td>Fluoview 1000</td> Mikroskop konfokalny <td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoview 1200</td><td>Suplement Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>ThermoFisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Koza poliklonalna anty-kurczak Alexa Fluor 594</td><td>Abcam</td><td>ab150176</td><td></td></tr><tr><td>Kozia poliklonalna anty-królik Alexa Fluor 594</td><td>Abcam</td><td>ab150077</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór soli zrównoważony Hanksa (HBSS) 1x</td><td>TermoFisher</td><td>14175095</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR</td><td>101170-478</td><td></td></tr><tr><td>HeraCell 150 Inkubator CO2</td><td>Heraeus (ThermoFisher)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ v1.52e</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IRIS-Drobne nożyczki (okrągłe)-S/S Str/31*8mm/13cm</td><td>RWD</td><td>S12014-13</td><td></td></tr><tr><td>Monosiarczan kanamycyny</td><td>Gold Bio</td><td>K-120-25</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7506</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-glutaminowy</td><td>VWR</td><td>97061-634</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu (MgCl2), andydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>MPII Mini pompa perystaltyczna, 115/230 VAC, 50/60 Hz</td><td>Aparatura</td> <td>Harvarda70-2027</td><td></td></tr><tr><td>MULLER Micro Forceps-Str, końcówki 0,15 mm, 11 cm</td><td>RWD</td><td>F11014-11</td><td></td></tr><tr><td>NBQX</td><td>Hello Bio</td><td>HB0443</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże neuropodstawowe</td><td>ThermoFisher</td><td>21103049</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia (NGS)</td><td>Abcam</td><td>ab7481</td><td></td></tr><tr><td>Pochodzenie 2020</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pAAV.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40</td><td>Addgene</td><td>100837-AAV1</td><td>Miano: 1,00E+13 gc/ml</td></tr><tr><td>Papaina</td><td>Worthington Biomedical Corporation</td><td>LS003126</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td>10 000 U/ml</td></tr><tr><td>soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) 1x</td><td>ThermoFisher</td><td>10010049</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4832</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-ornityna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl), bezwodny</td> Rurki głowicy pompy <td>Sigma-Aldrich</td><td>746436</td><td></td></tr><tr>do aparatu<td>MPII</td><td>Harvard</td><td>55-4148</td><td></td></tr><tr><td>Królik monoklonalny anty-kaspaza-3</td><td>Abcam</td><td>ab32351</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl), bezwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td>BioXtra, &ge; 99,5% (GC)</td></tr><tr><td>Samica myszy C57BL/6 w ciąży</td><td>w ciąży Texas A& M Instytut Medycyny</td><td></td><td></td>Genomicznej</tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Niebieskie końcówki do pipet o szerokim otworze P1000</td><td>VWR</td><td>83007-380</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja spontanicznych strumieni ca2+ i ich dalszych skutków w pierwotnych neuronach śródmózgowia myszy

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Choroba Parkinsona (PD) jest wyniszczającym zaburzeniem neurodegeneracyjnym spowodowanym degeneracją neuronów dopaminergicznych (DA). Nadmierny napływ Ca2+ spowodowany nieprawidłową aktywacją receptorów glutaminianu powoduje ekscytotoksyczność DA i został zidentyfikowany jako ważny mechanizm utraty neuronów DA. W tym badaniu izolujemy, dysocjujemy i hodujemy neurony śródmózgowia z brzusznego śródmózgowia myszy (VM) zarodków myszy ED14. Następnie zakażamy długoterminowe pierwotne hodowle śródmózgowia myszy wirusem związanym z adenowirusem (AAV) wyrażającym genetycznie kodowany wskaźnik wapnia, GCaMP6f pod kontrolą swoistego dla ludzkich neuronów promotora synapsyny, hSyn. Korzystając z obrazowania konfokalnego na żywo, pokazujemy, że hodowane neurony śródmózgowia myszy wykazują spontaniczne strumienie Ca2 + wykryte przez AAV-hSyn-GCaMP6f. Kąpielowe stosowanie glutaminianu do kultur śródmózgowia powoduje nieprawidłowe podwyższenie wewnątrzkomórkowego Ca2 + w neuronach, czemu towarzyszy aktywacja kaspazy-3 w neuronach DA, jak wykazano za pomocą barwienia immunologicznego. Techniki identyfikacji apoptozy za pośrednictwem glutaminianu w pierwotnych neuronach DA myszy mają ważne zastosowania w badaniach przesiewowych o wysokiej zawartości leków, które zachowują zdrowie neuronów DA.

Po wstępnym hodowaniu komórek, szalki z kulturami VM w 14 DIV potraktowano 1 µL AAV hSyn-GCaMP6f i pozostawiono na 5 dni w celu ekspresji wirusowej. W dniu obrazowania przygotowano świeży bufor rejestracyjny HEPES. Zastosowano dwa warianty; w pierwszym podawano 20 µM glutaminianu przez 10 min, natomiast w drugim podanie 10 µM NBQX przez 5 min poprzedzało 10 min wspólnego podawania 10 µM NBQX + 20 µM glutaminianu. W obu wariantach zaobserwowano heterogeniczne i spontaniczne zmiany fluorescencji GCaMP6f, co wskazuje na spontaniczne przepływy Ca2+, jak pokazano na reprezentatywnych przebiegach (Rysunek 1A,B, Film uzupełniający 1-2). Podanie 20 µM glutaminianu wywołało silną i trwałą odpowiedź Ca2+ zarówno w neuronach spontanicznie aktywnych, jak i spoczynkowych (Rysunek 1A, Film uzupełniający 1). Podanie 10 µM NBQX zredukowało aktywność spontaniczną i częściowo zablokowało odpowiedź na glutaminian (Rysunek 1B, Film uzupełniający 2). Stopień, w jakim podanie glutaminianu stymulowało odpowiedź Ca2+ w każdym wariancie, określono ilościowo za pomocą pola pod krzywą, amplitudy szczytowej oraz czasu opóźnienia odpowiedzi. Zarówno pole pod krzywą, jak i amplituda szczytowa były podobne dla wariantów traktowanych glutaminianem oraz NBQX + glutaminianem (Rysunek 1C), podczas gdy czas opóźnienia odpowiedzi był znacząco zwiększony w wariancie NBQX + glutaminian (Rysunek 2A,B). Oprócz ilościowego określenia odpowiedzi Ca2+ na traktowanie glutaminianem, próbki utrwalono i zabarwiono przeciwciałem anty-kaspaza-3 jako miarę apoptozy indukowanej glutaminianem. Zaobserwowano różny zakres aktywacji kaspazy-3 w poszczególnych wariantach (Rysunek 3A,B). Aktywację kaspazy-3 określono ilościowo poprzez pomiar powierzchni i średniej intensywności kaspazy-3. W porównaniu z nieleczonymi komórkami kontrolnymi, średnia powierzchnia komórek z aktywacją kaspazy-3 w warunkach z glutaminianem oraz NBQX + glutaminianem wykazywała tendencję do istotności statystycznej (Rysunek 3B). Średnia intensywność kaspazy-3 była znacząco wyższa w wariantach z glutaminianem i NBQX + glutaminian w porównaniu z nieleczonymi kontrolami (Rysunek 3B). Wspólnie wyniki te demonstrują wysokoprzepustowy schemat, w którym apoptozę neuronów można mierzyć poprzez ilościowe określanie odpowiedzi Ca2+ na czynniki ekscytotoksyczne, a następnie uzupełnić to analizą późniejszych zdarzeń apoptotycznych, takich jak aktywacja kaspazy-3 w tym samym zestawie kultur.
<img alt="Wykres analizy zdarzeń wapniowych; wpływ glutaminianu i NBQX na dynamikę Ca²⁺." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61481/61481fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Hodowlane neurony brzusznego śródmózgowia wykazują spontaniczną aktywność Ca2+ i są silnie stymulowane przez aplikację glutaminianu. (A) Reprezentatywne ślady spontanicznej aktywności Ca2+ w neuronach VM oraz ich odpowiedź na aplikację 20 µM glutaminianu. (B) Reprezentatywne ślady spontanicznej aktywności Ca2+ w neuronach VM oraz ich odpowiedź na aplikację 10 µM NBQX + 20 µM glutaminianu. (C) Dane populacyjne przedstawiające pole pod krzywą oraz amplitudę szczytową śladów Ca2+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61481/61481fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Zmiany latencji w odpowiedzi na glutaminian; wykres blokady AMPAR; amplituda ΔF/F₀; analiza statystyczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61481/61481fig02v3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Blokada AMPAR za pomocą NBQX opóźnia odpowiedź na aplikację glutaminianu w hodowanych neuronach brzusznego śródmózgowia.(A) Reprezentatywne zapisy Ca2+ dla odpowiedzi wywołanych glutaminianem (szary) oraz NBQX + glutaminianem (niebieski). Średnie zapisy Ca2+ dla glutaminianu (czarny) oraz NBQX + glutaminianu (czerwony) przedstawiono w formie nałożonej. (B) Dane populacyjne przedstawiające latencję odpowiedzi dla reakcji wywołanych glutaminianem oraz NBQX + glutaminianem. Procentowa zmiana między warunkami z glutaminianem a NBQX + glutaminianem jest wyświetlana w prawym panelu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61481/61481fig02v3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza apoptozy neuronów; obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej dla kaspazy-3 i TH; wykres powierzchni neuronów DA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61481/61481fig03v3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Aplikacja glutaminianu zwiększa ekspresję kaspazy-3 w neuronach brzusznej części śródmózgowia wykazujących obecność hydroksylazy tyrozynowej (TH). (A) Reprezentatywne obrazy konfokalne kultur VM poddanych immunobarwieniu na kaspazę-3 (zielony) i TH (czerwony), pasek skali = 10 µm. (B) Dane populacyjne przedstawiające powierzchnię neuronów DA oraz średnią wartość szarości ekspresji kaspazy-3 w każdej z warunków. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61481/61481fig03v3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Film uzupełniający 1: Spontaniczna aktywność Ca2+ oraz odpowiedź na aplikację glutaminianu. 
Spontaniczne przepływy Ca2+ w obecności buforu rejestrującego HEPES (0-300 s), a następnie aplikacja 20 µM glutaminianu (301-600 s). Pasek skali = 50 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61481/Supplementary_Movie%201_glutamate_ver_2.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
Film uzupełniający 2: Spontaniczna aktywność Ca2+ i odpowiedź na aplikację NBQX + glutaminianu. 
Spontaniczne przepływy Ca2+ w obecności buforu rejestracyjnego HEPES (0-300 s), a następnie aplikacja 10 µM NBQX (301-600 s) oraz 10 µM NBQX + 20 µM glutaminianu (601-900 s). Pasek skali = 50 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61481/Supplementary_Movie_2_NBQX_glut.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>

Tutaj prezentujemy protokół pomiaru in vitro strumieni Ca2+ w neuronach śródmózgowia i ich dalszego wpływu na kaspazę-3 za pomocą pierwotnych hodowli śródmózgowia myszy. Model ten można wykorzystać do badania zmian patofizjologicznych związanych z nieprawidłową aktywnością Ca2 + w neuronach śródmózgowia oraz do badań przesiewowych nowych terapii pod kątem właściwości antyapoptotycznych.

Kwantyfikacja spontanicznych strumieni Ca2+ i ich dalszych skutków w pierwotnych neuronach śródmózgowia myszy

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by the degeneration of dopaminergic (DA) neurons. Excessive Ca2+ influx ...

Protokół ten określa ilościowo strumienie wapnia w neuronach dopaminergicznych, które są tracone w chorobie Parkinsona. Jest to przydatne do zrozumienia, w jaki sposób nieprawidłowy wapń powoduje utratę neuronów dopaminergicznych w chorobie Parkinsona. Po raz pierwszy wykazaliśmy spontaniczne przepływy wapnia w hodowanych pierwotnych neuronach śródmózgowia.Metoda ta może być wykorzystana do analizy specyficznych wkładów receptorów zaangażowanych w apoptozę za pośrednictwem wapnia. Nasza metoda umożliwia badania przesiewowe leków o wysokiej zawartości w celu odkrycia specyficznych i skutecznych związków neuroprotekcyjnych w chorobie Parkinsona. Te związki neuroprotekcyjne zapobiegałyby apoptozie za pośrednictwem wapnia w neuronach dopaminergicznych.Zacznij od przygotowania jednego mililitra pożywki DMEM bez surowicy z jednym mikrolitrem hSyn-GCaMP6f AAV na danie. Odessać pożywkę do hodowli komórkowej z każdej płytki i zastąpić ją jednym mililitrem przygotowanego DMEM z hSyn-GCaMP6f. Umieść naczynia z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na godzinę.Po inkubacji odessać pożywkę za pomocą AAV i zastąpić ją trzema mililitrami pożywki do hodowli komórkowych. Inkubuj naczynia w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć do siedmiu dni. Zmiana pożywki co dwa do trzech dni przez cały okres infekcji wirusowej.Przygotuj jeden litr bufora zapisowego HEPES, 200 mililitrów 20 mikromolowego buforu zapisującego glutaminianu i 200 mililitrów 10 mikromolowego bufora zapisowego NBQX zgodnie ze wskazówkami rękopisu. Napełnij sterylną 35-milimetrową szalkę Petriego trzema mililitrami buforu nagrywającego. Wyjąć szalkę Petriego z zakażonymi kulturami z inkubatora, a następnie ostrożnie chwycić krawędź jednego szkiełka nakrywkowego za pomocą kleszczyków z cienką końcówką i przenieść go do naczynia z buforem rejestrującym.Umieść pozostałe szkiełko nakrywkowe w podłożu z powrotem do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza i przetransportuj szalkę z buforem rejestrującym do mikroskopu konfokalnego. Uruchom oprogramowanie do obrazowania. Podczas inicjalizacji uruchom pompę perystaltyczną i umieść linię w buforze nagrywającym.Następnie skalibruj przepływ do dwóch mililitrów na minutę. Przenieść zakażone szkiełko nakrywkowe z płytki Petriego do kąpieli nagraniowej za pomocą cienkich kleszczy. Korzystając z 10-krotnego zanurzenia w wodzie i światła jasnego pola, znajdź płaszczyznę ostrości i poszukaj obszaru o dużej gęstości ciał komórek neuronowych, a następnie przełącz się na obiektyw 40X i ponownie ustaw ostrość próbki.Wybierz i zastosuj AlexaFluor 488 w oknie listy barwników. Aby zapobiec prześwietleniu i wybielaniu fotograficznemu fluoroforów, zacznij od niskich ustawień HV i mocy lasera. Dla kanału AlexaFluor 488 ustaw HV na 500, wzmocnienie na 1x, a przesunięcie na zero.Ustaw moc na 5% dla linii laserowej 488. Zwiększ rozmiar otworu do 300 mikrometrów i użyj opcji skanowania ostrości x2, aby optymalnie dostosować sygnały emisyjne do poziomów nasycenia. Ustawienia można następnie dostosować, aby uzyskać optymalną widoczność każdego kanału.Po zoptymalizowaniu ustawień mikroskopu przesuń stolik, aby zlokalizować obszar z wieloma komórkami wykazującymi spontaniczne zmiany fluorescencji GCaMP6f i skup się na żądanej płaszczyźnie do obrazowania. Użyj narzędzia Przytnij prosto, aby przyciąć klatkę obrazowania do rozmiaru, który pozwala osiągnąć odstęp między klatkami wynoszący nieco poniżej jednej sekundy. Ustaw okno interwału na wartość 1,0, a okno Num na 600.Aby nagrać film z serii t, wybierz opcję Czas, a następnie użyj opcji skanowania Xyt, aby rozpocząć obrazowanie. Obserwuj pasek postępu obrazowania i przesuń linię z bufora zapisu HEPES do bufora zapisu glutaminianu o stężeniu 20 mikromolów w odpowiednim punkcie czasowym. Po zakończeniu obrazowania wybierz przycisk Zakończono serię i zapisz gotowy film z serii t.Kontynuuj perfuzję glutaminianu przez dodatkowe pięć minut, tak aby kultura neuronów była wystawiona na działanie glutaminianu przez łącznie 10 minut. Powtórz ten proces dla każdego arkusza nakrywkowego, który ma zostać zobrazowany. Możliwe jest przeglądanie śladów wapnia i ciał komórek nerwowych bezpośrednio po eksperymencie.Użyj narzędzia Elipsa, aby narysować żądaną liczbę ROI wokół somy neuronalnej. I użyj przycisku Analiza serii, aby zwizualizować ślady. Po dodatkowych pięciu minutach ekspozycji na glutaminian usuń szkiełko nakrywkowe z kąpieli za pomocą cienkich kleszczyków i umieść je z powrotem na szalce Petriego z buforem rejestrującym, aż do zakończenia całego obrazowania.W dniu obrazowania posiewy VM potraktowano glutaminianem lub kombinacją glutaminianu i NBQX. W obu warunkach obserwowano niejednorodne i spontaniczne zmiany w kwiatostancji GCaMP6f wskazujące na spontaniczne przepływy wapnia. Zastosowanie glutaminianu wywołało silną i trwałą odpowiedź wapniową zarówno w neuronach spontanicznie aktywnych, jak i w stanie spoczynku.Stosowanie NBQX zmniejszyło spontaniczną aktywność i częściowo zablokowało odpowiedź glutaminianu. Stopień, w jakim aplikacja glutaminianu stymulowała odpowiedź wapnia w każdym stanie, określono ilościowo przy użyciu obszaru pod krzywą, amplitudy piku i opóźnienia w odpowiedzi. Opóźnienie odpowiedzi wzrosło w warunkach NBQX i glutaminianu.Aby zmierzyć apoptozę za pośrednictwem glutaminianu, komórki utrwalono i wybarwiono przeciwciałem anty-kaspaza-3. Średnia intensywność kaspazy-3 była istotnie wyższa w obu warunkach leczenia w porównaniu z nieleczoną grupą kontrolną. Bardziej szczegółową analizę wzbudzonej toksycznej śmierci komórek można przeprowadzić, zliczając liczbę neuronów dopaminergicznych z dodatnim wynikiem hydroksylazy tyrozynowej w stanie kontrolnym i leczonym glutaminianem.Technika ta utorowała drogę do zrozumienia względnego udziału różnych receptorów i kanałów żelaza zaangażowanych w apoptozę za pośrednictwem wapnia w neuronach dopaminergicznych.

quantifying-spontaneous-ca2-fluxes-their-downstream-effects-primary

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje sposób ilościowego oznaczania liczby synaps zarówno w dysocjowanych kulturach neuronowych, jak i w przekrojach mózgu z wykorzystaniem immunocytochemii. Przy użyciu przeciwciał specyficznych dla poszczególnych przedziałów komórkowych znakujemy terminale presynaptyczne oraz miejsca specjalizacji postsynaptycznej. Synapsy definiujemy jako punkty kolokalizacji sygnałów generowanych przez te markery.

Ilościowe oznaczanie synaps: test oparty na immunocytochemii do ilościowego oznaczania liczby synaps

Ten film pokazuje infekowanie pierwotnych neuronów śródmózgowia myszy wirusami związanymi z adenowirusami przenoszącymi fluorescencyjny wskaźnik wapnia. Fluorescencja wskaźnika potwierdza udaną infekcję i umożliwia monitorowanie infekcji neuronalnej w czasie rzeczywistym.

Infekowanie pierwotnych neuronów śródmózgowia myszy zmodyfikowanymi wirusami związanymi z adenowirusami

Źródło: Bancroft, E. A., et al. Kwantyfikacja spontanicznych strumieni ca2+{ i ich dalsze efekty w pierwotnych neuronach śródmózgowia myszy. J. Vis. Exp. (2020) {{TAG_ 46}}Ten film pokazuje wizualizację w czasie rzeczywistym napływu wapnia do neuronów brzusznego śródmózgowia pochodzących z zarodków myszy. Wykorzystując wektor wirusowy do ekspresji wskaźnika wapnia, neurony są obrazowane pod mikroskopem konfokalnym w celu śledzenia zmian intensywności fluorescencji podczas spontanicznej i...

Wizualizacja napływu wapnia do neuronów brzusznego śródmózgowia pochodzących z zarodków myszy

Opisujemy eksperymentalną procedurę pomiaru aktywności neuronalnej za pomocą podwójnych okien optycznych nad obustronnymi głównymi korami somatosensorycznymi (S1) u transgenicznych myszy Thy1-GCaMP6s przy użyciu mikroskopii 2-fotonowej (2P) in vivo.

Obrazowanie aktywności neuronalnej w pierwotnej korze somatosensorycznej przy użyciu transgenicznych myszy Thy1-GCaMP6s

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania sygnalizacji wapniowej w populacjach poszczególnych typów komórek w mysim złączu nerwowo-mięśniowym.

Ex vivo Obrazowanie specyficznej dla komórki sygnalizacji wapniowej w trójdzielnej synapsie przepony myszy

Prezentujemy dwuczęściowy protokół, który łączy fluorescencyjne obrazowanie wapnia z hybrydyzacją in situ, pozwalając eksperymentatorowi skorelować wzorce aktywności wapnia z profilami ekspresji genów na poziomie pojedynczej komórki.

Fluorescencyjne obrazowanie wapnia i późniejsza hybrydyzacja in situ w celu charakterystyki prekursorów neuronalnych u Xenopus laevis

Opisano dwie powiązane metody wizualizacji zdarzeń subkomórkowych wymaganych do transmisji synaptycznej. Protokoły te umożliwiają monitorowanie w czasie rzeczywistym dynamiki napływu presynaptycznego wapnia i fuzji błony pęcherzyków synaptycznych przy użyciu obrazowania żywych komórek neuronów hodowanych in vitro.

Fluorescencyjny pomiar funkcji synaptycznych w czasie rzeczywistym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego

Ten protokół opisuje chirurgiczną ekspozycję zwoju korzenia grzbietowego (DRG), a następnie GCaMP3 (genetycznie kodowany wskaźnik Ca2+; Białko zielonej fluorescencji-białko kalmoduliny-M13 3) Ca2 + obrazowanie zespołów neuronalnych przy użyciu myszy Pirt-GCaMP3 przy jednoczesnym stosowaniu różnych bodźców do ipsilateralnej tylnej łapy.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego

Podstawowe obszary czuciowe w korze nowej wykazują unikalne spontaniczne działania podczas rozwoju. W tym artykule opisano, jak wizualizować aktywność poszczególnych neuronów i podstawowych obszarów czuciowych w celu analizy synchronicznych działań specyficznych dla danego obszaru u noworodków myszy in vivo.

Wizualizacja in vivo spontanicznej aktywności w korze czuciowej noworodków myszy w rozdzielczości pojedynczego neuronu

Protokół ten opisuje obrazowanie wapnia in vivo GCaMP nienaruszonych neuronów zwoju trójdzielnego (TG). Opis ten obejmuje chirurgię ekspozycji na TG, obrazowanie neuronów TG za pomocą mikroskopii konfokalnej in vivo , zastosowanie bodźców somatycznych podczas obrazowania mikroskopowego neuronów TG oraz analizę danych obrazowania wapnia GCaMP in vivo .

In vivo (in vivo ) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach nerwu trójdzielnego

Poznaj metodę kwantyfikacji strumieni wapniowych w pierwotnych neuronach śródmózgowia myszy przy użyciu obrazowania GCaMP6f. Protokół umożliwia badanie apoptozy zależnej od wapnia w neuronach dopaminergicznych oraz przesiewanie związków neuroprotekcyjnych w kontekście choroby Parkinsona.

Kwantyfikacja spontanicznych strumieni Ca²⁺ i ich dalszych skutków w pierwotnych neuronach śródmózgowia myszy

Przeglądaj więcej filmów