Kwantyfikacja spontanicznych strumieni Ca2+ i ich dalszych skutków w pierwotnych neuronach śródmózgowia myszy
9 września 2020
Tutaj prezentujemy protokół pomiaru in vitro strumieni Ca2+ w neuronach śródmózgowia i ich dalszego wpływu na kaspazę-3 za pomocą pierwotnych hodowli śródmózgowia myszy. Model ten można wykorzystać do badania zmian patofizjologicznych związanych z nieprawidłową aktywnością Ca2 + w neuronach śródmózgowia oraz do badań przesiewowych nowych terapii pod kątem właściwości antyapoptotycznych.
Protokół ten określa ilościowo strumienie wapnia w neuronach dopaminergicznych, które są tracone w chorobie Parkinsona. Jest to przydatne do zrozumienia, w jaki sposób nieprawidłowy wapń powoduje utratę neuronów dopaminergicznych w chorobie Parkinsona. Po raz pierwszy wykazaliśmy spontaniczne przepływy wapnia w hodowanych pierwotnych neuronach śródmózgowia.
Metoda ta może być wykorzystana do analizy specyficznych wkładów receptorów zaangażowanych w apoptozę za pośrednictwem wapnia. Nasza metoda umożliwia badania przesiewowe leków o wysokiej zawartości w celu odkrycia specyficznych i skutecznych związków neuroprotekcyjnych w chorobie Parkinsona. Te związki neuroprotekcyjne zapobiegałyby apoptozie za pośrednictwem wapnia w neuronach dopaminergicznych.
Zacznij od przygotowania jednego mililitra pożywki DMEM bez surowicy z jednym mikrolitrem hSyn-GCaMP6f AAV na danie. Odessać pożywkę do hodowli komórkowej z każdej płytki i zastąpić ją jednym mililitrem przygotowanego DMEM z hSyn-GCaMP6f. Umieść naczynia z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na godzinę.
Po inkubacji odessać pożywkę za pomocą AAV i zastąpić ją trzema mililitrami pożywki do hodowli komórkowych. Inkubuj naczynia w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć do siedmiu dni. Zmiana pożywki co dwa do trzech dni przez cały okres infekcji wirusowej.
Przygotuj jeden litr bufora zapisowego HEPES, 200 mililitrów 20 mikromolowego buforu zapisującego glutaminianu i 200 mililitrów 10 mikromolowego bufora zapisowego NBQX zgodnie ze wskazówkami rękopisu. Napełnij sterylną 35-milimetrową szalkę Petriego trzema mililitrami buforu nagrywającego. Wyjąć szalkę Petriego z zakażonymi kulturami z inkubatora, a następnie ostrożnie chwycić krawędź jednego szkiełka nakrywkowego za pomocą kleszczyków z cienką końcówką i przenieść go do naczynia z buforem rejestrującym
.Umieść pozostałe szkiełko nakrywkowe w podłożu z powrotem do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza i przetransportuj szalkę z buforem rejestrującym do mikroskopu konfokalnego. Uruchom oprogramowanie do obrazowania. Podczas inicjalizacji uruchom pompę perystaltyczną i umieść linię w buforze nagrywającym.
Następnie skalibruj przepływ do dwóch mililitrów na minutę. Przenieść zakażone szkiełko nakrywkowe z płytki Petriego do kąpieli nagraniowej za pomocą cienkich kleszczy. Korzystając z 10-krotnego zanurzenia w wodzie i światła jasnego pola, znajdź płaszczyznę ostrości i poszukaj obszaru o dużej gęstości ciał komórek neuronowych, a następnie przełącz się na obiektyw 40X i ponownie ustaw ostrość próbki.
Wybierz i zastosuj AlexaFluor 488 w oknie listy barwników. Aby zapobiec prześwietleniu i wybielaniu fotograficznemu fluoroforów, zacznij od niskich ustawień HV i mocy lasera. Dla kanału AlexaFluor 488 ustaw HV na 500, wzmocnienie na 1x, a przesunięcie na zero.
Ustaw moc na 5% dla linii laserowej 488. Zwiększ rozmiar otworu do 300 mikrometrów i użyj opcji skanowania ostrości x2, aby optymalnie dostosować sygnały emisyjne do poziomów nasycenia. Ustawienia można następnie dostosować, aby uzyskać optymalną widoczność każdego kanału.
Po zoptymalizowaniu ustawień mikroskopu przesuń stolik, aby zlokalizować obszar z wieloma komórkami wykazującymi spontaniczne zmiany fluorescencji GCaMP6f i skup się na żądanej płaszczyźnie do obrazowania. Użyj narzędzia Przytnij prosto, aby przyciąć klatkę obrazowania do rozmiaru, który pozwala osiągnąć odstęp między klatkami wynoszący nieco poniżej jednej sekundy. Ustaw okno interwału na wartość 1,0, a okno Num na 600.
Aby nagrać film z serii t, wybierz opcję Czas, a następnie użyj opcji skanowania Xyt, aby rozpocząć obrazowanie. Obserwuj pasek postępu obrazowania i przesuń linię z bufora zapisu HEPES do bufora zapisu glutaminianu o stężeniu 20 mikromolów w odpowiednim punkcie czasowym. Po zakończeniu obrazowania wybierz przycisk Zakończono serię i zapisz gotowy film z serii t.
Kontynuuj perfuzję glutaminianu przez dodatkowe pięć minut, tak aby kultura neuronów była wystawiona na działanie glutaminianu przez łącznie 10 minut. Powtórz ten proces dla każdego arkusza nakrywkowego, który ma zostać zobrazowany. Możliwe jest przeglądanie śladów wapnia i ciał komórek nerwowych bezpośrednio po eksperymencie.
Użyj narzędzia Elipsa, aby narysować żądaną liczbę ROI wokół somy neuronalnej. I użyj przycisku Analiza serii, aby zwizualizować ślady. Po dodatkowych pięciu minutach ekspozycji na glutaminian usuń szkiełko nakrywkowe z kąpieli za pomocą cienkich kleszczyków i umieść je z powrotem na szalce Petriego z buforem rejestrującym, aż do zakończenia całego obrazowania.
W dniu obrazowania posiewy VM potraktowano glutaminianem lub kombinacją glutaminianu i NBQX. W obu warunkach obserwowano niejednorodne i spontaniczne zmiany w kwiatostancji GCaMP6f wskazujące na spontaniczne przepływy wapnia. Zastosowanie glutaminianu wywołało silną i trwałą odpowiedź wapniową zarówno w neuronach spontanicznie aktywnych, jak i w stanie spoczynku.
Stosowanie NBQX zmniejszyło spontaniczną aktywność i częściowo zablokowało odpowiedź glutaminianu. Stopień, w jakim aplikacja glutaminianu stymulowała odpowiedź wapnia w każdym stanie, określono ilościowo przy użyciu obszaru pod krzywą, amplitudy piku i opóźnienia w odpowiedzi. Opóźnienie odpowiedzi wzrosło w warunkach NBQX i glutaminianu.
Aby zmierzyć apoptozę za pośrednictwem glutaminianu, komórki utrwalono i wybarwiono przeciwciałem anty-kaspaza-3. Średnia intensywność kaspazy-3 była istotnie wyższa w obu warunkach leczenia w porównaniu z nieleczoną grupą kontrolną. Bardziej szczegółową analizę wzbudzonej toksycznej śmierci komórek można przeprowadzić, zliczając liczbę neuronów dopaminergicznych z dodatnim wynikiem hydroksylazy tyrozynowej w stanie kontrolnym i leczonym glutaminianem.
Technika ta utorowała drogę do zrozumienia względnego udziału różnych receptorów i kanałów żelaza zaangażowanych w apoptozę za pośrednictwem wapnia w neuronach dopaminergicznych.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół pomiaru przepływów jonów wapnia (Ca2+) in vitro w neuronach śródmózgowia z wykorzystaniem pierwotnych kultur śródmózgowia myszy. Model ten pozwala badać zmiany patologiczne związane z nieprawidłową aktywnością wapnia, szczególnie w kontekście choroby Parkinsona, i stanowi platformę do przesiewania potencjalnych terapeutyków neuroprotekcyjnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Neurofarmakologia
Wstęp
- Przepływ jonów wapnia w neuronach odgrywa kluczową rolę w licznych procesach komórkowych.
- Utrata neuronów dopaminergicznych jest cechą charakterystyczną choroby Parkinsona.
- Badanie analizuje, w jaki sposób nieprawidłowe poziomy wapnia indukują apoptozę w neuronach dopaminergicznych.
- Zastosowanie glutaminianu oraz NBQX pomaga ocenić odpowiedzi zależne od wapnia oraz efekty neuroprotekcyjne.
Cel badania
- Pomiar spontanicznych przepływów wapnia w pierwotnych kulturach neuronów śródmózgowia.
- Zrozumienie roli receptorów w wapniowo-zależnej śmierci komórkowej.
- Umożliwienie wysokoprzepustowych przesiewów (high-content screening) w poszukiwaniu związków neuroprotekcyjnych.
Zastosowane metody
- Wykorzystano hodowle komórkowe pochodzące z pierwotnych neuronów środkowego mózgu myszy.
- Obrazowanie wapnia przeprowadzono z użyciem GCaMP6f w celu monitorowania zmian fluorescencji.
- Kluczowe procedury obejmowały przygotowanie pożywki hodowlanej oraz aplikację glutaminianu.
- Obrazowanie w czasie rzeczywistym wykonano pod mikroskopem przy starannym doborze parametrów.
- Komórki poddano działaniu glutaminianu lub kombinacji glutaminianu i NBQX.
Główne wyniki
- Reakcje wapniowe różniły się w zależności od warunków traktowania, wykazując zarówno zmiany spontaniczne, jak i indukowane glutaminianem.
- Aktywność kaspazy-3 była znacznie podwyższona w neuronach poddanych działaniu preparatów, co wskazuje na procesy apoptyczne.
- Zastosowanie NBQX zredukowało aktywność spontaniczną i zmodyfikowało reakcje na glutaminian.
- Metoda ta wykazała potencjał w analizie wkładu konkretnych receptorów w śmierć neuronów.
Wnioski
- Niniejsze badanie umożliwia szczegółową analizę apoptozy zależnej od wapnia w neuronach dopaminergicznych.
- Protokół ten stanowi cenne narzędzie do przesiewowego badania agentów neuroprotekcyjnych istotnych w kontekście choroby Parkinsona.
- Wyniki dostarczają wiedzy na temat mechanizmów patologicznych oraz celów terapeutycznych w procesach neurodegeneracji.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia ilościowe oznaczenie spontanicznych oraz wywołanych glutaminianem przepływów jonów wapnia w pierwotnych neuronach śródmózgowia myszy, zapewniając system istotny z punktu widzenia patogenez chorób do modelowania ekscytotoksyczności neuronów dopaminergicznych w chorobie Parkinsona. Poprzez powiązanie dynamiki wapnia z aktywacją kaspazy-3, metoda ta wspiera mechanistyczną ocenę ryzyka związków neuroprotekcyjnych poprzez funkcjonalne odczyty przeżywalności neuronów. Podejście to zapewnia ciągłość translacyjną od walidacji celu do badań przesiewowych w fazie przedklinicznej, umożliwiając wysokotreściową ocenę wpływu leków na apoptozę zależną od wapnia.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Analiza hipotez terapeutycznych dotyczących napływu wapnia za pośrednictwem receptorów glutaminianu w procesie utraty neuronów dopaminergicznych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celu poprzez pomiar strumienia wapnia jako bezpośredniego odczytu aktywności receptora.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność przewidywań poprzez powiązanie modulacji receptorów z późniejszymi skutkami apoptotycznymi za pośrednictwem aktywacji kaspazy-3.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Zapewnia ilościowe pomiary zmian poziomu wapnia wewnątrzkomórkowego w czasie rzeczywistym jako wynik funkcjonalnego testu.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzację testu poprzez określone warunki traktowania glutaminianem i NBQX oraz parametry obrazowania.
- Skalowalność: Wspiera format wysokoprzepustowego screeningu (high-content screening) dzięki obrazowaniu na żywo i zautomatyzowanej analizie ROI somy neuronów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Biomarker translacyjny: Wykorzystuje aktywację kaspazy-3 jako mierzalny punkt końcowy apoptozy indukowanej glutaminianem w neuronach wykazujących obecność tyrozynowej hydroksylazy.
- Model przedkliniczny: Ustanawia system istotny z punktu widzenia choroby, wykorzystujący pierwotne neurony brzusznego śródmózgowia do modelowania ekscytotoksyczności związanej z chorobą Parkinsona.
- Postęp skorygowany o ryzyko: Umożliwia priorytetyzację związków na podstawie ich zdolności do hamowania przepływu jonów wapnia oraz wtórnej aktywacji kaspazy-3.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w proces odkrywania leków — od walidacji celu, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po przedkliniczne badania skuteczności — dostarczając funkcjonalnego odczytu stanu zdrowia neuronów w modelu istotnym dla choroby Parkinsona.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez dotyczących udziału receptorów glutaminianu w wapń-zależnej apoptozie neuronów dopaminergicznych.
- Przesiew: Zapewnia gotowość do analiz dzięki standaryzowanym pomiarom przepływu jonów wapnia oraz detekcji apoptozy za pomocą immunobarwienia.
- Analityka: Generuje dane ilościowe, w tym pole pod krzywą, amplitudę szczytu oraz czas utajenia odpowiedzi dla zapisów wapniowych, umożliwiając analizę porównawczą warunków.
- Badania translacyjne: Łączy dysregulację wapnia z apoptyczną śmiercią komórek w neuronach dopaminergicznych, wspierając dopasowanie biomarkerów do ścieżek neurodegeneracyjnych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do oceny związków neuroprotekcyjnych w wielu kampaniach przesiewowych celujących w homeostazę wapnia.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez wyizolowanie przepływu jonów wapnia jako kluczowego czynnika apoptozy neuronów dopaminergicznych.
- Wartość operacyjna: Wspiera powtarzalność dzięki standaryzacji transdukcji wirusowej, przygotowania buforu do obrazowania oraz ustawień parametrów konfokalnych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia decyzje typu go/no-go, dostarczając wczesnych dowodów funkcjonalnych na zaangażowanie celu i neuroprotekcję.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków łagodzących wapniowo-zależną apoptozę w neuronach istotnych dla danej choroby, z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli pierwotnych neuronów, transdukcji wirusowej oraz obrazowaniu konfokalnym żywych komórek.
- Zależy od dostępności aparatury, w tym mikroskopu konfokalnego z systemem perfuzji oraz oprogramowania do analizy ROI.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie czasu ekspozycji na glutaminian, współaplikacji NBQX oraz protokołów barwienia kaspazy-3.
- Wiąże się z koniecznością uwzględnienia adaptacji przy przejściu z modeli neuronalnych mysich na ludzkie lub w przypadku innych kontekstów chorobowych.
- Ograniczona przez zmienność wydajności transfekcji pierwotnych neuronów oraz bazową aktywność spontaniczną w różnych preparatach.
