Name: Model retinopatii indukowanej tlenem w chorobach niedokrwiennych siatkówki u gryzoni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Poznaj model retinopatii indukowanej tlenem do badania chorób niedokrwiennych siatkówki u gryzoni. Ta metoda pozwala oceniać kandydatów terapeutycznych i mechanizmy patologicznej angiogenezy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Marianne Karlsberg, Anne Mari Haapaniemi, Päivi Partanen i Anne Kankkunen za doskonałe wsparcie techniczne. Praca została sfinansowana przez Akademię Fińską, Fundację Päivikki i Sakari Sohlberg, Fundację Gruźlicy w Tampere, Fińską Fundację Medyczną, Fundację Badawczą Szpitala Okręgowego Pirkanmaa oraz Fundusz Badawczy Szpitala Uniwersyteckiego w Tampere.

Opisany tutaj protokół został zatwierdzony przez Narodową Komisję Etyki Zwierząt Finlandii (numer protokołu ESAVI/9520/2020 i ESAVI/6421/04.10.07/2017).
1. Zwierzęta doświadczalne i mysie indukcja modelu OIR
UWAGA: Użyj zwierząt kojarzonych w czasie, np. powszechnie używanych myszy C57BL/6J, aby uzyskać młode urodzone tego samego dnia. Stosować matki zastępcze, np. matki laktacyjne szczepu 129 (129S1/SvImJ lub 129S3/SvIM), do karmienia młodych w trakcie i po indukcji hiperoksji. Alternatywnie upewnij się, że dostępne są dodatkowe matki laktacyjne na wypadek, gdyby matki karmiące musiały zostać wymienione z powodu wyczerpania. Ogranicz wielkość miotu do 6-7 młodych na każdą matkę w przypadku korzystania z myszy/matek C57BL/6J (jeśli mioty są większe, młode mają zwykle ograniczony przyrost masy ciała)16.
<ol>
	<li>Zapisać masę ciała zwierząt przed i po indukcji hiperoksji oraz w momencie składania ofiary.</li>
	<li>Upewnij się, że na dnie klatki jest wystarczająca ilość jedzenia, aby tamy miały łatwy dostęp do jedzenia.</li>
	<li>Dodaj wapno sodowane z kolorowym wskaźnikiem na dno komory, aby wchłonąć nadmiar CO2 , gdy system filtracji nie jest używany.</li>
	<li>Monitoruj wilgotność i temperaturę wewnątrz komory i utrzymuj wilgotność w zakresie od 40 do 65%. W razie potrzeby zwiększ wilgotność w komorze, umieszczając na dnie komory naczynia z wodą (np. szalki Petriego).</li>
	<li>Skalibruj czujnikO2 przy 100%O2 i normalnym powietrzu w pomieszczeniu.</li>
	<li>Umieść myszy P7 w komorze i ustaw poziom O2 na 75%. Trzymaj myszy w komorze przez 5 dni, do P12. Unikaj otwierania komory podczas indukcji hiperoksji. Sprawdź ciśnienie gazu w butli O2 i wymień butlę w razie potrzeby. Monitoruj zwierzęta podczas indukcji.</li>
	<li>Wyjmij klatki dla myszy z komory i zważ wszystkie szczenięta. Pogrupuj młode na podstawie wagi, tak aby każda grupa eksperymentalna miała podobny rozkład masy u młodych.</li>
</ol>
2. Zwierzęta doświadczalne i indukcja modelu OIR szczurów (przy użyciu systemu półzamkniętego)
UWAGA: Użyj zwierząt kojarzonych w czasie, aby młode urodziły się tego samego dnia. W przypadku OIR szczurów należy użyć zwiększonej wielkości miotu, około 18 młodych / matkę, aby uzyskać wystarczającą indukcję NV w modelu szczurzym. Połącz młode z kilku miotów, aby uzyskać wystarczającą liczbę młodych do każdego miotu.
<ol>
	<li>Zapisać masę ciała zwierząt przed i po indukcji oraz w momencie składania ofiary.</li>
	<li>Upewnij się, że na dnie klatki jest wystarczająca ilość jedzenia, aby tamy miały łatwy dostęp do jedzenia.</li>
	<li>Dodaj wapno sodowane z kolorowym wskaźnikiem na dno komory, aby wchłonąć nadmiar CO2, gdy system filtracji nie jest używany.</li>
	<li>Monitoruj wilgotność i temperaturę wewnątrz komory. Wchłoń dodatkową wilgoć (generowaną przez wiele szczurów), dodając żel krzemionkowy na dnie komory.</li>
	<li>Skalibruj czujnikO2 przy 100% N2 i normalnym powietrzu w pomieszczeniu.</li>
	<li>Umieść szczury w komorze w temperaturze P0 (kilka godzin po urodzeniu). Ustaw poziomO2 na 50% i podłącz butlęO2 do komory na 24 godziny. Następnie przełącz ustawienia na 10%O2 i podłącz butlę z azotem (N2) do komory na 24 godziny. Kontynuuj 24-godzinną jazdę na rowerze między 50% a 10% poziomemO2 przez 14 dni.</li>
	<li>Monitoruj zużycie gazu i dobrostan zwierząt podczas badania. Otwórz komorę podczas wymiany między 50/10%O2 i w razie potrzeby dodaj więcej jedzenia i wody. Zmień klatki zwierząt na czyste podczas indukcji.</li>
	<li>Wyjmij klatki dla szczurów z komory i zważ wszystkie młode. Pogrupuj młode na podstawie masy, tak aby każda grupa doświadczalna miała podobny rozkład masy w młodych.</li>
</ol>
3. Podawanie leków (opcjonalnie)
UWAGA: Powszechnie stosowaną drogą podawania leków w OIR jest leczenie doszklistkowe (ivt), w P12-P14 dla myszy i w P14 dla szczurów. Określ dzień leczenia na podstawie konfiguracji eksperymentalnej. Gdy w eksperymentach wykorzystuje się wiele miotów młodych, należy podzielić grupy leczone tak, aby zawierały zwierzęta ze wszystkich miotów. Najlepiej, wstrzyknąć lek tylko do jednego oka i zachować oko przeciwległe jako kontrolę.
<ol>
	<li>Zważyć zwierzęta i narysować znaki identyfikacyjne na ogonie i/lub uchu.</li>
	<li>Znieczulić zwierzę albo znieczuleniem do wstrzykiwań (na przykład mieszanina ketaminy i medetomidyny, 30 mg/kg i 0,4 mg/kg dla myszy), albo znieczuleniem wziewnym (izofluran w stężeniu 2-3,5% izofluranu i przepływie powietrza 200-350 ml/min). Sprawdź głębokość znieczulenia, ściskając palce u stóp. Podczas zabiegu należy trzymać zwierzę na poduszce grzewczej.</li>
	<li>W celu znieczulenia miejscowego nałóż kroplę środka przeciwbólowego na powiekę. Ostrożnie otwórz powiekę kleszczami przed wykonaniem IVT, ponieważ myszy i szczury otwierają oczy wokół P14. Nanieś kroplę środka przeciwbólowego (np. chlorowodorku oksybuprokainy) na rogówkę.</li>
	<li>Zastosuj kroplę jodu przed wykonaniem iniekcji IVT.</li>
	<li>Do iniekcji dożylnej należy użyć szklanej strzykawki z dołączoną igłą 33-34 G. Dociśnij powieki w dół i chwyć gałkę oczną kleszczami. Wstrzyknięcie należy wykonać z tyłu rąbka, pod kątem około 45° igły skierowanej w stronę nerwu wzrokowego.</li>
	<li>Należy unikać wstrzykiwania więcej niż 1,0 μl do przestrzeni doszklistkowej. Trzymaj igłę na miejscu przez 30 s po wstrzyknięciu leku, aby uniknąć refluksu wstrzykniętego roztworu.</li>
	<li>Zbadaj oko (np. za pomocą oftalmoskopu) pod kątem jakichkolwiek powikłań, takich jak krwotoki lub uszkodzenie siatkówki, po wyjęciu igły. Po wstrzyknięciu nałóż maść z antybiotykiem na rogówkę. 
	UWAGA: Objętość wstrzyknięcia ivt dla myszy powinna wynosić 0,5 – 1,0 μl.</li>
	<li>Odwróć znieczulenie (na przykład za pomocą α2-antagonisty medetomidyny (2,5 mg/kg) i wróć do klatki. Ściółkę należy przechowywać normalnie do końca badania.</li>
</ol>
4. Obrazowanie in vivo i elektroretinografia (opcjonalnie)
<ol>
	<li>W razie potrzeby należy przeprowadzić obrazowanie in vivo na żywych zwierzętach w okresie obserwacji, aby zarejestrować zmiany, które rozwijają się w siatkówce podczas odpowiedzi angiogennej. Na przykład wykonaj angiografię fluoresceinową (FA) lub skaningową laserową mikroskopię konfokalną 19, aby uwidocznić układ naczyniowy (<silna klasa="xfig">Ryc. 4). Użyj optycznej tomografii koherentnej w domenie spektralnej (SD-OCT) do wizualizacji warstw siatkówki in vivo (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4).</li>
	<li>W razie potrzeby zbadaj zmiany funkcjonalne w różnych populacjach komórek siatkówki po indukcji OIR za pomocą elektroretinografii (ERG) (<silna klasa = "xfig">Figura 5).</li>
</ol>
5. Pobieranie tkanek i przygotowanie płaskich mocowań siatkówki
UWAGA: Zbierz tkanki zgodnie z pożądaną hipotezą badawczą. W przypadku myszy należy pobrać próbki na przykład w punkcie P12 (w celu zbadania zanikania naczyń krwionośnych po fazie hiperoksycznej) lub w okresie niedotlenienia (P13-P17). Zbierz próbki OIR myszy w P17, który jest najczęstszym punktem czasowym pobierania próbek, aby wykryć pik ilości NV. W OIR szczurów zbierz próbki w P18-P21, aby zaobserwować największą ilość NV (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3).
<ol>
	<li>Zważyć zwierzęta przed pobraniem próbek.</li>
	<li>Aby oznaczyć unaczynienie siatkówki, głęboko znieczulone zwierzęta można perfundować przezsercowo za pomocą dekstranu FITC. (Alternatywnie, wybarwić płaskie mocowania siatkówki izolektyną później).</li>
	<li>Uśmiercać zwierzęta za pomocą przedawkowania leków znieczulających (na przykład mieszaniny ketaminy i medetomidyny, 300 mg/kg i 4 mg/kg w przypadku myszy) lub wdychania CO2 .</li>
	<li>Zbierz oczy zwierząt, chwytając za gałkę oczną zakrzywionymi kleszczami, przetnij tkankę wokół oczu i wyjmij oko z orbity.</li>
	<li>Inkubować gałki oczne w świeżo przygotowanym, przefiltrowanym 4% paraformaldehydzie (w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami, PBS) przez 1-4 godziny. Usunąć utrwalacz i przemyć gałki oczne 3 x 10 min PBS. Siatkówki należy natychmiast wyciąć lub przechowywać je w PBS w temperaturze +4 °C. 
	UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny przez drogi oddechowe, w kontakcie ze skórą i po połknięciu. Prosimy o zapoznanie się z kartą charakterystyki przed rozpoczęciem pracy z nim. 
	UWAGA: Nie należy wywierać nacisku na gałkę oczną podczas pobierania próbek lub jakiejkolwiek fazy przetwarzania tkanki, aby uniknąć odwarstwienia siatkówki, jeśli wykonywane są przekroje poprzeczne z całych gałek ocznych.</li>
	<li>Przygotuj płaskie mocowania siatkówki, aby określić ilościowo ilość NV i wielkość AVA. Alternatywnie, przetwórz gałki oczne/siatkówki do histologii lub analizy RNA lub białka. Wypreparuj siatkówkę pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą mikronożyczek i kleszczy.
	<ol>
		<li>Umieść gałkę oczną w PBS, aby była wilgotna i nakłuj gałkę oczną na rąbku za pomocą igły (23G) i przetnij wokół rąbka zakrzywionymi mikronożyczkami, aby usunąć tęczówkę i rogówkę.</li>
		<li>Ostrożnie umieść końcówkę nożyczek między twardówką a siatkówką i przetnij twardówkę w kierunku nerwu wzrokowego. Zrób to samo z drugą stroną gałki ocznej i ostrożnie przetnij/rozerwij twardówkę, aż miseczka siatkówki zostanie odsłonięta. Wyciągnij soczewkę z miseczki siatkówki i dodaj PBS do miseczki.</li>
		<li>Usuń wszystkie naczynia szkliste, ciało szkliste i zanieczyszczenia, nie uszkadzając siatkówki. Umyj siatkówkę, dodając PBS do miseczki siatkówki. Wykonaj cztery nacięcia (na godzinie 12, 3, 6 i 9) siatkówki prostymi mikronożyczkami, aby uzyskać strukturę przypominającą kwiat. Opcjonalnie wykonaj nacięcia ostrzem chirurgicznym przed zamontowaniem próbek. Podnieś siatkówkę za pomocą miękkiego pędzla do dołka w celu zabarwienia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznaczyć układ naczyniowy siatkówki za pomocą izolektyny B4, która barwi powierzchnię komórek śródbłonka (jeśli zwierzęta nie były perfundowane dekstranem FITC). Inkubować siatkówki w buforze blokującym (10% NGS + 0,5% Triton w TBS) przez 1 godzinę i przemywać 1% NGS + 0,1% Triton w TBS przez 10 minut. Inkubować siatkówki z fluorescencyjnym barwnikiem sprzężonym z izolektyną B4 (5-10 μg / ml) w 1% NGS + 0,1% Triton w TBS przez noc w temperaturze +4 °C, chroniąc przed światłem. 
	UWAGA: W razie potrzeby oznacz inne komórki, takie jak komórki zapalne i perycyty, za pomocą specyficznych przeciwciał.</li>
	<li>Przemyj siatkówki 3x przez 10 minut 1% NGS + 0,1% Triton w TBS i unieś siatkówki na mikroskopijnym szkiełku, wewnętrzną siatkówką skierowaną do góry. Ostrożnie rozprowadź siatkówkę za pomocą miękkiego pędzla i usuń wszelkie pozostałe naczynia hialoidalne lub zanieczyszczenia. Dodaj podłoże montażowe do szkiełka nakrywkowego i umieść je na siatkówce. Przechowywać siatkówki w temperaturze +4 °C i chronić przed światłem.</li>
</ol>
6. Analiza płaskich mocowań
<ol>
	<li>Wykonaj zdjęcia płaskich mocowań siatkówki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z obiektywem 10x. Skoncentruj się na powierzchownym splocie naczyniowym i neowaskularyzacji przesiatkowej. Utwórz obraz skanowania kafelków, aby uchwycić całą siatkówkę i scalić skany kafelków</li>
	<li>Określ ilościowo obrazy, mierząc AVA, obszar NV i całkowity obszar siatkówki za pomocą programu do przetwarzania obrazu (patrz tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Narysuj AVA i całkowity obszar siatkówki za pomocą narzędzia do rysowania odręcznego i wybierz obszary neowaskularne za pomocą narzędzia do zaznaczania. Oprogramowanie mierzy obszary zainteresowania w pikselach, a obszary AVA i NV (wyrażone w pikselach) można wykorzystać do obliczenia ich procentu w stosunku do całkowitej powierzchni siatkówki. Ponadto dostępne są niektóre narzędzia programowe do ilościowego określania NV. 
		UWAGA: Niedawno wprowadzono w pełni zautomatyzowane programy typu open source do kwantyfikacji kluczowych wartości obrazów OIR przy użyciu sieci neuronowych głębokiego uczenia, które zapewniają niezawodne narzędzie do powtarzalnej kwantyfikacji AVA siatkówki i NV (np. https://github.com/uw-biomedical-ml/oir/tree/bf75f9346064f1425b8b9408ab792b1531a86c64)20,21.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku stosowania przeciwciał do immunohistochemicznego wykrywania poszczególnych populacji komórek, należy określić ilościowo liczbę barwionych komórek (takich jak mikroglej, <silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B) z płaskich mocowań siatkówki ręcznie lub za pomocą automatycznych systemów analizy obrazu, jeśli jest to pożądane.</li>
</ol>
7. Statystyki
<ol>
	<li>Przeanalizuj dane o rozkładzie normalnym za pomocą testu t Studenta lub jednokierunkowej ANOVA, a następnie testu wielokrotnych porównań Dunnetta lub Tukeya, w zależności od potrzeb. Użyj testów nieparametrycznych, takich jak test U Manna-Whitneya lub test Kruskala Wallisa dla danych o rozkładzie nienormalnym. Rozważ różnice istotne statystycznie na poziomie P < 0,05.</li>
</ol>

Autorzy: dr Maria Vähätupa, Niina Jääskeläinen, dr Marc Cerrada-Gimenez i dr Rubina Thapa są pracownikami firmy Experimentica Ltd.
Autor, dr Giedrius Kalesnykas, jest pracownikiem (Prezesem i Dyrektorem Generalnym) oraz udziałowcem firmy Experimentica Ltd., która oferuje usługi badań kontraktowych z wykorzystaniem przedklinicznych modeli OIR wykorzystanych w niniejszym artykule.
Dr n. med. Tero Järvinen i dr n. med. Hannele Uusitalo-Järvinen nie mają nic do ujawnienia.

Nasilenie fenotypu choroby zależy zarówno od szczepu, jak i od dostawcy zarówno w mysich, jak i szczurzych modelach OIR23. Sugeruje to, że istnieje duża zmienność genotypowa w rozwoju patologii. Ogólnie rzecz biorąc, gryzonie pigmentowane rozwijają cięższy fenotyp niż gryzonie albinosy. Na przykład unaczynienie siatkówki albinosa BALB/c szybko rewaskularyzuje się po hiperoksji i w ogóle nie rozwija NV24. Podobnie u szczurów, pigmentowane brązowe szczury norweskie wykazują p...

Wiarygodne i powtarzalne modele eksperymentalne są potrzebne do badania patologii stojącej za angiogennymi chorobami oczu i do opracowania nowych metod leczenia tych wyniszczających chorób. Patologiczna angiogeneza jest cechą charakterystyczną wysiękowego zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD) oraz wielu chorób niedokrwiennych siatkówki, w tym retinopatii wcześniaków (ROP), proliferacyjnej retinopatii cukrzycowej (PDR) i niedrożności żył siatkówki (RVO)1,2,3,4. Siatkówki ludzkie i gryzonia podlegają podobnemu schematowi rozwoju, ponieważ zarówno siatkówka ludzka, jak i gryzoń są jednymi z ostatnich tkanek, które są unaczynione. Zanim unaczynienie siatkówki całkowicie się rozwinie, siatkówka otrzymuje składniki odżywcze z naczynia szklistego, które z kolei cofa się, gdy unaczynienie siatkówki zaczyna się rozwijać1,2. U człowieka rozwój naczyń krwionośnych siatkówki kończy się przed urodzeniem, podczas gdy u gryzoni wzrost unaczynienia siatkówki następuje po urodzeniu. Ponieważ rozwój naczyniowy siatkówki zachodzi po urodzeniu u gryzoni, stanowi idealny system modelowy do badania angiogenezy2,3. Nowonarodzone gryzonie mają beznaczyniową siatkówkę, która rozwija się stopniowo, aż do osiągnięcia pełnego rozwoju siatkówki naczyniowej pod koniec trzeciego tygodnia po urodzeniu4. Rosnące naczynia krwionośne nowonarodzonych myszy są plastyczne i ulegają regresji podczas bodźca hiperoksji5.
ROP jest główną przyczyną ślepoty dziecięcej w krajach zachodnich, ponieważ dotyka prawie 70% wcześniaków z masą urodzeniową poniżej 1,250 g6,7. ROP występuje u wcześniaków, które rodzą się, zanim naczynia siatkówki zakończą swój normalny wzrost. ROP postępuje w dwóch fazach: w fazie I przedwczesny poród opóźnia wzrost naczyń siatkówki, podczas gdy po fazie II niedokończone unaczynienie rozwijającej się siatkówki powoduje niedotlenienie, które indukuje ekspresję angiogennych czynników wzrostu, które stymulują nowy i nieprawidłowy wzrost naczyń krwionośnych8. Model OIR jest szeroko stosowanym modelem do badania patofizjologii ROP i innych retinopatii niedokrwiennych, a także do testowania nowych kandydatów na leki2,3,9. Jest powszechnie uważany za powtarzalny model do przeprowadzania badań potwierdzających słuszność koncepcji potencjalnych leków antyangiogennych stosowanych w chorobach oczu i innych niż oczne. Dwa modele gryzoni, tj. OIR myszy i szczura, różnią się indukcją modelu i fenotypem choroby. Model szczurzy naśladuje fenotyp ROP dokładniej, ale model mysi zapewnia bardziej solidny, szybki i powtarzalny model neowaskularyzacji siatkówki (NV). W modelu mysim NV rozwija się do centralnej siatkówki. Ten patologiczny odczyt jest ważny w badaniach skuteczności farmakologicznej w przypadku wielu retinopatii niedokrwiennych, takich jak PDR, RV i wysiękowe AMD, a także w chorobach angiogennych nieocznych, takich jak rak. Co więcej, dostępność myszy zmanipulowanych genetycznie (transgenicznych i nokautujących) sprawia, że mysi model OIR jest bardziej popularną opcją. Jednak ani mysi, ani szczurzy model OIR nie powoduje zwłóknienia siatkówki, które jest typowe dla chorób ludzi.
Zrozumienie, że wysoki poziom tlenu przyczynia się do rozwoju ROP w latach 50. XX wieku10,11 doprowadziło do opracowania modeli zwierzęcych. Pierwsze badania nad wpływem tlenu na unaczynienie siatkówki przeprowadzono w 1950 roku12,13,14 i do lat 90. XX wieku było wiele udoskonaleń modelu OIR. Badania przeprowadzone przez Smitha i wsp. w 1994 r. ustanowiły standard dla obecnego mysiego modelu OIR, który oddziela hialoidopatię od retinopatii15. Szerokie zastosowanie metody ilościowego oznaczania zaniku naczyń krwionośnych i patologicznego NV przez Connora i in. (2009) jeszcze bardziej zwiększyło jej popularność16. W tym modelu myszy umieszcza się w 75% tlenu (O2) przez 5 dni w P7, a następnie 5 dni w warunkach normoksyjnych. Hiperoksja od P7 do P12 powoduje regresję unaczynienia siatkówki w centralnej siatkówce. Po powrocie do warunków normoksyjnych siatkówka staje się niedotleniona (<silna klasa="xfig">Ryc. 1A). Ze względu na bodźce niedotlenienia beznaczyniowej centralnej siatkówki, niektóre naczynia krwionośne siatkówki kiełkują w kierunku ciała szklistego, tworząc NV przesiatkowe, zwane kępkami przesiatkówkowymi2,3. Te kępki są niedojrzałe i hiperprzepuszczalne. Ilość NV osiąga szczyt na poziomie P17, po czym ulega regresji. Siatkówka jest w pełni rewaskularyzowana, a NV jest w pełni regresywna przez P23 - P25 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A)2,3.
Model OIR szczurów (wykorzystujący różne poziomy O2) został po raz pierwszy opisany w latach 90-tych, pokazując, że różne poziomy O2 na poziomie 80% i 40% powodują bardziej wyraźne NV niż poniżej 80% O2 stała ekspozycja17. Później odkryto, że model przerywanej hipoksji, w którym O2 jest cyklicznie przenoszony od hiperoksji (50%) do hipoksji (10-12%), powoduje jeszcze więcej NV niż model 80/40% O218. W modelu 50/10% młode szczurów są narażone na działanie 50% przez 24 godziny, a następnie 24 godziny w 10% O2. Cykle te są kontynuowane do P14, kiedy to młode szczurów wracają do warunków normoksyjnych (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Podobnie jak u pacjentów z ROP, w modelu szczurzym obszary jałowe rozwijają się na obrzeżach siatkówki z powodu niedojrzałego splotu naczyniowego siatkówki (<silna klasa = "xfig">Ryc. 3).
W obu modelach, głównymi parametrami, które są zazwyczaj określane ilościowo, są rozmiar AVA i NV. Parametry te są zwykle analizowane z płaskich mocowań siatkówki, w których komórki śródbłonka są oznaczone4,16. Wcześniej ilość NV przesiatkowego oceniano na podstawie przekrojów siatkówki, licząc jądra komórek krwionośnych lub naczyniowych rozciągających się do ciała szklistego powyżej wewnętrznej błony granicznej. Głównym ograniczeniem tego podejścia jest to, że nie jest możliwe ilościowe określenie AVA.

<table><tbody><tr><td>Rozmiar 33, Mała piasta RN Igła</td><td>Hamilton Company</td><td>7803-05, 10mm, 25&deg;, PS4</td><td>Do iniekcji doszklistkowej</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe Inc.</td><td></td><td>Do analizy obrazu</td></tr><tr><td>Pompa powietrza air100</td><td>Eheim GmbH & Co. KG.</td><td>143207</td><td>Do znieczulenia wziewnego</td></tr><tr><td>Aparat anestezjologiczny 410 AP</td><td>Univentor Sp. z o.o.</td><td>2360309</td><td>Do znieczulenia wziewnego</td></tr><tr><td>AnalaR NORMAPUR Wapno sodowane</td><td>VWR International Ltd</td><td>22666.362</td><td>Do kontroli CO2 podczas indukcji modelu</td></tr><tr><td>Attane Vet 1000 mg/g</td><td>VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY</td><td>vnr 17 05 79</td><td>Do znieczulenia wziewnego</td></tr><tr><td>Szczotka</td><td></td><td></td><td>Do przygotowania płaskich mocowań</td></tr><tr><td>Gazowy dwutlenek</td><td></td><td></td> węgla <td>Na ofiarę</td></tr><tr><td>Celeris D430 System ERG</td><td>Diagnosys LLC</td><td>121</td><td>Do in vivo ERG</td></tr><tr><td>Naczynia do hodowli komórkowych</td><td>Greiner Bio-One International GmbH</td><td>664 160</td><td>Do przygotowania płaskich uchwytów</td></tr><tr><td>Cepetor Vet 1 mg/mL</td><td>VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY</td><td>vnr 08 78 96</td><td>Do znieczulenia</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15165452</td><td>Do przygotowania płaskich mocowań</td></tr><tr><td>Sterowana przez O2 szafka InVivo, system filtrariatu aninalnego i osuszacz</td><td>Coy Produkty</td><td></td> laboratoryjne <td>Zamknięty system do indukcji modelu choroby, opcjonalnie dla systemu półzamkniętego</td></tr><tr><td>Czujnik O2 E702</td><td>BioSphenix, Ltd.</td><td>E207, 1801901</td><td>Do pomiaru poziomu tlenu</td></tr><tr><td>Envisu R2200 Optyczny tomograf koherentny w domenie spektralnej (SD-OCT)</td><td>Bioptigen, Inc.</td><td>BPN000668</td><td>Do obrazowania in vivo</td></tr><tr><td>Włócznie do oczu</td><td>Beaver-Visitec International, Inc.</td><td>0008685</td><td>Do iniekcji doszklistkowej i obrazowania in vivo</td></tr><tr><td>Flexilux 600LL Źródło zimnego światła</td><td>Mikron</td><td>11140</td><td>Do iniekcji doszklistkowej lub pobierania tkanek</td></tr><tr><td>Sól sodowa fluoresceiny</td><td>Merck KGaA</td><td>F6377-100G</td><td>Do obrazowania in vivo</td></tr><tr><td>Jednostka wydechowa gazu (+Podwójny zawór 3-drogowy, maski na twarz myszy i szczura, filtr UNOsorb)</td><td>UNO Roestvaststaal BV</td><td>GEX 17015249</td><td>Do znieczulenia wziewnego</td></tr><tr><td>Szklana strzykawka, model 65 RN</td><td>Hamilton Company</td><td>7633-01</td><td>Do iniekcji doszklistkowej</td></tr><tr><td>HRA2 Kardiocjagiograf siatkówki (FA)</td><td>Heidelberg Engineering GmbH</td><td>Spec-KT-05488</td><td>Do obrazowania in vivo</td></tr><tr><td>Izolektyna GS-IB4, Alexa Fluor 488 Sprzężony</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>I21411</td><td>Do oznaczania naczyń krwionośnych siatkówki płaskie mocowania</td></tr><tr><td>Ketaminol Vet 50 mg/ml</td><td>Intervet International B.V.</td><td>vnr 51 14 85</td><td>Do znieczulenia</td></tr><tr><td>Medycyna Tlen gazowy</td><td></td><td></td><td>Do indukcji modelu choroby</td></tr><tr><td>Myszy C57BL/6JRj</td><td>Janvier Labs</td><td></td><td>Możliwe również inne</td></tr><tr><td>szczepy Szkiełka mikroskopowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td>Do przygotowania płaskich mocowań</td></tr><tr><td>Minims Powidon Jod 5% (jednostka)</td><td>Bausch & Lomb U.K Limited</td><td>vnr 24 11 304</td><td>Do wstrzykiwań doszklistkowych</td></tr><tr><td>Azot gazowy</td><td></td><td></td><td>Do indukcji modelu choroby (szczur)</td></tr><tr><td>Oftan Chlora 10 mg/g</td><td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td>vnr 55 01 11</td><td>Do wstrzykiwań doszklistkowych</td></tr><tr><td>Oftan Metaoksedrin 100 mg/ml</td><td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td>vnr 55 03 43</td><td>Dla in vivo ERG</td></tr><tr><td>Oftan Obucain 4 mg/ml</td><td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td>vnr 55 03 50</td><td>Do wstrzykiwań do ciała szklistego</td></tr><tr><td>Oftan Tropicamid 5 mg/ml</td><td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td>vnr 04 12 36</td><td>Do obrazowania in vivo</td></tr><tr><td>kontroler ProOx Model 110 O2 i komora dla zwierząt</td><td>BioSphenix, Ltd.</td><td>803</td><td>Do indukcji modelu choroby, system półzamknięty, opcjonalnie do systemu zamkniętego</td></tr><tr><td>ProOx Model P360 O2 sterownik i komora dla zwierząt</td><td>BioSphenix, Ltd.</td><td>538</td><td>Do indukcji modelu choroby, system półzamknięty, opcjonalnie dla systemu zamkniętego</td></tr><tr><td>Szczury CD(SD)</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Możliwe również inne szczepy</td></tr><tr><td>Revertor 5 mg/mL</td><td>VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY</td><td>vnr 13 04 97</td><td>Do odwrócenia znieczulenia</td></tr><tr><td>Żel</td><td></td><td></td> krzemionkowy <td>Do kontroli wilgotności podczas indukcji modelu</td></tr><tr><td>Systane Ultra 10ml</td><td>Alcon</td><td>Tamro 2050250</td><td>Do nawilżania oczu</td></tr><tr><td>Urządzenie Systane Ultra 0,7ml</td><td>Alcon</td><td>Tamro 2064871</td><td>Do nawilżania oka</td></tr><tr><td>Pipeta transferowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1343-9108</td><td>Do przygotowania uchwytów płaskich</td></tr><tr><td>VENTI-Line VL 180 PRIME Suszarka</td><td>VWR</td><td>VL180S 170301</td><td>Do suszenia żelu krzemionkowego</td></tr><tr><td>VisiScope SZT350 Mikroskop stereoskopowy</td><td>VWR</td><td>481067</td><td>Do iniekcji doszklistkowej lub pobrania tkanek</td></tr></tbody></table>

model retinopatii indukowanej tlenem w chorobach niedokrwiennych siatkówki u gryzoni

Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents

Jednym z powszechnie używanych modeli retinopatii niedokrwiennych jest model retinopatii indukowanej tlenem (OIR). W tym miejscu opisujemy szczegółowe protokoły indukcji modelu OIR i jego odczytów zarówno u myszy, jak i szczurów. Neowaskularyzacja siatkówki jest indukowana w OIR poprzez wystawienie młodych gryzoni na hiperoksję (myszy) lub naprzemienne poziomy hiperoksji i niedotlenienia (szczury). Podstawowymi odczytami tych modeli są wielkość obszarów neowaskularnych (NV) i jałowych (AVA) w siatkówce. Ten przedkliniczny model in vivo może być wykorzystany do oceny skuteczności potencjalnych leków antyangiogennych lub do zbadania roli określonych genów w angiogenezie siatkówki przy użyciu genetycznie zmodyfikowanych zwierząt. Model ma pewne specyficzne dla odkształcenia i dostawcy różnice w indukcji OIR, które powinny być brane pod uwagę podczas projektowania eksperymentów.

Głównym wynikiem modelu jest fenotyp naczyniowy: wielkość AVAs oraz ilość NV. W mysim modelu OIR wazo-obliteracja występuje w centralnej części siatkówki (Rycina 2A), podczas gdy w modelu szczurzym rozwija się ona na obwodzie, co jest podobne do ludzkiego ROP22 (Rycina 3A). Dzieje się tak dlatego, że powierzchowny splot naczyniowy jest już rozwinięty w momencie narażenia myszy na hiperoksję, natomiast w modelu szczurzym siatkówka jest bez...

Retinopatia indukowana tlenem (OIR) może być używana do modelowania chorób niedokrwiennych siatkówki, takich jak retinopatia wcześniaków i proliferacyjna retinopatia cukrzycowa, a także służyć jako model dla badań potwierdzających słuszność koncepcji w ocenie leków antyangiogennych w chorobach neowaskularnych. OIR indukuje solidną i powtarzalną neowaskularyzację w siatkówce, którą można określić ilościowo.

Model retinopatii indukowanej tlenem w chorobach niedokrwiennych siatkówki u gryzoni

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR ...

Po swoim opracowaniu model retinopatii indukowanej tlenem znalazł szerokie zastosowanie w badaniach przedklinicznych neowaskularnych chorób siatkówki. Został wykorzystany jako model do badania patologicznej angiogenezy w odpowiedzi na niedotlenienie. Główną zaletą tego modelu jest to, że indukuje on silną odpowiedź nerwowo-naczyniową, która jest powtarzalna i łatwo mierzalna.Model ten może być wykorzystany jako model przedkliniczny do badania efektów możliwych kandydatów terapeutycznych. Jest uważany za odpowiedni model dla wielu chorób ludzkich, takich jak retinopatia wcześniaków, retinopatia cukrzycowa i mokre zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem. Należy odnotować masę ciała zwierząt przed i po indukcji hipoksji oraz w momencie uśmiercenia.Upewnij się, że na dnie klatki jest wystarczająca ilość jedzenia i dodaj wapno sodowe z kolorowym wskaźnikiem na dno komory, aby wchłonąć nadmiar dwutlenku węgla, gdy system filtracji nie jest używany. Monitoruj wilgotność i temperaturę wewnątrz komory, utrzymując wilgotność w zakresie od 40 do 65%W razie potrzeby zwiększ wilgotność w komorze, umieszczając na dnie naczynia z wodą. Skalibruj czujnik tlenu z normalnym powietrzem w pomies

oxygen-induced-retinopathy-model-for-ischemic-retinal-diseases

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Siatkówka gryzonia od dawna jest uznawana za dostępne okno do mózgu. W tym artykule technicznym przedstawiamy protokół, który wykorzystuje mysi model retinopatii indukowanej tlenem do badania mechanizmów, które prowadzą do niepowodzenia regeneracji naczyń w ośrodkowym układzie nerwowym po urazie niedokrwiennym. Opisany system można również wykorzystać do zbadania strategii wspomagających odrastanie funkcjonalnych naczyń krwionośnych w obrębie siatkówki i ośrodkowego układu nerwowego.

Ocena regeneracji naczyń w OUN za pomocą siatkówki myszy

Celem tego protokołu jest fotochemiczne wywołanie niedokrwiennego uszkodzenia tylnego nerwu wzrokowego u szczura. Model ten ma kluczowe znaczenie dla badań nad patofizjologią tylnej niedokrwiennej neuropatii nerwu wzrokowego oraz podejść terapeutycznych dla tej i innych neuropatii nerwu wzrokowego, a także innych chorób niedokrwiennych OUN.

Szczurzy model indukowanej fotochemicznie tylnej niedokrwiennej neuropatii nerwu wzrokowego

Ten artykuł opisuje procedurę wywoływania uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego siatkówki przez podwyższone ciśnienie wewnątrzgałkowe u myszy. Uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne siatkówki spowodowane podwyższonym ciśnieniem wewnątrzgałkowym służy do modelowania ludzkich patologii charakteryzujących się upośledzonym dostarczaniem tlenu i składników odżywczych do siatkówki, umożliwiając naukowcom zbadanie potencjalnych mechanizmów komórkowych i metod leczenia chorób układu...

Mysi model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego siatkówki poprzez podniesienie ciśnienia wewnątrzgałkowego

Tutaj opisujemy użycie optycznej koherentnej tomografii spektralnej (SD-OCT) do wizualizacji struktur siatkówki i oka in vivo w modelach zwyrodnienia siatkówki, jaskry, retinopatii cukrzycowej i krótkowzroczności.

Strukturalne oceny in vivo chorób oczu w modelach gryzoni przy użyciu optycznej koherentnej tomografii

Tutaj opisujemy mysi model niedokrwienia siatkówki poprzez przejściowe obustronne zamknięcie tętnicy szyjnej za pomocą prostych szwów i zacisku. Model ten może być przydatny do zrozumienia patologicznych mechanizmów niedokrwienia siatkówki spowodowanego nieprawidłowościami sercowo-naczyniowymi.

Mysi model niedokrwiennego uszkodzenia siatkówki wywołanego przejściowym obustronnym zamknięciem tętnicy szyjnej wspólnej

Ten protokół opisuje szczegółową metodę przygotowania i immunofluorescencji barwienia płaskich mocowań siatkówki myszy oraz analizy. Szczegółowo opisano również zastosowanie angiografii dna oka fluoresceiny (FFA) u młodych myszy i przetwarzanie obrazu.

Monitorowanie dynamicznego wzrostu naczyń siatkówki w mysim modelu retinopatii indukowanej tlenem

Tutaj opisujemy zoptymalizowany protokół do zamykania żył siatkówki za pomocą róży bengalskiej i sterowanego laserowo systemu obrazowania siatkówki z zaleceniami maksymalizacji jego odtwarzalności w genetycznie modyfikowanych szczepach.

Optymalizacja mysiego modelu niedrożności żyły siatkówki w celu ograniczenia zmienności

Ten artykuł opisuje dobrze sprawdzony i powtarzalny test barwienia lektyny dla całego preparatu siatkówki Mount oraz protokoły wymagane do ilościowego pomiaru parametrów naczyniowych często zmienianych w retinopatiach proliferacyjnych i nieproliferacyjnych.

Kwantyfikacja parametrów naczyniowych w całych siatkówkach górskich myszy z retinopatiami nieproliferacyjnymi i proliferacyjnymi

Tutaj prezentujemy trzy protokoły analizy danych dla obrazów angiografii fluoresceinowej (FA) i optycznej koherentnej tomografii (OCT) w badaniu okluzji żył siatkówki (RVO).

In vivo (in vivo) Odczyty uszkodzeń naczyniowych w siatkówce myszy w celu zwiększenia odtwarzalności

Ten protokół modeluje uszkodzenie niedokrwienia siatkówki i reperfuzji w oku myszy poprzez wywołanie niedokrwienia siatkówki poprzez kaniulację przedniej komory i podniesienie ciśnienia wewnątrzgałkowego, a następnie normalizację ciśnienia wewnątrzgałkowego w celu zainicjowania reperfuzji.

Indukcja uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego siatkówki w modelu oka myszy

Poznaj model retinopatii indukowanej tlenem do badania chorób niedokrwiennych siatkówki u gryzoni. Ta metoda pozwala oceniać kandydatów terapeutycznych i mechanizmy patologicznej angiogenezy.

Model retinopatii indukowanej tlenem w chorobach niedokrwiennych siatkówki u gryzoni

Przeglądaj więcej filmów