Model retinopatii indukowanej tlenem w chorobach niedokrwiennych siatkówki u gryzoni
16 września 2020
Retinopatia indukowana tlenem (OIR) może być używana do modelowania chorób niedokrwiennych siatkówki, takich jak retinopatia wcześniaków i proliferacyjna retinopatia cukrzycowa, a także służyć jako model dla badań potwierdzających słuszność koncepcji w ocenie leków antyangiogennych w chorobach neowaskularnych. OIR indukuje solidną i powtarzalną neowaskularyzację w siatkówce, którą można określić ilościowo.
Po swoim opracowaniu model retinopatii indukowanej tlenem znalazł szerokie zastosowanie w badaniach przedklinicznych neowaskularnych chorób siatkówki. Został wykorzystany jako model do badania patologicznej angiogenezy w odpowiedzi na niedotlenienie. Główną zaletą tego modelu jest to, że indukuje on silną odpowiedź nerwowo-naczyniową, która jest powtarzalna i łatwo mierzalna.
Model ten może być wykorzystany jako model przedkliniczny do badania efektów możliwych kandydatów terapeutycznych. Jest uważany za odpowiedni model dla wielu chorób ludzkich, takich jak retinopatia wcześniaków, retinopatia cukrzycowa i mokre zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem. Należy odnotować masę ciała zwierząt przed i po indukcji hipoksji oraz w momencie uśmiercenia.
Upewnij się, że na dnie klatki jest wystarczająca ilość jedzenia i dodaj wapno sodowe z kolorowym wskaźnikiem na dno komory, aby wchłonąć nadmiar dwutlenku węgla, gdy system filtracji nie jest używany. Monitoruj wilgotność i temperaturę wewnątrz komory, utrzymując wilgotność w zakresie od 40 do 65%W razie potrzeby zwiększ wilgotność w komorze, umieszczając na dnie naczynia z wodą. Skalibruj czujnik tlenu z normalnym powietrzem w pomieszczeniu i 100% tlenem.
Następnie umieść myszy P7 w komorze i ustaw poziom tlenu na 75%Trzymaj myszy w komorze przez pięć dni do P12, monitorując zwierzęta podczas indukcji. Po zakończeniu wyjmij myszy z komory. Zważ zwierzęta i zrób znaki identyfikacyjne na ogonie lub uchu.
Po znieczuleniu zwierzęcia wykonaj uszczypnięcie palca u nogi. Dopuszczalny jest mały odruch. Podczas leczenia należy trzymać zwierzę na poduszce grzewczej.
Do iniekcji IVT należy użyć szklanej strzykawki z igłą o rozmiarze od 33 do 34. Nałóż kroplę jodu, a następnie dociśnij powiekę w dół i chwyć gałkę oczną kleszczami. Wstrzyknięcie należy wykonać z tyłu rąbka, w przybliżeniu pod kątem 45 stopni skierowanym w stronę nerwu wzrokowego.
Trzymać igłę na miejscu przez 30 sekund po wstrzyknięciu leku, aby uniknąć refluksu wstrzykiwanego roztworu. Zbadaj oko pod kątem powikłań, takich jak krwotoki lub uszkodzenie siatkówki po wyjęciu igły. Po wstrzyknięciu nałóż maść z antybiotykiem na oko.
W razie potrzeby należy przeprowadzić obrazowanie in vivo na żywych zwierzętach w okresie obserwacji, aby zarejestrować zmiany, które rozwijają się w siatkówce podczas odpowiedzi angiogennej. Użyj optycznej tomografii koherentnej w domenie spektralnej, aby uwidocznić warstwy siatkówki in vivo. Zbierz oczy zwierząt, przecinając tkankę wokół oka, chwytając za gałkę oczną zakrzywionymi kleszczami i podnosząc oko z oczodołu.
Inkubuj gałki oczne w świeżo przygotowanym przefiltrowanym 4% paraformaldehydzie przez jedną do czterech godzin. Usuń utrwalacz i przemyj gałki oczne trzy razy PBS przez 10 minut na przemycie. Natychmiast wypreparuj siatkówki lub przechowuj je w PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Przygotuj płaskie mocowania siatkówki, aby określić ilościowo ilość neowaskularyzacji i wielkość obszarów beznaczyniowych lub AVA. Wypreparuj siatkówkę pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą mikronożyczek i kleszczy. Umieść gałkę oczną w PBS, aby była wilgotna i nakłuj ją na rąbku igłą o rozmiarze 23, a następnie przetnij wokół rąbka zakrzywionymi mikronożyczkami, aby usunąć tęczówkę i rogówkę.
Ostrożnie umieść końcówkę nożyczek między RPE a siatkówką nerwową i przetnij kompleks twardówki naczyniówki RPE w kierunku nerwu wzrokowego. Zrób to samo z drugą stroną gałki ocznej. Następnie delikatnie przetnij lub rozerwij tkankę, aż miseczka siatkówki zostanie odsłonięta.
Wyciągnij soczewkę z miseczki siatkówki i dodaj PBS do miseczki. Usuń wszystkie naczynia szkliste, ciało szkliste i zanieczyszczenia, nie uszkadzając siatkówki. Wykonaj cztery nacięcia siatkówki prostymi mikronożyczkami, aby stworzyć strukturę przypominającą kwiat.
Użyj miękkiego pędzla lub pipety transferowej, aby przenieść go na płytkę dołka w celu barwienia. Oznacz układ naczyniowy siatkówki izolektyną B4, która barwi powierzchnię komórek śródbłonka. Inkubować siatkówki w buforze blokującym przez godzinę i przemywać je 1%NGS i 0,1%Tritonem w TBS przez 10 minut.
Inkubuj siatkówki z 5 do 10 mikrogramami na mililitr fluorescencyjnego barwnika sprzężonego z izolektyną B4 przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem. Następnego dnia przemyj siatkówki trzy razy 1%NGS i 0,1%Triton w TBS przez 10 minut na przemycie. Umieść siatkówki na szkiełku mikroskopowym wewnętrzną siatkówką skierowaną do góry.
Następnie ostrożnie rozprowadź siatkówkę za pomocą miękkiego pędzla i usuń wszelkie pozostałe naczynia szkliste lub zanieczyszczenia. Dodać podłoże montażowe na wierzch próbki i umieścić szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym. Przechowuj siatkówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc je przed światłem.
Zobrazuj płaskie mocowania siatkówki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z obiektywem 10X. Skoncentruj się na powierzchownym splocie naczyniowym i neowaskularyzacji przed siatkówką. Utwórz obraz skanowania kafelków, aby uchwycić całą siatkówkę i scalić skany kafelków.
Określ ilościowo obrazy, mierząc AVA, obszar neowaskularyzacji i całkowity obszar siatkówki za pomocą programu do przetwarzania obrazu. Narysuj AVA i całkowity obszar siatkówki za pomocą narzędzia do rysowania odręcznego i wybierz obszary neowaskularne za pomocą narzędzia do zaznaczania. W mysim modelu retinopatii indukowanej tlenem zacieranie naczyń krwionośnych występuje w centralnej siatkówce.
Podczas gdy w modelu szczurzym rozwija się na peryferiach podobnie jak ludzki ROP. Neowaskularyzacja przed siatkówką rozwija się w pobliżu obszarów beznaczyniowych, w szczególności centralnej siatkówki u myszy i obwodu u szczurów. Analizę histologiczną przy użyciu przekrojów poprzecznych lub płaskich mocowań można przeprowadzić w celu oceny zmian morfologicznych w siatkówkach OIR lub obecności interesujących typów komórek, na przykład komórek zapalnych.
Opcjonalnie można przeprowadzić nieinwazyjne obrazowanie in vivo w okresie obserwacji OIR. Unaczynienie siatkówki i kwasu hialoidalnego można uwidocznić za pomocą angiografii fluoresceinowej, a optyczna koherentna tomografia w domenie spektralnej może być wykorzystana do oceny zmian strukturalnych w siatkówce. Zmiany funkcjonalne można zmierzyć za pomocą elektroretinografii.
Aflibercept, rozpuszczalny pułapka VEGF, hamuje zarówno neowaskularną, jak i fizjologiczną rewaskularyzację w OIR. Oczy, którym wstrzyknięto do P14 dużą dawkę afliberceptu, miały jeszcze większe AVA siatkówki niż oczy nieleczone, co sugeruje, że aflibercept blokuje również fizjologiczną rewaskularyzację siatkówki spowodowaną niedotlenieniem. Próbując zastosować ten protokół, pamiętaj, aby wcześniej rozważyć odpowiednią wielkość miotu dla swojego eksperymentu i monitorować samopoczucie matek i młodych w komorze tlenowej.
Należy wziąć pod uwagę, że przyrost masy ciała po porodzie wpływa na wynik w modelu. Próbki siatkówki uzyskane z tego modelu mogą być wykorzystywane do metod analitycznych, takich jak immunohistochemia, analiza ekspresji genów lub białek, a także do pomiaru wpływu potencjalnych kandydatów terapeutycznych na siatkówkę na poziomie molekularnym.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Model retinopatii indukowanej tlenem (OIR) jest szeroko wykorzystywany w badaniach przedklinicznych do analizy neowaskularnych chorób siatkówki. Model ten skutecznie symuluje patologiczną angiogenezę wynikającą z hipoksji, zapewniając silną i mierzalną odpowiedź neuronaczyniową.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Okulistyka
- Patologiczna angiogeneza
Wprowadzenie
- OIR jest modelem niedokrwiennych chorób siatkówki.
- Ma on zastosowanie w badaniach nad retinopatią wcześniaków oraz retinopatią cukrzycową.
- Model ten umożliwia ocenę leków przeciwangiogennych.
- Indukuje on powtarzalną neowaskularyzację w siatkówce.
Cel badania
- Do modelowania niedokrwiennych chorób siatkówki.
- Do oceny kandydatów terapeutycznych w leczeniu chorób naczyniowych.
- Do badania wpływu hipoksji na angiogenezę w siatkówce.
Zastosowane metody
- Indukcja hipoksji w modelach zwierzęcych.
- Pomiar masy ciała zwierząt przed i po hipoksji.
- Ilościowe określenie neowaskularyzacji w siatkówce.
- Ocena interwencji terapeutycznych.
Główne wyniki
- Model OIR indukuje silną odpowiedź naczyniowo-nerwową.
- Neowaskularyzację można łatwo ilościowo określić.
- Model jest powtarzalny w różnych badaniach.
- Służy on jako odpowiedni model przedkliniczny dla chorób ludzi.
Wnioski
- Model OIR jest skuteczny w badaniu chorób siatkówki.
- Pozwala on na zgłębienie mechanizmów patologicznej angiogenezy.
- Model ten jest cenny przy testowaniu potencjalnych kandydatów terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Model retinopatii indukowanej tlenem (OIR) stanowi powtarzalny system in vivo do oceny terapeutyków antyangiogennych ukierunkowanych na niedokrwienne choroby siatkówki. Umożliwia on mechanistyczną weryfikację ryzyka kandydatów na leki poprzez ilościowe określanie zakresu patologicznej neowaskularyzacji oraz obszarów awaskularnych w siatkówkach gryzoni. Wspiera to pewność prognostyczną w walidacji celów terapeutycznych oraz selekcji projektów w ramach programów okulistycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Analiza hipotez terapeutycznych w patologicznych szlakach angiogenezy istotnych dla retinopatii wcześniaków i retinopatii cukrzycowej.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celów poprzez powtarzalną indukcję odpowiedzi naczyniowo-nerwowych u zwierząt poddanych manipulacjom genetycznym.
- Wartość predykcyjna: Wspiera przedkliniczne decyzje go/no-go poprzez pomiar efektów knockdownu lub nadekspresji genów w procesie angiogenezy siatkówki.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Gotowość do analizy: Umożliwia uzyskanie mierzalnych preparatów płaskich siatkówki do ustandaryzowanego pomiaru obszarów neowaskularyzacji (NV) i awaskularnych (AVA).
- Powtarzalność: Zapewnia spójne wyniki w różnych szczepach myszy i szczurów, przy uwzględnieniu zmienności w indukcji OIR zależnej od dostawcy zwierząt.
- Skalowalność: Wspiera średnioprzepustową ocenę kandydatów terapeutycznych poprzez zastosowanie procedur iniekcji do ciała szklistego i obrazowania.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie chorobowe: Modeluje ludzkie retinopatie niedokrwienne, w tym ROP, retinopatię cukrzycową oraz wilgotną AMD, poprzez indukowaną hipoksją angiogenezę patologiczną.
- Ciągłość translacyjna: Łączy modulację celu w fazie odkrywania z przedkliniczną oceną skuteczności za pomocą strukturalnych i funkcjonalnych odczytów siatkówki.
- Postęp dostosowany do ryzyka: Wspiera dobór dawki i indeks terapeutyczny poprzez rozróżnienie rewaskularyzacji patologicznej od fizjologicznej, co wykazano na podstawie wyników dla afliberceptu.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model OIR wpisuje się w kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, wspierając walidację celu, identyfikację związku wiodącego oraz testy skuteczności w ramach projektów rozwojowych w okulistyce.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia wyjaśnianie szlaków sygnałowych i ograniczanie ryzyka biologicznego celów angiogenezy poprzez indukowalne, hipoksjo-mimetyczne uszkodzenie siatkówki.
- Przesiew: Umożliwia standaryzację testów dzięki przygotowaniu płaskich preparatów siatkówki oraz barwieniu izolektyną B4 w celu ilościowego oznaczenia komórek śródbłonka.
- Analityka: Zapewnia ilościowe odczyty oparte na obrazowaniu (obszar NV, rozmiar AVA, całkowity obszar siatkówki) do porównywania warunków terapeutycznych lub genetycznych.
- Badania translacyjne: Jest zgodne z walidacją przedkliniczną poprzez modelowanie istotnych dla ludzi przestrzennych wzorców wazoobliteracji i neowaskularyzacji.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako platforma wielokrotnego użytku do iteracyjnej modulacji celów i przesiewu związków w wielu projektach okulistycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w szlakach angiogenezy poprzez mierzalne fenotypy siatkówki indukowane hipoksją.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje ocenę neowaskularyzacji za pomocą zdefiniowanych protokołów indukcji tlenowej i schematów analizy obrazu.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesne odrzucenie nieskutecznych modulatorów angiogenezy przed kosztownym etapem badań klinicznych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez rozróżnienie związków hamujących rewaskularyzację patologiczną od fizjologicznej.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z gryzoniami, obsłudze komory hipoksyjnej oraz sekcji tkanki siatkówki.
- Zależność od skalibrowanych czujników tlenu, monitorowania parametrów środowiskowych (wilgotność 40-65%) oraz odpowiedniego planowania wielkości miotu.
- Konieczna jest standaryzacja procedur przygotowania preparatów siatkówki (flat mount), barwienia oraz kwantyfikacji obrazów pomiędzy zespołami w celu zminimalizowania zmienności między laboratoriami.
- Przy interpretacji wyników należy uwzględnić różnice w wzorcach obliteracji naczyniowej zależne od szczepu (centralna u myszy, obwodowa u szczurów).
- Ograniczenie wynikające z wpływu postnatalnego przyrostu masy ciała na rezultaty, co wymaga monitorowania podłużnego w celu zapewnienia spójności danych.
