Name: Techniki immunohistochemiczne do analizy proliferacji komórkowej i neurogenezy u szczurów przy użyciu analogu tymidyny BrdU (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Poznaj techniki immunohistochemiczne do analizy proliferacji komórkowej i neurogenezy u szczurów przy użyciu analogu tymidyny BrdU. Ta metoda umożliwia badaczom wizualizację komórek dzielących się w zakręcie zębatym mózgu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Panu Miguelowi Burgosowi i Gustavo Lago za pomoc techniczną. Pragniemy również podziękować dr Clorindy Arias, dr Karli Hernandez i dr Oscarowi Galicii za ich życzliwe wsparcie w dostarczeniu odczynników i materiałów. Dziękujemy również División de Investigación y Posgrado z Universidad Iberoamericana Ciudad de México za zapewnienie funduszy na wykonanie tej pracy oraz pokrycie kosztów produkcji wideo.

<ol><li>Altman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+new+neurons+formed+in+the+brains+of+adult+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Are new neurons formed in the brains of adult mammals.</a> Science. 135 (3509), 1127-1128 (1962).</li>
<li>Altman, J., Das, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoradiographic+and+histological+evidence+of+postnatal+hippocampal+neurogenesis+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats.</a> The Journal of Comparative Neurology. 124 (3), 319-335 (1965).</li>
<li>Miller, M. W., Nowakowski, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bromodeoxyuridine-immunohistochemistry+to+examine+the+proliferation%2C+migration+and+time+of+origin+of+cells+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Use of bromodeoxyuridine-immunohistochemistry to examine the proliferation, migration and time of origin of cells in the central nervous system.</a> Brain Research. 457 (1), 44-52 (1988).</li>
<li>Eriksson, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+adult+human+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the adult human hippocampus.</a> Nature Medicine. 4 (11), 1313-1317 (1998).</li>
<li>Filippov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subpopulation+of+nestin-expressing+progenitor+cells+in+the+adult+murine+hippocampus+shows+electrophysiological+and+morphological+characteristics+of+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Subpopulation of nestin-expressing progenitor cells in the adult murine hippocampus shows electrophysiological and morphological characteristics of astrocytes.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 23 (3), 373-382 (2003).</li>
<li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends in Neurosciences. 27 (8), 447-452 (2004).</li>
<li>Matiašová, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+determination+of+5-bromo-2%27-deoxyuridine+pharmacokinetics+in+blood+serum+after+intraperitoneal+administration+to+rats+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric determination of 5-bromo-2'-deoxyuridine pharmacokinetics in blood serum after intraperitoneal administration to rats and mice.</a> Histochemistry and Cell Biology. 142 (6), 703-712 (2014).</li>
<li>Von Bohlen Und Halbach, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistological+markers+for+proliferative+events%2C+gliogenesis%2C+and+neurogenesis+within+the+adult+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Immunohistological markers for proliferative events, gliogenesis, and neurogenesis within the adult hippocampus.</a> Cell and Tissue Research. 345 (1), 1-19 (2011).</li>
<li>Sage, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DeconvolutionLab2%3A+An+open-source+software+for+deconvolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy.</a> Methods. 115, 28-41 (2017).</li>
<li>Manz, W., Arp, G., Schumann-Kindel, G., Szewzyk, U., Reitner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widefield+deconvolution+epifluorescence+microscopy+combined+with+fluorescence+in+situ+hybridization+reveals+the+spatial+arrangement+of+bacteria+in+sponge+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Widefield deconvolution epifluorescence microscopy combined with fluorescence in situ hybridization reveals the spatial arrangement of bacteria in sponge tissue.</a> Journal of Microbiological Methods. 40 (2), 125-134 (2000).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Abràmoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+with+imageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+International%22%5BJournal%5D)">Image processing with imageJ.</a> Biophotonics International. 11 (7), 36-41 (2004).</li>
<li>Giannini, A., Giannini, J. 2D and 3D Fluorescence Deconvolution Manual. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://pages.stolaf.edu/wp-content/uploads/sites/803/2016/12/Giannini_Giannini_Deconvolution_Manual_20161215.p">https://pages.stolaf.edu/wp-content/uploads/sites/803/2016/12/Giannini_Giannini_Deconvolution_Manual_20161215.p</a> (2016).</li>
<li>Taupin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BrdU+immunohistochemistry+for+studying+adult+neurogenesis%3A+Paradigms%2C+pitfalls%2C+limitations%2C+and+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: Paradigms, pitfalls, limitations, and validation.</a> Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).</li>
<li>Revilla, V., Jones, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryostat+sectioning+of+brains%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Cryostat sectioning of brains.</a> International Review of Neurobiology. 47, 61-70 (2002).</li>
<li>Amaral, D. G., Scharfman, H. E., Lavenex, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dentate+gyrus%3A+fundamental+neuroanatomical+organization+%28dentate+gyrus+for+dummies%29%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+brain+research%22%5BJournal%5D)">The dentate gyrus: fundamental neuroanatomical organization (dentate gyrus for dummies).</a> Progress in brain research. 163, 3-22 (2007).</li>
<li>Eadie, B. D., Redila, V. A., Christie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voluntary+exercise+alters+the+cytoarchitecture+of+the+adult+dentate+gyrus+by+increasing+cellular+proliferation%2C+dendritic+complexity%2C+and+spine+density%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Voluntary exercise alters the cytoarchitecture of the adult dentate gyrus by increasing cellular proliferation, dendritic complexity, and spine density.</a> Journal of Comparative Neurology. 486 (1), 39-47 (2005).</li>
<li>Leal-Galicia, P., Romo-Parra, H., Rodríguez-Serrano, L. M., Buenrostro-Jáuregui, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+adult+hippocampal+neurogenesis+exerted+by+sexual%2C+cognitive+and+physical+activity%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Regulation of adult hippocampal neurogenesis exerted by sexual, cognitive and physical activity: An update.</a> Journal of Chemical Neuroanatomy. 101, 101667(2019).</li>
<li>Gould, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+widespread+is+adult+neurogenesis+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">How widespread is adult neurogenesis in mammals.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 481-488 (2007).</li>
<li>Ngwenya, L. B., Peters, A., Rosene, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+and+electron+microscopic+immunohistochemical+detection+of+bromodeoxyuridine-labeled+cells+in+the+brain%3A+Different+fixation+and+processing+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Light and electron microscopic immunohistochemical detection of bromodeoxyuridine-labeled cells in the brain: Different fixation and processing protocols.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (7), 821-832 (2005).</li>
<li>Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+and+multiple+labeling+with+antibodies+from+the+same+host+species+to+study+adult+hippocampal+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52551(2015).</li>
<li>Tuttle, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescent+detection+of+two+thymidine+analogues+%28CldU+and+IdU%29+in+primary+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (46), e2166(2010).</li>
<li>Tischler, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple+immunohistochemical+staining+for+bromodeoxyuridine+and+catecholamine+biosynthetic+enzymes+using+microwave+antigen+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Triple immunohistochemical staining for bromodeoxyuridine and catecholamine biosynthetic enzymes using microwave antigen retrieval.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 1-4 (1995).</li>
<li>Taupin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+studying+adult+neurogenesis%3A+Insights+and+recent+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Protocols for studying adult neurogenesis: Insights and recent developments.</a> Regenerative Medicine. 2 (1), 51-62 (2007).</li>
<li>Leuner, B., Glasper, E. R., Gould, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymidine+analog+methods+for+studies+of+adult+neurogenesis+are+not+equally+sensitive%5BTitle%5D)+AND+%22Biosystems%22%5BJournal%5D)">Thymidine analog methods for studies of adult neurogenesis are not equally sensitive.</a> Biosystems. 517 (2), 123-133 (2010).</li>
<li>Magavi, S. S., MacKlis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+newborn+cells+by+BrdU+labeling+and+immunocytochemistry+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of newborn cells by BrdU labeling and immunocytochemistry in vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 438, 335-343 (2008).</li>
<li>Kempermann, G., Gast, D., Kronenberg, G., Yamaguchi, M., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+determination+and+long-term+persistence+of+adult-generated+new+neurons+in+the+hippocampus+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Early determination and long-term persistence of adult-generated new neurons in the hippocampus of mice.</a> Development. , 391-399 (2003).</li>
<li>Ramos-Vara, J. A., Beissenherz, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+immunohistochemical+methods+using+two+different+antigen+retrieval+methods+on+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%3A+Experience+with+63+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Diagnostic+Investigation%22%5BJournal%5D)">Optimization of immunohistochemical methods using two different antigen retrieval methods on formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: Experience with 63 markers.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 12 (4), 307-311 (2000).</li>
<li>Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+methods+of+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Principles and methods of immunohistochemistry.</a> Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).</li>
<li>Wojtowicz, J. M., Kee, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BrdU+assay+for+neurogenesis+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">BrdU assay for neurogenesis in rodents.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Neurogeneza dorosłych to proces, który zachodzi najczęściej w niszach dorosłych nerwowych komórek prekursorowych, które mają potencjał do generowania nowych neuronów przez całe życie. Znakowanie bromodeoksyurydyną (BrdU) jest szeroko stosowane w immunologii do charakteryzowania liczby nowo wytworzonych komórek w dorosłym mózgu. BrdU będzie wbudowywany głównie do komórek dyskretnych obszarów mózgu (strefy neurogenne). Komórki te znajdują się w strefie podkomorowej (SVZ), zakręcie zębatym hipokampa - między wnęką a komórkami ziarnistymi znanymi jako strefa subziarnista (SGZ)1,2,18. Co więcej, istnieją różne regiony mózgu charakteryzujące się niższą zdolnością proliferacyjną w wieku dorosłym, w tym podwzgórze, prążkowie, kora nowa i ciało migdałowate19. Jak wspomniano wcześniej, barwienie BrdU jest powszechnie stosowaną metodą badań neurogenezy dorosłych w celu wykrycia proliferacji komórek. Jednak użycie BrdU jako markera ma ograniczenia i pułapki. Pierwszym z nich jest to, że BrdU jest markerem cyklu komórkowego. Dlatego należy przeprowadzić podwójne lub potrójne barwienie w celu zidentyfikowania losu komórki i uwzględnienia markerów komórkowych w celu wykrycia określonego etapu rozwoju znakowanych komórek. Jeszcze jedną obawą związaną z BrdU jest to, że jest to toksyczny i mutagenny roztwór, który modyfikuje stabilność DNA, może zmieniać funkcje komórkowe i cykle komórkowe. Podejmując decyzję o przestrzeganiu protokołu podawania i dawek (50\u2012600 mg/kg), należy wziąć pod uwagę powyższe informacje. Inną istotną cechą jest to, że BrdU jest markerem syntezy DNA, a nie markerem proliferacji komórek14. Dlatego ważne jest, aby odróżnić proliferację komórek od innych zdarzeń, takich jak naprawa DNA, ponowne wejście w nieudany cykl komórkowy i duplikacja genów. Badacze muszą przestrzegać odpowiednich środków kontroli, aby zapewnić właściwe stosowanie BrdU. W celu bardziej szczegółowego omówienia tych problemów i ograniczeń zalecamy zapoznanie się z pracą Taupina14. Proces standaryzacji protokołu immunohistochemicznego może być powolny i trudny. W tej pracy przedstawiliśmy wszystkie ogólne kroki do zarządzania udanym protokołem IHC. Zalecamy jednak, aby każda grupa badawcza wcześniej przetestowała i oceniła tkanki, przeciwciała i warunki. Testy i oceny muszą być przeprowadzane z co najmniej trzema różnymi poziomami inkubacji, etapami płukania i mocami dla każdego badanego przeciwciała i tkanki. Zalecamy również, aby badacze przejrzeli dodatkowe protokoły, aby móc wybrać najlepszy, który spełnia określone potrzeby i wymagania 20,21,22,23,24,25.
Jak wspomniano wcześniej, procedura obejmuje kilka etapów i rozważań metodologicznych, które są powszechnie stosowane i wspominane w artykułach naukowych, które zostaną omówione w dalszej części. Zalecamy, aby badacze starannie i prawidłowo dobierali przeciwciała pod względem techniki, budżetu, sprzętu, konfiguracji i głównego celu badawczego. Przeciwciała muszą być testowane na tym samym typie tkanki, który zostanie później przetestowany w eksperymencie. Zalecamy również stosowanie przeciwciała, które zostało przetestowane w tym samym celu (IHC) (tj. nie tylko w technikach western blot lub cytometrii przepływowej) w celu sprawdzenia jego zgodności z techniką fiksacji. Do barwienia BrdU można zastosować różne drogi, takie jak wstrzyknięcie dootrzewnowe, wlew dootrzewnowy, spożycie doustne lub wlew dokomorowy (bardziej szczegółowy opis każdej techniki znajduje się w piśmiennictwie26). W przypadku wyboru wstrzyknięcia dootrzewnowego należy upewnić się, że BrdU jest podawany do jamy otrzewnej, omijając okolice jelita. Ponieważ jelito ma kilka zduplikowanych komórek, które mogą wyczerpać BrdU, zanim dostanie się do mózgu, co wpłynie na liczbę znakowanych komórek. Bardzo ważne jest, aby uzyskać cienkie przekroje, ponieważ pozwalają one na lepszą penetrację roztworów. Plastry koronalne o grubości 40 μm zostały przecięte doogonowo i przeniesione na 24-dołkową płytkę do hodowli komórkowej, zgodnie z procedurą stereologiczną zaproponowaną przez Kempermanna i wsp.27. Immunohistochemię można przeprowadzić z tkanką zamontowaną na szkiełkach lub jako swobodnie pływające sekcje. Ponieważ BrdU znajduje się głęboko w jądrach komórkowych, umożliwia przenikanie roztworów w swobodnie pływających sekcjach, co zapewnia lepsze wyniki i lepszy dostęp do obszaru zainteresowania. Ważne jest, aby otworzyć wiązania DNA (denaturacja DNA), aby umożliwić dostęp pierwotnemu przeciwciału anty-BrdU. W niniejszej pracy przeprowadziliśmy te specyficzne procedury z wykorzystaniem inkubacji HCI. Z drugiej strony, proces blokowania niespecyficznych epitopów pozwolił na dokładniejszą identyfikację sygnału komórkowego.
Dobra przepuszczalność błony pozwala przeciwciałom prawidłowo przenikać do obszaru zainteresowania. Dodanie permeabilizatora, takiego jak Triton X-100, do roztworów PBS++ i PBS+ poprawia przepuszczalność membrany. W tym protokole można stosować zarówno odczynniki PBS, jak i sól fizjologiczną buforowaną trisem (TBS). Pod względem budżetowym TBS mógłby być względnie tańszy niż PBS. Jednak PBS może zakłócać przeciwciała antyfosforanowe i hamować przeciwciała sprzężone z fosfatazą alkaliczną, więc unikaj stosowania PBS, jeśli cel jest zmodyfikowany potranslacyjnie przez fosforylację (tj. Fosforylowany). Do tej pracy użyliśmy PBS i odkryliśmy, że etapy mycia tkanek dawały bardziej konkretny sygnał. Zalecamy również badaczom przeprowadzenie co najmniej trzech cykli prania przy użyciu TBS lub PBS. Roztwory muszą być świeżo przygotowane. Pobieranie antygenu (AR) jest metodą mającą na celu zmniejszenie utraty antygenowości spowodowanej fiksacją, która modyfikuje strukturę antygenów trzeciorzędowych i czwartorzędowych. Ta redukcja sprawia, że antygeny są niewykrywalne przez przeciwciała28,29. Indukowane ciepłem odzyskiwanie epitopów (HIER) zastosowane w tym protokole próbowało odwrócić reakcje chemiczne między formaldehydem a białkami poprzez hydrolizę wysokotemperaturową lub silną hydrolizę alkaliczną (z innymi roztworami buforowymi, takimi jak EDTA pH 8,5 lub Tris pH 9,5). Niezbędne jest testowanie nowych przeciwciał z różnymi protokołami AR, aby porównać wyniki i wybrać najlepsze dla protokołu. Ten ostatni krok może być opcjonalny w zwykłym protokole; Jednak potraktowaliśmy tkanki protokołem odzyskiwania antygenu, aby zapewnić lepsze wyniki dla tego protokołu.
Bardzo ważne jest, aby wybrać właściwy końcowy kolor kontrastowy i technikę przeciwbarwienia, biorąc pod uwagę podstawowy kolor barwienia i metodę zastosowaną w celu uwidocznienia nieplamiącej struktury i uniknięcia maskowania pierwotnego koloru barwienia przed reakcją immunologiczną. W mikroskopii fluorescencyjnej DAPI (4', 6-diamidino-2-fenyloindol) jest bardzo popularnym barwnikiem jądrowym i chromosomowym, który emituje niebieską fluorescencję (absorpcja: 360 nm, emisja: 460 nm) po związaniu się z regionami AT DNA. Nośnik montażowy zawierający DAPI jest dostępny i łatwy w użyciu; Zapewnia to doskonałe zatrzymywanie sygnału podczas akwizycji obrazu. W przypadku reakcji nadtlenkowej IHC był dostępny w różnych opcjach, takich jak fiolet krezylowy, hematoksylina, barwienie czerwienią obojętną lub zielenią metylową. W przypadku wielu technik barwienia immunologicznego ważne jest, aby wybrać przeciwciało zgodne z techniką wiązania zastosowaną w celu uniknięcia reaktywności krzyżowej30. Kiedy problemy i komplikacje związane z pojedynczym barwieniem zostaną rozwiązane, zastosuj kolejne barwienie kolorem, jeśli uznasz to za konieczne. Kluczowe znaczenie ma kontrolowanie nieswoistego wiązania między przeciwciałami drugorzędowymi. Można to osiągnąć poprzez nasycenie przeciwciał pierwszorzędowych przed użyciem przeciwciała drugorzędowego wytwarzanego w tym samym gatunku gospodarza co przeciwciała pierwszorzędowe. Na przykład, w przypadku stosowania przeciwciał przeciw myszom wytwarzanych u królików i przeciwciał anty-króliczych wytwarzanych w kozich przeciwciałach drugorzędowych, przeciwciało anty-królicze wytwarzane w przeciwciałie kozim musi być użyte przed przeciwciałem przeciwko myszom wytwarzanym w przeciwciałie królika. Gdy metoda sekwencyjna jest całkowicie zdominowana, można rozpocząć jednoczesny proces barwienia immunologicznego. W tej metodzie konieczne jest odpowiednie dobranie przeciwciał drugorzędowych. Idealnie byłoby, gdyby wszystkie te przeciwciała pochodziły od tego samego zwierzęcia gospodarza, aby uniknąć reaktywności krzyżowej. Zalecamy przeprowadzenie kontroli pozytywnej w celu potwierdzenia, że metoda barwienia działa dokładnie w pourodzeniowej tkance hipokampa (obfita neurogeneza w tym wieku). Jeśli tkanka kontroli pozytywnej wykazuje problemy z barwieniem, należy dokonać przeglądu i przeglądu procedury, wprowadzić poprawki i regulacje, a następnie powtarzać, aż uzyska się dobre barwienie. Następnie przeprowadź kontrolę ujemną, aby sprawdzić, czy przeciwciało działa prawidłowo, pomijając lub zastępując określone przeciwciało pierwszorzędowe normalną surowicą (ten sam gatunek co przeciwciało pierwszorzędowe). Jak wspomniano we wstępie, dekonwolucja obrazu jest potężnym narzędziem i stanowi alternatywę, gdy mikroskop konfokalny nie jest dostępny. Może zastosować dekonwolucję obrazu do wszystkich obrazów uzyskanych przy użyciu jasnego pola przechodzącego, fluorescencji szerokiego pola i konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Ostatecznym celem dekonwolucji obrazu jest odtworzenie oryginalnego sygnału, że system akwizycji ulega pogorszeniu10.
Podsumowując, identyfikacja nowo wygenerowanych komórek uwidocznionych przez immunodetekcję analogu tymidyny BrdU jest skomplikowaną, ale potężną techniką. Praca ta jest próbą pomocy naukowcom, szczególnie w dziedzinie neurogenezy hipokampa u dorosłych, w dokładniejszym ilościowym określaniu nowych komórek. Mamy nadzieję, że ten wysiłek był pomocny dla społeczności naukowej i ułatwi dopracowanie badań nad proliferacją komórek za pomocą techniki immunohistochemicznej.

Koncepcja, według której w dorosłym ludzkim mózgu przez całe życie powstają nowe neurony, od dziesięcioleci fascynuje społeczność naukową. Wiedza o tym, że mózg generuje nowe neurony w ciągu całego swojego funkcjonowania, została zdobyta dzięki wykrywaniu komórek w trakcie podziału1,2. Nowo powstałe neurony w dorosłym mózgu zidentyfikowano po raz pierwszy poprzez dokraniowe wstrzykiwanie trytowanej tymidyny (tymidyny-H3) u szczurów i wykrywanie komórek w cyklu komórkowym za pomocą autoradiogramów1,2. Odnotowano podziały komórek gleju oraz obecność neuroblastów, co stanowiło pierwsze obiecujące dane na temat neurogenezy postnatalnej1. Niemniej jednak stosowanie i wykrywanie tymidyny-H3 wiązało się z wykorzystaniem radioaktywności, która może być szkodliwa dla osób ją obsługujących. Pierwsza próba zbadania przydatności immunohistochemii BrdU w badaniach nad proliferacją, migracją i pochodzeniem komórek w układach nerwowych pojawiła się w 1988 roku w pracy Millera i Nowakowskiego3. W 1998 roku w artykule opublikowanym przez Erikssona i współpracowników wykazano, że nowe neurony były widoczne pośmiertnie w dorosłym ludzkim mózgu pacjentów, którym podano 5-bromo-2′-deoksyurydynę (BrdU)4. Pacjenci ci otrzymali wstrzyknięcie BrdU (250 mg dożylnie) w celu oznakowania wzrostu guzów4. Technikę tę zaadaptowano w modelach zwierzęcych. Wprowadzenie tych metod stanowiło kamień milowy w tej dziedzinie, ponieważ umożliwiło wykrywanie nowo powstałych komórek bez użycia związków radioaktywnych. Procedura ta stała się złotym standardem w pomiarze proliferacji komórek w niszach dorosłego mózgu, co przyczyniło się do dalszego rozwoju badań w tej dziedzinie.
Ograniczeniem techniki z wykorzystaniem analogu tymidyny jest brak możliwości określenia tożsamości komórkowej nowo powstałych komórek. Jednak immunohistochemia pozwala na zastosowanie techniki podwójnego lub potrójnego znakowania tej samej komórki, co umożliwia walidację losu komórkowego nowo powstałych komórek, a nawet określenie ich etapów dojrzewania, co prowadzi do dalszego rozwoju tej dziedziny. Metoda ta została scharakteryzowana pod kątem różnicowania nowo powstałych komórek w glej, niedojrzałe neurony lub w pełni dojrzałe komórki ziarniste, a nawet określania, czy aktywnie uczestniczą one w obwodach neuronalnych. Kolejnym przełomem w tej dziedzinie było wykorzystanie modeli transgenicznych do identyfikacji niedojrzałych komórek w obrębie domeny nestyny. Transgeniczne myszy nestin-GFP wykazują ekspresję wzmocnionego zielonego białka fluorescencyjnego (GFP), które znajduje się pod kontrolą promotora nestyny. Nestyna jest filamentem pośrednim charakterystycznym dla komórek progenitorowych5. Transgeniczne myszy nestin-GFP pozwoliły na ustalenie wczesnych etapów rozwojowych zaangażowanych w neurogenezę6. Istotnym ograniczeniem jest jednak konieczność utrzymywania kolonii transgenicznych myszy nestin-GFP w specjalnych warunkach w placówce laboratoryjnej, co może okazać się nieopłacalne dla niektórych grup naukowych, szczególnie tych z krajów rozwijających się.
Wymienione powyżej techniki mają swoje zalety i wady. Jednakże identyfikacja komórek proliferujących za pomocą immunohistochemii (IHC) oraz możliwość zastosowania techniki podwójnego lub potrójnego znakowania metodą immunofluorescencji w celu określenia stopnia dojrzewania komórek lub ich losu stanowią do tej pory najbardziej wykonalny sposób pomiaru neurogenezy u dorosłych. Proces identyfikacji z wykorzystaniem immunohistochemii polega na znakowaniu białek, domen białkowych lub nukleotydów za pomocą specyficznego przeciwciała rozpoznającego, zwanego przeciwciałem pierwotnym. Jest ono z kolei rozpoznawane przez przeciwciało wtórne, które jest znakowane chromogenem (np. peroksydazą chrzanową) lub fluorochromem (np. FITC) sprzężonym z przeciwciałem wtórnym. Mikroskopy mogą wykrywać sygnały pochodzące zarówno z chromogenów, jak i fluorochromów. Dzięki IHC możliwe jest zidentyfikowanie białek błonowych, białek cytoszkieletu lub komponentów jądrowych, takich jak BrdU. Z drugiej strony, BrdU można znaleźć w jądrze komórkowym, ponieważ jest ono włączane do DNA w fazie S w drodze konkurencji. Dlatego kluczowym krokiem jest denaturacja DNA za pomocą HCl, która rozrywa wiązania DNA, umożliwiając przeciwciału anty-BrdU dostęp do BrdU wewnątrz DNA. Należy pamiętać, że po podaniu domięśniowym BrdU występuje w stężeniu nasyconym w surowicy myszy i szczurów odpowiednio przez 15 i 60 min, a następnie szybko spada do poziomów niewykrywalnych odpowiednio w 60. i 120. minucie7.
W niniejszej pracy opisujemy cztery różne, lecz ściśle powiązane techniki IHC: chromogeniczną detekcję pośrednią z wykorzystaniem reakcji peroksydazy chrzanowej (HRP) z DAB (3,3'-diaminobenzydyną) bez wzmocnienia sygnału (krok 4.1), wzmocnienie za pomocą kompleksu awidyna-biotyna (ABC) (krok 4.1), pośrednią detekcję immunofluorescencyjną bez wzmocnienia sygnału (krok 4.4) oraz wzmocnienie za pomocą znakowanej streptawidyny i biotyny (LSAB) (krok 4.3). Każda z metod posiada zalety i wady i może być użyteczna w zależności od specyficznych wymagań tkanki (patrz Tabela 1). Zdecydowaliśmy się na zastosowanie pośrednich metod IHC ze względu na ich przystępność cenową oraz łatwość przejścia z metod detekcji chromogenicznej na fluorescencyjne przy użyciu niekonjugowanych przeciwciał pierwszorzędowych. Podejście z wykorzystaniem HRP jest powszechnie stosowaną metodą IHC ze względu na niski koszt, wysoką stabilność, wysoką szybkość obrotu oraz pełną dostępność substratów. Niemniej jednak zalecamy stosowanie kontroli pozytywnej w celu potwierdzenia prawidłowego działania metody barwienia oraz kontroli negatywnej do efektywnego sprawdzenia funkcji przeciwciał. Wielokrotne barwienia immunohistochemiczne lub metody multiplex IHC (patrz krok 6) są potężnymi narzędziami pozwalającymi na pozyskanie dużej ilości danych z jednego skrawka tkanki w ramach jednego eksperymentu. Technika ta jest szczególnie istotna w przypadku ograniczonej dostępności próbek. Inną zaletą jest możliwość jednoczesnej identyfikacji specyficznych białek koekspresjonowanych w tej samej przestrzeni komórkowej przy zachowaniu integralności tkanki. Metoda multiplex pozwala na barwienie różnych markerów ekspresjonowanych podczas specyficznych etapów proliferacji (np. nestin, GFAP, DCX, Ki-67), co umożliwia bardziej szczegółowe badania nad proliferacją i różnicowaniem8. Kluczowe jest wybranie przeciwciał kompatybilnych z zastosowaną techniką utrwalania, aby uniknąć reaktywności krzyżowej. Zalecamy indywidualne testowanie każdego nowego przeciwciała (w tym BrdU) w celu dostosowania i dopracowania metody. Następnie należy wprowadzić podwójne barwienie sekwencyjne, a w końcowej fazie rozpocząć proces jednoczesnego barwienia immunohistochemicznego, gdy metoda sekwencyjna zostanie całkowicie opanowana. W tej metodzie kluczowy jest wybór odpowiednich przeciwciał wtórnych.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Metoda</td>
			<td>Metoda specyficzna</td>
			<td>Zalety</td>
			<td>Wady</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Metoda detekcji pośredniej</td>
			<td>Reakcja peroksydazy z DAB</td>
			<td>1. Wyższa czułość niż w przypadku detekcji bezpośredniej oraz metody pośredniej fluorescencji. 
			2. Wyższa odporność na fotoblaknięcie niż w przypadku fluorochromów. 
			3. Niższy koszt niż w przypadku metody detekcji fluorescencyjnej</td>
			<td>1. Trudności w przeprowadzaniu analizy multipleksowej z powodu ograniczonej liczby barwników fluorescencyjnych. 
			2. Skomplikowane w przypadku celów koekspresyjnych w tej samej przestrzeni komórkowej. 
			3. Zredukowany zakres dynamiczny dla jednoczesnego wykrywania rzadkich i wysokoobfitych celów w tej samej tkance.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescencja</td>
			<td>1. Najlepsza i najprostsza metoda do multipleksowania z wykorzystaniem większej liczby barwników kolorystycznych. 
			2. Najlepsze dla celów współwyrażanych w tej samej przestrzeni komórkowej. 
			3. Lepszy zakres dynamiczny dla jednoczesnego wykrywania rzadkich i wysokobobotnych celów w tej samej tkance. 
			4. Brak dodatkowych kroków.</td>
			<td>1. Niższa czułość niż w przypadku metody pośredniej reakcji peroksydazy z DAB. 
			2. Słaba odporność na fotoblaknięcie w czasie. 
			3. Wyższy koszt.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Metoda amplifikacji sygnału</td>
			<td>Kompleks awidyna-biotyna (ABC)</td>
			<td>1. Wyższa czułość niż w przypadku metody detekcji bezpośredniej i pośredniej. 
			2. Redukcja tła</td>
			<td>1. Kroki dodatkowe. 
			2. Wyższy koszt w porównaniu do metod bez amplifikacji.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metoda Labeled Streptavidin-Biotin (LSAB)</td>
			<td>1. Wyższa czułość niż w przypadku metody detekcji bezpośredniej i pośredniej. 
			2. Głębsza penetracja tkanek niż w przypadku metody ABC. 
			3. Redukcja tła</td>
			<td>1. Kroki dodatkowe. 
			2. Wyższy koszt niż w przypadku metody ABC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brak dodatkowej metody amplifikacji</td>
			<td>1. Niższy koszt. 
			2. Brak dodatkowych kroków. 
			3. Idealne dla celów o wysokiej liczebności.</td>
			<td>1. Niższa czułość: problematyczna w przypadku braku obfitych celów.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Zalety i wady technik IHC. Tabela ta przedstawia zalety i wady metod detekcji pośredniej: reakcji peroksydazy z (3,3'-diaminobenzydyną) DAB oraz fluorescencji; a także metod amplifikacji sygnału: kompleksu awidyna-biotyna (ABC), znakowanej streptawidyny-biotyny (LSAB) oraz braku dodatkowej metody amplifikacji.
Obraz o wysokiej rozdzielczości jest niezbędny do przeprowadzenia prawidłowej analizy i zaprezentowania wyników. Istnieją dwa podejścia do poprawy rozdzielczości: 1) zastosowanie lepszej konstrukcji mikroskopu (np. konfokalnego, wielofotonowego) lub 2) numeryczne odwrócenie procesu rozmycia w celu ulepszenia obrazów za pomocą dekonwolucji9. Niestety, mikroskopia konfokalna nie jest dostępna dla każdego ze względu na wysokie koszty sprzętu i jego serwisowania10. Mikroskop epifluorescencyjny w szerokim polu oraz następująca po nim dekonwolucja obrazów z serii z-stack stanowią odpowiednią, niskokosztową alternatywę dla mikroskopii konfokalnej8,9. Jak wspomniano powyżej, celem dekonwolucji jest przywrócenie oryginalnego sygnału, który uległ degradacji w systemie akwizycji9, poprzez redukcję rozmycia, mgiełki poza ogniskową i zniekształceń widocznych na obrazie uzyskanym za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego z wykorzystaniem matematycznych algorytmów usuwania10. Uzyskany rozmyty obraz można zamodelować matematycznie jako wynik splotu obserwowanych obiektów z trójwymiarową funkcją rozproszenia punktu (PSF). PSF to teoretyczny wzór dyfrakcyjny punktów światła emitowanych przez próbkę tkanki i zbieranych przez mikroskop. Plik PSF jest tworzony przy uwzględnieniu specyficznych warunków każdego obrazu, takich jak odstępy między komórkami CCD kamery, współczynnik załamania światła użytych mediów, apertura numeryczna obiektywu, długość fali emisji fluoroforu, rozmiary obrazów, liczba obrazów w metodzie przetwarzania z-stack oraz odległość między nimi (patrz specyfikacja techniczna w Tabeli 2). Innymi słowy, plik PSF podsumowuje wpływ konfiguracji obrazowania na obserwacje mikroskopowe9. W naszej pracy wykorzystujemy wtyczkę Diffraction PSF 3D (https://imagej.net/Diffraction_PSF_3D) do tworzenia własnego, specyficznego pliku PSF dla każdego obrazu z-stack. Obrazy z-stack to seria zdigitalizowanych przekrojów optycznych z określonych głębokości (oś z) w tej samej lokalizacji XY preparatu. Komputer kompiluje informacje uzyskane z płaszczyzny ogniskowania poprzez ponowne przypisanie sygnałów, które pochodziły z obiektów znajdujących się w innych płaszczyznach ogniskowych. Aby utworzyć obrazy z-stack, konieczne jest wykonanie zdjęć z różnych warstw ogniskowania preparatu (np. dziesięć różnych obrazów tego samego obszaru XY co 1 μm głębokości). Następnie używamy oprogramowania mikroskopowego dostarczonego przez producenta lub programu Fiji, aby stworzyć z-stack lub obraz 3D. Wynikiem będzie pojedynczy plik obrazu stosu (np. dziesięć obrazów z różnymi ogniskowaniem). Istnieje kilka specjalistycznych narzędzi i rozwiązań programowych, takich jak oprogramowanie open-source do mikroskopii dekonwolucyjnej. Przedstawimy wyniki procesu dekonwolucji przy użyciu DeconvolutionLab29, który jest wtyczką do programu Fiji11 (dystrybucja ImageJ12). Dekonwolucja pomoże poprawić rozdzielczość końcowych mikrografii (patrz Rycina 1B,C). W celu uzyskania dalszych informacji i instrukcji zdecydowanie zalecamy zapoznanie się z literaturą13.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna komórek mózgu myszy, wykazująca markery BrdU, DAPI, GFAP; schemat opisowy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61483/61483fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Reprezentatywny obraz dekonwolucji 3D dla wielu kanałów kolorystycznych. (A) DG przy małym powiększeniu. (B) Oryginalne obrazy z serii z-stack dla każdego kanału oraz obraz połączony. (C) Obrazy z serii z-stack po dekonwolucji 3D dla każdego kanału oraz obraz połączony. Mózg pochodził od szczura z grupy aktywności fizycznej. Zastosowano metodę amplifikacji LSAB (labeled streptavidin-biotin). Wykazano przeciwciało sprzężone ze streptawidyną Cy3 dla oznaczenia BrdU (czerwony), DAPI jako barwienie przeciwstawne (niebieski) oraz kwaśne białko włókienkowe gleju (GFAP) jako marker astroglialny (zielony). ML = warstwa molekularna; GCL = warstwa komórek ziarnistych; SGZ = strefa podziarnista. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61483/61483fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
Celem niniejszej pracy jest przedstawienie szczegółowego opisu kroków prowadzących do uzyskania pozytywnych i pomyślnych wyników w immunobarwieniu oraz wymienienie powszechnie stosowanych etapów w badaniach opartych na BrdU, bez wykorzystania mikroskopu konfokalnego. Barwienie BrdU jest techniką wymagającą wykonania kilku etapów, których należy ściśle przestrzegać, aby uzyskać pomyślne barwienie. Standaryzacja tych technik barwienia zazwyczaj trwa miesiące i jest czasochłonna oraz zasobożerna. Przewidujemy, że niniejszy artykuł może dostarczyć informacji grupom rozpoczynającym pracę w tej dziedzinie, redukując czas oraz liczbę błędów.

<table><tbody><tr><td>PRZYGOTOWANIE I KONFIGURACJA ODCZYNNIKÓW</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dawca Surowicy końskiej</td><td>BioWest</td><td>S0900</td><td>Roztwory blokujące i inkubacyjne w PBS</td></tr><tr><td>Odczynnik paraformaldehydowy, krystaliczny (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>toksyczny, łatwopalny</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746436-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu, monobasic</td><td>J.T Bker</td><td>3246-01</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>J.T Baker</td><td>4072-01</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Meyer</td><td>2365-500G</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500G</td><td>Koryzujący, do kalibracji pH</td></tr><tr><td>Phophate sodu Dibasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Triton-x 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>ANALOG TYMIDYNY PODANIE BRDU</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-2&prime;-deoksyurydyna, BrdU</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9285</td><td>toksyczny (mutagenny, teratogenny)</td></tr><tr><td>23&ndash; Igła podskórna 27G</td><td>BD PrecisionGlide</td><td></td><td></td></tr><tr><td>roztwór soli fizjologicznej</td><td></td> Strzykawki <td>PiSA</td> 30130032 <td></td></tr><tr><td>1 ml</td><td>NIPRO</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>em>PREPARAT TKANKOWY</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15-ml polipropylenowa tubka stożkowa</td><td>Thermo Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>50-ml polipropylenowa rurka stożkowa</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td>339652</tr><tr><td>Narzędzia</td><td></td><td></td><td></td>preparacyjne</tr><tr><td>Gilotyna</td><td>Stoelting</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtome Cryostat</td><td>MICROM</td><td>HM525</td><td></td></tr><tr><td>Netwell 15 mm wkładki membranowe z siatki poliestrowej</td><td>Corning</td><td>3477</td><td>wstępnie załadowane 12-dołkowe płytki hodowlane</td></tr><tr><td>Plastikowy zestaw nośny Netwell 12-dołkowy</td><td>Corning</td><td>3520</td><td>do siatki poliestrowej 15 mm wkładki membranowe</td></tr><tr><td>Plastikowy zestaw nośny 6-dołkowy Netwell</td><td>Corning</td><td>3521</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perfuzyjna</td><td>Cole-Parmer</td><td>7553-70</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka</td><td>IKA</td><td>ROKCER 3D Digital</td><td></td></tr><tr><td>IMMUNOSTAINING</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Cresyl violet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5042</td><td>1%, Światłoczuły</td></tr><tr><td>Zestaw substratów peroksydazy DAB (HRP) (z niklem), 3,3'-diaminobenzydyna</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td>rakotwórczy, światłoczuły</td></tr><tr><td>kwas hidochlorowy</td><td>J.T.Baker</td><td>9535-05</td><td>, do kalibracji pH</td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru, 50%</td> <td>Meyer</td><td>5375-1L</td><td>Toksyczny, utleniający</td></tr><tr><td>Podłoże montażowe Permount</td><td>Fisher Chemical</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Podłoże montażowe zapobiegające blaknięciu z DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Światłoczuły</td></tr><tr><td>VECTASTAIN&reg; Elite&reg; Zestaw ABC Peroksydaza (HRP)</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td>enzymatyczny system amplifikacji na bazie awidyny/biotyny</td></tr><tr><td>Przeciwciała pierwotne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-GFAP wytwarzane w króliku</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA056030</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne anty-BrdU wytwarzane w myszy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2531</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Przeciwciała drugorzędowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotin-SP (długi dystans) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-065-151</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H+L) z adsorbacją krzyżową, HRP</td><td>Invitrogen</td><td>G-21040</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Kozia IgG Anty-Mysz (cała cząsteczka), TRITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5393</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Kozia anty-królicza IgG (H+L) adsorbowana krzyżowo, FITC</td><td>Invitrogen</td><td>F-2765</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Streptawidyna, Cy3</td><td>Vector Laboratories</td><td>SA-1300</td><td>1:250</td></tr><tr><td>OBRAZOWANIE I ANALIZA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komputer</td><td>Dell Computer Company</td><td>T8P8T-7G8MR-4YPQV-96C2F-7THHB</td><td>Do sterowania i monitorowania procesów protokołów</td></tr><tr><td>Kamera CCD</td><td>Oprogramowanie Olympus</td><td>UC50</td><td></td></tr><tr><td>CellSens Standard</td><td>Oprogramowanie do akwizycji</td><td>Olympus</td><td>cellSens Standard Edition</td></tr><tr><td>Mikroskop epifluorescencyjny</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td></td></tr><tr><td>Wysokociśnieniowa lampa łukowa rtęciowa 130 W</td><td>Olejek immersyjny Olympus</td><td>U-HGLGPS</td><td></td></tr><tr><td>o niskiej autofluorescencji</td><td>Olympus</td><td>MOIL-30 Typ F</td><td></td></tr><tr><td>Mikro okulary nakrywkowe (VWR, nr kat. 48404 454; 24&nbsp; 60 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe (VWR, nr kat. 48323-185; 76&nbsp; 26 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kostka filtracyjna U-FBW</td><td>Olympus</td><td>U-FBW</td><td>wzbudzenie 460 - 495 nm, zwierciadło dichroiczne 505 nm, tłumienie 510 nm</td></tr><tr><td>Kostka filtra U-FGW</td><td>Olympus</td><td>U-FGW</td><td>wzbudzenie 530 - 550 nm, zwierciadło dichroiczne 570 nm, tłumienie 575 nm</td></tr><tr><td>Kostka filtra U-FUW</td><td>Olympus</td><td>U-FUW</td><td>wzbudzenie 340 - 490 nm, zwierciadło dichroiczne 410 nm, tłumienie 420 nm</td></tr></tbody></table>

techniki immunohistochemiczne do analizy proliferacji komórkowej i neurogenezy u szczurów przy użyciu analogu tymidyny brdu

Immunohistochemistry Techniques to Analyze Cellular Proliferation and Neurogenesis in Rats Using the Thymidine Analog BrdU

Jedną z najważniejszych rzeczy w dziedzinie neurogenezy hipokampa u dorosłych (AHN) jest identyfikacja nowo powstałych komórek. Immunodetekcja analogów tymidyny (takich jak 5-Bromo-2'-deoksyurydyna (BrdU)) jest standardową techniką stosowaną do wizualizacji tych nowo wytworzonych komórek. Dlatego BrdU jest zwykle wstrzykiwany małym zwierzętom dootrzewnowo, więc analog tymidyny zostaje włączony do dzielących się komórek podczas syntezy DNA. Wykrywanie odbywa się za pomocą analizy immunohistochemicznej wycinków mózgu. Każda grupa badawcza, która stosowała tę technikę, może docenić, że wymaga ona szczególnej dbałości o najdrobniejsze szczegóły, aby uzyskać udane barwienie. Na przykład ważnym krokiem jest denaturacja DNA HCl, co pozwala mu dotrzeć do jądra komórkowego w celu jego wybarwienia. Jednak istniejące raporty naukowe szczegółowo opisują bardzo niewiele takich kroków. Dlatego standaryzacja techniki jest wyzwaniem dla nowych laboratoriów, ponieważ uzyskanie pozytywnych i pomyślnych wyników może zająć kilka miesięcy. Celem niniejszej pracy jest szczegółowe opisanie i opracowanie kroków prowadzących do uzyskania pozytywnych i pomyślnych wyników techniki barwienia immunologicznego podczas pracy z analogiem tymidyny BrdU. Protokół obejmuje przygotowanie i ustawienie odczynnika, podanie analogu tymidyny u gryzonia, perfuzję przezsercową, przygotowanie tkanki, reakcję immunohistochemiczną peroksydazy, zastosowanie kompleksu awidyna-biotyna, immunofluorescencję, barwienie przeciwstawne, obrazowanie mikroskopowe i analizę komórek.

Opisane powyżej metody zastosowano w celu ilościowego oznaczenia nowo powstałych komórek w hipokampie dorosłych szczurów po dobrowolnej aktywności fizycznej, w porównaniu z grupą kontrolną bez dodatkowej aktywności fizycznej. Jako kontrolę pozytywną wykorzystano hipokamp szczura postnatalnego. Samce szczurów w wieku 3 miesięcy poddano protokołowi dobrowolnej aktywności fizycznej (kołowrotek) przez siedem dni. W 6. dniu szczurom wstrzyknięto BrdU (sekcja 2), a następnie powtarzano zabieg co 12 h, aż do wykonania trzech pełnych iniekcji. Aby umożliwić przejście trzech podziałów cyklu komórkowego, zwierzęta poddano perfuzji transkardialnej (sekcja 3) 8 h po ostatniej iniekcji BrdU. Tę samą procedurę zastosowano u trzymiesięcznych szczurów, które nie podejmowały aktywności fizycznej, w celu uzyskania kontroli porównawczej. Jako kontrolę pozytywną jednodniowym szczurzętom (1. dzień postnatalny) wstrzyknięto jednorazowo BrdU, zgodnie z opisem w sekcji 2 powyżej. Dzień po iniekcji (2. dzień postnatalny) szczurzęta zostały uśmiercone, a ich głowy zanurzono w roztworze PFA, zgodnie z opisem w kroku 3.4. Dorosłe szczury zostały poddane głębokiej anestezji (krok 3.1) i perfuzji transkardialnej, zgodnie z opisem w kroku 3.2. Mózgowia zostały wypreparowane i poddane postfixacji (krok 3.4). Mózgowia pocięto na koronalne sekcje o grubości 40 μm (krok 3.5). Sekcje przetworzono w celu przeprowadzenia immunohistochemii BrdU, zgodnie z opisem w kroku 4.
Do barwienia (krok 4.1) i zliczania komórek BrdU-dodatnich w DG wykorzystaliśmy reakcję peroksydazy chrzanowej z DAB IHC. Rysunek 5 przedstawia przekrój DG z komórkami znakowanymi BrdU. Rysunek 5C,D pokazuje reprezentatywną część przekroju DG przy większym powiększeniu. Komórki znakowane wykazywały intensywne, ciemne barwienie i zostały oznaczone strzałkami. Wstawka przedstawia średnią liczbę komórek znakowanych w grupach eksperymentalnej i kontrolnej (liczba zliczonych komórek dodatnich pomnożona przez sześć, zgodnie z opisem w kroku 8.1). Test t Studenta wykazał istotne różnice w liczbie komórek BrdU-dodatnich (t(10) = 2.704, p = 0.0222). Grupa kontrolna, która nie podejmowała aktywności fizycznej, wykazała 2 040 ± 314 komórek (n = 6 szczurów). W porównaniu z nią, grupa z aktywnością fizyczną wykazała średnio 3 606 ± 486 (n = 6 szczurów) komórek BrdU-dodatnich. Jak zaobserwowano, ekspozycja na aktywność fizyczną zwiększa liczbę komórek BrdU-dodatnich. Wyniki te są zatem zgodne z innymi raportowanymi danymi, które wskazują, że aktywność fizyczna zwiększa proliferację komórkową w zakręcie zębatym u osobników dorosłych17.
<img alt="Równowaga statyczna, obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej; rozkład komórkowy, porównanie próbek, skala 10 µm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61483/61483fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Przykłady różnej morfologii jąder komórkowych znakowanych BrdU.BrdU jest markerem syntezy DNA, który znakuje jądro komórkowe. W obszarze hipokampa jądra BrdU-dodatnie miały kształt półowalny i znajdowały się w strefie podziarnistej zakrętu zębatego. Ponieważ BrdU jest wbudowywane konkurencyjnie, ilość wbudowana w każdą komórkę będzie się różnić, co później odzwierciedli się w sposobie wizualizacji jądra. (A) Obraz immunofluorescencyjny. (B) Przedstawiono obraz z wykorzystaniem reakcji peroksydazy bez dodatkowej metody amplifikacji. Żółte strzałki wskazują artefakty i sygnały nieswoiste. Czarne lub białe strzałki wskazują komórki BrdU+. 1 – Jądro w pełni wypełnione, jądra półowalne silnie zabarwione. 2 – Jądra z kropkami; obrys jądra jest zaznaczony, a wewnątrz znajduje się kilka kropek. 3 – Jądra z niewielką liczbą kropek; obrysy jąder są zaznaczone, a wewnątrz znajduje się mała liczba kropek. 4 – Małe jądro; możliwe komórki w innym stadium różnicowania, ale wciąż będące częścią niszy. 5 – Klastry to komórki prekursorowe w trakcie podziału, dlatego można zaobserwować kilka komórek razem w zagęszczonych grupach. W obrębie tych grup liczenie musi być przeprowadzone szczególnie uważnie, aby uniknąć błędnego oznakowania komórek dodatnich. Czerwone strzałki wskazują jądra w trakcie podziału, które mogą zostać pomylone z pojedynczą komórką. Każda komórka jest zamknięta w ramce i może zostać rozróżniona w płaszczyźnie osi Z w czasie rzeczywistym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61483/61483fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza neurogenezy, mikroskopia konfokalna, BrdU, DAPI, GFAP, warstwy komórkowe hipokampa, skala 50 µm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61483/61483fig04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Reprezentatywny obraz RGB dla pojedynczych i połączonych kanałów. Górny obraz przedstawia oryginalny obraz z serii z-stack, a dolny obraz przedstawia obraz z serii z-stack po dekonwolucji 3D. (A) Małe powiększenie zakrętu zębatego (DG). (B) Obraz RGB dla każdego kanału oraz (C) połączony obraz RGB. Próbka pochodziła z mózgu grupy kontrolnej. Zastosowano immunofluorescencję bez dodatkowej metody amplifikacji. BrdU (czerwony), DAPI jako barwienie przeciwkostkowe (niebieski) oraz GFAP (kwaśne białko włókienkowe gleju) jako marker astroglialny (zielony). ML = warstwa molekularna; GCL = warstwa komórek ziarnistych; SGZ = strefa podziarnista. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61483/61483fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Histologia przekroju mózgu, analiza porównawcza, neurogeneza, mikroskopia, wpływ aktywności fizycznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61483/61483fig05.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Reprezentacyjny przekrój DG z komórkami znakowanymi BrdU (intensywny ciemny kolor) dla każdej grupy eksperymentalnej. Do reakcji peroksydazy wykorzystano metodę wzmocnienia z użyciem kompleksu awidyna-biotyna-peroksydaza. (A, B) Przedstawiają DG przy małym powiększeniu, a (C, D) pokazują obszar zaznaczony ramką przy większym powiększeniu. Panele A i C to tkanki z grupy aktywności fizycznej, a panele B i D z grupy kontrolnej. Wstawka przedstawia średnią liczbę znakowanych komórek w grupie aktywności fizycznej i grupie kontrolnej (liczba policzonych komórek dodatnich pomnożona przez sześć, zgodnie z opisem w kroku 8.1). ML = warstwa molekularna; GCL = warstwa komórek ziarnistych; SGZ = strefa podziarnista; strzałki wskazują komórki BrdU+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61483/61483fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Wideo 1: Film pokazujący różną płaszczyznę ostrości komórek pozytywnych wzdłuż osi z, rozmieszczonych w różnych warstwach. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61483/VIDEO_1.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
Wideo 2: Film przedstawiający inną płaszczyznę ogniskowania klastrów komórek pozytywnych wzdłuż osi z, rozmieszczonych w różnych warstwach. Przesuwaj się powoli wzdłuż osi z, aby skwantyfikować wszystkie jądra wchodzące w skład klastra. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61483/VIDEO_2.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Typ mikroskopu:</td>
			<td colspan="5">Mikroskop epifluorescencyjny Olympus BX53</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Źródło światła:</td>
			<td colspan="5">Lampy wysokociśnieniowej rtęciowej 130 W (U-HGLGPS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oprogramowanie do akwizycji danych:</td>
			<td colspan="5">CellSens Standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">Zestawy filtrów:</td>
			<td colspan="2">Numer katalogowy</td>
			<td>Zakres wzbudzenia</td>
			<td>Lustro dichroiczne</td>
			<td>Zakres supresji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">U-FUW</td>
			<td>340–490 nm</td>
			<td>410 nm</td>
			<td>420 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">U-FBW</td>
			<td>460–495 nm</td>
			<td>505 nm</td>
			<td>510 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">U-FGW</td>
			<td>530–550 nm</td>
			<td>570 nm</td>
			<td>575 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">Kamera:</td>
			<td colspan="2">Model:</td>
			<td colspan="3">kamera CCD UC50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Zakres widmowy:</td>
			<td colspan="3">290 – 1000 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Rozmiar matrycy CCD:</td>
			<td colspan="3">2/3 cala, 2588 (Szerokość *7) X 1960 (Wysokość *8) pikseli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Rozmiar piksela:</td>
			<td colspan="3">3.4 X 3.4 µm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">Fluorochrom:</td>
			<td colspan="2">Nazwa</td>
			<td>Długość fali wzbudzenia (nm)</td>
			<td>Emisja *3 długość fali (nm)</td>
			<td>Kolor emisji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">chlorowodorek 4, 6-diamidyno-2-fenylo-indolu (DAPI)</td>
			<td>345</td>
			<td>455</td>
			<td>Niebieski</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">izotiocyjanian tetrametylorodaminy (TRITC)</td>
			<td>541</td>
			<td>572</td>
			<td>Czerwony</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">izotiocyjanian fluoresceiny (FITC)</td>
			<td>494</td>
			<td>519</td>
			<td>Zielony</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Cy3</td>
			<td>552</td>
			<td>565</td>
			<td>Czerwony</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">Medium montażowe i olej immersyjny:</td>
			<td colspan="3">Nazwa</td>
			<td colspan="2">Współczynnik załamania światła ośrodków *1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Powietrze (brak medium między szkiełkiem a obiektywem)</td>
			<td colspan="2">1.00029</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Medium montażowe antyblaknące z DAPI</td>
			<td colspan="2">1.45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Medium montażowe Permount</td>
			<td colspan="2">1.519</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Olej immersyjny o niskiej autofluorescencji (MOIL-30 Type F)</td>
			<td colspan="2">1.518</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="6">Soczewka powiększająca (planfluorytowa)</td>
			<td>Powiększenie</td>
			<td>Apertura numeryczna (NA) *2</td>
			<td>Rozdzielczość (µm)</td>
			<td>Odstępy między pikselami obrazu (nm) *5</td>
			<td>Odstęp między przekrojami w osi Z (nm) *6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X</td>
			<td>0.13</td>
			<td>2.12</td>
			<td>850</td>
			<td>3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X</td>
			<td>0.3</td>
			<td>0.92</td>
			<td>340</td>
			<td>3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.55</td>
			<td>170</td>
			<td>2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x</td>
			<td>0.75</td>
			<td>0.37</td>
			<td>85</td>
			<td>1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X</td>
			<td>1.3</td>
			<td>0.21</td>
			<td>34</td>
			<td>1000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Specyfikacje konfiguracji mikroskopu i wymagania dotyczące tworzenia pliku funkcji rozproszenia punktu (PSF). W oknie wtyczki diffraction PSF 3D znajduje się 11 pól służących do utworzenia pliku PSF. Każde pole opisano w następujący sposób: *1 – Współczynnik załamania światła ośrodka: współczynnik załamania światła dla ośrodka znajdującego się między preparatem a obiektywem (np. powietrze = 1,00029). *2 – Apertura numeryczna: NA użytego obiektywu (musi zostać skorygowana w przypadku zastosowania innego medium immersyjnego niż to, dla którego obiektyw został zaprojektowany). *3 – Długość fali: Maksymalna długość fali emisji fluorochromu (nm). *4 – Podłużna aberracja sferyczna: 0,00. *5 – Odstępy między pikselami obrazu: rozmiar piksela CCD (nm)/powiększenie (np. 3,4 µm i obiektyw 100X, 3400/100 = 34 nm). *6 – Odległość między obrazami w osi Z. *7 – Szerokość: Wprowadź szerokość obrazu do dekonwolucji w pikselach. *8 – Wysokość: Wprowadź wysokość obrazu do dekonwolucji w pikselach. *9 – Głębokość, przekroje: liczba obrazów w stosie z (z-stack). *10 – Normalizacja: Suma wartości pikseli = 1. *11 – Tytuł: Pożądana nazwa pliku PSF. Plik powinien odpowiadać konkretnemu, unikalnemu obrazowi stosu z.

Ten artykuł przedstawia cztery najpopularniejsze techniki wizualizacji komórek BrdU dodatnich do pomiaru neurogenezy u dorosłych szczurów. Praca ta zawiera instrukcje dotyczące przygotowania odczynników, podawania analogu tymidyny, perfuzji przezsercowej, przygotowania tkanek, reakcji immunohistochemicznej peroksydazy, immunofluorescencji, wzmocnienia sygnału, barwienia przeciwstawnego, obrazowania mikroskopowego i analizy komórek.

Techniki immunohistochemiczne do analizy proliferacji komórkowej i neurogenezy u szczurów przy użyciu analogu tymidyny BrdU

One of the most important things in the field of adult hippocampal neurogenesis (AHN) is the identification of the newly generated cells. The ...

Jest to kluczowy protokół w dziedzinie neurogenezy dorosłych. Tutaj przedstawiamy szczegółowy opis kroków wymaganych do osiągnięcia udanego barwienia. Technika ta umożliwia jednoczesną identyfikację określonych białek ulegających koekspresji w poddanych podziałowi komórkach przy jednoczesnym zachowaniu integralności tkanek.Zalecamy wcześniejsze przetestowanie przeciwciał tkankowych i warunków. Kluczowymi etapami są przepuszczalność błony, staranna denaturacja DNA oraz testowanie czasów etapów blokowania i mycia. Standaryzacja techniki jest wyzwaniem dla nowych laboratoriów.Przygotowanie odczynnika i podawanie analogu tymidyny gryzoniom ma kluczowe znaczenie dla pomyślnych wyników W przypadku podawania analogu tymidyny BrdU należy unieruchomić dolną jamę brzuszną, aby unieruchomić szczura doświadczalnego i użyć jednomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 23 do dootrzewnowego wstrzyknięcia zwierzęciu świeżo przygotowanego roztworu BrdU o stężeniu 50 miligramów na kilogram. W odpowiednim eksperymentalnym punkcie końcowym zebrać mózg i zamrozić mózg, aby umożliwić pobranie skrawków koronalnych o grubości 40 mikrometrów za pomocą mikrotomu kriostatu i umieścić skrawki w indywidualnych studzienkach 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej w roztworze krioochronnym w kolejności ich pobrania. Po pobraniu wszystkich skrawków należy przechowywać próbki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez okres do kilku miesięcy.Aby ocenić barwienie BrdU, stosując reakcję peroksydazy, z kompleksem awidyna-biotyna-peroksydaza, przenieś plastry z roztworu krioochronnego do 0,1 molowego PBS, aż próbki osiągną temperaturę pokojową i przepłucz tkanki trzy razy przez 10 minut świeżym 0,1 molowym PBS na pranie. Po ostatnim płukaniu inkubuje skrawki w endogennym roztworze blokującym peroksydazę przez 30 minut, w temperaturze pokojowej, a następnie trzy 10-minutowe płukanie w 0,1 molowym PBS. Po ostatnim przepłukaniu inkubować skrawki przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w dwóch molowych kwasach solnych, a następnie jedno 10-minutowe płukanie w 0,1-molowym buforze boranowym.Po trzech przemyciach w lodowatym 0,1 molowym PBS inkubować próbki przez dwie godziny w temperaturze pokojowej w roztworze blokującym PBS +, a następnie przez noc inkubować z mysim przeciwciałem pierwszorzędowym Anti-BrdU w PBS + w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po trzech 0,1-molowych płukaniach PBS należy inkubować próbki przez dwie do czterech godzin z odpowiednim mysim biotynylowanym przeciwciałem drugorzędowym w PBS+ w temperaturze pokojowej. Po umyciu należy potraktować skrawki roztworem ABC przez godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie wykonać trzy płukania PBS o stężeniu 0,1 mola.Po ostatnim umyciu przenieś plastry do roztworu substratu peroksydazy DAB na dwie do 10 minut inkubacji, aż plastry staną się ciemnoszare. Jeśli można uwidocznić dodatnie komórki, przepłucz próbki trzema 15-minutowymi płukaniami wodą z kranu, a następnie trzema 0,1-molowymi płukaniami PBS. Po ostatnim praniu Użyj miękkiej szczotki, aby ostrożnie zamontować plastry na żelowatych szkiełkach, do wyschnięcia na powietrzu przez noc w temperaturze pokojowej.Następnego ranka należy użyć stałego podłoża montażowego, aby nałożyć szkiełka nakrywkowe na próbki. Aby określić ilościowo komórki BrdU dodatnie, najpierw użyj 4-krotnego powiększenia pod mikroskopem, aby zidentyfikować zakręt zębaty i dokładnie przeszukaj ziarnistą warstwę komórkową wzdłuż osi Z w poszukiwaniu jąder znakowanych BrdU. Po wybraniu sekcji interwału do wyszukiwania komórek w całym zakręcie zębatym, policz wszystkie komórki BrdU dodatnie.Morfologia znakowanego jądra może się zmieniać w zależności od tego, ile BrdU zawiera komórka. Przesuwaj się powoli po osi Z, aby określić ilościowo wszystkie jądra z co najmniej 10 sekcji na zwierzę i co najmniej pięciu zwierząt na grupę, które integrują klaster. Aby zdekonwolucjonizować obraz, otwórz wtyczkę 3D funkcji rozpraszania punktów dyfrakcji, wypełnij wszystkie wymagane dane, kliknij OK i zapisz plik.Następnie otwórz wtyczkę DeconvolutionLab2 i przeciągnij dopasowany obraz stosu Z i plik PSF do odpowiedniego miejsca w oknie. Wybierz algorytm dekonwolucji i liczbę iteracji, a następnie kliknij przycisk Uruchom. Aby połączyć zdekonwolucyjne obrazy w jeden obraz stosu Z, wybierz opcję Obraz i stosy i kliknij opcję Projekt Z.Z menu typu projekcji wybierz opcję Max Intensity (Maksymalna intensywność). Kliknij przycisk OK i zapisz plik. Aby utworzyć obraz RGB, wybierz opcję Obraz i kolor i kliknij przycisk Scal kanały, aby ustawić odpowiedni obraz na żądany kanał koloru z menu rozwijanego.Następnie usuń zaznaczenie pola Utwórz kompozyt. Kliknij przycisk OK i zapisz plik. Po utworzeniu wszystkich obrazów kanałów otwórz co najmniej dwa pliki obrazów i wybierz różne kanały kolorów dla każdego pliku obrazu, aby utworzyć obraz RBG.Na tych zdjęciach można zaobserwować reprezentatywne odcinki zakrętu zębatego z komórkami oznaczonymi BrdU. Jak zaobserwowano na tych powiększonych obrazach sekcji, oznaczone komórki wykazują intensywne ciemne zabarwienie. Warto zauważyć, że istnieją znaczące różnice w liczbie komórek BrdU dodatnich między kontrolowanymi szczurami, które nie były poddawane aktywności fizycznej, a grupą eksperymentalną, która była narażona na aktywność fizyczną, zgodnie z innymi zgłoszonymi wynikami, które wykazały, że aktywność fizyczna zwiększa proliferację komórek w dorosłym zakręcie zębatym.Próbując tego protokołu, należy użyć świeżo przygotowanych roztworów i delikatnie obchodzić się z tkanką. Hipokamp jest podatny na oddzielenie się od reszty szkiełków, gdy jest przez niego leczony i może zostać pominięty. Procedura ta może być dostosowana do oceny etykiet i indeksów DNA w syntezie DNA oraz badań nad podwajaniem barwienia komórek.Mamy nadzieję, że ten wysiłek był pomocny dla społeczności naukowej i ułatwi odpowiedzi na nowe pytania w badaniu proliferacji komórek, gdy technika immunohistochemiczna.

immunohistochemistry-techniques-to-analyze-cellular-proliferation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opracowaliśmy strategię wykrywania sekwencyjnego wbudowywania analogów tymydyny (CldU i IdU) w tkanki dorosłych myszy w celu ilościowego określenia dwóch następujących po sobie cykli podziałów komórkowych. Strategia ta jest przydatna do wykrywania wymiany komórkowej w tkankach długożyjących, transformacji onkogennej lub komórek wzmacniających przejście.

Immunofluorescencyjna detekcja dwóch analogów tymidyny (CldU i IdU) w tkance pierwotnej

W tym filmie określamy zdolność proliferacyjną neuronalnych komórek progenitorowych, mierząc inkorporację radioaktywnego znacznika tritiowanego tymidyny do DNA komórek. Technika ta może być stosowana do badania proliferacji komórek po leczeniu niektórymi lekami i czynnikami wzrostu.

Test syntezy DNA: technika oceny syntezy DNA w proliferujących komórkach przy użyciu radioaktywnej tritacji tymidyny

Źródło: Olesen, M. V., et al. Technika frakcjonowania optycznego do szacowania liczby komórek w szczurzym modelu terapii elektrowstrząsowej. J. Vis. exp. (2017).  Film demonstruje technikę ilościowego określania nowo wygenerowanych neuronów w tkance mózgowej. Wycinki tkanki hipokampa zawierające neurony znakowane bromodeoksyurydyną (BrdU) wybarwiono za pomocą immunohistochemii, a następnie określono ilościowo na całej grubości tkanki przy użyciu techniki frakcjonowania optycznego.

Kwantyfikacja nowo wygenerowanych neuronów w tkance mózgowej szczura przy użyciu techniki frakcjonowania optycznego

Funkcja neuronów u dorosłych ssaków pozostaje aktywnym obszarem badań. Promieniowanie jonizujące hamuje powstawanie nowych neuronów. Korzystając z napromieniania ogniskowego pod kontrolą tomografii komputerowej (CFIR), trójwymiarowe anatomiczne celowanie w określone populacje progenitorów nerwowych może być teraz wykorzystane do oceny funkcjonalnej roli neurogenezy dorosłych.

Funkcjonalne badanie neurogenezy podwzgórza u dorosłych z ogniskowym hamowaniem radiologicznym

Opisano metody manipulacji i analizy neurogenezy hipokampa zależnej od NF-κB u dorosłych. Przedstawiono szczegółowy protokół testu behawioralnego zależnego od zakrętu zębatego (określanego jako separacja wzorca przestrzennego - labirynt Barnesa) w celu zbadania wyników poznawczych u myszy. Technika ta powinna również pomóc w umożliwieniu badań w innych warunkach eksperymentalnych.

Metody modulacji i analizy neurogenezy dorosłych zależnej od NF-κB

Podawanie dwóch analogów tymidyny, EdU i BrdU, ciężarnym myszom pozwala na analizę progresji cyklu komórkowego w komórkach nerwowych i progenitorowych w embrionalnym mózgu myszy. Metoda ta jest przydatna do określenia skutków stresu genotoksycznego, w tym promieniowania jonizującego, podczas rozwoju mózgu.

Ocena progresji cyklu komórkowego nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych w mózgu myszy rozwijającym się po stresie genotoksycznym

Ten protokół wprowadzający opisuje odczynniki, sprzęt i techniki wymagane do przeprowadzenia immunohistochemicznego barwienia mózgów gryzoni, używając jako przykładu markerów dla mikrogleju i elementów neuronalnych.

Podstawa immunohistochemii na kriowyciętej tkance mózgowej szczura: przykładowe barwienie mikrogleju i neuronów

Tutaj opisujemy technikę badania neurogenezy poporodowej hipokampa za pomocą techniki organotypowej hodowli plastrów. Metoda ta pozwala na manipulację neurogenezą dorosłych w warunkach in vitro i pozwala na bezpośrednie zastosowanie środków farmakologicznych do hodowanego hipokampa.

Organotypowe kultury warstwowe do badań neurogenezy poporodowej

Ten artykuł wideo ilustruje kompleksowy protokół do wykrywania i ilościowego określania wszystkich etapów neurogenezy dorosłego hipokampa w obrębie tego samego odcinka tkanki. Opracowaliśmy metodę przezwyciężania ograniczeń pośredniej immunofluorescencji mnogiej, które powstają, gdy odpowiednie przeciwciała od różnych gatunków gospodarzy są niedostępne.

Immunohistochemia i wielokrotne znakowanie przeciwciałami od tego samego gatunku gospodarza w celu zbadania neurogenezy hipokampa u dorosłych

Ten protokół pokazuje, jak skonfigurować niezawodną metodę HFS u myszy. Neurony w zakręcie zębatym hipokampa są stymulowane elektrycznie przez HFS bezpośrednio i pośrednio in vivo. Aktywność neuronalną i sygnalizację molekularną bada się odpowiednio za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego c-fos i Notch1; Neurogenezę określa się ilościowo za pomocą testu znakowania bromodeoksyurydyny.

Inwazyjna metoda aktywacji zakrętu zębatego myszy poprzez stymulację o wysokiej częstotliwości

Celem tego protokołu jest opisanie podejścia do analizy zachowania dorosłych nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych w odpowiedzi na manipulację chemogenetyczną specyficznego lokalnego obwodu neuronowego.

Regulacja specyficzna dla obwodu testowego dorosłych nerwowych komórek prekursorowych hipokampa

Poznaj techniki immunohistochemiczne do analizy proliferacji komórkowej i neurogenezy u szczurów przy użyciu analogu tymidyny BrdU. Ta metoda umożliwia badaczom wizualizację komórek dzielących się w zakręcie zębatym mózgu.

Techniki immunohistochemiczne do analizy proliferacji komórkowej i neurogenezy u szczurów przy użyciu analogu tymidyny BrdU

Przeglądaj więcej filmów