Techniki immunohistochemiczne do analizy proliferacji komórkowej i neurogenezy u szczurów przy użyciu analogu tymidyny BrdU

Jest to kluczowy protokół w dziedzinie neurogenezy dorosłych. Tutaj przedstawiamy szczegółowy opis kroków wymaganych do osiągnięcia udanego barwienia. Technika ta umożliwia jednoczesną identyfikację określonych białek ulegających koekspresji w poddanych podziałowi komórkach przy jednoczesnym zachowaniu integralności tkanek.

Zalecamy wcześniejsze przetestowanie przeciwciał tkankowych i warunków. Kluczowymi etapami są przepuszczalność błony, staranna denaturacja DNA oraz testowanie czasów etapów blokowania i mycia. Standaryzacja techniki jest wyzwaniem dla nowych laboratoriów.

Przygotowanie odczynnika i podawanie analogu tymidyny gryzoniom ma kluczowe znaczenie dla pomyślnych wyników W przypadku podawania analogu tymidyny BrdU należy unieruchomić dolną jamę brzuszną, aby unieruchomić szczura doświadczalnego i użyć jednomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 23 do dootrzewnowego wstrzyknięcia zwierzęciu świeżo przygotowanego roztworu BrdU o stężeniu 50 miligramów na kilogram. W odpowiednim eksperymentalnym punkcie końcowym zebrać mózg i zamrozić mózg, aby umożliwić pobranie skrawków koronalnych o grubości 40 mikrometrów za pomocą mikrotomu kriostatu i umieścić skrawki w indywidualnych studzienkach 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej w roztworze krioochronnym w kolejności ich pobrania. Po pobraniu wszystkich skrawków należy przechowywać próbki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez okres do kilku miesięcy.

Aby ocenić barwienie BrdU, stosując reakcję peroksydazy, z kompleksem awidyna-biotyna-peroksydaza, przenieś plastry z roztworu krioochronnego do 0,1 molowego PBS, aż próbki osiągną temperaturę pokojową i przepłucz tkanki trzy razy przez 10 minut świeżym 0,1 molowym PBS na pranie. Po ostatnim płukaniu inkubuje skrawki w endogennym roztworze blokującym peroksydazę przez 30 minut, w temperaturze pokojowej, a następnie trzy 10-minutowe płukanie w 0,1 molowym PBS. Po ostatnim przepłukaniu inkubować skrawki przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w dwóch molowych kwasach solnych, a następnie jedno 10-minutowe płukanie w 0,1-molowym buforze boranowym.

Po trzech przemyciach w lodowatym 0,1 molowym PBS inkubować próbki przez dwie godziny w temperaturze pokojowej w roztworze blokującym PBS +, a następnie przez noc inkubować z mysim przeciwciałem pierwszorzędowym Anti-BrdU w PBS + w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po trzech 0,1-molowych płukaniach PBS należy inkubować próbki przez dwie do czterech godzin z odpowiednim mysim biotynylowanym przeciwciałem drugorzędowym w PBS+ w temperaturze pokojowej. Po umyciu należy potraktować skrawki roztworem ABC przez godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie wykonać trzy płukania PBS o stężeniu 0,1 mola.

Po ostatnim umyciu przenieś plastry do roztworu substratu peroksydazy DAB na dwie do 10 minut inkubacji, aż plastry staną się ciemnoszare. Jeśli można uwidocznić dodatnie komórki, przepłucz próbki trzema 15-minutowymi płukaniami wodą z kranu, a następnie trzema 0,1-molowymi płukaniami PBS. Po ostatnim praniu Użyj miękkiej szczotki, aby ostrożnie zamontować plastry na żelowatych szkiełkach, do wyschnięcia na powietrzu przez noc w temperaturze pokojowej.

Następnego ranka należy użyć stałego podłoża montażowego, aby nałożyć szkiełka nakrywkowe na próbki. Aby określić ilościowo komórki BrdU dodatnie, najpierw użyj 4-krotnego powiększenia pod mikroskopem, aby zidentyfikować zakręt zębaty i dokładnie przeszukaj ziarnistą warstwę komórkową wzdłuż osi Z w poszukiwaniu jąder znakowanych BrdU. Po wybraniu sekcji interwału do wyszukiwania komórek w całym zakręcie zębatym, policz wszystkie komórki BrdU dodatnie.

Morfologia znakowanego jądra może się zmieniać w zależności od tego, ile BrdU zawiera komórka. Przesuwaj się powoli po osi Z, aby określić ilościowo wszystkie jądra z co najmniej 10 sekcji na zwierzę i co najmniej pięciu zwierząt na grupę, które integrują klaster. Aby zdekonwolucjonizować obraz, otwórz wtyczkę 3D funkcji rozpraszania punktów dyfrakcji, wypełnij wszystkie wymagane dane, kliknij OK i zapisz plik.

Następnie otwórz wtyczkę DeconvolutionLab2 i przeciągnij dopasowany obraz stosu Z i plik PSF do odpowiedniego miejsca w oknie. Wybierz algorytm dekonwolucji i liczbę iteracji, a następnie kliknij przycisk Uruchom. Aby połączyć zdekonwolucyjne obrazy w jeden obraz stosu Z, wybierz opcję Obraz i stosy i kliknij opcję Projekt Z.

Z menu typu projekcji wybierz opcję Max Intensity (Maksymalna intensywność). Kliknij przycisk OK i zapisz plik. Aby utworzyć obraz RGB, wybierz opcję Obraz i kolor i kliknij przycisk Scal kanały, aby ustawić odpowiedni obraz na żądany kanał koloru z menu rozwijanego.

Następnie usuń zaznaczenie pola Utwórz kompozyt. Kliknij przycisk OK i zapisz plik. Po utworzeniu wszystkich obrazów kanałów otwórz co najmniej dwa pliki obrazów i wybierz różne kanały kolorów dla każdego pliku obrazu, aby utworzyć obraz RBG.

Na tych zdjęciach można zaobserwować reprezentatywne odcinki zakrętu zębatego z komórkami oznaczonymi BrdU. Jak zaobserwowano na tych powiększonych obrazach sekcji, oznaczone komórki wykazują intensywne ciemne zabarwienie. Warto zauważyć, że istnieją znaczące różnice w liczbie komórek BrdU dodatnich między kontrolowanymi szczurami, które nie były poddawane aktywności fizycznej, a grupą eksperymentalną, która była narażona na aktywność fizyczną, zgodnie z innymi zgłoszonymi wynikami, które wykazały, że aktywność fizyczna zwiększa proliferację komórek w dorosłym zakręcie zębatym.

Próbując tego protokołu, należy użyć świeżo przygotowanych roztworów i delikatnie obchodzić się z tkanką. Hipokamp jest podatny na oddzielenie się od reszty szkiełków, gdy jest przez niego leczony i może zostać pominięty. Procedura ta może być dostosowana do oceny etykiet i indeksów DNA w syntezie DNA oraz badań nad podwajaniem barwienia komórek.

Mamy nadzieję, że ten wysiłek był pomocny dla społeczności naukowej i ułatwi odpowiedzi na nowe pytania w badaniu proliferacji komórek, gdy technika immunohistochemiczna.