Elektroretinogram ze sprzężeniem bezpośrednim (DC-ERG) do rejestrowania wywołanych światłem reakcji elektrycznych nabłonka barwnikowego siatkówki myszy

Technika DC-ERG może być stosowana do niewymijającej oceny funkcji nabłonka barwnikowego siatkówki w celu monitorowania zmian związanych z wiekiem lub progresji choroby oraz do oceny efektów interwencji farmakologicznej. Technika ta poprawia zdolność odtwarzania DC-ERG i łatwość użycia poprzez uproszczenie przygotowania elektrody kapilarnej. Można go również uzupełnić o standardową aplikację Ohm w celu ułatwienia analizy.

Zacznij od ostrożnego wsunięcia igły strzykawki o rozmiarze 25 przez uszczelkę z gumy silikonowej do tylnej ścianki uchwytu elektrody. Napełnij podstawę uchwytu elektrody odgazowanym HBSS, powoli chowając igłę, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków, i załóż gwintowaną nasadkę bez dokręcania. Ponownie włożyć igłę strzykawki, aby wypełnić pustą przestrzeń w szczelinie HBSS i przytrzymać kapilarnę poziomo podczas napełniania, aby zapobiec wyciekaniu roztworu z drugiego końca.

Chwytając wypełnioną kapilarnę na zgiętym końcu, powoli włóż drugi koniec przez poluzowaną nakrętkę i dokręć nakrętkę na miejscu. Przechyl uchwyty elektrod tak, aby elektrody kapilarne były skierowane do góry, aby umożliwić wypłynięcie pęcherzyków i odgazuj kapilary w komorze próżniowej przez pięć do 10 minut. Następnie powoli zwolnij próżnię i napełnij uchwyty elektrod i szklane kapilary, jak pokazano.

Aby wykonać niestandardowy stojak na uchwyt mikroelektrody, usuń czarne klipsy poliacetalowe z jednej strony zacisku T numer osiem i użyj podstawy cylindra z magnetycznymi przegubami kulowymi obciętymi na pół, aby wyregulować wysokość. Przymocuj zmodyfikowane zaciski T do mocujących kulkę magnetyczną za pomocą nakrętek w rozmiarze M3 i suwaka w około jednocalowym, stożkowym drewnianym uchwycie, zmodyfikowanym z bawełnianego patyczka do czyszczenia, do stojaka pod kątem, aby przymocować uchwyt mikroelektrody do wykonanego na zamówienie stojaka z magnetycznym przegubem kulowym T-clip. Następnie użyj podstawy cylindra magnesów ziem rzadkich, aby bezpiecznie ustawić niestandardowy stojak uchwytu elektrody na metalowej płycie stolika, umożliwiając obrót o 360 stopni wokół osi 180 stopni.

Aby wykonać test elektrody, najpierw delikatnie opuść w pełni zmontowane mikroelektrody kapilarne wypełnione HBSS do małego pojemnika HBSS. Umieść elektrodę uziemiającą igłę i srebrną, wyśrodkowaną elektrodą referencyjną z chlorku srebra w tym samym HBSS, aby zakończyć obwód i wybrać lub utworzyć odpowiedni identyfikator opisujący mysz, która ma być testowana. Aby wybrać protokół elektroretinogramu sprzężonego z bezpośrednią sprzężoną, który ma zostać wykonany, kliknij Protokoły i wybierz DC-ERG.

Kliknij przycisk Uruchom. Pojawi się okno dialogowe z informacjami o pacjencie. Jeśli informacje są poprawne, kliknij przycisk tak i przejdź do pierwszego z sześciu kroków

Zamknij drzwi klatki Faradaya i kliknij impedancję, aby wyświetlić tryb impedancji. Sprawdź, czy wartości dla elektrod odniesienia ust, uziemienia ogona i elektrod rejestrujących są dopuszczalne, a następnie kliknij krok, aby przejść do kroku czwartego z sześciu, aby przetestować stabilność linii podstawowej. Aby rozpocząć wyświetlanie śladów, kliknij przycisk Podgląd.

Ścieżki powinny być niskoszumowe o amplitudzie międzyszczytowej mniejszej niż 200 mikrowoltów. Aby ustawić mysz i elektrody do eksperymentu, znieczulij rogówkę uspokojonej myszy kroplą 5% kwasu solnego proparakainy, a następnie rozszerz rogówkę kroplą 2,5% fenylefryny HCL i 5% tropikamidu. W oprogramowaniu systemu ERG sprawdź, czy wybrano właściwego pacjenta.

Kliknij pozycję Protocols (Protokoły). W obszarze Opis protokołu wybierz DC-ERG i kliknij przycisk Uruchom. Kliknij przycisk Tak, aby sprawdzić, czy wykonywany jest prawidłowy test.

Użyj kroku pierwszego z sześciu, aby włączyć przyciemnione czerwone światło wewnątrz kopuły i umieść mysz na podgrzewanym stole do nagrywania. Użyj kleszczy, aby ostrożnie namiotować skórę tylnej nogi. Jedną ręką mocno przytrzymuj elektrodę igłową, drugą ręką włóż elektrodę podskórnie do tylnej nogi, aby zamocować elektrodę na miejscu.

Umieść referencyjną elektrodę srebrną i chlorku srebra w pysku zwierzęcia tak, aby wyśrodkowana osadówka spoczywała wzdłuż tylnego policzka i była utrzymywana na miejscu za zębami. Przed umieszczeniem elektrod kapilarnych na oku należy ustawić uchwyt elektrody tak, aby szklane kapilary były ustawione pionowo i potrząśnij uchwytem elektrody palcem wskazującym, aby usunąć wszelkie pęcherzyki, które mogły zostać wprowadzone. Użyj igły o rozmiarze 25G, aby wypełnić końcówki kapilarne HBSS i sprawdź naczynia włosowate, aby upewnić się, że w końcówkach nie ma uwięzionych pęcherzyków powietrza.

Ustaw stojak uchwytu elektrody tak, aby otwarte końcówki naczyń włosowatych wypełnionych HBSS delikatnie stykały się z rogówką. Uważając, aby nie wprowadzać bąbelków, odwróć dozownik żelu do oczu z lubrykantem, aby usunąć początkowe krople. Następnie umieść kroplę nawilżającego żelu pod oczy na każdym oku, aby utrzymać przewodność i zapobiec wysuszeniu podczas nagrywania.

Aby nagrać DC-ERG, kliknij krok, aby wybrać krok piąty z sześciu i kliknij impedancję, aby użyć ekranu sprawdzania impedancji do zbadania rezystancji lewego i prawego oka. Wartości impedancji elektrod rejestrujących przy każdym oku powinny być podobne. A wartości impedancji zarówno dla elektrody uziemiającej, jak i elektrody odniesienia powinny być mniejsze niż 10 kiloomów.

Kliknij podgląd, aby wyświetlić ślady dla lewego i prawego oka i poczekaj do 10 minut, aby osiągnąć stabilną linię bazową. Następnie kliknij przycisk Stop, aby wyjść z podglądu śledzenia i kliknij przycisk Uruchom, aby rozpocząć nagrywanie. W tym miejscu pokazano przykładowy zestaw danych z myszy z warunkowym nokautem i myszami typu dzikiego.

W tej analizie ślad ucierpiał z powodu drobnych pęcherzyków w elektrodzie. Zwiększyło to szum międzyszczytowy w ścieżce. W oddzielnej analizie pęcherzyki zostały wyeliminowane za pomocą komory próżniowej przed zamontowaniem mikroelektrod w stojakach na elektrody.

Można obliczyć najlepsze linie dopasowania do początkowych 25 sekund, co pozwala na ponowne wykreślenie odpowiedzi skorygowanych o dryft i zidentyfikowanie amplitud składowych DC-ERG. Zgodnie z oczekiwaniami, zmniejszona ekspresja kanałów potasowych cure 7.1 w RPE znacznie osłabia załamek c i szybkie oscylacje, co wskazuje na znaczne upośledzenie właściwości elektrycznych nabłonka barwnikowego siatkówki. Tutaj pokazano względne amplitudy składowych DC-ERG, znormalizowane do typu dzikiego i wykreślone w stosunku do względnych dwóch największych amplitud fal a-wywołanych światłem.

Ta forma analizy może określić, czy zmniejszone reakcje elektryczne RPE można wytłumaczyć samym zmniejszeniem aktywności fotoreceptorów. Lub jeśli występuje podstawowa wada, która ma swoje źródło w RPE. Pamiętaj, aby osiągnąć stabilną linię bazową przed przejściem do nagrywania za pomocą myszy i okresowo sprawdzać elektrody pod kątem pęcherzyków, które mogły zostać wprowadzone.

Dostosowane do ciemności ERG mogą być rejestrowane przed DC-ERG w celu pomiaru funkcji siatkówki sterowanej stożkiem. Po DC-ERG można również wykonać ERG dostosowane do światła, aby ocenić reakcje siatkówki sterowane stożkiem.