Name: Elektroretinogram ze sprzężeniem bezpośrednim (DC-ERG) do rejestrowania wywołanych światłem reakcji elektrycznych nabłonka barwnikowego siatkówki myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Poznaj udoskonaloną metodę DC-ERG do nieinwazyjnej oceny funkcji nabłonka barwnikowego siatkówki u myszy. Technika obejmuje przygotowanie elektrod szklanych z odgazowanym buforem HBSS oraz redukcję szumów przez eliminację pęcherzyków powietrza w komorze próżniowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez wewnętrzne fundusze NEI. Autorzy serdecznie dziękują dr Sheldonowi Millerowi za jego wskazówki naukowe, porady techniczne i wiedzę specjalistyczną w zakresie fizjologii i chorób RPE. Autorzy dziękują Megan Kopera i personelowi zajmującemu się opieką nad zwierzętami za zarządzanie koloniami myszy, a także dr Tarunowi Bansalowi, Raymondowi Zhou i Yuan Wangowi za wsparcie techniczne.

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami zawartymi w protokole badań na zwierzętach, zatwierdzonym przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Narodowego Instytutu Oka.
1. Importowanie protokołów stymulacji światłem dla DC-ERG
UWAGA: Postępuj zgodnie z poniższymi wskazówkami, aby zaimportować protokoły stymulacji światłem dla DC-ERG do oprogramowania systemu ERG (Tabela materiałów). Protokół składa się z 0,5-minutowego interwału przed bodźcem, po którym następuje krok światła (10 cd/m 2) przez 7 minut, a kończący się 1,5-minutowym interwałem po bodźcu. Natężenie światła 10 cd/m2 (1 log10 cd/m2) zostało wybrane, ponieważ wywołuje około połowy maksymalnej odpowiedzi dla wszystkich składników DC-ERG w myszy WT 18,21. Fala c i szybkie oscylacje są szczególnie interesujące, ponieważ pochodzenie tych reakcji elektrycznych jest dobrze scharakteryzowane i może być izolowane i dalej badane w modelach RPE in vitro (np. iPSC-RPE). Zastosowanie innych natężeń światła może wydobyć dodatkowe informacje, na przykład reakcja wyłączenia ulega odwróceniu polaryzacji przy jaśniejszych bodźcach świetlnych i może wykazywać różnice przy intensywności, przy której następuje to odwrócenie. Użytkownik ma możliwość zmiany ustawień natężenia światła według własnego uznania.
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie systemowe ERG.</li>
	<li>Kliknij Centrum bazy danych.</li>
	<li>Kliknij Nowy (podaj nową nazwę pliku bazy danych). Kliknij Zapisz. W wyskakującym okienku pojawi się: "Utworzono bazę danych, czy chcesz połączyć się z nowym plikiem bazy danych?" Kliknij Tak. Bieżąca nazwa bazy danych powinna teraz odzwierciedlać nową nazwę pliku.</li>
	<li>Kliknij na Transfer In w oknie Centrum sterowania bazą danych.</li>
	<li>Wybierz Plik uzupełniający 1: LightProtocols - TRANSFER. EXP. Kliknij Otwórz.</li>
	<li>Kliknij Zamknij (Centrum sterowania bazą danych) po zakończeniu paska postępu.</li>
	<li>Kliknij zielony przycisk Start.</li>
	<li>Kliknij przycisk Nowy w oknie Wybierz pacjenta. Utwórz nową rodzinę pacjenta opisującą model myszy, wprowadź datę urodzenia (DOB, mm/dd/rrrr), przełącz przycisk płci (M/F) na odpowiedni opis. Kliknij przycisk Zamknij, aby zapisać szczegóły eksperymentu.</li>
	<li>Kliknij Protokoły. Dostosowane do ciemności protokoły ERG i DC-ERG powinny być teraz widoczne.</li>
	<li>Na koniec umieść plik Long Flash.col w następującym folderze C:\ERG User Files\Long Flash.col.</li>
</ol>
2. Przygotowanie elektrody kapilarnej
<ol>
	<li>Przeciąć szklane kapilary o grubości 1,5 mm na pół, używając płytki ceramicznej (tabela materiałów), aby naciąć szkło i rozbić je czysto za pomocą stołu, aby zapewnić fizyczną siłę przeciwstawną i ustabilizować szkło. 
	UWAGA: W razie potrzeby stępić odcięte końce.</li>
	<li>Używając palnika Bunsena (tabela materiałów), pozwól, aby ciepło lekko zagięło się w kapilarze, jednocześnie przytrzymując je nad płomieniem za pomocą kleszczy.</li>
</ol>
3. Napełnianie elektrod kapilarnych
<ol>
	<li>Podłączyć eksykator próżniowy do laboratoryjnej linii próżniowej przez wbudowany filtr (tabela materiałów).</li>
	<li>Wlej 30 ml zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS) (tabela materiałów) do otwartej stożkowej probówki o pojemności 50 ml i umieść ją (ze zdjętą nakrętką) w komorze próżniowej.</li>
	<li>Włącz odkurzacz i odgazuj HBSS podczas włączania komputera i sprzętu nagrywającego.</li>
	<li>Po 5\u201210 min wyłącz próżnię i użyj odgazowanego HBSS do napełnienia strzykawki 12 ml przez dołączoną igłę 25 G. Użyj go do wypełnienia podstaw uchwytów elektrod, zachodząc dodatkowe środki ostrożności, aby nie wprowadzić pęcherzyków.
	<ol>
		<li>W tym celu zdejmij gwintowaną nakrętkę i ostrożnie wsuń igłę strzykawki przez uszczelkę z gumy silikonowej, aby dotrzeć do tylnej ścianki (granulki srebra/chlorku srebra) uchwytu. 
		UWAGA: Granulki srebra / chlorku srebra są lepsze od uchwytów wykorzystujących drut srebrny, ponieważ zapewniają większą powierzchnię, co skutkuje stabilną linią bazową o niskim poziomie hałasu. Jednak granulki srebra/chlorku srebra wymagają ciekłego interfejsu wolnego od pęcherzyków powietrza, aby uzyskać dobre połączenie. Dlatego należy bardzo uważać, aby podczas tego procesu nie wprowadzać pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Stopniowo wstrzykiwać HBSS, aby wypełnić całą mikroelektrodę, powoli wycofując igłę strzykawki. Ponownie załóż gwintowaną nasadkę, ale nie dokjaj. Ponownie włożyć igłę strzykawki, aby wypełnić pustą przestrzeń w nasadce HBSS. Następnie napełnij szklaną kapilarę, trzymając ją poziomo, aby zapobiec ucieczce roztworu z drugiego końca.</li>
		<li>Przytrzymaj szklaną kapilarnę od zgiętego końca i powoli włóż przeciwległy koniec przez poluzowaną nasadkę, a następnie dokręć nakrętkę na miejsce. 
		UWAGA: Szklane elektrody wypełnione HBSS utrzymują smarowanie oka myszy i zapobiegają odwodnieniu rogówki, które wystąpiłoby przy użyciu standardowych elektrod ze złotą pętlą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw uchwyty elektrod tak, aby elektrody kapilarne były pochylone do góry, aby umożliwić wypływ pęcherzyków. Uruchom odkurzacz na 5–10 minut, aby odgazować. Gaz ulatniający się z powierzchni szklanych i plastikowych wypchnie HBSS z uchwytów elektrod.</li>
	<li>Zatrzymaj się, a następnie powoli zwolnij podciśnienie. Napełnij uchwyty elektrod i szklane kapilary zgodnie z wcześniejszym opisem. 
	UWAGA: Bąbelki mają tendencję do gromadzenia się na uszczelce z gumy silikonowej lub w jej pobliżu, a także mogą chować się w rowkach gwintowanej nasadki, dlatego należy zwrócić szczególną uwagę, aby obszary te były wolne od pęcherzyków.</li>
	<li>Zamontuj i zamocuj uchwyt mikroelektrody w wykonanym na zamówienie stojaku z klipsem T/magnetycznym przegubem kulowym (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A, wstawka). Aby wykonać niestandardowy stojak na uchwyt mikroelektrody, zmodyfikuj zacisk T (rurka o średnicy zewnętrznej 5/16"-11/32") #8 (Tabela materiałów), usuwając czarne klipsy poliacetalowe z jednej strony. Zleć obcięcie podstawy cylindra magnetycznych przegubów kulowych na pół, aby wyregulować wysokość (Tabela materiałów). Przymocuj zmodyfikowane zaciski T do mocujących kulkę magnetyczną za pomocą nakrętek o rozmiarze M3.</li>
	<li>Umieść uchwyt mikroelektrody w zmodyfikowanym zacisku w kształcie litery T i przytrzymaj go mocno na miejscu, wsuwając około 1-calowy, zwężający się drewniany uchwyt wykonany z łamania bawełnianego patyczka do czyszczenia (tabela materiałów) pod kątem. Użyj podstawy cylindra z magnesem ziem rzadkich, aby bezpiecznie ustawić niestandardowy stojak uchwytu elektrody na metalowej płycie stolika, umożliwiając obrót o 360° wokół osi 180°.</li>
</ol>
4. Elektrody testowe
<ol>
	<li>Wlać HBSS do małego pojemnika (np. nakrętki stożkowej probówki o pojemności 50 ml).</li>
	<li>Delikatnie opuść w pełni zmontowane, wypełnione HBSS mikroelektrody kapilarne do nasadki zawierającej HBSS, aby wstępnie zrównoważyć elektrody i umieść elektrodę uziemiającą igłę (ogon/tylną nogę) oraz elektrodę referencyjną Ag/AgCl ze spiekanego granulatu (usta) w tym samym HBSS, aby zakończyć obwód (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). 
	UWAGA: Wszystkie kolejne kroki wykonuj przy przyciemnionym czerwonym świetle. Użyj latarki z czerwonym światłem, aby ustawić mysz i elektrody kapilarne. Pamiętaj, aby całkowicie wyłączyć wszystkie źródła światła przed rozpoczęciem nagrywania.</li>
	<li>Wybierz lub utwórz odpowiedni identyfikator (nazwisko rodowe) opisujący mysz, która ma być testowana i wybierz protokół DC-ERG, który ma zostać wykonany, kończąc rejestrację zgodnie z poniższą kolejnością.
	<ol>
		<li>Kliknij Protokoły. Wybierz DC-ERG. Kliknij Uruchom. Pojawi się okno dialogowe: "Obecny pacjent to XXX [DATA URODZENIA: XX/XX/XX) Czy to jest poprawne dla wykonywanego testu?" Kliknij Tak. Następnie przejdź do "Krok 1/6".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamknij drzwi do klatki Faradaya.</li>
	<li>Wyświetl tryb impedancji, klikając Impedancja i sprawdź, czy wartości dla odniesienia ust, uziemienia ogona i elektrod rejestrujących są dopuszczalne (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>Przetestuj stabilność linii bazowej (szum i dryft), klikając Krok (strzałka do przodu), aby wybrać Krok 4/6 "Długi błysk bez światła" 
	UWAGA: Wielkość dryftu obserwowana po umieszczeniu elektrod w kąpieli HBSS jest na ogół mniejsza niż 500 μV na 80 s po ich ustabilizowaniu i jest równoważna dryftowi obserwowanemu, gdy elektrody są podłączone do myszy. W związku z tym odczyt elektryczny elektrod w kąpieli HBSS jest ważnym wskaźnikiem stanu elektrod. Hałas, mierzony od szczytu do szczytu, jest na ogół ~ 10-15% większy u myszy niż w kąpieli HBSS. Jest to prawdopodobnie spowodowane dodaniem artefaktów ruchowych z oddychania.</li>
	<li>Rozpocznij przeglądanie śladów, klikając Podgląd. Ścieżki powinny być niskoszumowe o amplitudzie międzyszczytowej <200 μV. Dopuszczalny jest niewielki dryft (<500 μV/80 s), który stopniowo zanika do linii bazowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
</ol>
5. Pozycjonowanie myszy i elektrod
<ol>
	<li>Trzymaj myszy na noc w dobrze wentylowanym, szczelnym pudełku w celu adaptacji do ciemności.</li>
	<li>Znieczulić zwierzęta poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy (80 mg/kg) i ksylazyny (8 mg/kg).</li>
	<li>Zastosuj miejscowo kroplę 0,5% proparakainy HCl, aby znieczulić rogówkę, a także kroplę 2,5% chlorowodorku fenylefryny i 0,5% tropikamidu, aby rozszerzyć źrenice.</li>
	<li>Przytnij wąsy myszy nożyczkami, aby zapobiec przypadkowemu drgawkom, które mogłyby zakłócić szklane elektrody kapilarne podczas nagrywania. 
	UWAGA: Protokół bodźca DC-ERG w systemie ERG ma kilka wbudowanych procedur bodźców, które można wybrać, klikając Krok (strzałka do przodu) lub Krok (strzałka do tyłu). Tylko kroki 1, 4 i 5 w oprogramowaniu są wymagane do przygotowania i przeprowadzenia zapisu DC-ERG.</li>
	<li>W oprogramowaniu systemu ERG sprawdź, czy wybrano właściwego pacjenta. Kliknij zielony przycisk Protokoły. W obszarze Protocol Description (Opis protokołu) wybierz pozycję DC-ERG. Następnie kliknij Uruchom. Sprawdź, czy jest to prawidłowy wykonywany test, klikając Tak.</li>
	<li>Użyj bodźca czerwonego światła wyznaczonego w kroku 1/6, aby włączyć czerwone światło wewnątrz kopuły, aby pomóc ustawić mysz i elektrody podczas obserwacji zmian impedancji.</li>
	<li>Umieść mysz na podgrzewanym stole do nagrywania i ostrożnie przykryj skórę tylnej nogi za pomocą kleszczy. Trzymaj elektrodę igłową mocno jedną ręką i włóż ją podskórnie do tylnej nogi, aby zamocować ją na miejscu.</li>
	<li>Umieść elektrodę referencyjną Ag/AgCl (tabela materiałów) w jamie ustnej tak, aby spiekana osadówka spoczywała wzdłuż tylnego policzka i była utrzymywana na miejscu za zębami. 
	UWAGA: Elektrody ze złotego drutu nie powinny być używane jako ustna elektroda odniesienia, ponieważ mają różne charakterystyki impedancji i zwiększają szum międzyszczytowy.</li>
	<li>Przed umieszczeniem elektrod kapilarnych w oku myszy przytrzymaj uchwyt elektrody ze szklanymi kapilarami pionowo, przesuń uchwyt elektrody palcem wskazującym, aby usunąć wszelkie pęcherzyki, które mogły zostać wprowadzone. Napełnij końcówkę HBSS za pomocą igły 25 G dołączonej do strzykawki i sprawdź, czy na końcówce nie ma pęcherzyków powietrza. Ustaw stojak uchwytu elektrody tak, aby otwarta końcówka naczyń włosowatych wypełnionych HBSS delikatnie stykała się z rogówką.</li>
	<li>Zachowaj szczególne środki ostrożności, aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków powietrza, trzymając dozownik żelu do oczu z lubrykantem odwróconym do góry nogami i wyrzuć początkowe krople. Umieść kroplę nawilżającego żelu pod oczy na każdym oku, aby utrzymać przewodność i zapobiec wysuszeniu podczas nagrywania.</li>
</ol>
6. Nagrywanie DC-ERG
<ol>
	<li>Kliknij Krok (strzałka do przodu), aby wybrać Krok 4/6 "Długi błysk bez Li".</li>
	<li>Kliknij Impedancja. Użyj ekranu sprawdzania impedancji, aby sprawdzić rezystancję lewego i prawego oka. Oczekuje się, że wartości impedancji dla elektrod rejestrujących przy każdym oku będą podobne (~39 kΩ). Oczekuje się, że wartości impedancji zarówno dla elektrody uziemiającej, jak i elektrody odniesienia będą mniejsze niż 10 kΩ).</li>
	<li>Kliknij Podgląd, aby wyświetlić ślady dla lewego i prawego oka. Poczekaj, aż zostanie osiągnięty stabilny poziom bazowy (<10 min). Kliknij Zatrzymaj, aby wyjść z podglądu śledzenia. 
	UWAGA: Nagłe zmiany kierunku dryftu lub nieprawidłowy szum w nagraniu nie poprawią się z czasem i będą wymagały zidentyfikowania elektrody kapilarnej, która wymaga uwagi. Najbardziej prawdopodobną przyczyną jest pęcherzyk wprowadzony do końcówki elektrody. Napełnij końcówkę HBSS. Kliknij ponownie Podgląd, aby sprawdzić linię bazową.</li>
	<li>Kliknij Krok (strzałka do przodu), aby wybrać Krok 5/6 "Długi błysk 10 cd 7 min".</li>
	<li>Kliknij Uruchom, aby rozpocząć nagrywanie (Rysunek 1D).</li>
</ol>
7. Eksport danych
<ol>
	<li>Wybierz "Pacjent" (nazwisko rodziny) opisujące nagranie myszy, które chcesz wyeksportować.</li>
	<li>Kliknij Stare testy.</li>
	<li>W obszarze Protocol Description (Opis protokołu) wybierz pozycję DC-ERG. Kliknij zielony przycisk Załaduj, aby załadować wcześniej pozyskane dane.</li>
	<li>Kliknij Krok (strzałka do przodu), aby przejść do kroku 5/6 "Long Flash 10 cd 7 min".</li>
	<li>Kliknij Eksportuj.</li>
	<li>Podaj nazwę pliku (np. filename.csv). Poprawna nazwa pliku musi zaczynać się od litery, po której następują litery, cyfry lub podkreślenia. Nie używaj znaków specjalnych ani łączników. Program do analizy danych (DCERG_Analysis.exe) wymaga, aby wpisy tabeli spełniały wymagania dotyczące nazw zmiennych.</li>
	<li>Umieść znacznik wyboru obok opcji Tabela danych. Obok pozycji separator wybierz pozycję Tab. Umieść znaczniki wyboru obok opcji Opcje (tytuły, pionowe), Uwzględnij wszystko (kroki, kanały, wyniki), kolumny danych (zawartość, wyniki, przeciągnięcia) i Format (plik).</li>
	<li>Następnie kliknij na Eksportuj (Rysunek 1E). Spowoduje to zapisanie pliku *.csv w folderze C:\Multifocusal.</li>
</ol>
8. Analiza danych
<ol>
	<li>Pobierz i zainstaluj odpowiedni instalator środowiska uruchomieniowego (tabela materiałów)</li>
	<li>Pobierz i zainstaluj instalator DCERG_Analysis.exe. 
	UWAGA: Spowoduje to zainstalowanie skryptu, który przeprowadzi analizę komponentów DC-ERG i utworzy skrót do uruchomienia programu w folderze Menu Start.</li>
	<li>Kliknij skrót utworzony w menu Start > folderze Programy.</li>
	<li>Wybierz wyeksportowany plik lub pliki danych (*.csv) do analizy. Użyj Ctrl + lewy przycisk myszy myszy, aby wybrać więcej niż jeden plik. 
	UWAGA: Plik wykonywalny generuje dwa typy wykresów: 1) surowe dane są wykreślane z linią najlepszego dopasowania wskazującą zmierzony dryf; 2) Odpowiedź skorygowana o dryft jest wykreślana po wygładzeniu za pomocą średniej ruchomej (o rozpiętości ~5 s). Na podstawie tego wykresu identyfikowane są amplitudy i czas do osiągnięcia szczytu składowych DC-ERG: fala c, szybka oscylacja, szczyt światła i odpowiedź wyłączenia. Dane są następnie eksportowane w formacie tabeli do programu Excel, gdzie każdy arkusz odpowiada innemu nagraniu myszy. Po tych arkuszach znajdują się dwa arkusze podsumowujące: (i) zestawione amplitudy DC-ERG (mV); (ii) skompilowany czas DC-ERG do szczytów (początek światła, t = 0 min).</li>
</ol>

<ol><li>Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+the+retinal+pigment+epithelium+and+the+neural+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Documenta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Interactions between the retinal pigment epithelium and the neural retina.</a> Documenta Ophthalmologica. 60 (4), 327-346 (1985).</li>
<li>Sahu, B., Maeda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RPE+Visual+Cycle+and+Biochemical+Phenotypes+of+Mutant+Mouse+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">RPE Visual Cycle and Biochemical Phenotypes of Mutant Mouse Models.</a> Methods in Molecular Biology. 1753, 89-102 (2018).</li>
<li>Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis%3A+use+and+utility+of+RPE+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Resarch%22%5BJournal%5D)">Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture.</a> Experimental Eye Resarch. 126, 51-60 (2014).</li>
<li>Wimmers, S., Karl, M. O., Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channels+in+the+RPE%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Ion channels in the RPE.</a> Progress in Retinal Eye Research. 26 (3), 263-301 (2007).</li>
<li>Gundersen, D., Orlowski, J., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+polarity+of+Na%2CK-ATPase+in+retinal+pigment+epithelium+is+linked+to+a+reversal+of+the+ankyrin-fodrin+submembrane+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Apical polarity of Na,K-ATPase in retinal pigment epithelium is linked to a reversal of the ankyrin-fodrin submembrane cytoskeleton.</a> Journal of Cell Biology. 112 (5), 863-872 (1991).</li>
<li>Fletcher, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+age-related+macular+degeneration+using+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Optometry+and+Vision+Science%22%5BJournal%5D)">Studying age-related macular degeneration using animal models.</a> Optometry and Vision Science. 91 (8), 878-886 (2014).</li>
<li>Gu, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+RPE65+cause+autosomal+recessive+childhood-onset+severe+retinal+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutations in RPE65 cause autosomal recessive childhood-onset severe retinal dystrophy.</a> Nature Genetics. 17 (2), 194-197 (1997).</li>
<li>Marlhens, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+RPE65+cause+Leber%27s+congenital+amaurosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutations in RPE65 cause Leber's congenital amaurosis.</a> Nature Genetics. 17 (2), 139-141 (1997).</li>
<li>Marmorstein, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((the+product+of+the+Best+vitelliform+macular+dystrophy+gene+%28VMD2%29%2C+localizes+to+the+basolateral+plasma+membrane+of+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).</li>
<li>Chang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+studies+of+retinal+degeneration+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mouse models for studies of retinal degeneration and diseases.</a> Methods in Molecular Biology. 935, 27-39 (2013).</li>
<li>Collin, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Models+of+Inherited+Retinal+Degeneration+with+Photoreceptor+Cell+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Mouse Models of Inherited Retinal Degeneration with Photoreceptor Cell Loss.</a> Cells. 9 (4), (2020).</li>
<li>Shrock, E., Güell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+in+Animals+and+Animal+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Molecular+Biology+and+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR in Animals and Animal Models.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 152, 95-114 (2017).</li>
<li>Smalley, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+mouse+model+boom%2C+rat+model+renaissance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">CRISPR mouse model boom, rat model renaissance.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 893-894 (2016).</li>
<li>Benchorin, G., Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Vollrath, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Murine+Retinal+Function+by+Electroretinography%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protocol%22%5BJournal%5D)">Assessment of Murine Retinal Function by Electroretinography.</a> Bio Protocol. 7 (7), (2017).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+phagolysosomal+activity+by+miR-204+critically+influences+structure+and+function+of+retinal+pigment+epithelium%2Fretina%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulation of phagolysosomal activity by miR-204 critically influences structure and function of retinal pigment epithelium/retina.</a> Human Molecular Genetics. 28 (20), 3355-3368 (2019).</li>
<li>Samuels, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-evoked+responses+of+the+retinal+pigment+epithelium%3A+changes+accompanying+photoreceptor+loss+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Light-evoked responses of the retinal pigment epithelium: changes accompanying photoreceptor loss in the mouse.</a> Journal of Neurophysiology. 104 (1), 391-402 (2010).</li>
<li>Wu, J., Marmorstein, A. D., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+abnormalities+in+the+retinal+pigment+epithelium+of+CFTR+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Functional abnormalities in the retinal pigment epithelium of CFTR mutant mice.</a> Experimental Eye Research. 83 (2), 424-428 (2006).</li>
<li>Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-evoked+responses+of+the+mouse+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).</li>
<li>Peachey, N. S., Stanton, J. B., Marmorstein, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+recording+and+response+characteristics+of+the+rat+dc-electroretinogram%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Noninvasive recording and response characteristics of the rat dc-electroretinogram.</a> Visual Neuroscience. 19 (6), 693-701 (2002).</li>
<li>Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+retinal+pigment+epithelium+dysfunction+is+concomitant+with+hyperglycemia+in+mouse+models+of+type+1+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).</li>
<li>Marmorstein, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+light+peak+of+the+electroretinogram+is+dependent+on+voltage-gated+calcium+channels+and+antagonized+by+bestrophin+%28best-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1).</a> Journal of General Physiology. 127 (5), 577-589 (2006).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invest.+Ophtalmol.+Vis.+Sci%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Meeting+for+the+Association+for+Research+in+Vision+and+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Invest. Ophtalmol. Vis. Sci.</a> Annual Meeting for the Association for Research in Vision and Ophthalmology. , 3568(2017).</li>
<li>Iacovelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Cre+transgenic+mice+with+postnatal+RPE-specific+ocular+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Generation of Cre transgenic mice with postnatal RPE-specific ocular expression.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (3), 1378-1383 (2011).</li>
<li>Wang, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-204%2F211+alters+epithelial+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology.</a> FASEB Journal. 24 (5), 1552-1571 (2010).</li>
<li>He, L., Marioutina, M., Dunaief, J. L., Marneros, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-+and+gene-dosage-dependent+cre-induced+abnormalities+in+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Age- and gene-dosage-dependent cre-induced abnormalities in the retinal pigment epithelium.</a> American Journal of Pathology. 184 (6), 1660-1667 (2014).</li>
<li>Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-evoked+modulation+of+basolateral+membrane+Cl-+conductance+in+chick+retinal+pigment+epithelium%3A+the+light+peak+and+fast+oscillation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation.</a> Journal of Neurophysiology. 70 (4), 1669-1680 (1993).</li>
<li>Blaug, S., Quinn, R., Quong, J., Jalickee, S., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+pigment+epithelial+function%3A+a+role+for+CFTR%5BTitle%5D)+AND+%22Documenta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Retinal pigment epithelial function: a role for CFTR.</a> Documenta Ophthalmologica. 106 (1), 43-50 (2003).</li>
<li>Gallemore, R. P., Griff, E. R., Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+in+support+of+a+photoreceptoral+origin+for+the+%22light-peak+substance%22%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Evidence in support of a photoreceptoral origin for the "light-peak substance".</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (4), 566-571 (1988).</li>
<li>Shahi, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+Electroretinogram+after+Kir7.1+Channel+Suppression+Suggests+Role+in+Retinal+Electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Abnormal Electroretinogram after Kir7.1 Channel Suppression Suggests Role in Retinal Electrophysiology.</a> Science Reports. 7 (1), 10651(2017).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+human+RPE65+P25L+hypomorph+resembles+wild+type+under+normal+light+rearing+but+is+fully+resistant+to+acute+light+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mouse model of human RPE65 P25L hypomorph resembles wild type under normal light rearing but is fully resistant to acute light damage.</a> Human Molecular Genetics. 24 (15), 4417-4428 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kroki krytyczne
Dobry zapis DC-ERG wymaga stabilnych elektrod, które są wolne od pęcherzyków, które tworzą artefakty i niepożądany dryf, ponieważ są niezwykle wrażliwe na odgazowanie i zmiany temperatury. Istotne jest, aby osiągnąć stabilną linię bazową, gdy elektrody zostaną umieszczone w roztworze kąpieli HBSS przed przystąpieniem do nagrywania za pomocą myszy. Małe pęcherzyki mają tendencję do gromadzenia się u podstawy elektrody kapilarnej lub wokół uszczelki silikonowej i...

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) to monowarstwa wyspecjalizowanych komórek, które wyściełają tylny segment oka i pełnią kluczowe funkcje w celu utrzymania homeostazy siatkówki1. RPE wspiera fotoreceptory, regenerując ich pigment wzrokowy wychwytujący fotony w procesie zwanym cyklem wzrokowym2, uczestnicząc w dobowej fagocytozie końcówek segmentów zewnętrznych zrzucanych3, oraz w transporcie składników odżywczych i produktów przemiany materii między fotoreceptorami a naczyniówką włosowatą4,5. Nieprawidłowości w funkcjonowaniu RPE leżą u podstaw wielu chorób siatkówki u ludzi, takich jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem6, wrodzona ślepota Lebera7,8 i Najlepsza dystrofia plamki żółtej w kształcie szklistości9. Ponieważ tkanki oka dawcy są często trudne do pozyskania wyłącznie do celów badawczych, modele zwierzęce z modyfikacjami genetycznymi mogą stanowić alternatywny sposób badania rozwoju chorób siatkówki10,11. Dodatkowo, pojawienie się i zastosowanie technologii CRISPR cas9 pozwala teraz na wprowadzenie genomu (knock-in) lub delecję (knock-out) w prostym, jednoetapowym procesie, przewyższając ograniczenia wcześniejszych technologii celowania w geny12. Gwałtowny wzrost dostępności nowych modeli myszy13 wymaga bardziej wydajnego protokołu nagrywania, aby nieinwazyjnie oceniać działanie RPE.
Pomiar reakcji elektrycznych RPE wywołanych światłem można osiągnąć za pomocą techniki elektroretinogramu bezpośrednio sprzężonego (DC-ERG). W połączeniu z konwencjonalnymi zapisami ERG, które mierzą odpowiedzi komórek fotoreceptora (załamek a) i bipolarny (fala b)14, DC-ERG może określić, w jaki sposób właściwości odpowiedzi RPE zmieniają się wraz ze zwyrodnieniem siatkówki15,16,17 czy też dysfunkcja RPE poprzedza utratę fotoreceptorów. Protokół ten opisuje metodę zaadaptowaną z pracy Marmorsteina, Peacheya i współpracowników, którzy jako pierwsi opracowali technikę DC-ERG16,18,19,20 i poprawia odtwarzalność oraz łatwość użycia.
Zapis DC-ERG jest trudny do wykonania ze względu na długi czas akwizycji (9 minut), podczas którego jakiekolwiek przerwanie lub wprowadzenie szumu może skomplikować interpretację danych. Zaletą tej nowej metody jest to, że linie podstawowe osiągają stan ustalony w krótszym czasie, co zmniejsza prawdopodobieństwo, że zwierzę obudzi się przedwcześnie ze znieczulenia i jest mniej podatne na tworzenie się pęcherzyków w elektrodach kapilarnych.

<table><tbody><tr><td>Elektroda Ag/AgCl (ustna) WPI</td><td>Inc</td><td>EP1</td><td>Elektroda referencyjna do ust dla myszy</td></tr><tr><td>Ceramiczna płytka</td><td>Sutter Instrument</td><td>CTS</td><td>Służy do cięcia szklanej rurki kapilarnej do odpowiedniego rozmiaru</td></tr><tr><td>Sztyft do czyszczenia z bawełnianą końcówką</td><td>Puritan Medical Products</td><td>867-WC Bez kleju</td><td>Do stosowania jako przekładka w celu poprawy dopasowania zespołu uchwytu elektrody</td></tr><tr><td>System elektroretinogramu (ERG)</td><td>Diagnosys Sp. z o.o</td>. <td>System E3</td><td>System elektrofizjologii wizualnej do diagnozowania schorzeń okulistycznych w badaniach wzroku i próbach leków</td></tr><tr><td>Palnik Bunsena</td><td>Argos Technologies</td><td>BW20002460</td><td>Lub odpowiednik szkła kształtowego pod płomieniem</td></tr><tr><td>Szklana rurka kapilarna (1,5 mm)</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF150-75</td><td>Do napełniania HBSS i nawiązywania kontaktu z rogówką</td></tr><tr><td>Hank' s Buforowany roztwór soli (HBSS)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>14175-095</td><td>Dostępny w handlu. Konserwacja w RT</td></tr><tr><td>Filtr liniowy</td><td>Whatman</td><td>6722-5001</td><td>Do ochrony pompy próżniowej przed aerozolami</td></tr><tr><td>o niskim poziomie szumów do uchwytów mikroelektrod</td><td>WPI Inc</td><td>5372</td><td>Sugerowany w celu poprawy długości i rozmieszczenia i zespołów uchwytów elektrod</td></tr><tr><td>Magnetyczny przegub kulowy</td><td>WPI Inc</td><td>500871</td><td>Do magnetycznego pozycjonowania zespołu uchwytu elektrody na scenie</td></tr><tr><td>MatLab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>MatLab: Do edycji oprogramowania analitycznego</td></tr><tr><td>MatLab Curvefit Toolbox</td><td>Mathworks</td><td></td><td>Toolbox dla MatLab (wymagany tylko do edycji oprogramowania do analizy)</td></tr><tr><td>MatLab Compiler</td><td>Mathworks</td><td></td><td>Toolbox dla MatLab (wymagany tylko do edycji i ponownego wydania oprogramowania do analizy)</td></tr><tr><td>MatLab Runtime wersja 9.5</td><td>Mathworks</td><td>R2018b (9.5)</td><td>Wymagane do uruchomienia oprogramowania analitycznego: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html</td></tr><tr><td>Uchwyty mikroelektrod (45 stopni)</td><td>WPI Inc</td><td>MEH345-15</td><td>Do przytrzymywania naczyń włosowatych</td></tr><tr><td>Igła (25 ga)</td><td>Covidien</td><td>8881250313</td><td>Do napełniania kapilar HBSS</td></tr><tr><td>Elektroda igłowa (uziemiająca) Rhythmlink</td><td></td><td>13mm - jedna elctrode</td><td>Podskórna elektroda igłowa (uziemiająca) dla myszy (igła o długości 13 mm, średnicy 0,4 mm, przewód 1,5 m)</td></tr><tr><td>Regulator/kondycjoner mocy</td><td>Furman</td><td>P-1800</td><td>Lub równoważny do usuwania przesunięcia DC od hałasu wprowadzanego przez linię energetyczną</td></tr><tr><td>Strzykawka (12 mL)</td><td>Monoject</td><td>1181200777</td><td>Do napełniania kapilar klipsem HBSS</td></tr><tr><td>T-clip</td><td>Cole-Parmer</td><td>06852-20</td><td>Do montażu uchwytu elektrody</td></tr><tr><td>Eksykator próżniowy</td><td>Bel-Art</td><td>420120000</td><td>Przezroczyste dno i pokrywa</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> z poliwęglanu<tr><td><mocny>Leczenie farmakologiczne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Smar żel pod oczy</td><td>Alcon</td><td>0078-0429-47</td><td>Pomaga smarować powierzchnię rogówki i utrzymywać kontakt elektryczny z elektrodami kapilarnymi</td></tr><tr><td>Chlorowodorek fenylefryny 2.5%</td><td>Akorn</td><td>17478-201-15</td><td>Krótko działające krople do oczu z rozszerzaniem źrenic (do rozszerzania źrenic)</td></tr><tr><td>Chlorowodorek proparakainy 0,5%</td><td>Akorn</td><td>17478-263-12</td><td>Znieczulenie miejscowe do wkraplania okulistycznego</td></tr><tr><td>Tropicamid 0,5%</td><td>Akorn</td><td>17478-101-12</td><td>Krótko działające krople do oczu na rozszerzenie źrenic (do rozszerzania źrenic)</td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>AnaSed</td><td>sc-362949Rx</td><td>Środek przeciwbólowy i zwiotczający mięśnie</td></tr><tr><td>Zetamine (Ketamine HCl)</td><td>VetOne</td><td>501072</td><td>Środek znieczulający do wstrzykiwań domięśniowych</td></tr></tbody></table>

elektroretinogram ze sprzężeniem bezpośrednim (dc-erg) do rejestrowania wywołanych światłem reakcji elektrycznych nabłonka barwnikowego siatkówki myszy

Direct-Coupled Electroretinogram (DC-ERG) for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) to wyspecjalizowana monowarstwa komórek strategicznie rozmieszczona między siatkówką a naczyniówką, która utrzymuje ogólny stan zdrowia i integralność strukturalną fotoreceptorów. RPE jest spolaryzowany, wykazując receptory lub kanały zlokalizowane wierzchołkowo i podstawowo i wykonuje wektorowy transport wody, jonów, metabolitów i wydziela kilka cytokin.
Nieinwazyjne pomiary funkcji RPE in vivo mogą być wykonywane za pomocą bezpośrednio sprzężonych ERG (DC-ERG). Metodologia stojąca za DC-ERG została zapoczątkowana przez Marmorsteina, Peacheya i współpracowników przy użyciu niestandardowego systemu rejestracji stymulacji, a następnie zademonstrowana przy użyciu dostępnego na rynku systemu. Technika DC-ERG wykorzystuje szklane kapilary wypełnione buforowanym roztworem soli Hanka (HBSS) do pomiaru wolniejszych reakcji elektrycznych RPE wywołanych zmianami stężenia w przestrzeni podsiatkówkowej wywołanymi światłem w wyniku aktywności fotoreceptorów. Przedłużony bodziec świetlny i długość nagrania DC-ERG sprawiają, że jest on podatny na dryft i szumy, co skutkuje niską wydajnością użytecznych nagrań. W tym miejscu przedstawiamy szybką, niezawodną metodę poprawy stabilności nagrań przy jednoczesnej redukcji szumów poprzez wykorzystanie podciśnienia do redukcji/eliminacji pęcherzyków, które powstają w wyniku odgazowania HBSS i uchwytu elektrody. Dodatkowo artefakty linii energetycznej są tłumione za pomocą regulatora napięcia/kondycjonera mocy. Dołączamy niezbędne protokoły stymulacji światłem dla dostępnego na rynku systemu ERG, a także skrypty do analizy składowych DC-ERG: fala c, szybka oscylacja, szczyt świetlny i odpowiedź wyłączenia. Ze względu na większą łatwość zapisów i szybki przebieg analizy, ten uproszczony protokół jest szczególnie przydatny w pomiarze związanych z wiekiem zmian w funkcji RPE, progresji choroby oraz w ocenie interwencji farmakologicznej.

Rysunek 2 przedstawia przykładowy zestaw danych z myszy miR-204 ko/ko cre/+ (warunkowy KO) oraz myszy typu dzikiego (WT). MiR-204 ko/ko cre/+ to myszy z warunkowym nokautem mikroRNA 204 w nabłonku barwnikowym siatkówki. Myszy te uzyskano poprzez krzyżowanie myszy z floxowanym genem miR-204 (opracowanych przez NEIGEF)22 z myszami VMD2-CRE23. MiR-204 wykazuje wysoką ekspresję w RPE, gdzie reguluje ekspresję białek kluczowych dla funkcji nabłonka,...

Tutaj prezentujemy metodę rejestrowania wywołanych światłem reakcji elektrycznych nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) u myszy za pomocą techniki znanej jako DC-ERG, po raz pierwszy opisanej przez Marmorsteina, Peacheya i współpracowników na początku 2000 roku.

Elektroretinogram ze sprzężeniem bezpośrednim (DC-ERG) do rejestrowania wywołanych światłem reakcji elektrycznych nabłonka barwnikowego siatkówki myszy

The retinal pigment epithelium (RPE) is a specialized monolayer of cells strategically located between the retina and the choriocapillaris that maintain ...

Technika DC-ERG może być stosowana do niewymijającej oceny funkcji nabłonka barwnikowego siatkówki w celu monitorowania zmian związanych z wiekiem lub progresji choroby oraz do oceny efektów interwencji farmakologicznej. Technika ta poprawia zdolność odtwarzania DC-ERG i łatwość użycia poprzez uproszczenie przygotowania elektrody kapilarnej. Można go również uzupełnić o standardową aplikację Ohm w celu ułatwienia analizy.Zacznij od ostrożnego wsunięcia igły strzykawki o rozmiarze 25 przez uszczelkę z gumy silikonowej do tylnej ścianki uchwytu elektrody. Napełnij podstawę uchwytu elektrody odgazowanym HBSS, powoli chowając igłę, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków, i załóż gwintowaną nasadkę bez dokręcania. Ponownie włożyć igłę strzykawki, aby wypełnić pustą przestrzeń w szczelinie HBSS i przytrzymać kapilarnę poziomo podczas napełniania, aby zapobiec wyciekaniu roztworu z drugiego końca.Chwytając wypełnioną kapilarnę na zgiętym końcu, powoli włóż drugi koniec przez poluzowaną nakrętkę i dokręć nakrętkę na miejscu. Przechyl uchwyty elektrod tak, aby elektrody kapilarne były skierowane do góry, aby umożliwić wypłynięcie pęcherzyków i odgazuj kapilary w komorze próżniowej przez pięć do 10 minut. Następnie powoli zwolnij próżnię i napełnij uchwyty elektrod i szklane kapilary, jak pokazano.Aby wykonać niestandardowy stojak na uchwyt mikroelektrody, usuń czarne klipsy poliacetalowe z jednej strony zacisku T numer osiem i użyj podstawy cylindra z magnetycznymi przegubami kulowymi obciętymi na pół, aby wyregulować wysokość. Przymocuj zmodyfikowane zaciski T do mocujących kulkę magnetyczną za pomocą nakrętek w rozmiarze M3 i suwaka w około jednocalowym, stożkowym drewnianym uchwycie, zmodyfikowanym z bawełnianego patyczka do czyszczenia, do stojaka pod kątem, aby przymocować uchwyt mikroelektrody do wykonanego na zamówienie stojaka z magnetycznym przegubem kulowym T-clip. Następnie użyj podstawy cylindra magnesów ziem rzadkich, aby bezpiecznie ustawić niestandardowy stojak uchwytu elektrody na metalowej płycie stolika, umożliwiając obrót o 360 stopni wokół osi 180 stopni.Aby wykonać test elektrody, najpierw delikatnie opuść w pełni zmontowane mikroelektrody kapilarne wypełnione HBSS do małego pojemnika HBSS. Umieść elektrodę uziemiającą igłę i srebrną, wyśrodkowaną elektrodą referencyjną z chlorku srebra w tym samym HBSS, aby zakończyć obwód i wybrać lub utworzyć odpowiedni identyfikator opisujący mysz, która ma być testowana. Aby wybrać protokół elektroretinogramu sprzężonego z bezpośrednią sprzężoną, który ma zostać wykonany, kliknij Protokoły i wybierz DC-ERG.Kliknij przycisk Uruchom. Pojawi się okno dialogowe z informacjami o pacjencie. Jeśli informacje są poprawne, kliknij przycisk tak i przejdź do pierwszego z sześciu kroków.Zamknij drzwi klatki Faradaya i kliknij impedancję, aby wyświetlić tryb impedancji. Sprawdź, czy wartości dla elektrod odniesienia ust, uziemienia ogona i elektrod rejestrujących są dopuszczalne, a następnie kliknij krok, aby przejść do kroku czwartego z sześciu, aby przetestować stabilność linii podstawowej. Aby rozpocząć wyświetlanie śladów, kliknij przycisk Podgląd.Ścieżki powinny być niskoszumowe o amplitudzie międzyszczytowej mniejszej niż 200 mikrowoltów. Aby ustawić mysz i elektrody do eksperymentu, znieczulij rogówkę uspokojonej myszy kroplą 5% kwasu solnego proparakainy, a następnie rozszerz rogówkę kroplą 2,5% fenylefryny HCL i 5% tropikamidu. W oprogramowaniu systemu ERG sprawdź, czy wybrano właściwego pacjenta.Kliknij pozycję Protocols (Protokoły). W obszarze Opis protokołu wybierz DC-ERG i kliknij przycisk Uruchom. Kliknij przycisk Tak, aby sprawdzić, czy wykonywany jest prawidłowy test.Użyj kroku pierwszego z sześciu, aby włączyć przyciemnione czerwone światło wewnątrz kopuły i umieść mysz na podgrzewanym stole do nagrywania. Użyj kleszczy, aby ostrożnie namiotować skórę tylnej nogi. Jedną ręką mocno przytrzymuj elektrodę igłową, drugą ręką włóż elektrodę podskórnie do tylnej nogi, aby zamocować elektrodę na miejscu.Umieść referencyjną elektrodę srebrną i chlorku srebra w pysku zwierzęcia tak, aby wyśrodkowana osadówka spoczywała wzdłuż tylnego policzka i była utrzymywana na miejscu za zębami. Przed umieszczeniem elektrod kapilarnych na oku należy ustawić uchwyt elektrody tak, aby szklane kapilary były ustawione pionowo i potrząśnij uchwytem elektrody palcem wskazującym, aby usunąć wszelkie pęcherzyki, które mogły zostać wprowadzone. Użyj igły o rozmiarze 25G, aby wypełnić końcówki kapilarne HBSS i sprawdź naczynia włosowate, aby upewnić się, że w końcówkach nie ma uwięzionych pęcherzyków powietrza.Ustaw stojak uchwytu elektrody tak, aby otwarte końcówki naczyń włosowatych wypełnionych HBSS delikatnie stykały się z rogówką. Uważając, aby nie wprowadzać bąbelków, odwróć dozownik żelu do oczu z lubrykantem, aby usunąć początkowe krople. Następnie umieść kroplę nawilżającego żelu pod oczy na każdym oku, aby utrzymać przewodność i zapobiec wysuszeniu podczas nagrywania.Aby nagrać DC-ERG, kliknij krok, aby wybrać krok piąty z sześciu i kliknij impedancję, aby użyć ekranu sprawdzania impedancji do zbadania rezystancji lewego i prawego oka. Wartości impedancji elektrod rejestrujących przy każdym oku powinny być podobne. A wartości impedancji zarówno dla elektrody uziemiającej, jak i elektrody odniesienia powinny być mniejsze niż 10 kiloomów.Kliknij podgląd, aby wyświetlić ślady dla lewego i prawego oka i poczekaj do 10 minut, aby osiągnąć stabilną linię bazową. Następnie kliknij przycisk Stop, aby wyjść z podglądu śledzenia i kliknij przycisk Uruchom, aby rozpocząć nagrywanie. W tym miejscu pokazano przykładowy zestaw danych z myszy z warunkowym nokautem i myszami typu dzikiego.W tej analizie ślad ucierpiał z powodu drobnych pęcherzyków w elektrodzie. Zwiększyło to szum międzyszczytowy w ścieżce. W oddzielnej analizie pęcherzyki zostały wyeliminowane za pomocą komory próżniowej przed zamontowaniem mikroelektrod w stojakach na elektrody.Można obliczyć najlepsze linie dopasowania do początkowych 25 sekund, co pozwala na ponowne wykreślenie odpowiedzi skorygowanych o dryft i zidentyfikowanie amplitud składowych DC-ERG. Zgodnie z oczekiwaniami, zmniejszona ekspresja kanałów potasowych cure 7.1 w RPE znacznie osłabia załamek c i szybkie oscylacje, co wskazuje na znaczne upośledzenie właściwości elektrycznych nabłonka barwnikowego siatkówki. Tutaj pokazano względne amplitudy składowych DC-ERG, znormalizowane do typu dzikiego i wykreślone w stosunku do względnych dwóch największych amplitud fal a-wywołanych światłem.Ta forma analizy może określić, czy zmniejszone reakcje elektryczne RPE można wytłumaczyć samym zmniejszeniem aktywności fotoreceptorów. Lub jeśli występuje podstawowa wada, która ma swoje źródło w RPE. Pamiętaj, aby osiągnąć stabilną linię bazową przed przejściem do nagrywania za pomocą myszy i okresowo sprawdzać elektrody pod kątem pęcherzyków, które mogły zostać wprowadzone.Dostosowane do ciemności ERG mogą być rejestrowane przed DC-ERG w celu pomiaru funkcji siatkówki sterowanej stożkiem. Po DC-ERG można również wykonać ERG dostosowane do światła, aby ocenić reakcje siatkówki sterowane stożkiem.

direct-coupled-electroretinogram-dc-erg-for-recording-light-evoked

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

W tym filmie wykonujemy zapis elektroretinogramu, zapis z nerwu wzrokowego oraz zapis wewnątrzsiatkówkowy u amerykańskiego kraba podkowiasty, Limulus Polyphemus. Te paradygmaty elektrofizjologiczne mogą być wykorzystywane do badania neuronalnych podstaw widzenia w laboratoriach badawczych lub dydaktycznych.

Wykorzystanie kraba podkowiastego, Limulus Polyphemus, w badaniach nad wzrokiem

Przedstawimy sposób rejestracji odpowiedzi na błysk z pojedynczych czopków mysich przy użyciu elektrody ssącej.

Rejestracje metodą ssania z pojedynczych komórek fotoreceptorów czopkowych myszy

Opisujemy stosunkowo prostą metodę rejestracji transretinalnego elektroretinogramu (ERG) w celu uzyskania odpowiedzi fotoreceptorowych pręcików i czopków z nienaruszonej siatkówki myszy. Podejście to wykorzystuje blokadę przekaźnictwa synaptycznego z fotoreceptorów w celu wyizolowania ich odpowiedzi na światło i zarejestrowania ich za pomocą elektrod polowych umieszczonych w poprzek wyizolowanej, rozłożonej płasko siatkówki.

Rejestracja transretinalnego ERG z siatkówki myszy: fotoreakcje czopków i pręcików

Ten film przedstawia protokół elektrofizjologicznego zapisu aktywności fotoreceptorów w oku unieruchomionej Drosophila, umożliwiając precyzyjny pomiar zmian napięcia w odpowiedzi na bodźce świetlne.

Elektrofizjologiczny zapis napięciowych odpowiedzi fotoreceptorów siatkówki Drosophila na bodźce świetlne

Ten film pokazuje, jak rejestrować elektroretinogram (ERG) i wizualny potencjał wywołany (VEP) u przytomnego szczura. Szczur, z chirurgicznie wszczepionymi elektrodami, jest najpierw przystosowany do ciemności. Po zastosowaniu kropli rozszerzających zwierzę umieszcza się w unieruchomieniu i umieszcza w misce Ganzfelda. Następnie rejestrowane są sygnały ERG i VEP.

Zapis elektroretinogramu i wizualnego potencjału wywołanego u szczura

Ten film pokazuje nagranie bezpośrednio sprzężonego elektroretinogramu (DC-ERG) na przystosowanym do ciemności, znieczulonym nabłonku barwnikowym siatkówki myszy (RPE). Po zastosowaniu kropli rozszerzających zwierzę umieszcza się w ustawieniu do nagrywania, a elektrodę kapilarną wypełnioną buforem solnym umieszcza się na rogówce. Po ustaleniu linii bazowej rejestruje się DC-ERG.

Zapis elektroretinogramu z bezpośrednim sprzężeniem nabłonka barwnikowego siatkówki u myszy

Elektroretinogram (ERG) to potencjał elektryczny generowany przez siatkówkę w odpowiedzi na światło. W artykule opisano, w jaki sposób można wykorzystać ERG do oceny funkcji siatkówki u szczurów przystosowanych do ciemności oraz jak można go wykorzystać do oceny interwencji neuroprotekcyjnej, w tym przypadku zdalnego warunkowania niedokrwiennego.

Wykorzystanie elektroretinogramu do oceny funkcji siatkówki gryzoni i ochronnych skutków warunkowania wstępnego niedokrwiennego kończyn na odległość

Ex vivo ERG może być używany do rejestrowania aktywności elektrycznej komórek siatkówki bezpośrednio z izolowanych nienaruszonych siatkówk zwierząt lub ludzi. Pokazujemy tutaj, jak powszechne systemy ERG in vivo można dostosować do zapisów ERG ex vivo w celu zbadania aktywności elektrycznej komórek siatkówki.

Jednoczesne badanie funkcjonalne ex vivo dwóch siatkówk za pomocą systemu elektroretinogramu in vivo

Ten protokół opisuje jednoczesny pomiar elektroretinogramu i wzrokowych potencjałów wywołanych u znieczulonych szczurów.

Jednoczesna rejestracja elektroretinografii i wzrokowych potencjałów wywołanych u znieczulonych szczurów

Przestrzeganie międzynarodowych standardów i utrzymanie adaptacji siatkówki do ciemności jest niezbędne do uzyskania prawidłowych odpowiedzi na elektroretinogram w pełnym polu w diagnostyce i leczeniu dziedzicznych chorób siatkówki. Dostępny jest praktyczny protokół wykorzystujący przenośną ciemnię w celu uzyskania  pełnopolowy elektroretinogram dla niemowląt i dzieci w sedacji lub znieczuleniu ogólnym na sali operacyjnej.

Zapis elektroretinogramu dla niemowląt i dzieci pod narkozą w celu osiągnięcia optymalnej adaptacji do ciemności i międzynarodowych standardów

Modyfikacja istniejących urządzeń do tworzenia wieloelektrodowych układów lub krosówek sprawia, że elektroretinogram ex vivo jest szerzej dostępny. Ulepszone metody rejestrowania i utrzymywania odpowiedzi na światło ex vivo ułatwiają badanie funkcji fotoreceptorów i komórek dwubiegunowych ON w zdrowej siatkówce, zwierzęcych modelach chorób oczu i ludzkich siatkówkach dawców.

Optymalizacja ustawień i warunków elektroretinogramu ex vivo w celu badania funkcji siatkówki w małych i dużych oczach

Poznaj udoskonaloną metodę DC-ERG do nieinwazyjnej oceny funkcji nabłonka barwnikowego siatkówki u myszy. Technika obejmuje przygotowanie elektrod szklanych z odgazowanym buforem HBSS oraz redukcję szumów przez eliminację pęcherzyków powietrza w komorze próżniowej.

Elektroretinogram ze sprzężeniem bezpośrednim (DC-ERG) do rejestrowania wywołanych światłem reakcji elektrycznych nabłonka barwnikowego siatkówki myszy (Wideo) | JoVE Journal

Elektroretinogram ze sprzężeniem bezpośrednim (DC-ERG) do rejestrowania wywołanych światłem reakcji elektrycznych nabłonka barwnikowego siatkówki myszy

Przeglądaj więcej filmów