Name: Model ksenoprzeszczepu pobrany od pacjenta w przypadku malformacji żylnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Poznaj protokół tworzenia ksenoprzeszczepu pobranego od pacjenta w celu badania malformacji żylnych. Model ten odwzorowuje cechy histopatologiczne choroby i umożliwia testowanie terapii przedklinicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Norze Lakes za korektę. Badania opisane w tym manuskrypcie były wspierane przez Narodowy Instytut Serca, Płuc i Krwi, w ramach nagrody o numerze R01 HL117952 (E.B.), będący częścią National Institutes of Health. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

<ol><li>Dompmartin, A., Vikkula, M., Boon, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venous+malformation%3A+update+on+aetiopathogenesis%2C+diagnosis+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Phlebology%3A+The+Journal+of+Venous+Disease%22%5BJournal%5D)">Venous malformation: update on aetiopathogenesis, diagnosis and management.</a> Phlebology: The Journal of Venous Disease. 25 (5), 224-235 (2010).</li>
<li>Limaye, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+mutations+in+angiopoietin+receptor+gene+TEK+cause+solitary+and+multiple+sporadic+venous+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Somatic mutations in angiopoietin receptor gene TEK cause solitary and multiple sporadic venous malformations.</a> Nature Genetics. 41 (1), 118-124 (2009).</li>
<li>Castel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+PIK3CA+mutations+as+a+driver+of+sporadic+venous+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Somatic PIK3CA mutations as a driver of sporadic venous malformations.</a> Science Translational Medicine. 8 (332), 42(2016).</li>
<li>Limaye, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+Activating+PIK3CA+Mutations+Cause+Venous+Malformation%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Somatic Activating PIK3CA Mutations Cause Venous Malformation.</a> The American Journal of Human Genetics. 97 (6), 914-921 (2015).</li>
<li>Castillo, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+activating+mutations+in+Pik3ca+cause+sporadic+venous+malformations+in+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Somatic activating mutations in Pik3ca cause sporadic venous malformations in mice and humans.</a> Science Translational Medicine. 8 (332), 43(2016).</li>
<li>Stratman, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+lumen+and+vascular+guidance+tunnel+formation+requires+MT1-MMP-dependent+proteolysis+in+3-dimensional+collagen+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell lumen and vascular guidance tunnel formation requires MT1-MMP-dependent proteolysis in 3-dimensional collagen matrices.</a> Blood. 114 (2), 237-247 (2009).</li>
<li>Okada, S., Vaeteewoottacharn, K., Kariya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Highly+Immunocompromised+Mice+for+the+Establishment+of+Patient-Derived+Xenograft+%28PDX%29+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Application of Highly Immunocompromised Mice for the Establishment of Patient-Derived Xenograft (PDX) Models.</a> Cells. 8 (8), 889(2019).</li>
<li>Byrne, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+open+issues+in+cancer+precision+medicine+with+patient-derived+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).</li>
<li>Allen, P., Melero-Martin, J., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+collagen%2C+fibrin+and+PuraMatrix+matrices+provide+permissive+environments+for+human+endothelial+and+mesenchymal+progenitor+cells+to+form+neovascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Type I collagen, fibrin and PuraMatrix matrices provide permissive environments for human endothelial and mesenchymal progenitor cells to form neovascular networks.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (4), 74(2011).</li>
<li>Allen, P., Kang, K. T., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+onset+of+perfused+blood+vessels+after+implantation+of+ECFCs+and+MPCs+in+collagen%2C+PuraMatrix+and+fibrin+provisional+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative%22%5BJournal%5D)">Rapid onset of perfused blood vessels after implantation of ECFCs and MPCs in collagen, PuraMatrix and fibrin provisional matrices.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 9 (5), 632-636 (2015).</li>
<li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425(2018).</li>
<li>Roh, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+results+of+surgical+treatment+for+patients+with+venous+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Vascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">The results of surgical treatment for patients with venous malformations.</a> Annals of Vascular Surgery. 26 (5), 665-673 (2012).</li>
<li>Marler, J. J., Mulliken, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+management+of+hemangiomas+and+vascular+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Plastic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Current management of hemangiomas and vascular malformations.</a> Clinics in Plastic Surgery. 32 (1), 99-116 (2005).</li>
<li>Goines, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+xenograft+model+for+venous+malformation%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">A xenograft model for venous malformation.</a> Angiogenesis. 21 (4), 725-735 (2018).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ponatinib+Combined+With+Rapamycin+Causes+Regression+of+Murine+Venous+Malformation%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+thrombosis%2C+and+vascular+biology%22%5BJournal%5D)">Ponatinib Combined With Rapamycin Causes Regression of Murine Venous Malformation.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 39 (3), 496-512 (2019).</li>
<li>Le Cras, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutively+active+PIK3CA+mutations+are+expressed+by+lymphatic+and+vascular+endothelial+cells+in+capillary+lymphatic+venous+malformation%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Constitutively active PIK3CA mutations are expressed by lymphatic and vascular endothelial cells in capillary lymphatic venous malformation.</a> Angiogenesis. , 1-18 (2020).</li>
<li>Boscolo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapamycin+improves+TIE2-mutated+venous+malformation+in+murine+model+and+human+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Rapamycin improves TIE2-mutated venous malformation in murine model and human subjects.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3491-3504 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

W tym miejscu opisano metodę generowania modelu ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta VM. Ten mysi model stanowi doskonały system, który pozwala naukowcom lepiej zrozumieć patologiczne powiększenie światła i będzie miał zasadnicze znaczenie w opracowywaniu bardziej skutecznych i ukierunkowanych terapii w leczeniu VM. Można to łatwo dostosować do badania innych rodzajów anomalii naczyniowych, takich jak kapilarne malformacje żylnelimfatyczne 16. Istnieje kilka etapów, które są kluczowe dla pomy...

Wady w rozwoju układu krwionośnego są podstawową przyczyną wielu chorób, w tym malformacji żylnej (VM). VM jest chorobą wrodzoną charakteryzującą się nieprawidłową morfogenezą i rozszerzaniem się żył1. Ważne badania nad tkankami VM i komórkami śródbłonka (EC) zidentyfikowały mutacje związane ze wzmocnieniem funkcji w dwóch genach: TEK, który koduje receptor kinazy tyrozynowej TIE2, oraz PIK3CA, który koduje izoformę p110α (podjednostka katalityczna) kinazy PI3 (PI3K)2,3,4,5. Te mutacje somatyczne powodują niezależną od ligandu hiperaktywację kluczowych szlaków sygnałowych angiogennych/wzrostu, w tym PI3K/AKT, co skutkuje rozszerzeniem żył ektatycznych 3. Pomimo tych ważnych odkryć genetycznych, późniejsze mechanizmy komórkowe i molekularne wywołujące nieprawidłową angiogenezę i powstawanie rozszerzonych kanałów naczyniowych nadal nie są w pełni poznane.
Podczas normalnej i patologicznej angiogenezy, nowe naczynia wyrastają z istniejącej wcześniej sieci naczyniowej, a EC przechodzi sekwencję ważnych procesów komórkowych, w tym proliferację, migrację, przebudowę macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i tworzenie światła6. Dwu- i trójwymiarowe (2D/3D) hodowle in vitro EC są ważnymi narzędziami do indywidualnego badania każdej z tych właściwości komórkowych. Niemniej jednak istnieje wyraźne zapotrzebowanie na mysi model rekapitulujący patologiczne powiększenie naczyń krwionośnych w mikrośrodowisku gospodarza, zapewniając jednocześnie skuteczną platformę do oceny przedklinicznej leków celowanych do badań translacyjnych.
Do tej pory, transgeniczny mysi model VM związany z mutacjami TIE2 gain-of-function nie został zgłoszony. Obecne transgeniczne modele myszy VM opierają się na wszechobecnej lub ograniczonej tkankowo ekspresji mutacji aktywującej PIK3CA p.H1047R3,5. Te transgeniczne zwierzęta dostarczają istotnych informacji na temat skutków tej mutacji PIK3CA na całe ciało lub tkanki. Ograniczeniem tych modeli jest tworzenie się wysoce patologicznej sieci naczyniowej skutkującej wczesną śmiertelnością. W związku z tym te mysie modele nie odzwierciedlają w pełni sporadycznego występowania zdarzeń mutacyjnych i zlokalizowanego charakteru patologii VM.
Wręcz przeciwnie, modele ksenoprzeszczepów pochodzące od pacjentów opierają się na przeszczepianiu lub wstrzykiwaniu patologicznej tkanki lub komórek pochodzących od pacjentów myszom z niedoborem odporności7. Modele ksenoprzeszczepów są potężnym narzędziem do poszerzania wiedzy na temat rozwoju chorób i odkrywania nowych środków terapeutycznych8. Ponadto wykorzystanie komórek pochodzących od pacjentów pozwala naukowcom na podsumowanie heterogeniczności mutacji w celu zbadania spektrum fenotypów pacjentów.
Tutaj opisujemy protokół, w którym pochodząca od pacjenta VM EC, która wyraża zmutowaną, konstytutywnie aktywną formę TIE2 i/lub PIK3CA, jest wstrzykiwana podskórnie w plecy atymicznym nagim myszom. Wstrzyknięte komórki naczyniowe są zawieszone w ramie ECM w celu promowania angiogenezy, jak opisano w poprzednich modelach ksenoprzeszczepów naczyniowych9,10,11. Te VM EC ulegają znaczącej morfogenezie i generują powiększone, perfundowane naczynia patologiczne przy braku komórek podporowych. Opisany model ksenoprzeszczepu VM stanowi wydajną platformę do przedklinicznej oceny leków celowanych pod kątem ich zdolności do hamowania niekontrolowanego rozszerzania się światła.

<table><tbody><tr><td>Atymiczne nagie myszy, (Foxn1-nu); 5-6 tygodni, samce</td><td>Envigo</td><td>069(nu)/070(nu/+)</td><td>Wstrzyknięcie podskórne</td></tr><tr><td>Biotynylowany Ulex europeaus Aglutynina-I (UEA-I)</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1065</td><td>Alaysis histologiczny</td></tr><tr><td>Filtr butelkowy (500 ml; 0,2 &micro; M)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>974106</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td> <td>BSA</td><td>A7906-50MG</td><td>Hodowla komórkowa; Analiza histologiczna</td></tr><tr><td>Dwuwodny kloryd wapnia (CaCl2.2H2O)</td><td>Sigma</td><td>C7902-500G</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Suwmiarka</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>50996491</td><td>Pomiar czopa zmian chorobowych</td></tr><tr><td>Kulki magnetyczne sprzężone z CD31 (Dynabeads)</td><td>Life Technologies</td><td>11155D</td><td>Separacja</td></tr><tr><td>EC Sitko komórkowe (100 &mu; M)</td><td>Greiner</td><td>542000</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Kolagenaza A</td><td>Roche</td><td>10103578001</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Probówka stożkowa; polipropylen (15 mL)</td><td>Greiner</td><td>07 000 241</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Probówka stożkowa; polipropylen (50 ml)</td><td>Greiner</td><td>07 000 239</td><td>Słoik do barwienia kultur komórkowych</td></tr><tr><td>Coplin</td><td>Ted Pella</td><td>21029</td><td>Anlaysis</td></tr> <tr>histologiczny<td>Szkło nakrywkowe (50 X 22 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12545E</td><td>Anatomia histologiczna</td></tr><tr><td>DAB: Odczynnik 3,3'diaminobenzydyny (ImmPACT DAB)</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4105</td><td>Nakładka histologiczna</td></tr><tr><td>Modyfikacja pożywki Eagle's Fashion firmy Dulbecco (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-027-CV</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>DynaMag-2</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td>Separacja EC</td></tr><tr><td>Dziurkacz do uszu</td><td>VWR</td><td>10806-286</td><td>Wstrzyknięcie podskórne</td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M, pH 8,0)</td> <td>Life Technologies</td><td>15575-020</td><td>Nakładka histologiczna</td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka-2 (EGM2) Bulletkit (podłoże podstawowe i suplementy)</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Eozyna Y (na bazie alkoholu)</td><td>Thermo Scientific</td><td>71211</td><td>Nakładka</td></tr> <tr>histologiczna<td>Etanol</td><td>Decon Labs</td><td>2716</td><td>Nakładka histologiczna</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS) , HyClone</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30910.03</td><td>Końcówka filtra do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>1,250 &mu; L</td><td>MidSci</td><td>AV1250-H</td><td>Wielostopniowa</td></tr><tr><td>końcówka filtra 20 &mu; L</td><td>VWR</td><td>10017-064</td><td>Wielostopniowy</td></tr><tr><td>Końcówka filtra 200 &mu; L</td><td>VWR</td><td>10017-068</td><td>Wieloetapowy</td></tr><tr><td>roztwór buforowany formaliną (10%)</td><td>Sigma</td><td>F04586</td><td>Rozwarstwienie zatyczek lejnych</td></tr><tr><td>Hemacytometr (INCYTO; Jednorazowe)</td><td>FOLIE SKC</td><td>DHCN015</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Wektor hematoksyliny</td><td>Hematoksylina</td><td>H-3401</td><td>Nakładki histologiczne</td></tr><tr><td>Oczyszczone białko fibronektyny z ludzkiego osocza (1 mg / ml)</td> <td>Sigma</td><td>FC010-10MG</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Roztwór nadtlenku wodoru (30% w/w)</td> <td>Sigma</td><td>H1009</td><td>Nakładka histologiczna</td></tr><tr><td>ImageJ Oprogramowanie</td><td></td><td></td><td>Analiza</td></tr><tr><td>Izofluran, USP</td><td>Akorn Animal Health</td><td>59399-106-01</td> Siarczan magnezu siedmiowodny do <td>iniekcji podskórnej</td></tr><tr><td>(MgSO4.7H2O)</td><td>Sigma</td><td>M1880-500G</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Macierz błony podstawnej (bez czerwieni fenolu; Bez LDEV)</td><td>Corning</td><td>356237</td><td>Wtrysk podskórny</td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówki (1,5 ml)</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td>Separacja EC</td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe Superfrost (75mm X 25mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>1255015-CS</td><td>Igły do anlayozy histologicznej</td></tr><tr><td>, sterylne igły 26G x 5/8 cala Sub-Q</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>BD305115</td><td>Wstrzyknięcie podskórne</td></tr><tr><td>Normalny surowica końska</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-2000</td><td>Nakładka histologiczna</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna-L-Glutamina (100X)</td><td>Corning</td><td>30-009-CI</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Trwałe podłoże montażowe (VectaMount)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-5000</td><td>Nakładka histologiczna</td></tr><tr><td>Rozmiar Tłuczka C, zwykła</td><td>Thomas Scientific</td><td>3431F55</td><td>EC</td></tr><tr><td>izolacja buforowana fosforanem Sól fizjologiczna (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3994</td><td>Waga do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>65500-202</td><td>Wstrzykiwanie podskórne</td></tr><tr><td>Pipety serologiczne (10 ml)</td><td>VWR</td><td>89130-898</td> Pipety serologiczne <td>do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>(5 ml)</td><td>VWR</td><td>89130-896</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Węglan sodu (Na2CO3)</td><td>Sigma</td><td>223530</td><td>Hodowla</td></tr> <tr><td>komórkowaStreptawidyna, Peroksydaza chrzanowa, Koncentrat, dla IHC</td><td>Vector Laboratories</td><td>SA-5004</td> Strzykawka do <td>hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>(60ml)</td><td>BD Biosciences</td><td>309653</td><td>Hodowla Cel</td></tr><tr><td>FILTR STRZYKAWKOWY (0,2 &mikro; M)</td> <td>Corning</td><td>431219</td> Strzykawki do <td>hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>(1 ml z Luer Lock)</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>BD-309628</td><td>Wstrzyknięcie podskórne</td></tr><tr><td>Płytka poddana hodowli tkankowej (100 X 20 mm)</td><td>Greiner</td><td>664160</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Płytka poddana kulturze tkankowej (145X20 mm)</td><td>Greiner</td><td>639160</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Płytki poddane kulturze tkankowej (60 X 15) mm</td><td>Eppendorf</td><td>30701119</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Tris-base (Trizma base)</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td>Histological anlaysis</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution (0,4 %)</td><td>Life Technologies</td><td>15250061</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Trypsyna EDTA, 1X (0,05% Trypsyna/0,53 mM EDTA)</td><td>Corning</td><td>25-052-Cl</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Biorad</td><td>170-6531</td><td>Nakładka histologiczna</td></tr><tr><td>Butelka Wheaton</td><td>VWR</td><td>16159-798</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Ksyleny</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td>Anatomia histologiczna</td></tr></tbody></table>

model ksenoprzeszczepu pobrany od pacjenta w przypadku malformacji żylnej

A Patient-Derived Xenograft Model for Venous Malformation

Malformacja żylna (VM) to anomalia naczyniowa, która powstaje w wyniku upośledzonego rozwoju sieci żylnej, co skutkuje rozszerzonymi i często dysfunkcyjnymi żyłami. Celem tego artykułu jest dokładne opisanie procesu tworzenia mysiego modelu ksenoprzeszczepu, który naśladuje ludzką maszynę wirtualną i jest w stanie odzwierciedlić heterogeniczność pacjenta. Hiperaktywujące niedziedziczne (somatyczne) mutacje TEK (TIE2) i PIK3CA w komórkach śródbłonka (EC) zostały zidentyfikowane jako główne czynniki powodujące patologiczne powiększenie naczyń w VM. Poniższy protokół opisuje izolację, oczyszczanie i ekspansję pochodzącego od pacjenta mutanta EC wykazującego ekspresję TIE2 i/lub PIK3CA. Te EC są wstrzykiwane podskórnie w plecy myszy z niedoborem odporności w celu wytworzenia ektatycznych kanałów naczyniowych. Zmiany powstałe za pomocą EC z mutacją TIE2 lub PIK3CA ulegają widocznemu unaczynieniu w ciągu 7–9 dni od wstrzyknięcia i przypominają cechy histopatologiczne tkanki pacjenta VM. Ten model ksenoprzeszczepu VM stanowi niezawodną platformę do badania mechanizmów komórkowych i molekularnych napędzających powstawanie i ekspansję VM. Ponadto model ten będzie miał zasadnicze znaczenie dla badań translacyjnych testujących skuteczność nowych kandydatów na leki w zapobieganiu nieprawidłowemu powiększeniu naczyń krwionośnych obserwowanemu u ludzi.

Niniejszy protokół opisuje proces tworzenia mysiego modelu ksenograftu VM w oparciu o podskórne wstrzyknięcie EC pochodzących od pacjenta w grzbiet immunodeficyjnych myszy nago. Kolonie komórek śródbłonka można zebrać w ciągu 4 tygodni po wstępnej izolacji komórek z tkanki VM lub krwi z obszaru zmiany (Ryc. 1A,B). Dzień po wstrzyknięciu guzek ksenograftu obejmuje powierzchnię około 80‒10 mm2. W naszych badaniach guzki ksenograftów z EC z mutacją TIE2/PIK3CA ulegają widocznej waskularyzacji i u...

Przedstawiamy szczegółowy protokół generowania mysiego modelu ksenoprzeszczepu malformacji żylnej. Model ten opiera się na podskórnym wstrzyknięciu komórek śródbłonka pochodzących od pacjenta zawierających hiperaktywujące mutacje genu TIE2 i/lub PIK3CA. Zmiany ksenoprzeszczepowe ściśle odwzorowują cechy histopatologiczne tkanki pacjenta z VM.

Model ksenoprzeszczepu pobrany od pacjenta w przypadku malformacji żylnej

Venous malformation (VM) is a vascular anomaly that arises from impaired development of the venous network resulting in dilated and often dysfunctional ...

Protokół ten może być wykorzystany do tworzenia ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjenta, które podsumowują histopatologię malformacji żylnych. Pozwoliło to na przeprowadzenie naszych przedklinicznych testów terapeutycznych. Technika ta zapewnia szybki i niezawodny system NVivo, który umożliwia codzienne monitorowanie wzrostu bezpośrednich komórek śródbłonka pacjenta i odpowiedzi na terapię eksperymentalną.Metodę tę można łatwo zaadaptować do badania innych rodzajów anomalii naczyniowych lub limfatycznych. Rozpocząć od przygotowania zawiesiny komórek do wstrzykiwań. Trypsynizuj komórki śródbłonka pięcioma mililitrami wstępnie podgrzanego 0,05% tripsin-EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie minuty.Zneutralizuj tripynę i dodając pięć mililitrów EGM i zbierz komórki do 150-mililitrowej stożkowej probówki. Odwirować go do 400 razy G przez pięć minut, a następnie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w trzech mililitrach EGM. Policz komórki za pomocą hemocytometru.Przenieś objętość z żądaną liczbą komórek do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów i ponownie zagnieźdź komórki przez odwirowanie. Odessać supernatant, pozostawiając niewielką objętość w celu poluzowania osadu komórkowego. Zawiesić osad komórkowy z 220 mikrolitrami BMEM na wstrzyknięcie.Dokładnie wymieszaj zawiesinę komórkową na lodzie, uważając, aby nie tworzyć bąbelków. Zassać mieszaninę kultur komórkowych BMEM do jednomililitrowego otworu strzykawki, pociągając za tłok. Do strzykawki należy przymocować sterylną igłę o rozmiarze 26 rozmiarów i przed wstrzyknięciem trzymać przygotowane strzykawki płasko na lodzie.Po upewnieniu się, że mysz została odpowiednio znieczulona, połóż ją na brzuchu i zdezynfekuj miejsce wstrzyknięcia 70% etanolem. Delikatnie zwinąć przygotowaną strzykawkę, aby ponownie zawiesić osiadłe komórki. Płatki pęcherzykują do końca strzykawki i wydalają niewielką objętość zawiesiny komórek.Ściśnij skórę w miejscu wstrzyknięcia, aby stworzyć strukturę przypominającą namiot. Następnie włóż igłę bezpośrednio pod skórę i upewnij się, że igła jest tylko głęboko w skórze, zwalniając szczypanie skóry, aby zapobiec wstrzyknięciu do tkanki mięśniowej. Trzymając igłę równomiernie, ostrożnie wstrzyknij 200 mikrolitrów zawiesiny komórek, aby utworzyć małą kulistą masę.Należy uważać, aby nie wstrzykiwać zawiesiny komórkowej do mięśni. Zmierz długość i szerokość każdej wtyczki za pomocą suwmiarki. Wyrównaj wypreparowane zatyczki ksenoprzeszczepu na desce do krojenia obok linijki i zrób zdjęcie, aby zarejestrować duże unaczynienie zmian.Następnie zamocuj zatyczki, zanurzając je na noc w 10% formalinie w temperaturze pokojowej. Po rozwarstwieniu czopy zmian chorobowych są przetwarzane do analizy histologicznej i barwione pod kątem UEA-1 w celu wykrycia komórek śródbłonka pochodzenia ludzkiego w czopie. Wykonaj pięć zdjęć HPF na wycinek zmiany chorobowej za pomocą mikroskopu jasnego pola przy 20-krotnym powiększeniu w płaszczyźnie X w obrębie sekcji zmiany, aby uniknąć nakładania się.Upewnij się, że na zrobionych zdjęciach znajduje się podziałka skali. Otwórz obrazy HPF na obrazie J.To skalibruj piksele paska skali, użyj narzędzia linii prostej i przejdź przez pasek skali. Następnie przelicz zmierzone piksele na milimetry, klikając Analizuj i ustaw skalę.Następnie kliknij Analizuj ustawione pomiary i wybierz obszar i dodaj do nakładki. Zmierz całkowitą powierzchnię pola HPF za pomocą analizy i pomiaru, zapisując ten pomiar w celu określenia ilościowego. Korzystając z narzędzia do zaznaczania z wolnej ręki, ręcznie obrysuj dodatni kanał naczyniowy UEA-1.Kliknij Analizuj i mierz, aby określić ilościowo zarysowany obszar. Zmierz wszystkie kanały naczyniowe w HPF. Powtórz ten proces dla pięciu HPF wykonanych w każdej sekcji i przenieś wartości do programu Excel w celu dalszej analizy.Następnie oblicz procent powierzchni naczyniowej i gęstość naczyń zgodnie ze wskazówkami rękopisu. Korzystając z tego protokołu, czopki zmian chorobowych z nadpobudliwymi zmutowanymi komórkami śródbłonka TIE2 lub PIK3CA są widocznie unaczynione i perfundowane w ciągu siedmiu do dziewięciu dni po wstrzyknięciu. Zatyczki zmian bardzo przypominają cechy histopatologiczne ludzkiej tkanki VM i widoczne są duże kanały naczyniowe wyrównane cienką warstwą komórek śródbłonka.Te struktury naczyniowe zazwyczaj zawierają erytrocyty potwierdzające funkcjonalne zespolenie z układem naczyniowym myszy gospodarza. Barwienie immunohistochemiczne przy użyciu swoistej dla człowieka lektyny UEA-1 potwierdza, że komórki wyściełające obszary naczyniowe pochodzą z ludzkich implantów, a nie z układu naczyniowego myszy. Po tej procedurze można wykonać dodatkowe barwienie skrawków zmian chorobowych pod kątem markerów proliferacji lub apoptozy w celu analizy określonych efektów eksperymentalnych zabiegów.Ten model scenograficzny został wykorzystany w badaniach przedklinicznych nad nowymi terapiami malformacji żylnych, takimi jak inhibitor mTOR rapamycyna, który wykazał skuteczność w kilku badaniach klinicznych u pacjentów z VM.

a-patient-derived-xenograft-model-for-venous-malformation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W tym filmie komórki czerniaka pochodzenia ludzkiego są wszczepiane podskórnie w obszar boczny myszy z obniżoną odpornością. Model PDX umożliwia przedkliniczne badanie komórek czerniaka, które lepiej oddaje niejednorodność guza i agresywność czerniaka obserwowane w warunkach in vivo.

Modelowanie ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjenta: technika generowania mysich modeli czerniaka

Opisujemy metodę tworzenia wiarygodnego modelu nadciśnienia żylnego mózgu u dorosłej myszy. Model ten został szeroko opisany i przetestowany na szczurach. Ten nowy odpowiednik u myszy otwiera możliwość wykorzystania genetycznie zmodyfikowanych zwierząt, a tym samym poszerza zastosowania modelu.

Model nadciśnienia żylnego dorosłej myszy: Zespolenie tętnicy szyjnej wspólnej z żyłą szyjną zewnętrzną.

Unaczynienie jest kluczem do skutecznego podejścia do inżynierii tkankowej. W związku z tym potrzebne są niezawodne technologie do oceny rozwoju sieci naczyniowych w konstruktach tkankowych. Tutaj przedstawiamy prostą i opłacalną metodę wizualizacji i ilościowego określania unaczynienia in vivo.

Pełny model ubytku skóry do oceny unaczynienia biomateriałów in vivo

Aby poszerzyć naszą wiedzę na temat komórkowego i molekularnego tworzenia się nowotworów, niedawno opracowano mysi model TEVG. Przeszczepy wszczepiono jako przeszczepy z interpozycją żyły głównej podnerkowej u myszy C57BL/6. Model ten osiąga wyniki podobne do tych osiągniętych w naszym badaniu klinicznym, ale w znacznie krótszym czasie.

Implantacja przeszczepu interpozycji żyły głównej dolnej w modelu mysim

Opisujemy mikrochirurgiczne podejście do generowania pętli tętniczo-żylnej (AV) jako model do analizy unaczynienia in vivo w izolowanym i dobrze scharakteryzowanym środowisku. Model ten jest nie tylko przydatny do badania angiogenezy, ale jest również optymalnie przystosowany do inżynierii osiowo unaczynionych i przeszczepialnych tkanek.

Pętla tętniczo-żylna (AV) w małym modelu zwierzęcym do badania angiogenezy i inżynierii tkanek unaczynionych

Ten film demonstruje model do badania rozwoju przerostu mięśniowo-wewnętrznego, po operacji wstawiania żył u szczurów.

Model wstawiania żył: odpowiedni model do badania drożności przeszczepu bypassów

Modele ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta (PDX) bardziej solidnie rekapitulują molekularne i biologiczne cechy czerniaka i są bardziej predykcyjne dla odpowiedzi na terapię w porównaniu do tradycyjnych testów opartych na hodowli tkanek plastycznych. W tym miejscu opisujemy nasz standardowy protokół operacyjny do tworzenia nowych modeli PDX oraz charakteryzacji/eksperymentowania z istniejącymi modelami PDX.

Model ksenoprzeszczepu pobrany od pacjenta z czerniakiem

Przetoka aortalno-bębenkowa powstała poprzez przebicie mysiej aorty podnerkowej przez obie ściany do żyły głównej dolnej, a następnie powstało zwężenie w jej odpływie poprzez częściowe podwiązanie żyły głównej dolnej. Ten powtarzalny model może być wykorzystany do badania zwężenia żyły centralnej.

Mysi model zwężenia żyły centralnej z wykorzystaniem przetoki aortalno-caval ze zwężeniem odpływu

Obecny protokół ma na celu eksperymentalne stworzenie przerostu żył wewnętrznych poprzez poddanie żył działaniu ciśnienia krwi tętniczej w celu opracowania strategii osłabienia przerostu żył wewnętrznych po operacji rewaskularyzacji za pomocą przeszczepów żyłowych.

Model wstawiania żył królika naśladujący operację rewaskularyzacji przy użyciu przeszczepów żył do oceny przerostu błony wewnętrznej pod ciśnieniem tętniczym krwi

Opisujemy mysi model raka piersi z przerzutami do mózgu generowanymi przez wstrzyknięcie do żyły ogonowej endogennej linii komórkowej zapalnego raka piersi z amplifikacją HER2.

Modelowanie przerzutów do mózgu poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej komórek zapalnego raka piersi

W tym protokole, nowatorskie obejście żył świni zostało przeprowadzone przez małe nacięcie w lewej ścianie klatki piersiowej bez krążenia pozaustrojowego. Wykonano pooperacyjne badanie patomorfologiczne, które wykazało pogrubienie błony wewnętrznej.

Opracowanie i ocena modelu choroby przeszczepu żyły świni

Poznaj protokół tworzenia ksenoprzeszczepu pobranego od pacjenta w celu badania malformacji żylnych. Model ten odwzorowuje cechy histopatologiczne choroby i umożliwia testowanie terapii przedklinicznych.

Model ksenoprzeszczepu pobrany od pacjenta w przypadku malformacji żylnej

Przeglądaj więcej filmów