27 maja 2022
Ten protokół przedstawia metody charakteryzowania neurozapalnej i hemodynamicznej odpowiedzi na łagodne urazowe uszkodzenie mózgu oraz integracji tych danych jako części wielowymiarowej analizy systemów przy użyciu częściowej regresji metodą najmniejszych kwadratów.
Metody te można wykorzystać do scharakteryzowania neurozapalnych i hemodynamicznych reakcji na uszkodzenie mózgu w ramach wielowymiarowej analizy systemu przy użyciu częściowej regresji metodą najmniejszych kwadratów. Techniki te są stosowane, aby dać bardziej holistyczne spojrzenie na reakcję mózgu na uraz. Aby wywołać uraz, potwierdź brak reakcji na uszczypnięcie palca u znieczulonej myszy i umieść mysz w pozycji leżącej na środku cienkiej błony.
Używając obu rąk do trzymania nauczonej tkanki, zabezpiecz ogon myszy pod kciukiem i ustaw głowę myszy pod rurką prowadzącą. Gdy mysz jest w odpowiedniej pozycji, dążąc do uderzenia między tylną częścią oczu a przednią częścią uszu, upuść z górnej części rurki prowadzącej na grzbietową stronę głowy myszy. Po uderzeniu mysz przebije się przez tkankę, umożliwiając szybkie przyspieszenie głowy wokół szyi.
Po kontuzji pozwól myszy dojść do siebie w pozycji leżącej na podkładce rozgrzewającej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po dwuminutowym okresie stabilizacji delikatnie oprzyj czujnik DCS na prawej półkuli czaszki myszy, tak aby górna krawędź czujnika optycznego zrównywała się z tyłem oka, a bok czujnika układał się wzdłuż linii środkowej. Przyłóż dłoń do czujnika, aby osłonić go przed światłem w pomieszczeniu i uzyskać pięć sekund danych.
Następnie ustaw czujnik na lewej półkuli i uzyskaj dane z lewej półkuli przez pięć sekund. Aby ocenić produkcję cytokin i fosfoprotein multipleksowanych, dodaj 150 mikrolitrów mieszanego buforu do lizy na około trzy miligramy pobranej tkanki mózgowej zwierzęcia. I użyj końcówki pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów, aby mechanicznie rozcierać tkankę od 15 do 20 razy.
Umieść homogenizowane próbki na rotatorze na 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza przed zebraniem resztek tkanek przez odwirowanie. Przenieść supernatanty do nowych probówek i odwirować próbki w celu usunięcia pozostałego osadu. Przenieść supernatanty do nowych probówek i oznaczyć stężenie białka za pomocą testu BCA zgodnie ze standardowymi protokołami.
Przygotować 25 mikrolitrów każdej próbki o optymalnym stężeniu białka, określonym przez analizę zakresu liniowego w nowych probówkach. Użycie buforu testowego do normalizacji całkowitej objętości każdej próbki do 25 mikrolitrów. Aby przygotować płytkę do oznaczania, dodaj 200 mikrolitrów buforu do przemywania do każdej studzienki 96-dołkowej płytki i potrząsaj płytką na wytrząsarce przez 10 minut z prędkością 750 obrotów na minutę.
Pod koniec inkubacji zdekantować bufor do płukania i postukać płytką o ręcznik papierowy, aby usunąć wszelkie pozostałości. Następnie dodaj 25 mikrolitrów buforu testowego do każdej studzienki, a następnie 25 dodatkowych mikrolitrów buforu do studzienek tła. Dodać 25 mikrolitrów rozcieńczonych próbek do odpowiednich dołków na próbki i wirować przez jedną minutę przez multipleksowane kulki magnetyczne, a następnie dodać 25 mikrolitrów dokładnie zawieszonych kulek do każdej studzienki.
Po dodaniu wszystkich kulek zamknąć płytkę zgrzewarką do płytek i przykryć płytkę folią do inkubacji przez noc z wytrząsaniem w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza. Następnego ranka umieść płytkę na separatorze magnetycznym, upewniając się, że studzienki są wyrównane z magnesami. Po dwóch minutach zdekantować zawartość studzienki z płytką nadal przymocowaną do separatora magnetycznego i dodać 200 mikrolitrów buforu do płukania do każdej studzienki.
Po potrząśnięciu przez dwie minuty umieść płytkę na separatorze magnetycznym na dwie minuty. Następnie zdekantować zawartość studzienki z płytką nadal przymocowaną do separatora magnetycznego i umyć płytkę świeżym buforem do płukania o pojemności 200 mikrolitrów na studzienkę, jak to właśnie pokazano. Po drugim przemyciu dodać 25 mikrolitrów przeciwciała wykrywającego na studzienkę i ponownie przykryć folią na godzinną inkubację przy 750 obrotach na minutę w temperaturze pokojowej.
Pod koniec inkubacji dodać 25 mikrolitrów streptawidyny i fikoerytryny do każdej studzienki i włożyć płytkę do wytrząsarki na dodatkowe 30 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji umieścić płytkę na separatorze magnetycznym na dwie minuty przed dekantacją zawartości studzienki. Umyj płytkę dwa razy 200 mikrolitrami świeżego buforu do mycia na mycie i dodaj 75 mikrolitrów odpowiedniego płynu napędowego do każdej studzienki.
Następnie ponownie zawieś kulki na wytrząsarce płytek na pięć minut w temperaturze pokojowej i odczytaj płytki na analizatorze zgodnie z instrukcjami producenta. W tej analizie przepływ krwi w mózgu mierzono za pomocą spektroskopii korelacji rozproszonej cztery godziny po ostatnim urazie. Następnie można określić wskaźnik przepływu krwi w mózgu i średni wskaźnik przepływu w mózgu dla każdej półkuli.
Można przeprowadzić analizę zakresu liniowego w celu określenia odpowiedniej masy obciążenia białkami przed zebraniem danych ze wszystkich próbek. Dane dotyczące cytokin można przygotować, odejmując pomiary tła od danych próbki, a następnie obliczając dane Z-score dla każdego anolitu. Częściową regresję metodą najmniejszych kwadratów można przeprowadzić przy użyciu markera aktywacji mikrogleju fagocytów lub innej interesującej zmiennej jako zmiennej odpowiedzi oraz pomiarów cytokin jako zmiennych predykcyjnych.
Rotację Varimax można przeprowadzić, aby zmaksymalizować kowariancję danych na zmiennej utajonej jeden, z pomiarami markera aktywacji. Wysokie masy ładunku w zmiennej utajonej pierwszej odpowiadają ekspresji cytokin najbardziej związanych z wysoką ekspresją markera aktywacji. Regresje liniowe między markerem aktywacji a cytokinami ilustrują, że cytokiny o największej masie obciążenia w zmiennej utajonej jeden były również statystycznie istotne dla tej analizy.
Chociaż skupiliśmy się w tym protokole na urazowym uszkodzeniu mózgu, metody te można szeroko uogólnić na badanie wielu stanów patologicznych, które wpływają na mózg. Używamy tych technik, aby pomóc nam zidentyfikować możliwe do wykonania cele do modulacji w przyszłych eksperymentach, aby ustalić przyczynowe związki mechanistyczne i ostatecznie w celu opracowania nowych strategii terapeutycznych dla łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Niniejsze badanie przedstawia protokół charakteryzacji odpowiedzi neurozapalnych i hemodynamicznych na łagodne urazowe uszkodzenie mózgu przy użyciu różnych technik eksperymentalnych. Protokół integruje te pomiary w ramach wielowymiarowej analizy systemowej z wykorzystaniem regresji cząstkowych najmniejszych kwadratów, zapewniając tym samym bardziej kompleksowe zrozumienie reakcji mózgu na uraz.
Zrozumienie zintegrowanej odpowiedzi neurozapalnej i hemodynamicznej na łagodne urazy czaszkowo-mózgowe umożliwia mechanistyczną ocenę ryzyka celów terapeutycznych w obszarze neurozapaleń i szlaków naczyniowo-mózgowych. To podejście na poziomie systemowym wspiera walidację celów poprzez powiązanie biomarkerów molekularnych z funkcjonalnymi efektami fizjologicznymi, co zwiększa pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych. Przedstawiona metodologia dostarcza istotnego dla przebiegu choroby systemu do oceny modulacji szlaków i dopasowania biomarkerów we wczesnej fazie poszukiwań leków.
Metoda ta integruje biologię odkrywczą, analitykę przesiewową oraz badania translacyjne, aby wspierać proces przechodzenia od identyfikacji celu do walidacji przedklinicznej w obrębie szlaków neurozapalnych i naczyniowych.