Name: Obrazowanie całego zwierzęcia Drosophila melanogaster za pomocą tomografii mikrokomputerowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Poznaj tomografię mikrokomputerową do obrazowania całych muszek owocówek Drosophila melanogaster. Ta nieniszcząca metoda zachowuje architekturę tkanek i pozwala badać fizjologię oraz rozwój zwierząt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nic z tego nie byłoby możliwe bez wsparcia Nassera Rusana. Chciałbym podziękować H. Dougowi Morrisowi, Danielle Donahue i Brendzie Klaunberg z NIH Mouse Imaging Facility oraz Benowi Ache z Micro Photonics za szkolenie i pomocną dyskusję. Dziękuję również Mansourehowi Norouzi Rad z firmy Zeiss za skanowanie próbek z jamy brzusznej za pomocą aparatu Xradia 520 Versa. Lauren Smith, Samantha Smith i Rachel Ng również pomagały w skanowaniu. Mike Marsh z Object Research Systems zapewnił wsparcie techniczne dla Dragonfly. Jestem również wdzięczny za wsparcie ze strony Narodowego Instytutu Serca, Płuc i Krwi (1K22HL137902-01) oraz funduszy na rozpoczęcie działalności z University of Wyoming. Dziękuję również anonimowym recenzentom za ich pomocne sugestie i komentarze.

1. Wybór próbki i przygotowanie skórek
<ol>
	<li>Wybierz odpowiedni punkt czasowy rozwoju (zarodek, larwa, poczwarka lub osoba dorosła) do obrazowania.
	<ol>
		<li>W stadiach embrionalnych samice umieszcza się w klatkach na płytkach agarowych z sokiem winogronowym posmarowanych pastą drożdżową i zbiera jaja co 30-60 minut. Pozostawić te zarodki do rozwoju w temperaturze 25 °C, aż do osiągnięcia właściwego etapu.</li>
		<li>W przypadku stadiów larwalnych należy pobrać pierwsze i drugie stadium z eksperymentów z czasowym pobieraniem zarodków. Bezpośrednio podnieś wędrujące 3 gwiazdki z boku fiolki z jedzeniem w warunkach bez zatłoczenia.</li>
		<li>Aby określić czas poczwarki, zbierz białe przetchlinki (odwrócone przetchlinki) i zanotuj czas, w którym naskórek zaczyna brązowieć. Zwierzęta przechodzą przez 15 etapów rozwoju poczwarki w określonych punktach czasowych po brązowieniu naskórka i mogą być odpowiednio zbierane42.</li>
		<li>Dorosłe osobniki należy zebrać jako dziewice po eklozji i pozostawić do leżakowania w fiolce z jedzeniem przez wymagany czas (np. 5 dni dla pełnego rozwoju jelit).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś 5-50 zwierząt do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 ml 0,5% Triton X-100 w 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (0,5% PBST). Okresowo stukając rurką o blat stołu, inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT), aby pomóc w usunięciu powłoki hydrofobowej i umożliwić zwierzętom całkowite zanurzenie.
	<ol>
		<li>W stadiach embrionalnych, larwalnych i poczwarkowych należy zatrzymać dalszy rozwój, umieszczając probówkę w bloku grzewczym ustawionym na 100 °C na 20 s, a następnie schładzając w temperaturze pokojowej przez 5 minut 
		UWAGA: Zwierzęta mogą być również błyskawicznie zamrażane w ciekłym azocie37.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Utrwalanie i barwienie
<ol>
	<li>Usuń 0,5% PBST i dodaj 1 ml roztworu Bouina. Dotknij rurki, aby upewnić się, że zwierzęta są całkowicie zanurzone. 
	UWAGA: Roztwór Bouina zawiera formaldehyd. Rozlany może powodować ostrą toksyczność dla skóry i oczu, a połknięcie może być śmiertelne. Podczas obchodzenia się z materiałem należy nosić rękawice, okulary ochronne i fartuch laboratoryjny. 
	UWAGA: Można również zastosować dodatkowe techniki utrwalania, takie jak użycie etanolu. Zalety innych utrwalaczy są szczegółowo opisane w ref.1,30.
	<ol>
		<li>W przypadku próbek z zarodków i osobników dorosłych inkubować na stole przez 16–20 godzin w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>W przypadku próbek larw i poczwarek należy utrwalać zwierzęta przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Roztwór Bouina należy wyrzucić i trzykrotnie przemyć 1x PBS przez 5 minut. Przenieś do wielodołkowej miski preparacyjnej zawierającej 1x PBS i użyj małej szpilki przymocowanej do uchwytu, aby zrobić otwór w przednim i tylnym naskórku, uważając, aby nie naruszyć żadnej leżącej pod spodem tkanki miękkiej.</li>
		<li>Przenieś próbki larw i poczwarek z powrotem do probówki do mikrofuge i dodaj 1 ml świeżego roztworu Bouina. Inkubować na stole przez 24 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usunąć roztwór Bouina i przemywać próbkę przez 30 minut 1 ml buforu do płukania μ-CT (0,1 M Na2HPO4, 1,8% sacharozy) lub trzykrotnie 1x PBS.</li>
	<li>Dodać 1 ml odpowiedniego roztworu barwiącego i inkubować na stole przez 2-7 dni. 
	UWAGA: Wybór bejcy będzie zależał od wielu czynników, ale generalnie jest to równowaga między penetracją, czasem inkubacji i rozdzielczością. Ogólnie rzecz biorąc, kwas fosfowolframowy (PTA) zapewnia lepszy kontrast i rozdzielczość tkanek miękkich, ale wymaga mechanicznego uszkodzenia naskórka i dłuższego czasu inkubacji. Zalety różnych rodzajów bejc są szczegółowo opisane w ref.1.
	<ol>
		<li>Do barwienia jodem użyj 1 ml 0,1 N I2KI (płyn Lugola). Inkubować przez 2 dni. Nie jest konieczne dalsze naruszanie naskórka osoby dorosłej.</li>
		<li>Do barwienia kwasem fosfotungstycznym (PTA) należy użyć 1 ml 0,5% (w/v) roztworu rozcieńczonego w wodzie. Zarąb naskórek dorosłego człowieka, usuwając aparat gębowy lub robiąc w klatce piersiowej lub naskórku brzucha za pomocą małej szpilki przymocowanej do uchwytu. Inkubować przez 5-7 dni lub dłużej, jeśli barwienie tkanek wydaje się niejednorodne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Myć 1 ml ultraczystej wody lub 1x PBS przez 30 min. Powtórzyć krok prania. Przechowuj zwierzęta w RT w ultraczystej wodzie lub 1x PBS przez okres do jednego miesiąca.</li>
	<li>Jeśli zwierzęta mają być skanowane w stanie nawodnienia, należy przejść bezpośrednio do sekcji 4. Jeżeli konieczne jest dłuższe przechowywanie próbki, należy przejść do sekcji 3 protokołu.</li>
</ol>
3. Suszenie w punkcie krytycznym (opcjonalnie)
<ol>
	<li>Wykonać serię dehydratacji etanolu (EtOH) na próbce: 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 100%. Dodać 1 ml roztworu EtOH i inkubować na stole przez 1 godzinę dla każdego stężenia w podanej kolejności.</li>
	<li>Po ostatnim 100% namoczeniu EtOH zastąp go świeżym 100% EtOH i pozostaw próbkę do inkubacji na stole przez noc.</li>
	<li>Przeprowadzić suszenie w punkcie krytycznym próbek zgodnie z instrukcjami producenta. 
	UWAGA: Urządzenia do mikroskopii elektronowej zazwyczaj są wyposażone w maszynę do suszenia w punkcie krytycznym (patrz Tabela materiałów), która przeprowadzi suszenie próbki po odwodnieniu EtOH.</li>
</ol>
4. Przykładowy montaż
<ol>
	<li>W przypadku próbek suszonych w krytycznym punkcie, gorące próbki klej do szpilki przeciw owadom lub innego uchwytu zaprojektowanego tak, aby pasował do uchwytu obrotowego stolika lub umieścić go w plastikowej lub szklanej rurce kapilarnej (średnica wewnętrzna ~1,0-1,25 mm).</li>
	<li>W przypadku próbek uwodnionych napełnij końcówkę pipety P10 wodą i zabezpiecz wąski koniec zgrzewaniem lub folią parafinową, aby zapobiec wyciekom. 
	UWAGA: Pamiętaj, aby szczelnie owinąć wszystkie połączenia, aby woda nie dostała się do skanera i nie spowodowała uszkodzenia.
	<ol>
		<li>Przenieś pojedynczą próbkę na końcówkę pipety za pomocą kleszczy. Używając długiego, smukłego przedmiotu, takiego jak stępiona igła 20 G lub inna końcówka do pipety, ostrożnie wepchnij próbkę w dół końcówki, aż dotknie ona ścianki końcówki pipety, aby utrzymać ją na miejscu.</li>
		<li>Zakryj otwór końcówki pipety folią parafinową, aby zapobiec parowaniu wody podczas długich skanów.</li>
		<li>Zamontuj pipetę P10 za pomocą uchwytu zaprojektowanego tak, aby pasował do uchwytu obrotowego stolika (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A-C).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Skanowanie
<ol>
	<li>Wykonaj wszelkie niezbędne kalibracje urządzenia przed obrazowaniem na dzień. 
	UWAGA: Będą się one różnić w zależności od producenta i zaleca się skonsultowanie się ze specjalistą ds. aplikacji w celu ustalenia właściwych kroków. Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat konfiguracji i oprogramowania używanego w tym protokole. Ogólnie rzecz biorąc, kalibracje, takie jak wyrównanie osi stolika w celu usunięcia wszelkich "chybotań" związanych z przesunięciem uchwytu w stosunku do obracającego się stolika i wykonywanie korekcji płaskiego pola w celu zapewnienia jednolitej intensywności pikseli tła w kamerze, zapewniają optymalne warunki obrazowania dla najlepszej rozdzielczości i zestawów danych, które są porównywalne z wieloma skanami.</li>
	<li>Otwórz drzwiczki skanera, aby uzyskać dostęp do obrotowego uchwytu scenicznego, klikając ikonę "Otwórz drzwi" w lewym górnym rogu oprogramowania. Przymocuj próbkę, zaciskając kołnierz wokół podstawy uchwytu próbki. 
	UWAGA: Używaj delikatnego nacisku podczas mocowania próbki do obracającego się uchwytu, aby utrzymać wyrównanie skanera.</li>
	<li>Ustaw parametry skanowania w oprogramowaniu sterującym skanerem, aby uzyskać optymalną rozdzielczość i kontrast. 
	UWAGA: Będą one musiały zostać określone empirycznie, ponieważ źródło promieniowania rentgenowskiego, kamera/detektor i geometria każdego skanera będą się różnić w zależności od producenta. Dodatkowe informacje dotyczące wyboru najlepszych parametrów można również znaleźć tutaj43, a także u specjalisty ds. aplikacji producenta.
	<ol>
		<li>Otwórz układ sterowania zasilaniem źródła promieniowania rentgenowskiego (punkt menu Opcje | Źródło promieniowania rentgenowskiego). Użyj suwaków, aby ustawić napięcie promieniowania rentgenowskiego na 30-40 kV i prąd na 100-110 μA, aby wytworzyć wiązkę promieniowania rentgenowskiego o mocy 3-4 W i małym rozmiarze plamki dla lepszej rozdzielczości.</li>
		<li>Użyj okna dialogowego Tryby akwizycji (punkt menu Opcje | File Mode (Tryby akwizycji), aby ustawić czas ekspozycji aparatu na 500-800 ms.</li>
		<li>Użyj suwaka znajdującego się obok ikony lupy na dole oprogramowania, aby ustawić żądany rozmiar piksela obrazu (od ~700 nm do 4 μm), w zależności od ustawień i położenia kamery. Określa to liczbę obrazów projekcyjnych, które są rejestrowane podczas skanowania, przy czym więcej projekcji prowadzi do zwiększonej rozdzielczości, ale dłuższego czasu skanowania (patrz Reprezentatywne wyniki).</li>
		<li>Kliknij i przeciągnij suwak znajdujący się obok obracającej się strzałki u dołu oprogramowania, aby przesunąć próbkę wzdłuż ścieżki obrotu o 360°. Upewnij się, że próbka pozostaje w polu widzenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kliknij ikonę "Rozpocznij pobieranie" (ikona niebieskiego kółka ze strzałką) w górnej części oprogramowania. Pojawi się okno dialogowe, w którym można ustawić dodatkowe parametry skanowania oraz określić plik i folder wyjściowy, w którym zostanie zapisane skanowanie.
	<ol>
		<li>Ustaw losowy ruch na 10 i średnio 4-6 klatek. Krok obrotu jest obliczany automatycznie w zależności od używanych ustawień kamery.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozpocznij skanowanie, klikając przycisk "OK" w oknie dialogowym Pobieranie. Pojawi się drugie okno dialogowe paska postępu, które pokazuje czas skanowania. Skaner uzyska teraz serię obrazów projekcyjnych (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D) próbki wzdłuż ścieżki obrotu i nie musi być monitorowana.</li>
</ol>
6. Rekonstrukcja
<ol>
	<li>Aby wygenerować tomogramy, należy przeprowadzić rekonstrukcję obrazu za pomocą obrazów projekcyjnych. 
	UWAGA: Podczas gdy prawie wszystkie rekonstrukcje obrazów ze skanerów geometrii wiązki stożkowej opierają się na algorytmie Feldkampa16, indywidualne parametry będą się różnić w zależności od implementacji oprogramowania i powinny być określone empirycznie. Poniższe ustawienia, specyficzne dla oprogramowania dostępnego na rynku (patrz Spis materiałów), mogą służyć jako przewodnik. Parametry, takie jak kompensacja niewspółosiowości, redukcja artefaktów pierścieniowych i korekcja utwardzenia wiązki (0% dla większości próbek much) są wykonywane w sposób iteracyjny, aby wybrać najlepsze wartości dla końcowej rekonstrukcji. Dla zaawansowanych użytkowników, którzy chcieliby mieć większą kontrolę nad procesem rekonstrukcji, zobacz interfejs MATLAB tutaj44.</li>
	<li>Wykonaj wstępne wyrównanie obrazu, wykorzystując algorytm korekcji przesunięcia oparty na skanach referencyjnych45 (Działania | Wyrównanie X/Y ze skanem referencyjnym).</li>
	<li>Dostosuj każdy parametr rekonstrukcji (Start | Dostrajanie). Spowoduje to uaktywnienie okna dialogowego "Dostrajanie parametrów".
	<ol>
		<li>Dostosuj wyrównanie, klikając "Dalej" do "Po wyrównaniu". Ustaw liczbę iteracji na pięć, a krok parametru na 1,0. Kliknij przycisk Start, aby wygenerować serię podglądów. Wybierz obraz, który jest prawidłowo wyrównany. 
		UWAGA: Prawidłowo wyrównany obraz nie będzie rozmyty ani nie będzie wyświetlał artefaktów "ścinania", gdy ciągła struktura (taka jak naskórek) wydaje się podzielona.</li>
		<li>Dostosuj redukcję artefaktu pierścienia, klikając obok niego. Ustaw liczbę iteracji na pięć, a krok parametru na 1,0. Kliknij przycisk Start, aby wygenerować serię podglądów. Wybierz obraz, który zawiera najmniejszą liczbę pierścieni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zoptymalizowaniu powyższych parametrów w celu uzyskania najlepszego obrazu, upewnij się, że wybrane wartości są prawidłowo odwzorowane w zakładce Ustawienia (Ustawienia).</li>
	<li>Dostosuj dowolne końcowe wartości jasności i kontrastu za pomocą histogramu, parametrów pliku, takich jak głębia bitowa i typ, oraz wykorzystaj obszar zainteresowania (ROI) obejmujący tylko interesujące struktury (np. cały rozporek lub tylko głowę), aby skrócić czas obliczeń (wyjście).</li>
	<li>Rozpocznij odbudowę (punkt menu Start | Początek). Jeśli wymagane są wielokrotne rekonstrukcje, dodaj bieżący obraz do menedżera wsadów (punkt menu Start | Dodaj do partii) i powtórz kroki 6.2-6.5 dla pozostałych obrazów.</li>
</ol>
7. Analiza obrazu
<ol>
	<li>Wizualizuj tomogramy w dwóch i trzech wymiarach i wykonuj dalszą analizę morfometryczną za pomocą darmowego lub komercyjnego oprogramowania. 
	UWAGA: Szczegółowe informacje na temat oprogramowania używanego w tym protokole są dostępne w Tabeli materiałów. Inne pakiety oprogramowania, które są w stanie ocenić zestawy danych μ-CT, obejmują opcje freeware, takie jak FIJI46, Seg3D (www.seg3D.org)47 i ITK-SNAP48, a także oprogramowanie komercyjne (np. AMIRA). Inne aplikacje, które wykorzystują algorytmy oparte na uczeniu maszynowym do częściowej automatyzacji procesu segmentacji, mogą pomóc przyspieszyć przepływy pracy i zmniejszyć stronniczość człowieka (np. Biomedisa49).</li>
	<li>Zaimportuj plik tomogramu do oprogramowania (Plik | Importuj pliki obrazów). Metadane skojarzone z plikiem powinny zostać automatycznie załadowane do okna, ale można je również ustawić ręcznie, aby odpowiadały właściwościom obrazu.</li>
	<li>Aby podzielić interesującą Cię strukturę na segmenty, kliknij zakładkę Segment po lewej stronie ekranu. Tworzenie nowego obszaru zainteresowania (ROI) (Podstawowe | Nowy), nadaj mu nazwę i wybierz odpowiedni kolor.</li>
	<li>Zdefiniuj zakres progowy, który obejmuje strukturę zainteresowania (punkt menu Zakres | Zdefiniuj zakres) za pomocą suwaka.</li>
	<li>Wybierz odpowiedni tryb narzędzia do malowania ROI 2D lub 3D (ROI Painter | Opcja pędzla).</li>
	<li>Aby namalować obszar zdefiniowany przez próg, naciśnij i przytrzymaj Ctrl, przytrzymując jednocześnie lewy myszy. Aby usunąć obszar, naciśnij i przytrzymaj Shift, przytrzymując jednocześnie lewy myszy. 
	UWAGA: Aby zmienić rozmiar okrągłego lub kwadratowego pędzla, po prostu przewiń kółko myszy, przytrzymując Ctrl lub Shift.</li>
	<li>Kontynuuj malowanie interesującej Cię struktury przez cały tom Z.</li>
	<li>Przekształć ROI w siatkę (punkt menu Eksport | Do siatki | Normalny).</li>
	<li>Podświetl nakładkę siatki, klikając ją w panelu Właściwości i ustawienia danych w prawym górnym rogu.</li>
	<li>Wygładź siatkę za pomocą odpowiedniej liczby iteracji (Gładka siatka | Iteracje). 
	UWAGA: Użyj tej samej wartości iteracji wygładzania siatki dla wszystkich obrazów, które mają być porównywane.</li>
	<li>Upewnij się, że pomiary ROI siatki (powierzchnia, objętość i średnica Feret) są wyświetlane w panelu informacyjnym po prawej stronie ekranu w celu przeprowadzenia podstawowej analizy morfometrycznej. Dodatkową analizę można przeprowadzić za pomocą Modułu Analizy Obiektowej.</li>
	<li>Renderuj obiekt siatki i cały obraz tomogramu i wizualizuj go w 3D. Użyj wbudowanego programu Movie Maker, aby wygenerować wideo obiektu (Prawy przycisk myszy | Pokaż program Movie Maker) przy użyciu pojedynczych klatek z poziomu przeglądarki (Dodaj klucz). 
	UWAGA: Do filmu można również zastosować kilka ulepszeń wizualnych za pomocą karty efektów wizualnych w panelu po prawej stronie, aby wyróżnić niektóre funkcje itp.</li>
	<li>Wyeksportuj wideo do wyświetlenia za pomocą przycisku Eksportuj animację w programie Movie Maker.</li>
</ol>

Autor deklaruje brak konkurencyjnych interesów lub interesów finansowych.

Wizualizacja nienaruszonego Drosophila melanogaster na wszystkich etapach rozwoju pozostała wyzwaniem, przede wszystkim ze względu na niezgodność mikroskopii świetlnej z grubym, pigmentowanym naskórkiem znajdującym się u tego zwierzęcia. Podczas gdy inne metody obrazowania całych zwierząt, takie jak rezonans magnetyczny (MRI), optyczna tomografia koherentna (OCT) i ultramikroskopia w połączeniu z oczyszczaniem tkanek były z powodzeniem stosowane u muszek 50,51,52,53,54, μ-CT ma szereg zalet, które czynią go idealnym do obrazowania całego organizmu u całych zwierząt 13,15,30. Promienie rentgenowskie z łatwością przenikają przez pigmentowany naskórek, a ich mała długość fali pozwala na obrazowanie submikronowe. Etykietowanie wymaga minimalnych inwestycji w powszechnie dostępne chemikalia i nie wymaga specjalistycznych umiejętności laboratoryjnych13. Skanery μ-CT są również dostępne na rynku, a ich koszty są porównywalne z platformami do mikroskopii świetlnej, a jednocześnie są bardziej atrakcyjne dla szerszego zakresu dyscyplin (geologia, paleontologia, inżynieria itp.), które również mogą skorzystać z ich dostępności w instytucji. Synchrotronowe źródła promieniowania rentgenowskiego mogą być również wykorzystywane do obrazowania μ-CT o wysokiej rozdzielczości owadów stacjonarnych i żywych31,55,56, ale są mniej dostępne niż komercyjne skanery stacjonarne.
Protokół ten zapewnia skuteczny sposób uzyskiwania obrazów μ-CT dorosłych much, poczwarek, larw i zarodków komórkowych. Należy pamiętać, że w przypadku wielu kroków opisanych powyżej można również zastosować alternatywne metody w celu przygotowania próbek do obrazowania. Inne badania dostarczyły szczegółowego porównania różnych etapów utrwalania, etykietowania i suszenia do stosowania u owadów, a osoby zainteresowane zastosowaniem tej techniki są zachęcane do oceny zalet każdego podejścia 1,4,13,29,30,57. Chociaż ten protokół jest stosunkowo prosty, przedstawiono kilka pomocnych sugestii.
Po pierwsze, należy zachować ostrożność podczas naruszania naskórka nienaruszonych próbek, tak aby leżące pod nimi tkanki miękkie nie zostały znacząco naruszone. Ważne jest, aby przed szturchnięciem pozostawić larwy i wczesne stadia poczwarki na utrwalenie przez 2 godziny w roztworze Bouina. Spowoduje to usztywnienie tkanki i ograniczenie ilości hemolimfy, która będzie wyciekać z otworów naskórka, co może zmienić architekturę narządów. Poszczególne segmenty ciała (głowa, klatka piersiowa i brzuch) osoby dorosłej mogą być oddzielone, jeśli znajdują się tam interesujące struktury. Zaleca się użycie skalpela do czystego przecięcia tych segmentów, zamiast rozrywania ich kleszczami, co może zakłócić architekturę 3D na przykład jelit lub ośrodkowego układu nerwowego. Jeśli chodzi o czas, dorośli zazwyczaj potrzebują tylko 16 godzin. do całkowitego utrwalenia, natomiast stadia larwalne i poczwarkowe potrzebują 24 godzin. Ponadto, jeśli barwienie jodem lub PTA wydaje się nierówne, próbkę można ponownie umieścić w roztworze, aby inkubować dłużej, aż do uzyskania równomiernego barwienia. Wreszcie, uwodnionych próbek nie należy umieszczać w temperaturze 4 °C, ponieważ wydaje się, że powoduje to tworzenie się pęcherzyków powietrza w jamie ciała po ogrzaniu do temperatury pokojowej.
Po drugie, mocowanie próbki będzie się różnić w zależności od urządzenia, typu etapu i tego, czy próbka musi pozostać uwodniona, czy też została wysuszona w punkcie krytycznym. W przypadku uwodnienia upewnij się, że próbka nie przecieka i nie może zniszczyć skanera. Podczas umieszczania próbki w końcówce pipety należy pamiętać o delikatnym dociskaniu stępionym przedmiotem, aż próbka napotka niewielki opór i nie będzie mogła się poruszać. Zbyt mocne naciskanie może prowadzić do deformacji naskórka i leżących u jego podstaw wad strukturalnych. Upewnij się również, że próbka jest wyrównana w uchwycie jak najbliżej osi obrotu. Każde chybotanie wydłuży czas skanowania ze względu na większe pole widzenia i zmniejszy rozdzielczość końcowego tomogramu po rekonstrukcji.
Po trzecie, ustawienia skanera do pozyskiwania obrazów projekcyjnych również będą się różnić w zależności od instrumentu. Aby zmaksymalizować możliwości rozdzielcze skanera, rozmiar plamki wiązki promieniowania rentgenowskiego powinien być jak najmniejszy (5-10 μm). Można to osiągnąć poprzez zrównoważenie ustawień napięcia i prądu rentgenowskiego tak, aby całkowita moc wynosiła 3-4 W. Dzięki tym ustawieniom i odpowiedniemu czasowi naświetlania w aparacie można uzyskać odpowiednie tłumienie wiązki promieniowania rentgenowskiego przez próbkę i optymalny kontrast obrazu. Zastosowanie aluminiowych lub miedzianych filtrów między obiektem a źródłem promieniowania rentgenowskiego może być wykorzystane do precyzyjnego dostrojenia optymalnych ustawień energii promieniowania rentgenowskiego w celu uzyskania najlepszego kontrastu obrazu lub wystarczającego tłumienia wiązki, aby można było zastosować źródła o większej mocy. Jeśli chodzi o rozdzielczość obrazu, będzie ona zależeć od wielu różnych zmiennych, w tym rodzaju plamy, liczby obrazów projekcyjnych, rozmiaru pikseli obrazu, pozycji kamery, ruchu próbki, drgań skanera i parametrów rekonstrukcji. Fantom wzoru pręta (QRM GmbH) zawierający znaczniki o znanym rozmiarze może pomóc w ocenie rozdzielczości przestrzennej dla danego ustawienia skanera i kamery.
Warto również ocenić zalety obrazowania próbek wysuszonych lub uwodnionych w punkcie krytycznym. Sombke i in. przeprowadzili ocenę porównawczą obu metod i stwierdzili, że suszenie w punkcie krytycznym jest lepsze w przypadku zastosowań μ-CT z udziałem stawonogów30. Jednak zaletą uwodnionych próbek jest to, że zwierzęta są poddawane mniejszemu narażeniu chemicznemu i mechanicznemu, co może prowadzić zarówno do artefaktów ilościowych, jak i morfologicznych. Ma to również tendencję do lepszej ochrony delikatnych tkanek niż CPD. Jednak uwodnione próbki mają znacznie krótszy okres trwałości i powinny być obrazowane nie później niż miesiąc po utrwaleniu, ponieważ degradacja tkanek i obniżona jakość obrazu stają się oczywiste w tym momencie. Ponadto rozdzielczość uwodnionych próbek będzie nieco mniejsza niż w przypadku próbki wysuszonej w punkcie krytycznym, ponieważ promienie rentgenowskie muszą również przenikać zarówno przez plastikową końcówkę pipety, jak i przez otaczającą ciecz (wodę lub bufor). Próbki suszone w punkcie krytycznym mogą być przechowywane przez znacznie dłuższy czas, zwłaszcza gdy są przechowywane na Drierite. Można je również umieścić bezpośrednio na ścieżce wiązki promieniowania rentgenowskiego, po prostu przyklejając skrzydła lub nogi do szpilki przeciw owadom i umieszczając ją w uchwycie scenicznym, upraszczając proces montażu. Jednak znaczne odwodnienie etanolem w tych próbkach może prowadzić do kurczenia się tkanek i utraty delikatnej architektury tkanek, dlatego ważne jest, aby wykonać szereg zwiększających się stężeń EtOH w celu zminimalizowania tych skutków. Niemniej jednak należy zauważyć, że wszystkie formy obróbki chemicznej, w tym utrwalanie paraformaldehydu, a nawet barwienie jodem, mogą powodować kurczenie się tkanek58,59. Chociaż żadna z tych metod nie dostarczy pomiarów "rzeczywistej wielkości narządu" u żywej muchy, pomiary morfometryczne są nadal ważne przy porównywaniu zwierząt zmutowanych i dzikich typów, o ile etapy utrwalania, barwienia i suszenia są przeprowadzane identycznie dla obu zestawów próbek - najlepiej równolegle.
Podsumowując, μ-CT zapewnia użyteczne narzędzie do obrazowania całych zwierząt dla Drosophila 33,34,35,36,37,38,39,40,41. Wiele innych badań wykazało moc tej technologii w zrozumieniu różnych aspektów taksonomii, ekologii, fizjologii, rozwoju i anatomii owadów, które mogą pomóc w przyszłych badaniach na muchach 1,28,30,31,32,55,56,57 . W połączeniu z narzędziami do mikroskopii genetycznej i świetlnej, które są już szeroko stosowane w tym organizmie, μ-CT może pozycjonować się w procesie eksperymentalnym, który pozwala na głębsze zrozumienie genotypu i fenotypu.

Metody obrazowania, które pozwalają na szczegółowe badanie wewnętrznych struktur obiektu bez niszczenia jego ogólnej architektury 3D, okazały się bardzo korzystne dla wielu różnych dyscyplin, w tym fizyki, inżynierii, materiałoznawstwa, archeologii, paleontologii, geologii i biologii1,2,3,4,5,6,7,8,9. Wśród tych nieniszczących metod obrazowania, platformy oparte na promieniowaniu rentgenowskim są szczególnie przydatne ze względu na zdolność wysokoenergetycznych promieni rentgenowskich do przenikania przez wiele różnych typów próbek i materiałów przy minimalnym rozpraszaniu w porównaniu z falami światła widzialnego. Tomografia komputerowa (CT), mikrotomografia komputerowa (μ-CT), nanotomografia komputerowa (Nano-CT) i mikrotomografia synchrotronowa stały się zatem podstawowymi technologiami obrazowania rentgenowskiego próbek o rozmiarach od metrów do mikronów, z rozdzielczością od milimetra do submikrona10,11,12,13,14.
Chociaż te platformy różnią się konstrukcją, geometrią promieniowania rentgenowskiego i komponentami w celu zrównoważenia wielkości próbki i rozdzielczości, wszystkie opierają się na tej samej podstawowej zasadzie przechwytywania obrazu: źródło promieni rentgenowskich, które przechodzą przez obiekt i są rejestrowane przez detektor. Zróżnicowane tłumienie wiązki promieniowania rentgenowskiego przechodzącej przez różne gęstości w obiekcie generuje kontrast obrazu. Dane 3D uzyskuje się poprzez obracanie próbki lub detektora, zbierając serię obrazów projekcyjnych 2D, które są następnie rekonstruowane za pomocą algorytmów w tomogramy zawierające informacje 3D, których rozdzielczość jest izotropowa w x,y,z15. W przypadku wielu stacjonarnych tomografów komputerowych μ, które wykorzystują geometrię promieniowania rentgenowskiego wiązki stożkowej do rzutowania promieni rentgenowskich na obrazowany obiekt, algorytm Feldkampa jest używany do dokładnej rekonstrukcji obiektu z minimalnymi błędami16.
Rozdzielczość danej platformy zależy przede wszystkim od parametrów systemu, takich jak rozmiar wiązki promieniowania rentgenowskiego (rozmiar plamki), geometria skanera (odległość od obiektu do źródła promieniowania rentgenowskiego), rozmiar pikseli na detektorze oraz zastosowany algorytm rekonstrukcji. Dodatkowe czynniki, takie jak drgania skanera, fluktuacje wiązki promieniowania rentgenowskiego, ruch próbki oraz rodzaj materiału lub plama chemiczna użyta do wizualizacji obiektu, mogą również znacząco wpływać na rozdzielczość przestrzenną w warunkach obrazowania w świecie rzeczywistym15.
Dla zastosowań biomedycznych, CT i μ-CT odegrały kluczową rolę w pogłębieniu naszego zrozumienia anatomii, fizjologii, rozwoju i mechanizmów chorobowych, służąc zarówno jako narzędzie do diagnozowania pacjentów, jak i jako platforma obrazowania przedklinicznego dla organizmów modelowych17,18. Na przykład Mouse International Phenotyping Consortium, którego celem jest zidentyfikowanie funkcji każdego genu w genomie myszy, wykorzystuje μ-CT jako część swojego potoku fenotypowania19. Ich wyniki miały kluczowe znaczenie dla zrozumienia genów zaangażowanych w rozwój i procesy chorobowe, a jednocześnie służyły jako atlas anatomii i rozwoju myszy20. Inne organizmy modelowe, takie jak danio pręgowany i szczury, również w pełni przyjęły wykorzystanie μ-CT do przeprowadzania fenotypowania wielu mutantów genów u całych zwierząt17,21,22,23.
Zaletą połączenia obrazowania całych zwierząt z organizmami modelowymi jest to, że mechanistyczne zrozumienie funkcji genów dla danego procesu biologicznego może być w pełni zbadane. Jest to możliwe dzięki dobrze scharakteryzowanym genomom i wielu narzędziom genetycznym dostępnym w organizmach modelowych, które pozwalają na precyzyjną manipulację funkcją genów w różnych punktach czasowych rozwoju, określonych tkankach, pojedynczych komórkach, a nawet organellach subkomórkowych. Należą do nich systemy wyrażeń binarnych, takie jak system UAS/GAL4 (i jego wiele pochodnych), CRISPR/Cas9 i RNAi24,25,26. Kiedy te narzędzia genetyczne są używane w połączeniu z potężnym procesem obrazowania składającym się z mikroskopii elektronowej, mikroskopii świetlnej (fluorescencyjnej i niefluorescencyjnej) oraz obrazowania całych zwierząt, takich jak μ-CT, można uzyskać dokładną ocenę cząsteczek, komórek, tkanek, narządów i całego organizmu, co pozwala na znacznie głębsze zrozumienie funkcji genów.
Ten protokół skupia się na użyciu μ-CT w niessakowym organizmie modelowym Drosophila melanogaster, którego niezliczone narzędzia genetyczne pomogły wyjaśnić liczne mechanizmy molekularne26,27. Został zaadoptowany z poprzednich protokołów u owadów niebędących modelami1,28,29,30,31,32, i opiera się na poprzednich badaniach μ-CT na Drosophila, aby ustanowić ustandaryzowany protokół do jego stosowania u tego zwierzęcia33,34,35,36,37,38,39,40,41. Przedstawiono etapy skutecznego przygotowania próbki, obrazowania i analizy zestawów danych μ-CT przy użyciu dostępnych na rynku skanerów. Dzięki temu protokołowi wszystkie etapy rozwojowe muchy mogą być wizualizowane w wysokiej rozdzielczości zarówno dla badań opisowych, jak i testujących hipotezy, w tym taksonomii, anatomii, rozwoju, fizjologii i choroby27. Protokół ten będzie również przydatny do obrazowania praktycznie wszystkich owadów, a nawet materiałów nieożywionych, które wymagają barwienia chemicznego w celu kontrastu obrazu, aby poprawić wizualizację za pomocą μ-CT.

<table><tbody><tr><td>100% etanol</td><td></td><td></td><td>Do suszenia w punktach krytycznych</td></tr><tr><td>Rozwiązanie Bouina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT10132</td><td>Do fiksacji zwierząt</td></tr><tr><td>Suszarka</td><td></td><td></td> do punktów krytycznych <td>Suszenie próbek metodą punktu krytycznego; dostępnych jest wiele opcji (Balzers CPD 020 lub Leica EMCPD300)</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Dragonfly</td><td>Systemy</td><td></td> <td>do badań obiektowychDo wizualizacji i segmentacji zbiorów danych mikro-CT; </td></tr><tr><td>https://www.theobjects.com/dragonfly/index.html Blok</td><td></td><td></td> grzewczy <td>Do probówek mikrofuge</td></tr><tr><td>Stacja</td><td></td><td></td> robocza do analizy obrazu <td>Powinna zawierać wystarczającą ilość pamięci RAM i wysokiej jakości kartę graficzną do renderowania 3D</td></tr><tr><td>Roztwór jodu (I2KI)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SI86-1</td><td>Do barwienia</td></tr><tr><td>Skaner tomografii mikrokomputerowej</td><td>Bruker</td><td>Skyscan 1172</td><td>Geometria promieniowania rentgenowskiego w kształcie stożka; detektor to kamera Hamamatsu 10 MP z 11,54 &mikro; m rozmiar piksela.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do tomografii mikrokomputerowej</td><td>Bruker</td><td></td><td>Do sterowania samym skanerem (np. Wykonywanie poprawek płaskiego pola, mocy lampy rentgenowskiej, czasów wygaśnięcia kamery, akwizycji itp.)</td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-15</td><td>Do wybijania w naskórku</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do rekonstrukcji obrazu NRecon</td><td>Bruker</td><td></td><td>Służy do rekonstrukcji obrazów przekrojów poprzecznych z obrazów projekcyjnych 2D wykonanych za pomocą geometrii rentgenowskiej wiązki stożkowej</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet P10</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-120</td><td>Montaż próbki</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Resarch Products International</td><td>P32060-4000.0</td><td>Rozcieńczyć do 1X wodą przed użyciem</td></tr><tr><td>Hydrat kwasu fosfatungstycznego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79690-25g</td><td>Do barwienia</td></tr><tr><td>uchwytu na szpilki</td><td>Fine Science Tools</td><td>26018-17</td><td>Do szpilek Minutien</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Research Products International</td><td>111036</td><td>Do usuwania woskowego nalotu z dorosłych much (jako 0,5% PBST)</td></tr><tr><td>Mikroskop rentgenowski</td><td>Zeiss</td><td>Xradia 520 Geometria promieniowania</td><td>rentgenowskiego Versa Cone-beam z soczewkami obiektywowymi ze strefą Fresnela do Resoluton na odległość (RaaD&trade;)</td></tr></tbody></table>

obrazowanie całego zwierzęcia drosophila melanogaster za pomocą tomografii mikrokomputerowej

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Narzędzia do obrazowania biomedycznego pozwalają na badanie mechanizmów molekularnych w różnych skalach przestrzennych, od genów po organizmy. Drosophila melanogaster, dobrze scharakteryzowany organizm modelowy, skorzystał z zastosowania mikroskopii świetlnej i elektronowej w celu zrozumienia funkcji genów na poziomie komórek i tkanek. Zastosowanie platform obrazowania, które pozwalają na zrozumienie funkcji genów na poziomie całego nienaruszonego organizmu, jeszcze bardziej poszerzyłoby naszą wiedzę na temat mechanizmów genetycznych. Przedstawiono tutaj metodę obrazowania całego zwierzęcia, która przedstawia kroki potrzebne do wizualizacji Drosophila na dowolnym etapie rozwoju za pomocą tomografii mikrokomputerowej (μ-CT). Zalety μ-CT obejmują dostępne na rynku oprzyrządowanie i minimalny czas potrzebny na uzyskanie dokładnych informacji 3D w rozdzielczości na poziomie mikronów bez konieczności stosowania metod sekcji tkanek lub oczyszczania. W połączeniu z oprogramowaniem, które przyspiesza analizę obrazu i renderowanie 3D, można przeprowadzić szczegółową analizę morfometryczną dowolnej tkanki lub układu narządów, aby lepiej zrozumieć mechanizmy rozwoju, fizjologii i anatomii zarówno w badaniach opisowych, jak i testujących hipotezy. Wykorzystując proces obrazowania, który obejmuje wykorzystanie mikroskopii elektronowej, mikroskopii świetlnej i tomografii komputerowej μ, można przeprowadzić dokładną ocenę funkcji genów, zwiększając w ten sposób użyteczność tego potężnego organizmu modelowego.

Rycina 2 przedstawia obrazy zarodka, larw 3rd stadium, poczwarek w stadium pharate adult (P7) oraz dorosłej samicy muchy, barwionych jodem i obrazowanych w stanie uwodnienia w wodzie przy użyciu komercyjnego skanera nablatowego. Widoczna jest doskonała konserwacja i równomierne barwienie delikatnych tkanek, co pozwala na łatwą identyfikację wszystkich głównych organów i ich wykorzystanie do analizy morfometrycznej oraz wizualizacji 3D.
Zazwyczaj skany, podczas których pozyskiwanych jest mniej obrazów projekcyjnych preparatu, oferują niższą rozdzielczość niż skany z większą liczbą obrazów projekcyjnych, a kompromisem jest czas poświęcony na skanowanie. Chociaż czas skanowania różni się w zależności od instrumentu i innych parametrów, skany pozyskujące kilkaset projekcji (rozmiar piksela obrazu ~3 µm) trwają około 30 min na preparat, podczas gdy skany składające się z tysięcy obrazów projekcyjnych (rozmiar piksela obrazu 700 nm-1,25 µm) mogą trwać od 8 do 16 h. Porównanie tej samej głowy dorosłej muchy wykonane zarówno w trybie skanowania „wolnym” (tysiące projekcji), jak i „szybkim” (setki projekcji) przedstawiono na Rysunku 3. Co ważne, analizy morfometryczne nie wykazują różnic pomiędzy skanami „wolnymi” a „szybkimi” (Rysunek 3C)40. Nasz proces obrazowania wykorzystuje zatem szybkie skany do wygenerowania wystarczająco dużej próby do analizy morfometrycznej oraz wolne skany do wizualizacji wszelkich wad morfologicznych lub anatomicznych w wyższej rozdzielczości. Przy użyciu oprogramowania (Krok 7) dowolna interesująca tkanka lub układ organów może zostać wysegmentowana i wykorzystana do analizy morfometrycznej oraz zwizualizowana w 3D za pomocą narzędzia do tworzenia filmów (Film 1).
Rysunek 4 przedstawia przykład odwłoka muchy barwionego PTA i obrazowanego w stanie uwodnionym (woda) lub po suszeniu w punkcie krytycznym (CPD) przy użyciu mikroskopu rentgenowskiego (Tabela materiałów). Szczegółowość uzyskana dzięki połączeniu PTA i możliwości tej platformy jest wyraźnie widoczna na obrazach, dzięki czemu łatwo można rozróżnić poszczególne komórki nabłonka jelita środkowego oraz pęczki plemników w jądrach. Choć obraz po CPD wykazuje nieznacznie wyższą rozdzielczość w porównaniu z próbką uwodnioną, lepszą konserwację ultrastruktury delikatnych tkanek (takich jak komórki tłuszczowe w pobliżu kutykuli) uzyskuje się w przypadku próbek uwodnionych (Film 2).
<img alt="Układ mikroskopii rentgenowskiej z końcówką pipety do obrazowania muszki owocówki w wodzie, schemat procesu eksperymentalnego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przegląd konstrukcji skanera i montażu próbki do µ-CT.(A) Komercyjny laboratoryjny skaner µ-CT. (B) Widok wnętrza skanera. Źródło promieniowania rentgenowskiego (po prawej) emituje promienie X, które przechodzą przez próbkę umieszczoną na obrotowym stole (żółta strzałka). Tłumienie tych promieni generuje kontrast obrazu podczas przechodzenia przez próbkę do detektora, który składa się z ekranu scyntylacyjnego przekształcającego promienie X w fotony oraz standardowej kamery CCD (po lewej). (C) Montaż dorosłej muszki owocówki do obrazowania w stanie uwodnionym w wodzie. Punkty połączenia między końcówką pipety a mosiężnym uchwytem są owinięte folią parafinową, aby zapobiec wyciekom i potencjalnemu uszkodzeniu skanera. Wyróżniono również uchwyt stołu. Należy zauważyć, że końcówka pipety została ustawiona nieco poza osią, co doprowadziło do wydłużenia czasu skanowania i zmniejszenia rozdzielczości w końcowej rekonstrukcji. (D) Pojedynczy dwuwymiarowy obraz projekcyjny dorosłej samicy muszki; podczas skanowania wzdłuż osi obrotu pozyskuje się od setek do tysięcy takich projekcji, które są wykorzystywane do rekonstrukcji w celu wygenerowania tomogramów o izotropowej rozdzielczości i dokładnych informacjach 3D. Paski skali (C) = 2 mm. P, posterior (tylny); V, ventral (brzuszny). Rysunek zmodyfikowany na podstawie pracy Schoborg et al.40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="MRI rozwoju zarodka; schemat przekroju anatomicznego, ilustrujący organy i układ nerwowy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Wszystkie stadia cyklu życiowego Drosophila melanogaster, obrazowane za pomocą µ-CT. Próbki barwione jodem i obrazowane w stanie nawodnienia w wodzie. Przedstawiono pojedynczy przekrój 2D. (A) Zarodek, który zakończył wczesne stadia gastrulacji (gwiazdka). (B) Larwa trzeciego stadium. (C) P7 imago w stadium poczwarki podczas metamorfozy. (D) Dorosła samica. Wyróżniono różne organy: BWM, mięśnie ściany ciała; Br, mózg; Cd, cardia; Cr, wole; DLMs, grzbietowe mięśnie podłużne; DVM, mięśnie grzbietowo-brzuszne; E-AD, dysk oko-czułkowy; Em, zarodek; FB, ciała tłuszczowe; FBCs, komórki ciała tłuszczowego; H, serce; Hg, jelito tylne; La, lamina; L, odnóże; Mg, jelito środkowe; OL, płat optyczny mózgu; Ov, wywijak; PC, kutykula poczwarki; SG, gruczoły ślinowe; VNC, brzuszny sznur nerwowy; W, skrzydło; WD, dysk skrzydłowy. Paski skali (A) = 100 µm; (B)-(D) = 500 µm. D, grzbietowo (Dorsal); A, przednio (Anterior); L, lewo (Left). Parametry skanowania: Odległość źródła od próbki (mm): (A, D) 36.5, (B) 48.8, (C) 40.3. Odległość źródła od kamery (mm): (A, D) 350, (B, C) 285. Rozmiar piksela kamery (µm): (A-D) 11.6. Rozmiar piksela obrazu (µm): (A, D) 1.2, (B) 1.9, (C) 1.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Porównanie skanów mózgu; metody szybkie i wolne; obrazy MRI; analiza wykresu objętości; wyniki badań." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Parametry skanowania i rozdzielczość obrazu nie zmieniają wyników analiz morfometrycznych.Głowa dorosłego osobnika przeskanowana przy użyciu zarówno (A, A’) „szybkich” ustawień skanera (setki projekcji), jak i (B, B’) „wolnych” ustawień skanera (tysiące projekcji). Mózg jest obrysowany na żółto. (C) Pomiary objętości mózgu z wolnych i szybkich skanów. Wyróżnione struktury: AL, płat antenny; CB, centralna część mózgu; FB, ciało wachlarzowate; FCs, komórki tłuszczowe; La, lamina; Lo, lobula; LoP, płyta lobuli; Me, medulla; Re, siatkówka. n = 5, test t Welcha. ns = brak istotności statystycznej. Paski skali = 100 µm. Parametry skanowania: Odległość źródła od próbki (mm): (A) 44.4, (B) 36.5. Odległość źródła od kamery (mm): (A) 348 (B) 350. Rozmiar piksela kamery (µm): (A-B) 11.6. Rozmiar piksela obrazu (µm): (A) 2.95, (B) 1.2. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Schoborg et al.40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza histologiczna, przekroje narządów, porównawczy kontrast tkanek, próbki CPD w porównaniu z próbkami traktowanymi wodą." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Odbrzuch Drosophila melanogaster obrazowany za pomocą mikroskopii rentgenowskiej. Odbrzuchy barwiono 0,5% PTA i obrazowano w stanie uwodnionym (woda) lub po suszeniu w punkcie krytycznym (CPD). (A) Odbrzuch suszony w punkcie krytycznym, przedstawiony w rzucie YZ oraz (A’) w rzucie XZ. (B) Odbrzuch uwodniony, przedstawiony w rzucie YZ oraz (B’) w rzucie XZ. Wyróżniono różne narządy: FC, komórki tłuszczowe; Hg, jelito tylne; Mg, jelito środkowe; SP, pompa plemników; Te, jądra. Pasek skali (A) = 250 µm. D, grzbietowo; A, przednio; L, lewo. Parametry skanowania: odległość od źródła do próbki (mm): (A) 6,7, (B) 7. Odległość od źródła do kamery (mm): (A) 28 (B) 29,5. Obiektyw: (A-B) 4X. Rozmiar piksela obrazu (µm): (A-B) 0,65. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Film 1: Larva trzeciego stadium, przedstawiona w 3D przy użyciu narzędzia Movie Maker w programie Dragonfly. Wyróżnione organy obejmują mózg (żółty), dyski imaginalne oka i czułka (czerwone), ciało tłuszczowe (niebieskie) oraz mięśnie ściany ciała (zielone). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61515/Movie_1_Revised.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
Film 2: Porównanie próbek obrazowanych w wodzie lub po suszeniu w punkcie krytycznym. Przedstawiono odwłoki barwione 0,5% PTA. Oba odwłoki zostały przeskanowane przy identycznych ustawieniach rozmiaru piksela obrazu (0,65 µm). Seria przekrojów 2D jest pokazana w formacie „Z-stack” (YZ), zaczynając od powierzchni grzbietowej, a kończąc na powierzchni brzusznej odwłoka. Wyróżnione organy: FC, komórki tłuszczowe; Mg, jelito środkowe; SP, pompa nasienna; Te, jądra. Parametry skanowania: Odległość źródła od próbki (mm): (A) 6,7, (B) 7. Odległość źródła od kamery (mm): (A) 28 (B) 29,5. Obiektyw: (A-B) 4X. Rozmiar piksela obrazu (µm): (A-B) 0,65. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61515/Movie_2_Revised.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>

Przedstawiono protokół, który pozwala na wizualizację nienaruszonego Drosophila melanogaster na dowolnym etapie rozwoju za pomocą tomografii mikrokomputerowej.

Obrazowanie całego zwierzęcia Drosophila melanogaster za pomocą tomografii mikrokomputerowej

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

Protokół ten pozwala na nieniszczące obrazowanie w nienaruszonej lub miękkiej rozdzielczości mikronów laboratoryjnych. Może być wykorzystany do zrozumienia mechanizmów fizjologii, anatomii i rozwoju zwierząt. Ponieważ muchy są obrazowane w stanie nienaruszonym bez konieczności sekcji tkanek, architektura przestrzenna tkanek i narządów jest utrzymywana w ich naturalnym stanie i jest łatwa do zaobserwowania.Mikrotomografia komputerowa jest idealnym narzędziem do badań mających na celu modelowanie chorób człowieka u muszek lub do zrozumienia wad rozwojowych, które wpływają na jakość życia. Okazał się również przydatny w innych dyscyplinach, takich jak inżynieria, fizyka, materiałoznawstwo, geologia i antropologia. Po wybraniu interesującego punktu czasowego rozwoju do obrazowania, przenieś 5 do 20 zwierząt do jednego mililitra PBST w 1,5 mililitrowej probówce mikrowirówki i inkubuj probówkę przez pięć minut w temperaturze pokojowej z okresowym stukaniem, aby pomóc w usunięciu powłoki hydrofobowej i umożliwić zwierzętom całkowite zanurzenie.Pod koniec inkubacji zastąp PBST jednym mililitrem roztworu Bouina i postukaj w probówkę, aby całkowicie zanurzyć muchy. W przypadku próbek larw i poczwarek, po dwugodzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej, umyć zwierzęta trzy razy przez pięć minut i jeden mililitr świeżego PBS na mycie. Po ostatnim płukaniu przenieść próbki do wielodołkowego naczynia preparacyjnego zawierającego świeży PBS na studzienkę pod mikroskopem preparacyjnym i użyć małej szpilki przymocowanej do uchwytu, aby zrobić otwór w przedniej i tylnej naskórku każdej próbki, uważając, aby nie naruszyć leżącej pod spodem tkanki miękkiej.Po wniknięciu w skórki inkubować próbki w jednym mililitrze świeżego roztworu Bouina w nowej 1,5-mililitrowej probówce przez 24 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie umyć próbkę trzykrotnie przez 30 minut i jeden mililitr jednego buforu do płukania mikro CT na pranie. Po ostatnim płukaniu dodaj jeden mililitr odpowiedniego roztworu barwiącego do probówki i inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez dwa do siedmiu dni. Jeśli konieczne jest dłuższe zachowanie obrazu, należy odwodnić próbki w rosnących seriach etanolu w jednym mililitrze etanolu przez jedną godzinę na stężenie zgodnie ze wskazaniami, aby przygotować próbki do suszenia w punkcie krytycznym.Aby zamontować wysuszone próbki w punkcie krytycznym, umieść je w plastikowych lub szklanych rurkach kapilarnych przed zamontowaniem probówek na obrotowym uchwycie stolika. W celu zamontowania próbki z uwodnionym napełnij końcówkę pipety P10 wodą i zabezpiecz wąską końcówkę folią parafinową. Użyj kleszczyków, aby przenieść pojedynczą próbkę na końcówkę pipety i użyj długiego, smukłego przedmiotu, aby ostrożnie wepchnąć próbkę w dół, aż dotknie ścianki końcówki, aby utrzymać próbkę na miejscu.Po zakryciu otwartego końca pipety zamontuj pipetę P10 na uchwycie zaprojektowanym tak, aby pasowała do klina obracającego się stolika. Aby zeskanować, kliknij ikonę otwartych drzwi w oprogramowaniu skanera, aby uzyskać dostęp do obrotowego klina stolika i dokręć kołnierz wokół podstawy uchwytu próbki, aby przymocować próbkę. Ustaw parametry skanowania w oprogramowaniu w celu uzyskania optymalnej rozdzielczości i kontrastu, a następnie kliknij Opcje i źródło promieniowania rentgenowskiego, aby otworzyć sterowanie mocą źródła promieniowania rentgenowskiego.Użyj suwaków, aby ustawić napięcie promieniowania rentgenowskiego na 30 do 40 kilowoltów, a prąd na 100 do 110 mikroamperów, aby wytworzyć wiązkę promieniowania rentgenowskiego o mocy od trzech do czterech watów i małym rozmiarze plamki. Aby ustawić liczbę obrazów projekcyjnych, które mają zostać zarejestrowane podczas skanowania, wybierz Opcje i Tryby akwizycji, aby ustawić czas ekspozycji aparatu na 500 do 800 milisekund i użyj suwaka, aby ustawić żądany rozmiar piksela obrazu zgodnie z ustawieniami i pozycją aparatu. Kliknij i przeciągnij suwak, aby przesunąć próbkę wzdłuż jej ścieżki obrotu o 360 stopni, utrzymując próbkę w polu widzenia.Kliknij ikonę rozpoczęcia pobierania. Pojawi się okno dialogowe umożliwiające ustawienie dodatkowych parametrów skanowania. Nazwij plik i folder wyjściowy, w którym zostanie zapisany skan.Ustaw losowy ruch na 10, a średnią na cztery do sześciu klatek. Krok obrotu zostanie automatycznie obliczony w zależności od użytych ustawień kamery, a następnie kliknij przycisk OK, aby rozpocząć akwizycję. Pojawi się okno dialogowe paska postępu pokazujące czas skanowania, a skaner zacznie pobierać serię obrazów projekcyjnych próbki wzdłuż ścieżki obrotu.Aby wygenerować tomogramy, otwórz obrazy projekcyjne w oprogramowaniu do rekonstrukcji i wybierz algorytm korekcji przesunięcia, aby wykonać wstępne wyrównanie obrazu. Wybierz najlepszą wartość, która prawidłowo wyrównuje obrazy projekcji, a następnie kliknij przycisk Dostrajanie, aby dostosować każdy parametr rekonstrukcji. Zostanie wygenerowana seria podglądów, których można użyć do wybrania prawidłowych wartości.Upewnij się, że optymalne wartości parametrów są wyświetlane na karcie Ustawienia, a na karcie Wyjście dostosuj parametry pliku, takie jak głębia bitowa, nazwa pliku i folder, w którym zostaną zapisane dane. Obszar zainteresowania może być używany do rekonstrukcji tylko tych struktur, które są przedmiotem zainteresowania. Jeśli wymagane jest wykonanie wielu rekonstrukcji, kliknij przycisk Start i Dodaj do partii, aby dodać bieżący obraz do menedżera wsadów i powtórzyć rekonstrukcję dla pozostałych obrazów.W celu analizy morfometrycznej zrekonstruowanych obrazów, na karcie Segment, w odpowiednim oprogramowaniu do analizy morfometrycznej kliknij Podstawowe i Nowy, nadaj obrazowi nową nazwę i wybierz odpowiedni kolor. Zaznacz pole Zdefiniuj zakres i dostosuj suwak, aby dostosować zakres progowy obejmujący strukturę zainteresowania. Aby namalować obszar zdefiniowany przez próg, naciśnij i przytrzymaj Control, przytrzymując jednocześnie lewy myszy.Aby usunąć obszar, naciśnij i przytrzymaj Shift, przytrzymując jednocześnie lewy myszy. Upewnij się, że pomiary obszaru siatki będącego przedmiotem zainteresowania są wyświetlane w panelu informacyjnym dla podstawowej analizy morfometrycznej. Renderuj obiekt siatki i cały obraz tomogramu, a następnie zwizualizuj wynikowy obraz w 3D, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać opcję Pokaż program Movie Maker, aby wygenerować wideo obiektu przy użyciu poszczególnych klatek z przeglądarki.Na tych zdjęciach można zaobserwować zarodek, larwę trzeciego stadium rozwojowego, poczwarkę w stadium dorosłego dziecka oraz dorosłą samicę muchy zabarwioną jodem i zobrazowaną w wodzie za pomocą komercyjnego skanera stołowego. Widoczne jest doskonałe zachowanie i równomierne zabarwienie delikatnej tkanki, co pozwala na łatwą identyfikację wszystkich głównych narządów. Tutaj pokazano porównanie tej samej dorosłej głowy muchy, uzyskanej zarówno w trybie skanowania wolnej, jak i szybkiej projekcji.Co ważne, mimo że rozdzielczość w wolnych obrazach jest wyższa, analiza morfometryczna nie różni się między wolnymi i szybkimi skanami. Korzystając z oprogramowania do renderowania, każdy interesujący nas układ tkankowy lub narządowy można podzielić na segmenty i wykorzystać do analizy morfometrycznej i wizualizacji 3D. Na tych obrazach można zaobserwować odwłok muchy zabarwiony kwasem fosfowolframowym i zobrazowany podczas nawodnienia wodą lub po wyschnięciu w punkcie krytycznym pod mikroskopem rentgenowskim.Za pomocą kwasu fosfowolframowego można łatwo rozdzielić poszczególne komórki nabłonkowe jelita środkowego i wiązki plemników w jądrach. Podczas gdy obrazy suszenia w punkcie krytycznym wykazują nieznacznie zwiększoną rozdzielczość w porównaniu z próbką uwodnioną, lepsze zachowanie ultrastruktury delikatnych tkanek uzyskuje się w przypadku próbek uwodnionych, takich jak komórki tłuszczowe w pobliżu naskórka. Aby uzyskać najlepszą rozdzielczość, ogranicz ruch próbki i nadmierne wibracje.Zabezpieczenie próbki do etapu ma w tym celu kluczowe znaczenie, chociaż w tym celu może być wymagana kreatywność i zaradność. Dodatkowe metody obrazowania, takie jak mikroskopia świetlna i elektronowa, mogą być stosowane jako część procesu obrazowania w celu zrozumienia danej mutacji genu w skali nano dla całego organizmu.

whole-animal-imaging-drosophila-melanogaster-using-microcomputed

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Mezoskopowa tomografia fluorescencyjna działa poza limitami penetracji charakterystycznymi dla fluorescencyjnej mikroskopii sekcji tkanek. Technika ta opiera się na oświetleniu wieloprojekcyjnym oraz opisie transportu fotonów. Demonstrujemy wizualizację 3D całego organizmu in-vivo podczas morfogenezy wyobraźników skrzydeł wykazujących ekspresję GFP u Drosophila melanogaster.

Mezoskopowa tomografia fluorescencyjna do obrazowania in-vivo rozwijających się Drosophila

Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster

Niniejszy protokół opisuje niezawodną metodę znieczulania i obrazowania nienaruszonych larw Drosophila melanogaster. Wykorzystaliśmy lotny anestetyk desfluran, aby umożliwić powtarzalne obrazowanie z rozdzielczością podkomórkową oraz ponowną identyfikację struktur przez okres do kilku dni1.

Obrazowanie in vivo nienaruszonych larw Drosophila z rozdzielczością podkomórkową

Obrazowanie naczyń krwionośnych małych zwierząt z kontrastem za pomocą mikrotomografii komputerowej (microCT) jest szybką, kosztowo efektywną i wysokoprzepustową techniką do seryjnych badań in situ rozwoju guzów, analizy sieci naczyń krwionośnych je odżywiających oraz monitorowania odpowiedzi guzów na przedkliniczne interwencje terapeutyczne.

Obrazowanie naczyń z kontrastem przy użyciu mikrotomografii komputerowej (MicroCT)

Ten artykuł demonstruje użycie szybkiego skaningowego mikroskopu konfokalnego do obrazowania zachowania komórek bezpośrednio przez poczwarkę. Pozostawiając nienaruszoną obudowę poczwarki, metoda ta umożliwia obserwację i pomiar dynamicznych procesów komórkowych na etapie rozwoju Drosophila, który jest trudny do bezpośredniego zbadania.

Obrazowanie przez poczwarkę Drosophila melanogaster

W tym protokole demonstrujemy zastosowanie tomografii elektronowej o przekroju szeregowym do wyjaśnienia struktury mitochondrialnej w mięśniu lotu pośredniego Drosophila.

Ultrastruktura mitochondrialna 3D mięśnia lotu pośredniego Drosophila ujawniona przez tomografię elektronową o przekroju szeregowym

Tutaj ilustrujemy, jak można przeprowadzić mikroskopię lokalizacyjną aktywowaną fotocząsteczką pojedynczej cząsteczki na zakończeniu nerwu ruchowego żywej larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym.

In vivo (in vivo) Śledzenie pojedynczych cząsteczek na presynaptycznym zakończeniu nerwu ruchowego Drosophila

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji i jednoczesnego obrazowania wielu zarodków Drosophila podczas rozwoju embrionalnego za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości na płytce.

Przygotowanie zarodków Drosophila i mikroiniekcja do mikroskopii żywych komórek wykonana przy użyciu automatycznego analizatora o wysokiej zawartości

Opisujemy przygotowanie wstęg odcinków szeregowych i ich zbieranie na dużym nośniku transferu do użycia jako próbki tomografii matrycowej, wraz z automatycznymi procedurami obrazowania w skaningowym mikroskopie elektronowym. Protokół umożliwia badania przesiewowe, wyszukiwanie i ukierunkowane obrazowanie miejscowych, rzadkich zdarzeń oraz pozyskiwanie dużych ilości danych.

Tomografia matrycowa do ukierunkowanego pozyskiwania informacji objętościowych za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

Prezentujemy metodę specjalnie dostosowaną do obrazowania całego mózgu dorosłego Drosophila podczas zachowania i w odpowiedzi na bodźce. Głowa jest ustawiona tak, aby umożliwić optyczny dostęp do całego mózgu, podczas gdy mucha może poruszać nogami i czułkami, czubkiem trąbki, a oczy mogą odbierać bodźce czuciowe.

Przygotowanie dorosłego osobnika Drosophila melanogaster do obrazowania całego mózgu podczas reakcji na zachowanie i bodźce

Tutaj przedstawiono protokół implementacji mikroskopii ekspansywnej we wczesnych zarodkach Drosophila w celu uzyskania obrazowania w superrozdzielczości przy użyciu konwencjonalnego laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego.

Wykorzystanie mikroskopii ekspansywnej do fizycznego powiększenia całych zarodków Drosophila w celu obrazowania w superrozdzielczości

Poznaj tomografię mikrokomputerową do obrazowania całych muszek owocówek Drosophila melanogaster. Ta nieniszcząca metoda zachowuje architekturę tkanek i pozwala badać fizjologię oraz rozwój zwierząt.

Obrazowanie całego zwierzęcia Drosophila melanogaster za pomocą tomografii mikrokomputerowej

Przeglądaj więcej filmów