Obrazowanie całego zwierzęcia Drosophila melanogaster za pomocą tomografii mikrokomputerowej

Protokół ten pozwala na nieniszczące obrazowanie w nienaruszonej lub miękkiej rozdzielczości mikronów laboratoryjnych. Może być wykorzystany do zrozumienia mechanizmów fizjologii, anatomii i rozwoju zwierząt. Ponieważ muchy są obrazowane w stanie nienaruszonym bez konieczności sekcji tkanek, architektura przestrzenna tkanek i narządów jest utrzymywana w ich naturalnym stanie i jest łatwa do zaobserwowania.

Mikrotomografia komputerowa jest idealnym narzędziem do badań mających na celu modelowanie chorób człowieka u muszek lub do zrozumienia wad rozwojowych, które wpływają na jakość życia. Okazał się również przydatny w innych dyscyplinach, takich jak inżynieria, fizyka, materiałoznawstwo, geologia i antropologia. Po wybraniu interesującego punktu czasowego rozwoju do obrazowania, przenieś 5 do 20 zwierząt do jednego mililitra PBST w 1,5 mililitrowej probówce mikrowirówki i inkubuj probówkę przez pięć minut w temperaturze pokojowej z okresowym stukaniem, aby pomóc w usunięciu powłoki hydrofobowej i umożliwić zwierzętom całkowite zanurzenie.

Pod koniec inkubacji zastąp PBST jednym mililitrem roztworu Bouina i postukaj w probówkę, aby całkowicie zanurzyć muchy. W przypadku próbek larw i poczwarek, po dwugodzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej, umyć zwierzęta trzy razy przez pięć minut i jeden mililitr świeżego PBS na mycie. Po ostatnim płukaniu przenieść próbki do wielodołkowego naczynia preparacyjnego zawierającego świeży PBS na studzienkę pod mikroskopem preparacyjnym i użyć małej szpilki przymocowanej do uchwytu, aby zrobić otwór w przedniej i tylnej naskórku każdej próbki, uważając, aby nie naruszyć leżącej pod spodem tkanki miękkiej.

Po wniknięciu w skórki inkubować próbki w jednym mililitrze świeżego roztworu Bouina w nowej 1,5-mililitrowej probówce przez 24 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie umyć próbkę trzykrotnie przez 30 minut i jeden mililitr jednego buforu do płukania mikro CT na pranie. Po ostatnim płukaniu dodaj jeden mililitr odpowiedniego roztworu barwiącego do probówki i inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez dwa do siedmiu dni. Jeśli konieczne jest dłuższe zachowanie obrazu, należy odwodnić próbki w rosnących seriach etanolu w jednym mililitrze etanolu przez jedną godzinę na stężenie zgodnie ze wskazaniami, aby przygotować próbki do suszenia w punkcie krytycznym.

Aby zamontować wysuszone próbki w punkcie krytycznym, umieść je w plastikowych lub szklanych rurkach kapilarnych przed zamontowaniem probówek na obrotowym uchwycie stolika. W celu zamontowania próbki z uwodnionym napełnij końcówkę pipety P10 wodą i zabezpiecz wąską końcówkę folią parafinową. Użyj kleszczyków, aby przenieść pojedynczą próbkę na końcówkę pipety i użyj długiego, smukłego przedmiotu, aby ostrożnie wepchnąć próbkę w dół, aż dotknie ścianki końcówki, aby utrzymać próbkę na miejscu.

Po zakryciu otwartego końca pipety zamontuj pipetę P10 na uchwycie zaprojektowanym tak, aby pasowała do klina obracającego się stolika. Aby zeskanować, kliknij ikonę otwartych drzwi w oprogramowaniu skanera, aby uzyskać dostęp do obrotowego klina stolika i dokręć kołnierz wokół podstawy uchwytu próbki, aby przymocować próbkę. Ustaw parametry skanowania w oprogramowaniu w celu uzyskania optymalnej rozdzielczości i kontrastu, a następnie kliknij Opcje i źródło promieniowania rentgenowskiego, aby otworzyć sterowanie mocą źródła promieniowania rentgenowskiego.

Użyj suwaków, aby ustawić napięcie promieniowania rentgenowskiego na 30 do 40 kilowoltów, a prąd na 100 do 110 mikroamperów, aby wytworzyć wiązkę promieniowania rentgenowskiego o mocy od trzech do czterech watów i małym rozmiarze plamki. Aby ustawić liczbę obrazów projekcyjnych, które mają zostać zarejestrowane podczas skanowania, wybierz Opcje i Tryby akwizycji, aby ustawić czas ekspozycji aparatu na 500 do 800 milisekund i użyj suwaka, aby ustawić żądany rozmiar piksela obrazu zgodnie z ustawieniami i pozycją aparatu. Kliknij i przeciągnij suwak, aby przesunąć próbkę wzdłuż jej ścieżki obrotu o 360 stopni, utrzymując próbkę w polu widzenia.

Kliknij ikonę rozpoczęcia pobierania. Pojawi się okno dialogowe umożliwiające ustawienie dodatkowych parametrów skanowania. Nazwij plik i folder wyjściowy, w którym zostanie zapisany skan

Ustaw losowy ruch na 10, a średnią na cztery do sześciu klatek. Krok obrotu zostanie automatycznie obliczony w zależności od użytych ustawień kamery, a następnie kliknij przycisk OK, aby rozpocząć akwizycję. Pojawi się okno dialogowe paska postępu pokazujące czas skanowania, a skaner zacznie pobierać serię obrazów projekcyjnych próbki wzdłuż ścieżki obrotu.

Aby wygenerować tomogramy, otwórz obrazy projekcyjne w oprogramowaniu do rekonstrukcji i wybierz algorytm korekcji przesunięcia, aby wykonać wstępne wyrównanie obrazu. Wybierz najlepszą wartość, która prawidłowo wyrównuje obrazy projekcji, a następnie kliknij przycisk Dostrajanie, aby dostosować każdy parametr rekonstrukcji. Zostanie wygenerowana seria podglądów, których można użyć do wybrania prawidłowych wartości.

Upewnij się, że optymalne wartości parametrów są wyświetlane na karcie Ustawienia, a na karcie Wyjście dostosuj parametry pliku, takie jak głębia bitowa, nazwa pliku i folder, w którym zostaną zapisane dane. Obszar zainteresowania może być używany do rekonstrukcji tylko tych struktur, które są przedmiotem zainteresowania. Jeśli wymagane jest wykonanie wielu rekonstrukcji, kliknij przycisk Start i Dodaj do partii, aby dodać bieżący obraz do menedżera wsadów i powtórzyć rekonstrukcję dla pozostałych obrazów.

W celu analizy morfometrycznej zrekonstruowanych obrazów, na karcie Segment, w odpowiednim oprogramowaniu do analizy morfometrycznej kliknij Podstawowe i Nowy, nadaj obrazowi nową nazwę i wybierz odpowiedni kolor. Zaznacz pole Zdefiniuj zakres i dostosuj suwak, aby dostosować zakres progowy obejmujący strukturę zainteresowania. Aby namalować obszar zdefiniowany przez próg, naciśnij i przytrzymaj Control, przytrzymując jednocześnie lewy myszy.

Aby usunąć obszar, naciśnij i przytrzymaj Shift, przytrzymując jednocześnie lewy myszy. Upewnij się, że pomiary obszaru siatki będącego przedmiotem zainteresowania są wyświetlane w panelu informacyjnym dla podstawowej analizy morfometrycznej. Renderuj obiekt siatki i cały obraz tomogramu, a następnie zwizualizuj wynikowy obraz w 3D, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać opcję Pokaż program Movie Maker, aby wygenerować wideo obiektu przy użyciu poszczególnych klatek z przeglądarki.

Na tych zdjęciach można zaobserwować zarodek, larwę trzeciego stadium rozwojowego, poczwarkę w stadium dorosłego dziecka oraz dorosłą samicę muchy zabarwioną jodem i zobrazowaną w wodzie za pomocą komercyjnego skanera stołowego. Widoczne jest doskonałe zachowanie i równomierne zabarwienie delikatnej tkanki, co pozwala na łatwą identyfikację wszystkich głównych narządów. Tutaj pokazano porównanie tej samej dorosłej głowy muchy, uzyskanej zarówno w trybie skanowania wolnej, jak i szybkiej projekcji.

Co ważne, mimo że rozdzielczość w wolnych obrazach jest wyższa, analiza morfometryczna nie różni się między wolnymi i szybkimi skanami. Korzystając z oprogramowania do renderowania, każdy interesujący nas układ tkankowy lub narządowy można podzielić na segmenty i wykorzystać do analizy morfometrycznej i wizualizacji 3D. Na tych obrazach można zaobserwować odwłok muchy zabarwiony kwasem fosfowolframowym i zobrazowany podczas nawodnienia wodą lub po wyschnięciu w punkcie krytycznym pod mikroskopem rentgenowskim.

Za pomocą kwasu fosfowolframowego można łatwo rozdzielić poszczególne komórki nabłonkowe jelita środkowego i wiązki plemników w jądrach. Podczas gdy obrazy suszenia w punkcie krytycznym wykazują nieznacznie zwiększoną rozdzielczość w porównaniu z próbką uwodnioną, lepsze zachowanie ultrastruktury delikatnych tkanek uzyskuje się w przypadku próbek uwodnionych, takich jak komórki tłuszczowe w pobliżu naskórka. Aby uzyskać najlepszą rozdzielczość, ogranicz ruch próbki i nadmierne wibracje.

Zabezpieczenie próbki do etapu ma w tym celu kluczowe znaczenie, chociaż w tym celu może być wymagana kreatywność i zaradność. Dodatkowe metody obrazowania, takie jak mikroskopia świetlna i elektronowa, mogą być stosowane jako część procesu obrazowania w celu zrozumienia danej mutacji genu w skali nano dla całego organizmu.