Name: Sekwencjonowanie RNA z mikrodysekcją laserową do przestrzennej i czasowej analizy ekspresji genów specyficznych dla tkanek u roślin (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Poznaj metodę sekwencjonowania RNA z mikrodysekcją laserową do analizy przestrzennej i czasowej ekspresji genów w roślinach. Technika ta umożliwia precyzyjną izolację komórek z tkanek jęczmienia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Centrum Doskonałości w Biologii Energii Roślin (CE140100008) przez Australijską Radę ds. Badań Naukowych () dla JW. M.G.L otrzymał wsparcie od La Trobe University Starting Grant. Dziękujemy La Trobe Genomics Platform za wsparcie w zakresie wysokoprzepustowego sekwencjonowania i analizy danych. Dziękujemy profesorowi nadzwyczajnemu Matthew Tuckerowi za fachowe porady dotyczące ustanowienia LCM w naszym laboratorium.

Ponieważ produktem końcowym jest RNA, uważaj, aby nie zanieczyścić pracy RNazami. Noszenie rękawiczek jest koniecznością. Używaj wody uzdatnionej pirowęglanem dietylu (DEPC), itp. Autoklaw buforuje i piecz szklane naczynia przed użyciem.
1. Utrwalenie tkanek
<ol>
	<li>Przygotuj utrwalacz według wyboru w zależności od gatunku i rodzaju tkanki; w przypadku nasion jęczmienia użyj utrwalacza Farmera (75% etanol, 25% lodowaty kwas octowy (v/v)).</li>
	<li>Schłodzić utrwalacz na lodzie przed pobraniem tkanek.</li>
	<li>Zbierz interesujący Cię materiał roślinny i, jeśli to konieczne, pokrój go na kawałki o odpowiedniej wielkości, aby zmieściły się w wybranej formie do zatapiania. W przypadku nasion jęczmienia należy przeciąć nasiona na pół wzdłużnie, aby ułatwić penetrację roztworu utrwalającego i dopasować się do formy do zatapiania.</li>
	<li>Zanurz tkankę w co najmniej 10-krotnie większej objętości lodowatego utrwalacza. W przypadku nasion jęczmienia zanurz nasiona pokrojone na pół w utrwalaczu.</li>
	<li>Użyj infiltracji próżniowej, aby przyspieszyć penetrację utrwalacza. Tkanki powinny opaść po infiltracji próżniowej utrwalacza. W przypadku nasion jęczmienia należy zastosować 30-minutową infiltrację próżniową.</li>
	<li>Wymienić utrwalacz i inkubować w temperaturze 4 °C, aby utrwalacz mógł w pełni wniknąć w tkankę. W przypadku nasion jęczmienia próbki inkubować przez noc (~12-16 h). 
	UWAGA: Cieńsze lub małe tkanki będą wymagały krótszego czasu utrwalania ze względu na większą szybkość dyfuzji utrwalacza w tkance.</li>
	<li>Usuń tkankę z utrwalacza i przenieś tkankę do kaset, a następnie rozpocznij przetwarzanie tkanki. 
	UWAGA: Małe lub delikatne tkanki, takie jak tkanka liścia, można umieścić w kasetach w celu zamocowania, aby upewnić się, że nie zostanie uszkodzona podczas mocowania. Worki biopsyjne, podkładki lub owijki mogą być używane do bezpiecznego utrzymywania tkanki wewnątrz kaset podczas etapów utrwalania tkanek i przetwarzania tkanek.</li>
</ol>
2. Przetwarzanie tkanek
<ol>
	<li>W kroku 2 należy użyć automatycznego procesora tkanek z co najmniej 10 komorami roztworu i 2 podgrzewanymi komorami parafinowymi (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Sprawdzić, czy w każdej komorze znajduje się odpowiednia ilość roztworu; wymieniać roztwory po każdych kilku użyciach procesora tkankowego.</li>
	<li>Umieść kasety z chusteczką w metalowym koszu. Przymocuj metalowy kosz do uchwytu nad komorą 1. Uchwyt obróci się i "zanurzy i zanurzy" kasety w komorach, zgodnie z wyznaczonym programem.</li>
	<li>Ustaw program, wykonując kliknięcia przyciskami na panelach sterowania procesora tkankowego, które obejmują ustawienie czasu dla każdej komory.</li>
	<li>Naciśnij przycisk "Start", aby uruchomić program przetwarzania. Poniższy program jest przeznaczony do nasion jęczmienia i działa przez noc (~18 h)
	<ol>
		<li>Przeprowadzić odwadnianie, zanurzając kasetę na 1 godzinę 30 minut w serii gradientowej etanolu (etanol 75%, 85%, 100%, 100% i 100% (v/v)).</li>
		<li>Oczyszczanie należy przeprowadzić przy użyciu gradientu etanol: ksylen przez 1 h 30 min każdy o 75:25, 50:50, 25:75 (etanol: ksylen, v/v). Następnie zanurz kasetę na 1 godzinę 30 minut w 100% ksylenie, a następnie w 100% ksylenie.</li>
		<li>Przeprowadzić infiltrację parafiny w temperaturze 55-60 °C przez 1 h 30 min dwukrotnie w stopionej parafinie. 
		UWAGA: Temperaturę komór podgrzewacza parafiny można ustawić z tyłu procesora tkanek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Następnego ranka wyjmij kasety z procesora tkanek i przystąp do zatapiania parafiny. 
	UWAGA: Czas programu może się różnić w zależności od typu tkanki. Próżnia i/lub mieszanie mogą być stosowane podczas przetwarzania tkanek w celu przyspieszenia infiltracji wybranych roztworów poprzez naciśnięcie przycisków "V" i/lub "mieszanie" na panelu sterowania procesora tkanek.</li>
</ol>
3. Osadzanie parafiny
<ol>
	<li>Na tym etapie użyj maszyny do zatapiania (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Ustaw maszynę do zatapiania tak, aby włączała się co najmniej kilka godzin przed osadzaniem, aby dać czas na całkowite stopienie parafiny w zbiornikach.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem włącz zimną płytę.</li>
	<li>Osadź próbki w formach, przytrzymując je w odpowiedniej pozycji za pomocą drobnych kleszczy i dozując stopioną parafinę do formy. Należy zapewnić właściwą orientację próbek dla każdego celu doświadczalnego. W przypadku nasion jęczmienia należy ustawić nasiona wzdłużnie w kierunku cięcia, aby uzyskać przekroje wzdłużne. 
	UWAGA: Formy do zatapiania są dostępne w różnych rozmiarach. Wybierz odpowiedni rozmiar, aby umożliwić prawidłowe ustawienie i osadzenie próbki. Orientację próbek należy rozważyć w zależności od potrzeb doświadczalnych. Jeżeli wymagane są przekroje wzdłużne, próbka powinna być zorientowana wzdłużnie w kierunku cięcia, natomiast w przypadku przekrojów poprzecznych próbka powinna być zorientowana równolegle do kierunku cięcia.</li>
	<li>Umieść czystą kasetę na formie i upewnij się, że wystarczająca ilość parafiny całkowicie pokrywa całą kasetę, aby utrzymać próbkę na kasecie.</li>
	<li>Umieść formę na zimnej płycie i pozwól parafinie całkowicie związać (10-20 min) przed wyjęciem bloku z formy.</li>
	<li>Przystąpić do dzielenia na sekcje lub przenieść bloki do temperatury 4 °C w celu przechowywania. 
	UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Osadzone bloki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do trzech miesięcy.</li>
</ol>
4. Przygotowanie szkiełek membranowych z polietylenowo-naftalanowego (PEN)
<ol>
	<li>Zanurz szkiełka membranowe PEN w roztworze dezaktywującym RNazę na 3 sekundy, a następnie wykonaj dwa krótkie płukania w wodzie uzdatnionej przez DEPC, aby usunąć RNazy ze szkiełek. Wysuszyć szkiełka w inkubatorze o temperaturze 37 °C, aby usunąć resztki roztworu.</li>
	<li>Szkiełka należy poddać działaniu promieni UV za pomocą lampy UV w komorze z przepływem laminarnym przez 30 minut, aby poprawić właściwości hydrofilowe i poprawić przyczepność parafiny.</li>
</ol>
5. Podział na sekcje
<ol>
	<li>Na etapie cięcia należy użyć mikrotomu (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Umieść nowe ostrze w uchwycie noża i zawsze trzymaj osłonę noża w górze, gdy nie jest aktywnie cięty 
	UWAGA: Ostrza mikrotomu są niezwykle ostre i mogą spowodować znaczne szkody w przypadku niewłaściwego obchodzenia się z nimi. 
	UWAGA: Na mikrotomie znajdują się dwa mechanizmy blokujące, jeden z boku maszyny, a drugi na uchwycie koła. Oba mają być zaangażowane, gdy nie są aktywnie sekcjonowane.</li>
	<li>Wyreguluj blok noża tak, aby znajdował się jak najbliżej próbki bez dotykania. Upewnij się, że ramię mikrotomu nigdy nie styka się w pełni z blokiem noża, ponieważ spowoduje to katastrofalne uszkodzenie strukturalne mikrotomu.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem włącz zimną płytę. Trzymaj bloki parafiny na zimnej płycie przed cięciem i w razie potrzeby ponownie schładzaj bloki podczas cięcia, aby zapobiec zmiękczeniu bloków.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem napełnić łaźnię wodną wodą uzdatnioną metodą DEPC i podgrzać do 42 °C.</li>
	<li>Przytnij bloki na żądaną głębokość (gdzie znajduje się przekrój, który Cię interesuje) i przekrój bloki parafiny o żądanej grubości (6-10 μm) za pomocą mikrotomu; dobrze pocięty blok utworzy "wstęgę" na krawędzi ostrza. Do nasion jęczmienia, sekcja o grubości 8 μm.</li>
	<li>Delikatnie przenieś wstążki z mikrotomu do łaźni wodnej za pomocą cienkiego pędzla lub cienkich kleszczyków, upewniając się, że wstążka leży płasko na powierzchni wody.</li>
	<li>Przytrzymaj szkiełko pod kątem 45°, wykonując ruchy w górę, wyjmij wstążkę z wody na zjeżdżalnię i ostrożnie usuń nadmiar wody niestrzępiącą się chusteczką.</li>
	<li>Suszyć szkiełka przez 30 minut w temperaturze 37 °C, aby usunąć resztki wody pod parafiną.</li>
	<li>Przystąpić do usuwania parafiny lub przechowywać w temperaturze 4 °C w zamkniętym pudełku w warunkach odwadniania (do wykorzystania w ciągu kilku dni).</li>
	<li>Usuń parafinę, myjąc szkiełka 3x przez 20 s w ksylenie, a następnie 2x pranie 30 s w 100% (v/v) etanolu i 2x płukanie 30 s w 70% (v/v) etanolu.</li>
	<li>Po usunięciu parafiny natychmiast przystąp do mikrodysekcji laserowej. 
	UWAGA: Kriosekcja jest alternatywną metodą, która została z powodzeniem połączona z LCM. Przygotowanie próbki do kriosekcji będzie się różnić.</li>
</ol>
6. Mikrodysekcja laserowa
<ol>
	<li>Użyj mikroskopu mikrodyparacyjnego z wychwytem laserowym (patrz Tabela materiałów) do mikropreparacji komórek z odparafinowanych i wysuszonych skrawków tkanek.</li>
	<li>Załaduj suwaki na trzy dostępne gniazda. </li>
	<li>Użyj specjalnych nasadek samoprzylepnych probówek zbiorczych, aby pobrać pobrane próbki. Przechwytywanie bez zbierania cieczy ("na sucho") minimalizuje aktywność RNazy. Załaduj probówki zbiorcze do dostępnych szczelin.</li>
	<li>Przesuń stolik, aby zlokalizować obszar próbki, który należy wyciąć. Można to zrobić za pomocą myszy lub joysticka maszyny LCM lub strzałek na klawiaturze.</li>
	<li>Aby zoptymalizować prędkość cięcia, energię cięcia i ostrość, energię katapultowania laserowego pod ciśnieniem (LPC) i ostrość, najpierw wytnij nieskrojony segment wolny od tkanki na szkiełku membranowym. Dla nasion jęczmienia, prędkość cięcia = 18, CutEnergy = 52, CutFocus = 63, LPCEnergy = 78, Ostrość LPC = 61 przy 10-krotnym powiększeniu. 
	UWAGA: Ostrość i energia cięcia muszą być dostosowane do różnych slajdów, różnych tkanek i uchwyconego obszaru, ale ogólne zasady mówią, że moc katapultowania jest wyższa niż moc cięcia, a laser musi być rozogniskowany w celu katapultowania. Im większe powiększenie soczewki obiektywu, tym mniejsze ognisko lasera i tym wyższa energia.</li>
	<li>Użyj narzędzi do rysowania, aby zaznaczyć komórki, obrysowując obszar zainteresowania.</li>
	<li>Wybierz funkcję RoboLPC z paska narzędzi funkcji, aby katapultować komórki do nasadek samoprzylepnych w oparciu o zoptymalizowane parametry uzyskane przez cięcie na czarnym segmencie powyżej. 
	UWAGA: Parametry LCM różnią się w zależności od rodzaju tkanki, a także grubości przekroju, twardości tkanki i soczewek obiektywowych. Dlatego najlepiej jest zoptymalizować każdy szkiełko na gładkim obszarze błony bez próbki tkanki przed przecięciem właściwej próbki.</li>
	<li>Użyj narzędzi Flaga, aby oznaczyć interesujące obszary, aby natychmiast je zlokalizować, wybierając tę flagę z listy elementów.</li>
	<li>Sprawdź za pomocą przycisku "CapCheck", aby sprawdzić nasadkę samoprzylepną i potwierdzić, że próbki zostały pobrane. Zazwyczaj do ekstrakcji RNA wymagany jest LCM 10-15 sekcji (~ 200 komórek) na czapkę.</li>
	<li>Pobrane próbki należy przechowywać na lodzie. Natychmiast przystąp do ekstrakcji RNA, aby uniknąć degradacji RNA. 
	UWAGA: Niektóre mikroskopy LCM są wyposażone w światło fluorescencyjne, które umożliwia uchwycenie komórek znakowanych markerami fluorescencyjnymi.</li>
</ol>
7. Ekstrakcja RNA
<ol>
	<li>Użyj zestawu do izolacji RNA o niskim wejściu (patrz Tabela materiałów) do ekstrakcji RNA po LCM. Takie zestawy są zaprojektowane do konsekwentnego odzyskiwania wysokiej jakości całkowitego RNA z mniej niż dziesięciu komórek.</li>
	<li>Wyizolować całkowite RNA z wychwyconych typów komórek zgodnie z instrukcjami producenta, w tym z zastosowaniem leczenia DNazą na kolumnie. 
	UWAGA: Pierwszy etap ekstrakcji RNA, w którym probówka jest odwracana i przesuwana, ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia, że wychwycone próbki na pokrywie stykają się z dodanym buforem ekstrakcyjnym.</li>
</ol>
8. Amplifikacja RNA
<ol>
	<li>Użyj zestawu do amplifikacji antysensownego RNA (aRNA) (patrz tabela materiałów) do amplifikacji aRNA z RNA wyekstrahowanego przez transkrypcję in vitro, aby wytworzyć wystarczającą ilość aRNA do syntezy biblioteki sekwencyjnej RNA.</li>
	<li>Wykonaj dwie rundy amplifikacji za pomocą zestawu do amplifikacji aRNA zgodnie z instrukcjami producenta. 
	UWAGA: Ważne jest, aby podgrzać termocykler i pokrywę do temperatury zalecanej przez producenta zestawu (patrz tabela materiałów). Alternatywnym podejściem zamiast amplifikacji RNA jest użycie zestawu do przygotowania biblioteki o niskim nakładzie wejściowym do syntezy biblioteki bezpośrednio z wyekstrahowanego RNA.</li>
</ol>
9. Kwantyfikacja RNA
<ol>
	<li>Określ ilościowo i zakwalifikuj aRNA za pomocą zautomatyzowanego systemu elektroforezy (patrz tabela materiałów). 
	UWAGA: Preferowany jest zautomatyzowany system elektroforezy, ponieważ wymaga mniejszej próbki (1-2 μl) i zapewnia obraz przypominający żel i elektroferogram dla każdej pojedynczej próbki.</li>
</ol>
10. qRT-PCR i/lub sekwencja RNA
<ol>
	<li>Zsyntetyzuj cDNA z aRNA do qRT-PCR lub do tworzenia bibliotek sekwencyjnych RNA przy użyciu standardowych zestawów bibliotek sekwencyjnych RNA.</li>
</ol>

<ol><li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li>
<li>Alevizos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+cancer+in+vivo+gene+expression+profiling+assisted+by+laser+capture+microdissection+and+microarray+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Oral cancer in vivo gene expression profiling assisted by laser capture microdissection and microarray analysis.</a> Oncogene. 20 (43), 6196-6204 (2001).</li>
<li>Cong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+localization+of+follicular+lymphoma%3A+description+and+analysis+by+laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%2C+The+Journal+of+the+American+Society+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">In situ localization of follicular lymphoma: description and analysis by laser capture microdissection.</a> Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 99 (9), 3376-3382 (2002).</li>
<li>Blokhina, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+protocol+for+xylem+tissues+of+woody+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection protocol for xylem tissues of woody plants.</a> Frontiers in Plant Science. 7, 1965(2017).</li>
<li>Casson, S., Spencer, M., Walker, K., Lindsey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+for+the+analysis+of+gene+expression+during+embryogenesis+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection for the analysis of gene expression during embryogenesis of Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 42 (1), 111-123 (2005).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LCM-seq+reveals+the+crucial+role+of+LsSOC1+in+heat-promoted+bolting+of+lettuce+%28Lactuca+sativa+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">LCM-seq reveals the crucial role of LsSOC1 in heat-promoted bolting of lettuce (Lactuca sativa L.).</a> The Plant Journal. 95 (3), 516-528 (2018).</li>
<li>Jiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptome+atlas+of+rice+cell+types+uncovers+cellular%2C+functional+and+developmental+hierarchies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A transcriptome atlas of rice cell types uncovers cellular, functional and developmental hierarchies.</a> Nature Genetics. 41 (2), 258-263 (2009).</li>
<li>Kivivirta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+laser+microdissection+%28LMD%29+followed+by+transcriptome+analysis+of+plant+reproductive+tissue+in+phylogenetically+distant+angiosperms%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">A protocol for laser microdissection (LMD) followed by transcriptome analysis of plant reproductive tissue in phylogenetically distant angiosperms.</a> Plant Methods. 15 (1), 1-11 (2019).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+dynamics+of+the+maize+leaf+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome.</a> Nature Genetics. 42 (12), 1060-1067 (2010).</li>
<li>Liew, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+tissue-specific+regulation+of+transcriptomes+during+barley+%28Hordeum+vulgare%29+seed+germination%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Temporal tissue-specific regulation of transcriptomes during barley (Hordeum vulgare) seed germination.</a> The Plant Journal. 101 (3), 700-715 (2020).</li>
<li>Matas, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-and+cell-type+specific+transcriptome+profiling+of+expanding+tomato+fruit+provides+insights+into+metabolic+and+regulatory+specialization+and+cuticle+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Tissue-and cell-type specific transcriptome profiling of expanding tomato fruit provides insights into metabolic and regulatory specialization and cuticle formation.</a> The Plant Cell. 23 (11), 3893-3910 (2011).</li>
<li>Sakai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+laser-assisted+microdissection+%28LAM%29+and+RNA-seq+allows+to+perform+a+comprehensive+transcriptomic+analysis+of+epidermal+cells+of+Arabidopsis+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Combining laser-assisted microdissection (LAM) and RNA-seq allows to perform a comprehensive transcriptomic analysis of epidermal cells of Arabidopsis embryo.</a> Plant Methods. 14 (1), 10(2018).</li>
<li>Zhan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Sequencing+of+Laser-Capture+Microdissected+compartments+of+the+maize+kernel+identifies+regulatory+modules+associated+with+endosperm+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">RNA Sequencing of Laser-Capture Microdissected compartments of the maize kernel identifies regulatory modules associated with endosperm cell differentiation.</a> The Plant Cell. 27 (3), 513-531 (2015).</li>
<li>Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+bioinformatics+pipelines%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines.</a> Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).</li>
<li>Zeb, Q., Wang, C., Shafiq, S., Liu, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZeb%2C+Q+%22Single-Cell+Omics%22">Single-Cell Omics</a>. , Elsevier. 101-135 (2019).</li>
<li>Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+INTACT+method+for+cell+type-specific+gene+expression+and+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana.</a> Nature Protocols. 6 (1), 56(2011).</li>
<li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+%28TRAP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9 (6), 1282(2014).</li>
<li>Bevilacqua, C., Ducos, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microdissection%3A+A+powerful+tool+for+genomics+at+cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Laser microdissection: A powerful tool for genomics at cell level.</a> Molecular Aspects of Medicine. 59, 5-27 (2018).</li>
<li>Nelson, T., Tausta, S. L., Gandotra, N., Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microdissection+of+plant+tissue%3A+what+you+see+is+what+you+get%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Laser microdissection of plant tissue: what you see is what you get.</a> Annual Reviews in Plant Biology. 57, 181-201 (2006).</li>
<li>Day, R. C., Grossniklaus, U., Macknight, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Be+more+specific%21+Laser-assisted+microdissection+of+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Be more specific! Laser-assisted microdissection of plant cells.</a> Trends in Plant Science. 10 (8), 397-406 (2005).</li>
<li>Takahashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+obtaining+high+quality+RNA+from+paraffin+sections+of+plant+tissues+by+laser+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Research%22%5BJournal%5D)">A method for obtaining high quality RNA from paraffin sections of plant tissues by laser microdissection.</a> Journal of Plant Research. 123 (6), 807-813 (2010).</li>
<li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RIN%3A+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7 (1), 3(2006).</li>
<li>Ferreira, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+mRNA+amplification+approach+for+RNAseq+from+limited+amount+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Linear mRNA amplification approach for RNAseq from limited amount of RNA.</a> Gene. 564 (2), 220-227 (2015).</li>
<li>Schneider, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+T7+RNA+polymerase+based+in+vitro+linear+RNA+amplification+for+use+in+microarray+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of T7 RNA polymerase based in vitro linear RNA amplification for use in microarray experiments.</a> BMC Genomics. 5 (1), 29(2004).</li>
<li>Shanker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+commercially+available+RNA+amplification+kits+for+RNA+sequencing+using+very+low+input+amounts+of+total+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Techniques%22%5BJournal%5D)">Evaluation of commercially available RNA amplification kits for RNA sequencing using very low input amounts of total RNA.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 26 (1), 4(2015).</li>
<li>Bhattacherjee, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+of+fluorescently+labeled+embryonic+cranial+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection of fluorescently labeled embryonic cranial neural crest cells.</a> Genesis. 39 (1), 58-64 (2004).</li>
<li>Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilization+of+RNA+during+laser+capture+microdissection+by+performing+experiments+under+argon+atmosphere+or+using+ethanol+as+a+solvent+in+staining+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions.</a> RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).</li>
<li>Blokhina, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parenchymal+Cells+Contribute+to+Lignification+of+Tracheids+in+Developing+Xylem+of+Norway+Spruce%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Parenchymal Cells Contribute to Lignification of Tracheids in Developing Xylem of Norway Spruce.</a> Plant Physiology. 181 (4), 1552-1572 (2019).</li>
<li>Schad, M., Lipton, M. S., Giavalisco, P., Smith, R. D., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+two-dimensional+electrophoresis+and+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+for+tissue-specific+protein+profiling+of+laser-microdissected+plant+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Evaluation of two-dimensional electrophoresis and liquid chromatography-tandem mass spectrometry for tissue-specific protein profiling of laser-microdissected plant samples.</a> Electrophoresis. 26 (14), 2729-2738 (2005).</li>
<li>Schad, M., Mungur, R., Fiehn, O., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+profiling+of+laser+microdissected+vascular+bundles+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Metabolic profiling of laser microdissected vascular bundles of Arabidopsis thaliana.</a> Plant Methods. 1 (1), 2(2005).</li>
<li>Latrasse, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quest+for+epigenetic+regulation+underlying+unisexual+flower+development+in+Cucumis+melo%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+%26+Chromatin%22%5BJournal%5D)">The quest for epigenetic regulation underlying unisexual flower development in Cucumis melo.</a> Epigenetics & Chromatin. 10 (1), 22(2017).</li>
<li>Turco, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+and+gene+expression+regulation+associated+with+vascularization+in+Sorghum+bicolor%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">DNA methylation and gene expression regulation associated with vascularization in Sorghum bicolor.</a> The New Phytologist. 214 (3), 1213-1229 (2017).</li>
<li>Gomez, S. K., Harrison, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microdissection+and+its+application+to+analyze+gene+expression+in+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%3A+Formerly+Pesticide+Science%22%5BJournal%5D)">Laser microdissection and its application to analyze gene expression in arbuscular mycorrhizal symbiosis.</a> Pest Management Science: Formerly Pesticide Science. 65 (5), 504-511 (2009).</li>
<li>Roux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+analysis+of+plant+and+bacterial+gene+expression+in+symbiotic+root+nodules+using+laser-capture+microdissection+coupled+to+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">An integrated analysis of plant and bacterial gene expression in symbiotic root nodules using laser-capture microdissection coupled to RNA sequencing.</a> The Plant Journal. 77 (6), 817-837 (2014).</li>
<li>Tang, W., Coughlan, S., Crane, E., Beatty, M., Duvick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+laser+microdissection+to+in+planta+gene+expression+profiling+of+the+maize+anthracnose+stalk+rot+fungus+Colletotrichum+graminicola%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">The application of laser microdissection to in planta gene expression profiling of the maize anthracnose stalk rot fungus Colletotrichum graminicola.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (11), 1240-1250 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wiele badań nad ekspresją genów specyficznych dla tkanek zostało ograniczonych przez ręczne preparowanie próbek, które jest czasochłonne, pracochłonne, wiąże się z wysokim ryzykiem zanieczyszczenia i może wykorzystywać tylko te próbki, które człowiek jest wystarczająco zręczny do pobrania. LCM to precyzyjna i bezkontaktowa technika pobierania komórek z nieruchomych skrawków tkanek za pomocą mechanicznie obsługiwanej wiązki laserowej pod mikroskopową wizualizacją.
Dobre przygotowanie próbki ma ...

Rozwój i wzrost roślin obejmują skoordynowane działanie sieci regulacji transkrypcyjnej w różnych komórkach istniejących w złożonym środowisku komórkowym. Aby zrozumieć aktywność tych sieci regulacyjnych, niezbędna jest wiedza na temat przestrzennej i czasowej ekspresji genów w różnych typach komórek na poszczególnych etapach rozwoju. Jednakże analizy ekspresji genów są częściej przeprowadzane w całych organach lub zbiorczych próbkach tkanek ze względu na trudności techniczne związane z izolacją i analizą niewielkiej liczby komórek. Metoda, którą tutaj opisujemy, pozwoliła na uzyskanie przestrzennej i czasowej analizy transkryptomu specyficznego dla danej tkanki poprzez połączenie LCM z RNA-seq.
Metoda LCM została opracowana dwie dekady temu przez Emmert-Buck i współpracowników1. Technika ta umożliwiła badaczom precyzyjną izolację pojedynczych komórek lub skupisk komórek z ich otoczenia przy użyciu bezpośredniej wizualizacji mikroskopowej i manipulacji za pomocą wąskiej wiązki lasera1. Od tego czasu metoda ta jest szeroko stosowana w biologii nowotworów i patologii2,3. Wiele grup badawczych zajmujących się roślinami zaadaptowało również LCM do zastosowań u różnych gatunków roślin i w różnych typach tkanek4,5,6,7,8,9,10,11. Niedawno w kilku publikacjach wykorzystano LCM w nasionach dwuliściennych i jednoliściennych do badania zarodków, endospermów i innych struktur nasion podczas ich rozwoju i kiełkowania10,12,13. Większość innych powszechnie stosowanych metod izolacji pojedynczych komórek, takich jak mikropipetowanie, sortowanie komórek, separacja magnetyczna i platformy mikroprzepływowe, opiera się na trawieniu enzymatycznym lub homogenizacji mechanicznej w celu dysocjacji komórek. Może to zaburzyć ekspresję genów, wprowadzając artefakty techniczne utrudniające interpretację danych14,15. Metody te wymagają również wcześniejszej wiedzy na temat genów markerowych dla każdego typu komórki, aby powiązać zdysocjowane komórki z ich lokalizacją przestrzenną i rzeczywistym typem komórkowym. Kolejna grupa technik opiera się na izolacji struktur subkomórkowych w oparciu o powinowactwo zamiast całych komórek, na przykład INTACT (Isolation of Nuclei Tagged in Cell Types) oraz TRAP (Translating Ribosome Affinity Purification)16,17. Jednak znakowanie powinowactwem i oczyszczanie jąder komórkowych lub rybosomów jest trudne technicznie u gatunków roślin, które nie posiadają dobrze opracowanych protokołów transformacji. LCM wykorzystuje szybką fiksację tkanek w celu zachowania poziomów transkrypcyjnych oraz konwencjonalną identyfikację histologiczną poprzez bezpośrednią wizualizację komórek w ich normalnym kontekście tkankowym/narządowym, co pozwala na izolację poszczególnych komórek w krótkim czasie18,19.
Przedstawiony tutaj protokół jest zoptymalizowaną metodą izolacji konkretnych komórek lub typów komórek z przekrojów tkanek nasion zbóż, którą można zastosować do większości komórek możliwych do zidentyfikowania histologicznie. LCM zapewnia bezkontaktową metodę izolacji komórek, co znacznie ogranicza zanieczyszczenia i zwiększa integralność odzyskanego RNA. Ponadto metoda ta ilustruje możliwości LCM w szeroko zakrojonych badaniach genomowych rozpoczynających się od niewielkich ilości materiałów biologicznych. Opisujemy również linearną amplifikację RNA w celu wygenerowania wystarczającej ilości materiału wejściowego do późniejszych analiz transkryptów/transkryptomu.
Protokół LCM RNA-seq służący do analizy przestrzennych i czasowych transkryptomów specyficznych dla tkanek składa się z dziesięciu głównych etapów, obejmujących utrwalanie próbek tkanek, odwodnienie, infiltrację parafiną, zatapianie, krojenie, LCM, ekstrakcję RNA, amplifikację RNA, kwantyfikację RNA oraz qRT-PCR i/lub RNA-seq (Rycina 1).
<img alt="Schemat workflow sekwencjonowania RNA; od utrwalania tkanek do qPCR; sprzęt: procesor tkanek, LCM, TapeStation." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61517/61517fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat blokowy procedury LCM, po której następuje RNA-seq lub qRT-PCR. LCM jest precyzyjną przestrzennie i bezkontaktową techniką pobierania komórek z utrwalonych skrawków tkanek przy użyciu wiązki lasera pod kontrolą mikroskopową. Proces rozpoczyna się od utrwalenia próbek tkanek, po czym następuje odwodnienie przy użyciu serii gradientowej etanolu i ksylenu, a kończy infiltracja parafiną. Proces ten można w pełni zautomatyzować, korzystając z procesora tkanek. Po zainfiltrowaniu tkanki parafiną zostaje ona zatopiona w formie z płynną parafiną przy użyciu stacji do zatapiania. Krojenie wykonuje się za pomocą mikrotomu ustawionego na pożądaną grubość. Przygotowuje się preparaty, a następnie przeprowadza LCM bezpośrednio przed ekstrakcją RNA z pobranych komórek. Po ekstrakcji RNA następują dwie rundy amplifikacji RNA przed przeprowadzeniem qRT-PCR i/lub RNA-seq. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61517/61517fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>Kwas octowy 100 % ACS/R.</td><td>AnalaR NORMAPUR (BioStrategies)</td><td>VWRC20104.323</td><td></td></tr><tr><td>AdhesiveCap 200 nieprzezroczysty</td><td>Zeiss</td><td>415190-9181-000</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczyste formy bazowe 8 X 10</td><td>Leica</td><td>3803015</td><td></td></tr><tr><td>Pirowęglan dietylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>40718-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Taśma ekranowa RNA o wysokiej czułości</td><td>Agilent</td><td>5067-5579</td><td></td></tr><tr><td>Niska i nieśmiała; Profile Disp.Blades DB80LS</td><td>Leica</td><td>14035843489</td><td></td></tr><tr><td>MembraneSlide 1.0 PEN</td><td>Zeiss</td><td>415190-9041-000</td><td></td></tr><tr><td>MessageAmp II aRNA Amp</td> II <td>Ampon (ThermoFisher)</td><td>AMB17515</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do mineralizacji na kolumnie DNazy I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DNASE70</td><td></td></tr><tr><td>Ovation RNA-Seq System V2</td><td>NuGen (Integrated Science)</td><td>7102-08</td><td></td></tr><tr><td>Parafina (Surgipath Paraplast)</td><td>Zestaw</td><td></td> do izolacji RNA Leica 39601006 <td></td></tr><tr><td>PicoPure</td><td>ABI (ThermoFisher)</td><td>KIT0214</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do dekontaminacji RNaseZap Ambion</td><td>(ThermoFisher)</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>AnalaR NORMAPUR (BioStrategies)</td><td>VWRC28975.360</td><td></td></tr><tr><td>Stacjonarny procesor tkanek Leica</td><td>Leica Biosystems</td><td>TP1020</td><td></td></tr><tr><td>Podgrzewany moduł osadzania parafiny Leica</td><td>EG1150H</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Biosystems Leica Cold Plate</td> Szafy bezpieczeństwa biologicznego <td>Leica Biosystems</td><td>EG1150C</td><td></td></tr><tr><td>Safemate Class 2 LAF</td><td>Technologies Pty Ltd</td><td>Safemate 1.5</td><td></td></tr><tr><td>Leica - w pełni zautomatyzowany mikrotom obrotowy</td><td>Leica Biosystems</td><td>RM2265</td><td>z oprogramowaniem PALMRobo v 4.6</td></tr><tr><td>System Zeiss PALM MicroBeam LCM</td><td>Zeiss Miscroscopy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TapeStation</td><td>Agilent</td><td>TapeStation 2200</td><td></td></tr></tbody></table>

sekwencjonowanie rna z mikrodysekcją laserową do przestrzennej i czasowej analizy ekspresji genów specyficznych dla tkanek u roślin

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

Rozwój złożonego organizmu wielokomórkowego jest regulowany przez różne typy komórek, które mają różne profile transkrypcyjne. Aby zidentyfikować transkrypcyjne sieci regulacyjne, które zarządzają procesami rozwojowymi, konieczne jest zmierzenie przestrzennych i czasowych profili ekspresji genów tych indywidualnych typów komórek. Dlatego wgląd w czasoprzestrzenną kontrolę ekspresji genów jest niezbędny do zrozumienia, w jaki sposób regulowane są procesy biologiczne i rozwojowe. W tym miejscu opisujemy metodę mikrodysekcji laserowej (LCM) w celu wyizolowania niewielkiej liczby komórek z trzech narządów zarodka jęczmienia w czasie podczas kiełkowania, po którym następuje profilowanie transkryptu. Metoda składa się z utrwalenia tkanki, przetwarzania tkanek, zatapiania parafiny, cięcia, ekstrakcji LCM i RNA, a następnie PCR w czasie rzeczywistym lub sekwencji RNA. Metoda ta umożliwiła nam uzyskanie profili przestrzennych i czasowych transkryptomów narządów nasiennych z różnej liczby komórek (od dziesiątek do setek), zapewniając znacznie większą swoistość tkankową niż typowe analizy tkanek masowych. Na podstawie tych danych byliśmy w stanie zdefiniować i porównać transkrypcyjne sieci regulacyjne, a także przewidzieć potencjalne regulacyjne czynniki transkrypcyjne dla poszczególnych tkanek. Metoda powinna mieć zastosowanie do innych tkanek roślinnych przy minimalnej optymalizacji.

Wygenerowaliśmy przestrenne i czasowe transkryptomy specyficzne dla tkanek z nasion jęczmienia podczas kiełkowania, korzystając z naszego protokołu LCM RNA-seq10. Badanie przeprowadzono, stosując LCM RNA-seq do niewielkiej liczby komórek z trzech organów embrionalnych (koleonka, wierzchołek korzenia pierwotnego, skutellum) co 8 h w ciągu 48 h procesu kiełkowania (0-48 h, 7 punktów czasowych) (Rycina 2A,B).
<p class="jove_content" fo:keep-together....

Prezentowany tutaj jest protokół do laserowego mikrodyparowania (LCM) tkanek roślinnych. LCM to mikroskopowa technika izolowania obszarów tkanki w sposób wolny od zanieczyszczeń. Procedura obejmuje utrwalenie tkanek, zatopienie parafiny, cięcie, ekstrakcję LCM i RNA. RNA jest wykorzystywane w dalszej, specyficznej tkankowo, czasowo rozdzielczej analizie transkryptomów.

Sekwencjonowanie RNA z mikrodysekcją laserową do przestrzennej i czasowej analizy ekspresji genów specyficznych dla tkanek u roślin

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify ...

Protokół ten wykorzystuje mikrodysekcję laserową w połączeniu z sekwencjonowaniem RNA w celu uzyskania transkryptomów przestrzennych i czasowych z określonych komórek w roślinach będących przedmiotem zainteresowania, przy użyciu niewielkich ilości materiałów biologicznych. Główną zaletą techniki laserowej jest to, że ułatwia bezpośrednią wizualizację komórek w normalnym kontekście tkankowym, umożliwiając precyzyjną izolację dyskretnych komórek w sposób bezkontaktowy. Chociaż protokół ten jest zoptymalizowany pod kątem izolacji komórek roślinnych, można go zastosować do większości komórek, które można zidentyfikować stologicznie.Dobre przygotowanie próbki ma kluczowe znaczenie. Dlatego, gdy wykonuje się tę technikę po raz pierwszy, przed mikrodysekcją laserową ważna jest optymalizacja mocowania tkanek i osadzania. Przed pobraniem próbki tkanki należy przygotować utrwalacz odpowiedni dla gatunku i typu tkanki, która ma być pobrana.W przypadku nasion jęczmienia należy przeciąć próbki nasion na pół przed zanurzeniem próbek w co najmniej 10-krotnej objętości lodowatego utrwalacza. Użyj infiltracji próżniowej, aby przyspieszyć penetrację utrwalacza. Tkanka powinna zatonąć pod koniec naciekania, a następnie odświeżyć utrwalacz do inkubacji przez noc i przenieść próbki do kaset w celu przetworzenia tkanki.Umieść kasety załadowane chusteczkami w metalowym koszu automatycznego procesora i przymocuj metalowy kosz do uchwytu nad komorą pierwszą. Ustaw program na panelach sterowania procesora tkanek i naciśnij start, aby rozpocząć program automatycznego przetwarzania. System odwodni próbki, zanurzając kasety w gradientowej serii etanolu na 90 minut na stężenie zgodnie ze wskazaniami.Po ostatnim zanurzeniu w etanolu system zanurzy próbki w gradientach ksylenu na 90 minut na roztwór, jak wskazano. Następnie następuje 290-minutowe zanurzenie w stopionej parafinie w temperaturze od 55 do 60 stopni Celsjusza. Następnego ranka wyjmij kasety z naciekami parafiny z procesora tkanek i przystąp do zatapiania parafiny.Następnego ranka za pomocą cienkich kleszczyków przenieś próbki procesowe do form o odpowiedniej wielkości i dodaj stopioną parafinę do każdej próbki. W przypadku nasion jęczmienia należy ustawić próbki w parafinie wzdłużnie w kierunku cięcia, aby ułatwić uzyskanie przekrojów wzdłużnych. Umieść czystą kasetę na formie i upewnij się, że cała kaseta jest całkowicie pokryta wystarczającą ilością parafiny, aby przymocować próbkę do kasety.Następnie umieść formę na zimnej płycie na 10 do 20 minut, aż parafina stężeje przed zwolnieniem bloku z formy. Aby przygotować szkiełka membranowe PEN, zanurz je w roztworze dezaktywującym RNS na trzy sekundy, a następnie wykonaj dwa krótkie płukania i uzdatnioną wodę DEPC. Następnie wbij szkiełka do inkubatora o temperaturze 370 stopni Celsjusza, aby usunąć resztki roztworu i poddaj je działaniu promieniowania UV w komorze z przepływem laminarnym przez 30 minut, aby wzmocnić ich parafinę, a nie orzechy laskowe.W celu przekroju tkanki próbki umieść bloki parafiny na zimnej płycie i napełnij łaźnię wodną wodą uzdatnioną DEPC, a następnie podgrzej do 42 stopni Celsjusza. Przytnij bloki do głębokości obszaru zainteresowania i pokrój bloki parafiny na grubość od sześciu do 10 mikronów. Dobrze podzielony blok utworzy wstęgę na krawędzi ostrza.Za pomocą cienkiej pęsety delikatnie przenieś wstążki z mikrotomu do łaźni wodnej, uważając, aby wstążka leżała płasko na powierzchni wody. Aby zebrać sekcje, trzymając szkiełko pod kątem 45 stopni, użyj ruchu w górę, aby podnieść wstążkę z wody na zjeżdżalnię i użyj niestrzępiącej się chusteczki, aby ostrożnie usunąć nadmiar wody. Po zebraniu wszystkich skrawków umyj szkiełka 320-sekundowymi płukaniami w ksylenie, a następnie 230-sekundowymi płukaniami w 100% etanolu i 230-sekundowymi płukaniami w 70% etanolu.Aby przeprowadzić mikropreparację interesujących komórek z odparraffinizowanych i suchych skrawków tkanki, załaduj szkiełka na trzy szczeliny mikroskopu LCM i załaduj rurkę zbiorczą do dostępnych szczelin. Przesunąć stolik, aby zlokalizować obszar próbki, który należy wyciąć, i wyciąć pusty segment wolny od tkanki na szkiełku membranowym. Aby zoptymalizować prędkość cięcia i cięcie w laserze, katapultując energię i skupienie.Użyj narzędzi do rysowania, aby obrysować obszar zainteresowania w tkance i użyj zoptymalizowanych parametrów oraz funkcji Robo LPC, aby katapultować komórki do nasadek samoprzylepnych. Wybierz flagę z listy elementów, aby użyć narzędzia flagi do oznaczenia obszarów zainteresowania. Sprawdź przycisk sprawdzania nasadki, aby sprawdzić nasadkę samoprzylepną, aby potwierdzić, że próbki zostały pobrane.Zazwyczaj do ekstrakcji RNA potrzeba od 10 do 15 sekcji na czapkę. Natychmiast po pobraniu wszystkich próbek należy natychmiast przystąpić do ekstrakcji RNA, aby uniknąć degradacji RNA. Po ekstrakcji RNA i amplifikacji RNA należy użyć zautomatyzowanego systemu elektroforezy, zgodnie z instrukcjami producenta, aby określić ilościowo i zakwalifikować antysensowne RNA.W tym badaniu, LCM, sekwencjonowanie RNA zastosowano do niewielkiej liczby komórek z trzech narządów zarodka, co osiem godzin w ciągu 48 godzin podczas kiełkowania. Ważne jest, aby odpowiednio dostosować parametry cięcia, aby umożliwić precyzyjne wycięcie i usunięcie interesującej tkanki z otaczającej tkanki bez wypalania krawędzi wybranego obszaru. Rozgałęzienie całkowitego RNA przed amplifikacją RNA pozwala na wykrycie wyraźnych prążków elektroforetycznych i pików fluorescencyjnych podjednostek rybosomalnych 18 i 28S w dobrej jakości próbkach RNA.Pomyślnie zsyntetyzowany antysensowny RNA będzie wykazywał jednomodalny, symetryczny rozkład wielkości od 100 do 1000 nukleotydów ze szczytem około 300 nukleotydów po dwóch rundach amplifikacji. Wielowymiarowe wykreślanie genów ulegających ekspresji w różnych tkankach w ciągu 48 godzin od wykiełkowania ilustruje większe podobieństwo między próbkami pojedynczej tkanki niż między próbkami z tego samego punktu czasowego, ale z różnych tkanek. Liczba genów o zróżnicowanej ekspresji wzrasta stopniowo w trakcie kiełkowania w każdej tkance w stosunku do punktu czasowego godziny zero tkanki.W tej reprezentatywnej analizie stwierdzono, że 25% genów pióropusza, 34% korzonków nerwowych i 41% genów tarczki o zróżnicowanej ekspresji ulega ekspresji wyłącznie w każdej tkance. Ważne jest, aby prawidłowo dostosować parametry cięcia w celu precyzyjnego wycięcia i usunięcia obszaru selektora z otaczającej tkanki bez wypalania krawędzi wybranego obszaru. Dzięki ulepszonym metodom oczyszczania chromatyny i białek oraz ulepszonemu instrumentowi do spektrometrii mas, LCM może być stosowany do implantów do badań epigenomicznych i proteomicznych specyficznych dla typu komórki.

laser-capture-microdissection-rna-sequencing-for-spatial-temporal

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mikrosekcja laserowa została zastosowana do analizy profilu ekspresji genów w konkretnych przedziałach tarczki skrzydła Drosophila poddanych lokalnemu RNAi in vivo. RNA wyekstrahowany z równoważnych obszarów przedziałów wyciszonych i niewyciszonych przeanalizowano za pomocą ilościowej RT-PCR w celu określenia porównawczego profilu ekspresji genów w kontekście rodzimej mikroekologii tkanki.

Mikrosekcja laserowa zastosowana do profilowania ekspresji genów w podzbiorze komórek z dysku skrzydłowego Drosophila

Profilowanie ekspresji RNA w oddzielnych regionach mózgu myszy wymaga precyzyjnej i powtarzalnej strategii pobierania tkanek. W niniejszym opracowaniu opisano protokół wykorzystujący zarówno sekcjonowanie mózgu w płaszczyźnie czołowej, jak i mikrodysekcję wspomaganą wycinakiem do tkanek. Wydajność i jakość całkowitego RNA uzyskanego z otrzymanych próbek potwierdzają użyteczność przedstawionej metody.

Metoda mikroskopii bez użycia laserowej mikrodysekcji do mikrodysekcji dyskretnych obszarów mózgu myszy w celu izolacji całkowitego RNA oraz późniejszego sekwencjonowania następnej generacji i profilowania ekspresji genów

Opisany tutaj protokół hybrydyzacji in situ umożliwia bezpośrednią lokalizację ekspresji mRNA i małych RNA na poziomie komórkowym z wysoką czułością i swoistością. Procedura została zoptymalizowana dla przekrojów tkanek roślinnych zatopionych w parafinie, ma zastosowanie do szerokiego zakresu roślin i tkanek oraz może zostać ukończona w ciągu dziesięciu dni.

Hybrydyzacja in situ w celu precyzyjnej lokalizacji transkrypty w roślinach

Opisujemy, jak korzystać z mikrodysekcji laserowej (LCM) w celu uzyskania wzbogaconych populacji neuronów hipokampa lub pojedynczych neuronów z zamrożonych fragmentów uszkodzonego mózgu szczura do późniejszej analizy ekspresji genów przy użyciu ilościowego PCR w czasie rzeczywistym i/lub mikromacierzy całego genomu.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji wzbogaconych populacji neuronów lub pojedynczych neuronów do analizy ekspresji genów po urazowym uszkodzeniu mózgu

Tutaj prezentujemy protokół do wspomaganej laserem mikrodysekcji określonych typów komórek roślinnych do profilowania transkrypcyjnego. Chociaż protokół jest odpowiedni dla różnych gatunków i typów komórek, nacisk kładziony jest na wysoce niedostępne komórki żeńskiej linii zarodkowej, ważne dla rozmnażania płciowego i apomiktycznego w rodzaju krzyżowych Boechera.

Mikrodysekcja wspomagana laserowo (LAM) jako narzędzie do profilowania transkrypcji poszczególnych typów komórek

Wiele ważnych rozwojowo genów ma specyficzne dla komórek lub tkanek wzorce ekspresji. W artykule opisano eksperymenty LM RNA-seq w celu identyfikacji genów, które ulegają zróżnicowanej ekspresji na granicy blaszki liściowej kukurydzy i pochwy oraz w mutantach lg1-R w porównaniu z typem dzikim. Omówione tu rozważania eksperymentalne odnoszą się do analiz transkryptomicznych innych zjawisk rozwojowych.

Eksperymentalny projekt mikrodysekcji laserowej RNA-Seq: wnioski z analizy rozwoju liści kukurydzy

Ten protokół opisuje mikrodysekcję laserową do izolacji chrząstki i kości ze świeżo zamrożonych fragmentów zarodka myszy. Chrząstka i kość mogą być szybko uwidocznione przez barwienie fioletem krezylo i precyzyjnie zebrane w celu uzyskania wysokiej jakości RNA do analizy transkryptomicznej.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji chrząstki embrionalnej i kości myszy w celu analizy ekspresji genów

Mikrodysekcja laserowa (LMD) jest czułą i wysoce powtarzalną techniką, która może być wykorzystana do odkrycia ścieżek pośredniczących w heterogeniczności i inwazji glejaka. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół izolacji dyskretnych obszarów z tkanki glejaka za pomocą laserowego LMD, a następnie analizy transkryptomicznej.

Mikrodysekcja podregionów glejaka do wychwytywania laserowego w celu przestrzennej i molekularnej charakterystyki heterogeniczności wewnątrznowotworowej, onkostrumieni i inwazji

Opisujemy protokół laserowej mikrodysekcji podsegmentów ludzkiej nerki, w tym kłębuszka nerkowego, kanalika proksymalnego, grubej kończyny wstępującej, przewodu zbiorczego i śródmiąższu. RNA jest następnie izolowane z uzyskanych przedziałów i przeprowadza się sekwencjonowanie RNA w celu określenia zmian w sygnaturze transkryptomicznej w każdym podsegmencie.

Zastosowanie mikrodysekcji laserowej do odkrycia regionalnej transkryptomiki w ludzkiej tkance nerkowej

Opisano protokół, który wykorzystuje laserową mikrodysekcję do izolowania pojedynczych tkanek nicieni do sekwencjonowania RNA. Protokół nie wymaga zestawów narzędzi genetycznych specyficznych dla danego gatunku, co pozwala na porównywanie profili ekspresji genów między różnymi gatunkami na poziomie próbek jednotkankowych.

Mikrodysekcja laserowa do zastosowań jednotkankowych niezależnych od gatunku

Protokół ten opisuje metodę izolowania RNA z określonych histologicznych obszarów tkanki wątroby myszy z unieruchomioną o Optymalnej Temperaturze Cięcia z zastosowaniem złożonego tkanki wątroby za pomocą mikrosekcji laserowej, umożliwiającej ukierunkowaną analizę ekspresji genów w dalszej fazie.

Mikroskop laserowego przechwytywania tkanki wątroby myszy utrwalonej paraformaldehydem do analizy RNA

Poznaj metodę sekwencjonowania RNA z mikrodysekcją laserową do analizy przestrzennej i czasowej ekspresji genów w roślinach. Technika ta umożliwia precyzyjną izolację komórek z tkanek jęczmienia.

Sekwencjonowanie RNA z mikrodysekcją laserową do przestrzennej i czasowej analizy ekspresji genów specyficznych dla tkanek u roślin (Wideo) | JoVE Journal

Sekwencjonowanie RNA z mikrodysekcją laserową do przestrzennej i czasowej analizy ekspresji genów specyficznych dla tkanek u roślin

Przeglądaj więcej filmów