Sekwencjonowanie RNA z mikrodysekcją laserową do przestrzennej i czasowej analizy ekspresji genów specyficznych dla tkanek u roślin
August 5th, 2020
Prezentowany tutaj jest protokół do laserowego mikrodyparowania (LCM) tkanek roślinnych. LCM to mikroskopowa technika izolowania obszarów tkanki w sposób wolny od zanieczyszczeń. Procedura obejmuje utrwalenie tkanek, zatopienie parafiny, cięcie, ekstrakcję LCM i RNA. RNA jest wykorzystywane w dalszej, specyficznej tkankowo, czasowo rozdzielczej analizie transkryptomów.
Protokół ten wykorzystuje mikrodysekcję laserową w połączeniu z sekwencjonowaniem RNA w celu uzyskania transkryptomów przestrzennych i czasowych z określonych komórek w roślinach będących przedmiotem zainteresowania, przy użyciu niewielkich ilości materiałów biologicznych. Główną zaletą techniki laserowej jest to, że ułatwia bezpośrednią wizualizację komórek w normalnym kontekście tkankowym, umożliwiając precyzyjną izolację dyskretnych komórek w sposób bezkontaktowy. Chociaż protokół ten jest zoptymalizowany pod kątem izolacji komórek roślinnych, można go zastosować do większości komórek, które można zidentyfikować stologicznie.
Dobre przygotowanie próbki ma kluczowe znaczenie. Dlatego, gdy wykonuje się tę technikę po raz pierwszy, przed mikrodysekcją laserową ważna jest optymalizacja mocowania tkanek i osadzania. Przed pobraniem próbki tkanki należy przygotować utrwalacz odpowiedni dla gatunku i typu tkanki, która ma być pobrana.
W przypadku nasion jęczmienia należy przeciąć próbki nasion na pół przed zanurzeniem próbek w co najmniej 10-krotnej objętości lodowatego utrwalacza. Użyj infiltracji próżniowej, aby przyspieszyć penetrację utrwalacza. Tkanka powinna zatonąć pod koniec naciekania, a następnie odświeżyć utrwalacz do inkubacji przez noc i przenieść próbki do kaset w celu przetworzenia tkanki.
Umieść kasety załadowane chusteczkami w metalowym koszu automatycznego procesora i przymocuj metalowy kosz do uchwytu nad komorą pierwszą. Ustaw program na panelach sterowania procesora tkanek i naciśnij start, aby rozpocząć program automatycznego przetwarzania. System odwodni próbki, zanurzając kasety w gradientowej serii etanolu na 90 minut na stężenie zgodnie ze wskazaniami.
Po ostatnim zanurzeniu w etanolu system zanurzy próbki w gradientach ksylenu na 90 minut na roztwór, jak wskazano. Następnie następuje 290-minutowe zanurzenie w stopionej parafinie w temperaturze od 55 do 60 stopni Celsjusza. Następnego ranka wyjmij kasety z naciekami parafiny z procesora tkanek i przystąp do zatapiania parafiny.
Następnego ranka za pomocą cienkich kleszczyków przenieś próbki procesowe do form o odpowiedniej wielkości i dodaj stopioną parafinę do każdej próbki. W przypadku nasion jęczmienia należy ustawić próbki w parafinie wzdłużnie w kierunku cięcia, aby ułatwić uzyskanie przekrojów wzdłużnych. Umieść czystą kasetę na formie i upewnij się, że cała kaseta jest całkowicie pokryta wystarczającą ilością parafiny, aby przymocować próbkę do kasety.
Następnie umieść formę na zimnej płycie na 10 do 20 minut, aż parafina stężeje przed zwolnieniem bloku z formy. Aby przygotować szkiełka membranowe PEN, zanurz je w roztworze dezaktywującym RNS na trzy sekundy, a następnie wykonaj dwa krótkie płukania i uzdatnioną wodę DEPC. Następnie wbij szkiełka do inkubatora o temperaturze 370 stopni Celsjusza, aby usunąć resztki roztworu i poddaj je działaniu promieniowania UV w komorze z przepływem laminarnym przez 30 minut, aby wzmocnić ich parafinę, a nie orzechy laskowe.
W celu przekroju tkanki próbki umieść bloki parafiny na zimnej płycie i napełnij łaźnię wodną wodą uzdatnioną DEPC, a następnie podgrzej do 42 stopni Celsjusza. Przytnij bloki do głębokości obszaru zainteresowania i pokrój bloki parafiny na grubość od sześciu do 10 mikronów. Dobrze podzielony blok utworzy wstęgę na krawędzi ostrza.
Za pomocą cienkiej pęsety delikatnie przenieś wstążki z mikrotomu do łaźni wodnej, uważając, aby wstążka leżała płasko na powierzchni wody. Aby zebrać sekcje, trzymając szkiełko pod kątem 45 stopni, użyj ruchu w górę, aby podnieść wstążkę z wody na zjeżdżalnię i użyj niestrzępiącej się chusteczki, aby ostrożnie usunąć nadmiar wody. Po zebraniu wszystkich skrawków umyj szkiełka 320-sekundowymi płukaniami w ksylenie, a następnie 230-sekundowymi płukaniami w 100% etanolu i 230-sekundowymi płukaniami w 70% etanolu.
Aby przeprowadzić mikropreparację interesujących komórek z odparraffinizowanych i suchych skrawków tkanki, załaduj szkiełka na trzy szczeliny mikroskopu LCM i załaduj rurkę zbiorczą do dostępnych szczelin. Przesunąć stolik, aby zlokalizować obszar próbki, który należy wyciąć, i wyciąć pusty segment wolny od tkanki na szkiełku membranowym. Aby zoptymalizować prędkość cięcia i cięcie w laserze, katapultując energię i skupienie.
Użyj narzędzi do rysowania, aby obrysować obszar zainteresowania w tkance i użyj zoptymalizowanych parametrów oraz funkcji Robo LPC, aby katapultować komórki do nasadek samoprzylepnych. Wybierz flagę z listy elementów, aby użyć narzędzia flagi do oznaczenia obszarów zainteresowania. Sprawdź przycisk sprawdzania nasadki, aby sprawdzić nasadkę samoprzylepną, aby potwierdzić, że próbki zostały pobrane.
Zazwyczaj do ekstrakcji RNA potrzeba od 10 do 15 sekcji na czapkę. Natychmiast po pobraniu wszystkich próbek należy natychmiast przystąpić do ekstrakcji RNA, aby uniknąć degradacji RNA. Po ekstrakcji RNA i amplifikacji RNA należy użyć zautomatyzowanego systemu elektroforezy, zgodnie z instrukcjami producenta, aby określić ilościowo i zakwalifikować antysensowne RNA.
W tym badaniu, LCM, sekwencjonowanie RNA zastosowano do niewielkiej liczby komórek z trzech narządów zarodka, co osiem godzin w ciągu 48 godzin podczas kiełkowania. Ważne jest, aby odpowiednio dostosować parametry cięcia, aby umożliwić precyzyjne wycięcie i usunięcie interesującej tkanki z otaczającej tkanki bez wypalania krawędzi wybranego obszaru. Rozgałęzienie całkowitego RNA przed amplifikacją RNA pozwala na wykrycie wyraźnych prążków elektroforetycznych i pików fluorescencyjnych podjednostek rybosomalnych 18 i 28S w dobrej jakości próbkach RNA.
Pomyślnie zsyntetyzowany antysensowny RNA będzie wykazywał jednomodalny, symetryczny rozkład wielkości od 100 do 1000 nukleotydów ze szczytem około 300 nukleotydów po dwóch rundach amplifikacji. Wielowymiarowe wykreślanie genów ulegających ekspresji w różnych tkankach w ciągu 48 godzin od wykiełkowania ilustruje większe podobieństwo między próbkami pojedynczej tkanki niż między próbkami z tego samego punktu czasowego, ale z różnych tkanek. Liczba genów o zróżnicowanej ekspresji wzrasta stopniowo w trakcie kiełkowania w każdej tkance w stosunku do punktu czasowego godziny zero tkanki.
W tej reprezentatywnej analizie stwierdzono, że 25% genów pióropusza, 34% korzonków nerwowych i 41% genów tarczki o zróżnicowanej ekspresji ulega ekspresji wyłącznie w każdej tkance. Ważne jest, aby prawidłowo dostosować parametry cięcia w celu precyzyjnego wycięcia i usunięcia obszaru selektora z otaczającej tkanki bez wypalania krawędzi wybranego obszaru. Dzięki ulepszonym metodom oczyszczania chromatyny i białek oraz ulepszonemu instrumentowi do spektrometrii mas, LCM może być stosowany do implantów do badań epigenomicznych i proteomicznych specyficznych dla typu komórki.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie przedstawia protokół Laser-Capture Mikrodyssekcji (LCM) połączony z sekwencjonowaniem RNA w celu analizy przestrzennych i czasowych transkryptomów w komórkach roślinnych. Technika ta pozwala na precyzyjne izolację komórek w ich naturalnym kontekście tkankowym, ułatwiając szczegółowe badania ekspresji genów.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Biologia roślin
- Biologia molekularna
- Transkryptyka
Tło
- Znaczenie analizy ekspresji genów specyficznych dla tkanki
- Potrzeba technik bez kontaminacji w przygotowaniu próbek
- Korzyści z sekwencjonowania RNA w rozumieniu biologii roślin
Zastosowane metody
- Laser-Capture Mikrodyssekcja (LCM)
- Komórki roślinne, konkretnie z nasion jęczmienia
- Ekstrakcja i sekwencjonowanie RNA
Główne wyniki
- Pomyślna izolacja specyficznych komórek dla analizy RNA
- Identyfikacja wzorców ekspresji genów przez 48 godzin podczas kiełkowania
- Wykazanie skuteczności LCM w uzyskiwaniu wysokiej jakości próbek RNA
Wnioski
- Protokół poprawia rozumienie przestrzennej i czasowej ekspresji genów u roślin.
- Stanowi cenny narzędzie dla badaczy zajmujących się biologią rozwojową i genetyką.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Laser-capture microdissection (LCM) combined with RNA-sequencing enables high-resolution spatial and temporal gene expression profiling in plant tissues, supporting precise dissection of transcriptional regulatory networks. This capability is critical for de-risking early discovery and target validation by providing cell-type and tissue-specific transcriptomic data. The approach enhances predictive confidence in functional genomics and supports risk-adjusted portfolio decisions in plant biotechnology R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of transcriptional regulatory networks at single-tissue and time-resolved levels.
- Supports biological de-risking by distinguishing cell-type specific gene expression patterns.
- Facilitates identification of candidate regulatory transcription factors for functional validation.
- Improves predictive confidence in developmental and stress response pathways.
Screening & Assay Development
- Provides validated, tissue-specific transcriptomic profiles for downstream assay development.
- Enables reproducible isolation of discrete cell populations for quantitative gene expression analysis.
- Supports standardization of sample preparation and RNA quality assessment workflows.
- Facilitates scalable screening of gene expression changes across developmental stages.
Translational & Preclinical Research
- Aligns spatial transcriptomics with translational biomarker discovery in plant systems.
- Enables continuity from early discovery through preclinical validation of gene function.
- Supports risk-adjusted advancement of candidate genes for crop improvement or trait engineering.
- Provides mechanistic de-risking for functional genomics pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
LCM-RNA-seq integrates into the discovery continuum from hypothesis-driven target identification to preclinical validation of gene function in plants.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling spatially resolved transcriptome analysis.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative gene expression outputs for assay readiness.
- Analytics: Provides high-content transcriptomic data for comparative analysis across tissues and time points.
- Translational Research: Bridges early discovery with preclinical validation through tissue-specific biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for spatial transcriptomics across diverse plant tissues and developmental stages.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in gene function studies.
- Operational Value: Standardizes tissue processing, RNA extraction, and quality control for reproducible results.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient prioritization of gene targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement and triage of candidate genes in plant biotechnology pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue fixation, embedding, and microdissection techniques.
- Demands access to LCM instrumentation and high-quality RNA-seq analytical infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation and RNA quality assessment.
- Adaptable to various plant tissues with minimal protocol optimization.
- RNA integrity and precise microdissection are critical for reliable downstream analysis.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:11
Tissue Fixation
1:47
Tissue Processing
2:38
Paraffin Embedding
3:21
Polyethylene Naphthalate (PEN) Membrane Slide Preparation
3:49
Sectioning
4:53
Laser-Capture Microdissection (LCM)
6:14
Results: Representative LCM Sample Acquisition and RNA Quantification
7:52
Conclusion
