Sekwencjonowanie RNA z mikrodysekcją laserową do przestrzennej i czasowej analizy ekspresji genów specyficznych dla tkanek u roślin
5 sierpnia 2020
Prezentowany tutaj jest protokół do laserowego mikrodyparowania (LCM) tkanek roślinnych. LCM to mikroskopowa technika izolowania obszarów tkanki w sposób wolny od zanieczyszczeń. Procedura obejmuje utrwalenie tkanek, zatopienie parafiny, cięcie, ekstrakcję LCM i RNA. RNA jest wykorzystywane w dalszej, specyficznej tkankowo, czasowo rozdzielczej analizie transkryptomów.
Protokół ten wykorzystuje mikrodysekcję laserową w połączeniu z sekwencjonowaniem RNA w celu uzyskania transkryptomów przestrzennych i czasowych z określonych komórek w roślinach będących przedmiotem zainteresowania, przy użyciu niewielkich ilości materiałów biologicznych. Główną zaletą techniki laserowej jest to, że ułatwia bezpośrednią wizualizację komórek w normalnym kontekście tkankowym, umożliwiając precyzyjną izolację dyskretnych komórek w sposób bezkontaktowy. Chociaż protokół ten jest zoptymalizowany pod kątem izolacji komórek roślinnych, można go zastosować do większości komórek, które można zidentyfikować stologicznie.
Dobre przygotowanie próbki ma kluczowe znaczenie. Dlatego, gdy wykonuje się tę technikę po raz pierwszy, przed mikrodysekcją laserową ważna jest optymalizacja mocowania tkanek i osadzania. Przed pobraniem próbki tkanki należy przygotować utrwalacz odpowiedni dla gatunku i typu tkanki, która ma być pobrana.
W przypadku nasion jęczmienia należy przeciąć próbki nasion na pół przed zanurzeniem próbek w co najmniej 10-krotnej objętości lodowatego utrwalacza. Użyj infiltracji próżniowej, aby przyspieszyć penetrację utrwalacza. Tkanka powinna zatonąć pod koniec naciekania, a następnie odświeżyć utrwalacz do inkubacji przez noc i przenieść próbki do kaset w celu przetworzenia tkanki.
Umieść kasety załadowane chusteczkami w metalowym koszu automatycznego procesora i przymocuj metalowy kosz do uchwytu nad komorą pierwszą. Ustaw program na panelach sterowania procesora tkanek i naciśnij start, aby rozpocząć program automatycznego przetwarzania. System odwodni próbki, zanurzając kasety w gradientowej serii etanolu na 90 minut na stężenie zgodnie ze wskazaniami.
Po ostatnim zanurzeniu w etanolu system zanurzy próbki w gradientach ksylenu na 90 minut na roztwór, jak wskazano. Następnie następuje 290-minutowe zanurzenie w stopionej parafinie w temperaturze od 55 do 60 stopni Celsjusza. Następnego ranka wyjmij kasety z naciekami parafiny z procesora tkanek i przystąp do zatapiania parafiny.
Następnego ranka za pomocą cienkich kleszczyków przenieś próbki procesowe do form o odpowiedniej wielkości i dodaj stopioną parafinę do każdej próbki. W przypadku nasion jęczmienia należy ustawić próbki w parafinie wzdłużnie w kierunku cięcia, aby ułatwić uzyskanie przekrojów wzdłużnych. Umieść czystą kasetę na formie i upewnij się, że cała kaseta jest całkowicie pokryta wystarczającą ilością parafiny, aby przymocować próbkę do kasety.
Następnie umieść formę na zimnej płycie na 10 do 20 minut, aż parafina stężeje przed zwolnieniem bloku z formy. Aby przygotować szkiełka membranowe PEN, zanurz je w roztworze dezaktywującym RNS na trzy sekundy, a następnie wykonaj dwa krótkie płukania i uzdatnioną wodę DEPC. Następnie wbij szkiełka do inkubatora o temperaturze 370 stopni Celsjusza, aby usunąć resztki roztworu i poddaj je działaniu promieniowania UV w komorze z przepływem laminarnym przez 30 minut, aby wzmocnić ich parafinę, a nie orzechy laskowe.
W celu przekroju tkanki próbki umieść bloki parafiny na zimnej płycie i napełnij łaźnię wodną wodą uzdatnioną DEPC, a następnie podgrzej do 42 stopni Celsjusza. Przytnij bloki do głębokości obszaru zainteresowania i pokrój bloki parafiny na grubość od sześciu do 10 mikronów. Dobrze podzielony blok utworzy wstęgę na krawędzi ostrza.
Za pomocą cienkiej pęsety delikatnie przenieś wstążki z mikrotomu do łaźni wodnej, uważając, aby wstążka leżała płasko na powierzchni wody. Aby zebrać sekcje, trzymając szkiełko pod kątem 45 stopni, użyj ruchu w górę, aby podnieść wstążkę z wody na zjeżdżalnię i użyj niestrzępiącej się chusteczki, aby ostrożnie usunąć nadmiar wody. Po zebraniu wszystkich skrawków umyj szkiełka 320-sekundowymi płukaniami w ksylenie, a następnie 230-sekundowymi płukaniami w 100% etanolu i 230-sekundowymi płukaniami w 70% etanolu.
Aby przeprowadzić mikropreparację interesujących komórek z odparraffinizowanych i suchych skrawków tkanki, załaduj szkiełka na trzy szczeliny mikroskopu LCM i załaduj rurkę zbiorczą do dostępnych szczelin. Przesunąć stolik, aby zlokalizować obszar próbki, który należy wyciąć, i wyciąć pusty segment wolny od tkanki na szkiełku membranowym. Aby zoptymalizować prędkość cięcia i cięcie w laserze, katapultując energię i skupienie.
Użyj narzędzi do rysowania, aby obrysować obszar zainteresowania w tkance i użyj zoptymalizowanych parametrów oraz funkcji Robo LPC, aby katapultować komórki do nasadek samoprzylepnych. Wybierz flagę z listy elementów, aby użyć narzędzia flagi do oznaczenia obszarów zainteresowania. Sprawdź przycisk sprawdzania nasadki, aby sprawdzić nasadkę samoprzylepną, aby potwierdzić, że próbki zostały pobrane.
Zazwyczaj do ekstrakcji RNA potrzeba od 10 do 15 sekcji na czapkę. Natychmiast po pobraniu wszystkich próbek należy natychmiast przystąpić do ekstrakcji RNA, aby uniknąć degradacji RNA. Po ekstrakcji RNA i amplifikacji RNA należy użyć zautomatyzowanego systemu elektroforezy, zgodnie z instrukcjami producenta, aby określić ilościowo i zakwalifikować antysensowne RNA.
W tym badaniu, LCM, sekwencjonowanie RNA zastosowano do niewielkiej liczby komórek z trzech narządów zarodka, co osiem godzin w ciągu 48 godzin podczas kiełkowania. Ważne jest, aby odpowiednio dostosować parametry cięcia, aby umożliwić precyzyjne wycięcie i usunięcie interesującej tkanki z otaczającej tkanki bez wypalania krawędzi wybranego obszaru. Rozgałęzienie całkowitego RNA przed amplifikacją RNA pozwala na wykrycie wyraźnych prążków elektroforetycznych i pików fluorescencyjnych podjednostek rybosomalnych 18 i 28S w dobrej jakości próbkach RNA.
Pomyślnie zsyntetyzowany antysensowny RNA będzie wykazywał jednomodalny, symetryczny rozkład wielkości od 100 do 1000 nukleotydów ze szczytem około 300 nukleotydów po dwóch rundach amplifikacji. Wielowymiarowe wykreślanie genów ulegających ekspresji w różnych tkankach w ciągu 48 godzin od wykiełkowania ilustruje większe podobieństwo między próbkami pojedynczej tkanki niż między próbkami z tego samego punktu czasowego, ale z różnych tkanek. Liczba genów o zróżnicowanej ekspresji wzrasta stopniowo w trakcie kiełkowania w każdej tkance w stosunku do punktu czasowego godziny zero tkanki.
W tej reprezentatywnej analizie stwierdzono, że 25% genów pióropusza, 34% korzonków nerwowych i 41% genów tarczki o zróżnicowanej ekspresji ulega ekspresji wyłącznie w każdej tkance. Ważne jest, aby prawidłowo dostosować parametry cięcia w celu precyzyjnego wycięcia i usunięcia obszaru selektora z otaczającej tkanki bez wypalania krawędzi wybranego obszaru. Dzięki ulepszonym metodom oczyszczania chromatyny i białek oraz ulepszonemu instrumentowi do spektrometrii mas, LCM może być stosowany do implantów do badań epigenomicznych i proteomicznych specyficznych dla typu komórki.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół mikrodysekcji laserowej (LCM) połączonej z sekwencjonowaniem RNA w celu analizy transkryptomów przestrzennych i czasowych w komórkach roślinnych. Technika ta umożliwia precyzyjną izolację komórek w ich naturalnym kontekście tkankowym, co ułatwia szczegółowe badania ekspresji genów.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Biologia roślin
- Biologia molekularna
- Transkryptomika
Wstęp
- Znaczenie analizy tkankowo-specyficznej ekspresji genów
- Konieczność stosowania technik wolnych od kontaminacji podczas przygotowania próbek
- Zalety sekwencjonowania RNA w zrozumieniu biologii roślin
Zastosowane metody
- Mikrosekcja laserowa (LCM)
- Komórki roślinne, konkretnie z nasion jęczmienia
- Ekstrakcja i sekwencjonowanie RNA
Główne wyniki
- Pomyślnie wyizolowano specyficzne komórki do analizy RNA
- Zidentyfikowano wzorce ekspresji genów w ciągu 48 godzin podczas kiełkowania
- Wykazano skuteczność LCM w uzyskiwaniu wysokiej jakości próbek RNA
Wnioski
- Protokół ten zwiększa zrozumienie przestrzennej i czasowej ekspresji genów u roślin.
- Stanowi on cenną metodę dla badaczy zajmujących się biologią rozwoju i genetyką.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Mikrodysekcja wspomagana laserem (LCM) w połączeniu z sekwencjonowaniem RNA umożliwia wysokorozdzielcze przestrzenne i czasowe profilowanie ekspresji genów w tkankach roślinnych, co pozwala na precyzyjną analizę sieci regulacji transkrypcyjnej. Możliwość ta jest kluczowa dla zmniejszenia ryzyka na etapie wczesnego odkrywania i walidacji celów poprzez dostarczenie transkrypomicznych danych specyficznych dla konkretnych typów komórek i tkanek. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w genomice funkcjonalnej i wspiera decyzje dotyczące portfela projektów z uwzględnieniem ryzyka w badaniach i rozwoju (R&D) w obszarze biotechnologii roślin.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia analizę sieci regulacji transkrypcyjnej na poziomie pojedynczych tkanek oraz w rozdzielczości czasowej.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez rozróżnianie wzorców ekspresji genów specyficznych dla konkretnych typów komórek.
- Ułatwia identyfikację kandydackich czynników transkrypcyjnych regulacyjnych do walidacji funkcjonalnej.
- Zwiększa pewność prognostyczną w odniesieniu do szlaków rozwojowych i odpowiedzi na stres.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Zapewnia zwalidowane, tkankowo specyficzne profile transkrypcyjne do późniejszej optymalizacji testów.
- Umożliwia powtarzalną izolację dyskretnych populacji komórek do ilościowej analizy ekspresji genów.
- Wspiera standaryzację przygotowania próbek oraz procedur oceny jakości RNA.
- Ułatwia skalowalne badanie zmian ekspresji genów na różnych etapach rozwoju.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Łączy transkryptomikę przestrzenną z odkrywaniem translacyjnych biomarkerów w systemach roślinnych.
- Zapewnia ciągłość od wczesnego etapu odkrywania po przedkliniczną walidację funkcji genów.
- Wspiera dostosowany do ryzyka postęp w analizie genów kandydatów na potrzeby ulepszania upraw lub inżynierii cech.
- Zapewnia mechanistyczną redukcję ryzyka w procesach genomiki funkcjonalnej.
Integracja potoku i przepływu pracy
LCM-RNA-seq integruje kontinuum odkryć, od identyfikacji celów opartej na hipotezach po przedkliniczną walidację funkcji genów u roślin.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez umożliwienie analizy transkryptomu z rozdzielczością przestrzenną.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki ekspresji genów niezbędne do przygotowania testów.
- Analityka: Zapewnia wysokotreściowe dane transkryptomiczne do analiz porównawczych między tkankami i punktami czasowymi.
- Badania translacyjne: Łączy wczesne etapy odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez dopasowanie specyficznych dla tkanki biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę do ponownego wykorzystania w zakresie transkryptomiki przestrzennej w różnych tkankach roślinnych i stadiach rozwojowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad funkcją genów.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje obróbkę tkanek, ekstrakcję RNA oraz kontrolę jakości w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywne pod względem kapitałowym ustalanie priorytetów dla celów genowych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera dostosowany do ryzyka postęp i selekcję genów kandydackich w projektach biotechnologii roślin.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w technikach utrwalania, zatapiania w parafini oraz mikrodysekcji tkanek.
- Wymagany jest dostęp do aparatury do LCM oraz wysokiej jakości infrastruktury analitycznej do RNA-seq.
- Niezbędna jest standaryzacja przygotowania próbek i oceny jakości RNA pomiędzy zespołami.
- Metoda jest możliwa do zaadaptowania do różnych tkanek roślinnych przy minimalnej optymalizacji protokołu.
- Integralność RNA oraz precyzyjna mikrodysekcja są kluczowe dla wiarygodności dalszych analiz.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:11
Tissue Fixation
1:47
Tissue Processing
2:38
Paraffin Embedding
3:21
Polyethylene Naphthalate (PEN) Membrane Slide Preparation
3:49
Sectioning
4:53
Laser-Capture Microdissection (LCM)
6:14
Results: Representative LCM Sample Acquisition and RNA Quantification
7:52
Conclusion
