Name: Minimalna objętość witryfikacji niedojrzałych oocytów kotów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Poznaj minimalną objętość witryfikacji niedojrzałych oocytów kotów dla biologii rozrodu. Ta metoda wspiera zachowanie płodności i bioróżnorodności gatunków felinowych poprzez szybką krioprezerwację.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była częściowo wspierana przez EVSSAR (Europejskie Towarzystwo Weterynaryjne ds. Rozrodu Małych Zwierząt) Grant 2016 oraz przez Università degli Studi di Milano, Piano di Sostegno alla Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A). Pragniemy również podziękować dr Marii Giorgii Morselli za jej wkład w przedstawione tu eksperymenty i pozyskiwanie obrazów.

Przedstawione tutaj procedury nie uzyskały aprobaty etycznej, ponieważ jajniki kotów były pobierane w klinikach weterynaryjnych jako produkty uboczne rutynowej wycięcia jajników lub owariohisterektomii, na życzenie właściciela.
1. Kolekcja oocytów
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem eksperymentów należy przygotować roztwory do pobrania jajników i komórek jajowych. Przygotować roztwór do pobierania jajników z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) z mieszaniną antybiotyków i leków przeciwgrzybiczych (100 j.m./ml sodu penicyliny G, 0,1 mg/ml siarczanu streptomycyny, 0,25 μg/ml amfoterycyny B). Przygotować roztwór do pobierania oocytów (tj. PBS/PVA) z PBS ze 100 j.m./ml penicyliny G sodu, 0,1 mg/ml siarczanu streptomycyny i 0,1% (m/v) alkoholu poliwinylowego (PVA).</li>
	<li>Roztwory do pobrania jajników i komórek jajowych należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.</li>
	<li>W dniu sterylizacji matek, na kilka godzin przed przetworzeniem próbek, należy pobrać część roztworów do pobrania jajników i oocytów i pozwolić im ogrzać się w temperaturze pokojowej (RT; 25 ± 2 °C).</li>
	<li>Po dostarczeniu próbek do laboratorium należy wyizolować jajniki z otaczającej tkanki łącznej oraz z jajowodu, a następnie umyć je w pożywce do pobierania świeżych jajników na szalce Petriego.</li>
	<li>Napełnij jedną szalkę Petriego o średnicy 35 mm dla każdej królowej około 3 ml RT PBS/PVA i jeszcze jedną szalkę, aby zebrać oocyty.</li>
	<li>Umieść parę jajników na szalce Petriego i zmiel korę skalpelem chirurgicznym. Upewnij się, że wszystkie mieszki włosowe zostały złamane za pomocą mikroskopu stereoskopowego (powiększenie 8x).</li>
	<li>Zebrać COC za pomocą pipety i przenieść je do świeżego PBS/PVA na wyznaczonej szalce Petriego. Wybierz COC o dobrej jakości, z jednorodną, ciemną cytoplazmą i otoczone kilkoma zwartymi warstwami komórek wzgórka (stopień I18).</li>
</ol>
2. Witryfikacja
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę równoważącą i witryfikacyjną.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór równoważący (ES) z 7,5% (v/v) glikolem etylenowym (EG) i 7,5% (v/v) dimetylosulfotlenkiem (DMSO) w pożywce 199, z 20% płodową surowicą bydlęcą (FBS).</li>
		<li>Przygotować roztwór witryfikacyjny (VS) z 15% (v/v) EG, 15% (v/v) DMSO i 0,5 M sacharozy w pożywce 199, z 20% FBS (zmodyfikowany z 19).</li>
		<li>Pozwól ES i VS rozgrzać się w temperaturze pokojowej przed użyciem. 
		UWAGA: Wiadomo, że krioprotektanty (np. EG, DMSO) są cytotoksyczne. Strategią przeciwdziałania ich toksyczności jest obniżenie temperatury, w której komórki są na nie narażone20, a oocyty są zwykle narażone na działanie krioprotektantów w RT. Tak więc cała procedura, od pobrania oocytów po witryfikację, jest przeprowadzana w RT w tym protokole, aby uniknąć wahań temperatury.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj naczynie do witryfikacji (tj. specjalne naczynie składające się z sześciu stożkowych studzienek podzielonych na dwa rzędy, znane jako "płytka reprodukcyjna"). Przygotuj jeden rząd (trzy studzienki) dla każdego podłoża witryfikacyjnego.
	<ol>
		<li>Dodaj 20 μl ES na dno pierwszego dołka.</li>
		<li>Dodaj 300 μl VS na dno drugiej (tj. 1VS) i trzeciej (tj. 2VS) studzienki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zrównoważ COC w ES.
	<ol>
		<li>Za pomocą pipety o małym otworze (np. pipety Pasteura naciągniętej na dziób Bunsena, aby była cieńsza – średnica powinna wynosić co najmniej 200 μm), przenieś jeden (lub więcej) COC na dno pierwszego dołka. 
		UWAGA: Rozmiar pipety należy dobrać w zależności od liczby warstw wzgórków otaczających oocyty, a więc do wymiarów COC, dążąc do maksymalnego zmniejszenia objętości pożywki, która jest przenoszona za pomocą COC na każdym etapie. Dzięki obecnemu protokołowi przeszkoleni operatorzy mogą z powodzeniem witryfikować do ośmiu COC kotów na każdy nośnik witryfikacji.</li>
		<li>Powoli dodaj 20 μl ES na granicy kropli. Poczekaj 3 minuty.</li>
		<li>Powoli dodaj kolejne 20 μl ES na granicy kropli. Poczekaj 3 minuty.</li>
		<li>Powoli dodaj 240 μl ES na granicy kropli. Poczekaj 9 minut.</li>
		<li>W oczekiwaniu przygotuj pudełko z ciekłym azotem (LN2), oznacz podporę witryfikacyjną kodem identyfikacyjnym eksperymentu/kota i pozostaw ją otwartą. Umieść je w pobliżu mikroskopu stereoskopowego, aby były łatwo dostępne podczas pracy. 
		OSTROŻNOŚĆ! Podczas obchodzenia się z LN2 należy stosować środki ochrony osobistej.</li>
		<li>Alternatywnie, jeśli kilka COC musi zostać zeszklonych, należy rozpocząć pierwszy etap równoważenia (patrz kroki 2.3.1 - 2.3.2) dla innej grupy COC (która zostanie załadowana na nowy nośnik witryfikacyjny).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zeszklone COC w VS w mniej niż 90 sekund.
	<ol>
		<li>Używając tej samej pipety o małym otworze, napełnij ją 1VS, weź COC z dna pierwszego dołka (ES) i przenieś je na powierzchnię drugiego dołka (1VS).</li>
		<li>Umyj pipetę za pomocą 1VS.</li>
		<li>Weź COC i przenieś je w inne miejsce (na dnie) studzienki; wymieszaj otaczające je podłoże z pipetą.</li>
		<li>Napełnij pipetę 1VS w innym miejscu studzienki, weź COC, przesuń je i wymieszaj otaczające je podłoże z pipetą.</li>
		<li>Powtórz krok 2.4.4.</li>
		<li>Umyj pipetę za pomocą 2VS.</li>
		<li>Weź COC i przenieś je na dno trzeciego dołka (2VS); wymieszaj otaczające je podłoże z pipetą.</li>
		<li>Napełnij pipetę 2VS w innym miejscu studzienki, weź COC, przesuń je i wymieszaj otaczające je podłoże z pipetą.</li>
		<li>Powtórz krok 2.4.8.</li>
		<li>Napełnij pipetę 2VS w innym miejscu studzienki, weź COC i załaduj je na pasek wspornika witryfikacji, jak najbliżej końcówki. Odessać nadmiar pożywki, aby maksymalnie zmniejszyć objętość VS.</li>
		<li>Natychmiast zanurz podporę witryfikacyjną w LN2, przesuwając ją. Zamknij go za pomocą kilku zacisków, upewniając się, że zawsze pozostaje zanurzony w LN2. 
		UWAGA: Zachowanie właściwego czasu ma kluczowe znaczenie ze względu na toksyczność komórek krioprotektantu. Ze względu na ich wysokie stężenie w pożywkach do witryfikacji, ekspozycja komórek musi być kontrolowana, również poprzez bezbłędne wykonanie techniki21. Jeśli próbek jest dużo, rozważ ich podzielenie w celu szybszego przetworzenia i zminimalizowania czasu od pobrania oocytów do witryfikacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przechowuj załadowane podpory do witryfikacji w kielichu i przechowuj je w zbiorniku LN2 do momentu ocieplenia. 
	UWAGA: Wszystkie poprzednie kroki protokołu mogą być również zastosowane w warunkach polowych, jeśli LN2 jest dostępny. Do bezpiecznego transportu próbek do laboratorium i przeprowadzenia tam kolejnych etapów niezbędny będzie suchy transporter.</li>
</ol>
3. Ogrzewanie
<ol>
	<li>Przygotuj podłoże rozgrzewające.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór do rozmrażania (TS) z 1 M sacharozą w pożywce 199, z 20% FBS.</li>
		<li>Przygotować roztwór rozcieńczający (DS) z 0,5 M sacharozą w pożywce 199, z 20% FBS.</li>
		<li>Przygotować roztwór myjący (WS) z Medium 199 z 20% FBS.</li>
		<li>Przed użyciem rozgrzać TS do 38 °C oraz DS i WS w temperaturze RT.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W razie potrzeby należy przygotować pożywkę hodowlaną do późniejszego użycia podgrzanych COC (np. dojrzewanie in vitro, IVM).</li>
	<li>Umieść stopień grzewczy w pobliżu mikroskopu stereoskopowego i włącz go (38 °C). Przykryj pokrywkę szalki Petriego, aby się rozgrzała.</li>
	<li>Gdy wszystko będzie gotowe, przenieś nośniki do witryfikacji, które należy podgrzać, ze zbiornika magazynowego do pudełka z LN2 i umieść pudełko w pobliżu mikroskopu stereoskopowego.</li>
	<li>Przygotuj "Płytę reprodukcyjną". Przygotuj rząd dla każdego podłoża witryfikacyjnego, które ma zostać podgrzane.
	<ol>
		<li>Dodać 300 μl DS na dno pierwszego dołka.</li>
		<li>Dodaj 300 μl WS na dno drugiej (tj. 1WS) i trzeciej (tj. 2WS) studzienki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj kroplę TS (100 μl) na pokrywie szalki Petriego.</li>
	<li>Za pomocą zacisków otwórz jeden wspornik do witryfikacji w LN2.</li>
	<li>Umieść kroplę TS pod mikroskopem stereoskopowym i jednym szybkim ruchem weź podporę witryfikacyjną z LN2 i zanurz jej pasek w kropli, przesuwając go, aż wszystkie COC oderwą się. Usuń podporę z kropli, gdy tylko będzie pusta, ale pozostaw COC w TS łącznie na 1 minutę (od zanurzenia do następnego kroku).</li>
	<li>Weź pipetę podobną do tej, której używa się do witryfikacji i napełnij ją DS. Weź COC ze zrzutu (TS) i przenieś je na dno pierwszego dołka (DS). Poczekaj 3 minuty.</li>
	<li>Umyj pipetę środkiem 1WS. Weź COC i przenieś je na dno drugiej studzienki (1WS). Poczekaj 5 minut.</li>
	<li>Umyj pipetę za pomocą 2WS. Weź COC i przenieś je na powierzchnię trzeciej studzienki (2WS). Poczekaj, aż dotkną dna studni.</li>
	<li>Powtórz krok 3.11, używając innego obszaru studni.</li>
	<li>Umyj pipetę pożywką hodowlaną i przenieś oocyty do naczynia hodowlanego w celu następnego użycia (np. IVM).</li>
</ol>

<ol><li>Bankowski, B., Lyerly, A., Faden, R., Wallach, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+social+implications+of+embryo+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">The social implications of embryo cryopreservation.</a> Fertility and Sterility. 84 (4), 823-832 (2005).</li>
<li>Saragusty, J., Arav, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+progress+in+oocyte+and+embryo+cryopreservation+by+slow+freezing+and+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification.</a> Reproduction. 141 (1), 1-19 (2011).</li>
<li>Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamete+cryopreservation+in+the+domestic+cat%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Gamete cryopreservation in the domestic cat.</a> Theriogenology. 66 (1), 101-111 (2006).</li>
<li>Thongphakdee, A., Tipkantha, W., Punkong, C., Chatdarong, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+and+controlling+ovarian+activity+in+wild+felids%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Monitoring and controlling ovarian activity in wild felids.</a> Theriogenology. 109, 14-21 (2018).</li>
<li>Parks, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothermia+and+mammalian+gametes%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Tissue+Banking%22%5BJournal%5D)">Hypothermia and mammalian gametes.</a> Reproductive Tissue Banking. , 229-261 (1997).</li>
<li>Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte-granulosa+cell+heterologous+gap+junctions+are+required+for+the+coordination+of+nuclear+and+cytoplasmic+meiotic+competence%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence.</a> Developmental Biology. 226 (2), 167-179 (2000).</li>
<li>Murakami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blastocysts+derived+from+in+vitro-fertilized+cat+oocytes+after+vitrification+and+dilution+with+sucrose%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Blastocysts derived from in vitro-fertilized cat oocytes after vitrification and dilution with sucrose.</a> Cryobiology. 48 (3), 341-348 (2004).</li>
<li>Merlo, B., Iacono, E., Regazzini, M., Zambelli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cat+blastocysts+produced+in+vitro+from+oocytes+vitrified+using+the+cryoloop+technique+and+cryopreserved+electroejaculated+semen%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Cat blastocysts produced in vitro from oocytes vitrified using the cryoloop technique and cryopreserved electroejaculated semen.</a> Theriogenology. 70 (1), 126-130 (2008).</li>
<li>Luciano, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+different+cryopreservation+protocols+on+cytoskeleton+and+gap+junction+mediated+communication+integrity+in+feline+germinal+vesicle+stage+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Effect of different cryopreservation protocols on cytoskeleton and gap junction mediated communication integrity in feline germinal vesicle stage oocytes.</a> Cryobiology. 59 (1), 90-95 (2009).</li>
<li>Comizzoli, P., Wildt, D. E., Pukazhenthi, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+compaction+of+germinal+vesicle+chromatin+is+beneficial+to+survival+of+vitrified+cat+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction+in+Domestic+Animals%22%5BJournal%5D)">In vitro compaction of germinal vesicle chromatin is beneficial to survival of vitrified cat oocytes.</a> Reproduction in Domestic Animals. 44, SUPPL. 2 269-274 (2009).</li>
<li>Alves, A. E., Kozel, A. C., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+with+DAP+213+and+Cryotop+of+ex+situ+and+in+situ+feline+cumulus-oocyte+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction+in+Domestic+Animals%22%5BJournal%5D)">Vitrification with DAP 213 and Cryotop of ex situ and in situ feline cumulus-oocyte complexes.</a> Reproduction in Domestic Animals. 47 (6), 1003-1008 (2012).</li>
<li>Kuwayama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+vitrification+for+cryopreservation+of+human+oocytes+and+embryos%3A+The+Cryotop+method%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: The Cryotop method.</a> Theriogenology. 67 (1), 73(2007).</li>
<li>Pope, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+survival+of+domestic+cat+oocytes+after+vitrification%2C+intracytoplasmic+sperm+injection+and+embryo+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">In vivo survival of domestic cat oocytes after vitrification, intracytoplasmic sperm injection and embryo transfer.</a> Theriogenology. 77 (3), 531-538 (2012).</li>
<li>Galiguis, J., Gómez, M. C., Leibo, S. P., Pope, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth+of+a+domestic+cat+kitten+produced+by+vitrification+of+lipid+polarized+in+vitro+matured+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Birth of a domestic cat kitten produced by vitrification of lipid polarized in vitro matured oocytes.</a> Cryobiology. 68 (3), 459-466 (2014).</li>
<li>Fernandez-Gonzalez, L., Jewgenow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+feline+oocytes+by+vitrification+using+commercial+kits+and+slush+nitrogen+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction+in+Domestic+Animals%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of feline oocytes by vitrification using commercial kits and slush nitrogen technique.</a> Reproduction in Domestic Animals. 52, 230-234 (2017).</li>
<li>Colombo, M., Morselli, M. G., Tavares, M. R., Apparicio, M., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+competence+of+domestic+cat+vitrified+oocytes+in+3D+enriched+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Animals%22%5BJournal%5D)">Developmental competence of domestic cat vitrified oocytes in 3D enriched culture conditions.</a> Animals. 9 (6), 329(2019).</li>
<li>Colombo, M., Morselli, M. G., Apparicio, M., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulosa+cells+in+three-dimensional+culture%3A+A+follicle-like+structure+for+domestic+cat+vitrified+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction+in+Domestic+Animals%22%5BJournal%5D)">Granulosa cells in three-dimensional culture: A follicle-like structure for domestic cat vitrified oocytes.</a> Reproduction in Domestic Animals. , (2020).</li>
<li>Wood, T. C., Wildt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+quality+of+the+cumulus-oocyte+complex+in+the+domestic+cat+on+the+ability+of+oocytes+to+mature%2C+fertilize+and+develop+into+blastocysts+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reproduction+and+Fertility%22%5BJournal%5D)">Effect of the quality of the cumulus-oocyte complex in the domestic cat on the ability of oocytes to mature, fertilize and develop into blastocysts in vitro.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 110 (2), 355-360 (1997).</li>
<li>Cobo, A., Kuwayama, M., Pérez, S., Ruiz, A., Pellicer, A., Remohí, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+concomitant+outcome+achieved+with+fresh+and+cryopreserved+donor+oocytes+vitrified+by+the+Cryotop+method%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Comparison of concomitant outcome achieved with fresh and cryopreserved donor oocytes vitrified by the Cryotop method.</a> Fertility and Sterility. 89 (6), 1657-1664 (2008).</li>
<li>Mullen, S. F., Critser, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+science+of+cryobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Oncofertility+-+Fertility+preservation+for+Cancer+Survivors%22%5BJournal%5D)">The science of cryobiology.</a> Oncofertility - Fertility preservation for Cancer Survivors. , 83-109 (2007).</li>
<li>Fahy, G. M., Wowk, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+cryopreservation+by+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Principles of cryopreservation by vitrification.</a> Methods in Molecular Biology. 1257, 21-82 (2015).</li>
<li>Apparicio, M., Ruggeri, E., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+of+immature+feline+oocytes+with+a+commercial+kit+for+bovine+embryo+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction+in+Domestic+Animals%22%5BJournal%5D)">Vitrification of immature feline oocytes with a commercial kit for bovine embryo vitrification.</a> Reproduction in Domestic Animals. 48 (2), 240-244 (2013).</li>
<li>Brambillasca, F., Guglielmo, M. C., Coticchio, G., Mignini Renzini, M., Dal Canto, M., Fadini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+current+challenges+to+efficient+immature+oocyte+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Assisted+Reproduction+and+Genetics%22%5BJournal%5D)">The current challenges to efficient immature oocyte cryopreservation.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (12), 1531-1539 (2013).</li>
<li>Moussa, M., Shu, J., Zhang, X., Zeng, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+mammalian+oocytes+and+embryos%3A+current+problems+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Science+China+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of mammalian oocytes and embryos: current problems and future perspectives.</a> Science China Life Sciences. 57 (9), 903-914 (2014).</li>
<li>Luvoni, G., Pellizzari, P., Battocchio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+slow+and+ultrarapid+freezing+on+morphology+and+resumption+of+meiosis+in+immature+cat+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reproduction+and+Fertility.+Supplement%22%5BJournal%5D)">Effects of slow and ultrarapid freezing on morphology and resumption of meiosis in immature cat oocytes.</a> Journal of Reproduction and Fertility. Supplement. 51, 93-98 (1997).</li>
<li>Calvo, J. J., Robert, D., Viqueira, M., Lombide, P., Calvo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrified+and+in+vitro+matured+oocytes+viability+from+adult+housecat+%28Felis+catus%29+in+reproductive+season%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">Vitrified and in vitro matured oocytes viability from adult housecat (Felis catus) in reproductive season.</a> International Journal of Morphology. 33 (4), (2015).</li>
<li>Nowak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+viability+of+Serval+%28Leptailurus+serval%29+and+Pallas+Cat+%28Felis+manul%29+oocytes+after+cryopreservation+using+the+Rapid-I+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Cryo+Letters%22%5BJournal%5D)">The viability of Serval (Leptailurus serval) and Pallas Cat (Felis manul) oocytes after cryopreservation using the Rapid-I Method.</a> Cryo Letters. 40 (4), 226-230 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kriokonserwacja oocytów jest kluczową techniką konserwacji plazmy zarodkowej, zwłaszcza w taksonach, w których wiele gatunków jest zagrożonych, takich jak rodzina kotowatych. W pracy przedstawiono prosty i przyjazny w praktyce protokół witryfikacji niedojrzałych oocytów kotów. Pożywki laboratoryjne, środki wspomagające witryfikację o minimalnej objętości oraz przeszkolony personel są kluczowymi czynnikami sukcesu tej metody, która pozwala na konsekwentne i powtarzalne uzyskiwanie żywotnych oocytów, jak pokazują reprezent...

Kriokonserwacja stała się kluczowym krokiem technik wspomaganego rozrodu (ARTs). U ludzi pozwala na zachowanie płodności lub odroczenie rodzicielstwa z powodów medycznych lub osobistych. U zwierząt konieczne jest pokonywanie odległości i czasu w planowanych kryciach, zwłaszcza u zwierząt gospodarskich i domowych, lub zachowanie materiału genetycznego cennych podmiotów w programach ochrony, szczególnie u dzikich gatunków zagrożonych. Kriokonserwacja gamet jest najlepszym wyborem, gdy osobniki, które mają być hodowane, nie zostały jeszcze wybrane lub w celu uniknięcia problemów etycznych związanych z zamrażaniem zarodków, zwłaszcza w medycynie ludzkiej1. Plemniki są stosunkowo łatwe do konserwacji i dają zadowalające wyniki po rozmrożeniu, ale oocyty, ze względu na swoje cechy strukturalne, mogą być bardziej skomplikowane w przechowywaniu. Rzeczywiście, niski stosunek powierzchni do objętości, a także obecność osłonki przejrzystej otaczającej ooplazmę, ogranicza ruch krioprotektantów i wody po komórce2. Co więcej, u zwierząt domowych, w tym kotowatych, charakteryzują się cytoplazmą bogatą w lipidy, co uważa się, że czyni je bardziej wrażliwymi na krioprezerwację3.
Większość kotowatych jest zagrożona, a kot domowy jest używany jako model do opracowania protokołów zachowania plazmy zarodkowej dzięki dostępności gonad z rutynowej owariektomii. U dzikich zwierząt gonady można uzyskać po planowych operacjach lub (częściej) pośmiertnych, a także można pobrać niedojrzałe (pęcherzyki rozrodcze) gamety. Stymulacja hormonalna mająca na celu uzyskanie dojrzałych oocytów (metafaza II) nie jest tak powszechna jak w ludzkich ART ze względu na kwestie etyczne oraz specyficzną dla gatunku i osobnika reakcję na leczenie4.
Dlatego rozwój strategii kriokonserwacji skupił się na niedojrzałych gametach, które zazwyczaj mogą być odzyskane po niespodziewanej lub nagłej śmierci rzadkich osobników. Z biologicznego punktu widzenia istnieją pewne różnice w kriokonserwacji niedojrzałych lub dojrzałych gamet, z których każda ma swoje zalety. Po pierwsze, DNA jest lepiej chronione w niedojrzałych oocytach, których pęcherzyk rozrodczy zawiera chromosomy otoczone błoną jądrową, podczas gdy wrzeciono mejotyczne oocytów metafazy II może być bardziej podatne na kriourazy5. Po drugie, uszkodzenia cytoszkieletu wywołane zimnem mogą wpływać na rotację wrzeciona, wytłaczanie ciała polarnego, migrację przedjądrową i cytokinezę, co może mieć różny wpływ w zależności od fazy rozwoju oocytów, wpływając na progresję mejozy lub zdarzenia po zapłodnieniu. Wreszcie, i być może najważniejsze, podczas gdy dojrzałe oocyty są gotowe do zapłodnienia, niedojrzałe gamety polegają na wsparciu otaczających komórek wzgórka, aby przejść przez dojrzewanie jądrowe i cytoplazmatyczne6, i to jest powód, dla którego całe kompleksy wzgórek-oocyty (COC) są kriokonserwowane. Jednak utrata komórek wzgórka i/lub utrata funkcjonalnego połączenia między gametą a otaczającymi komórkami somatycznymi jest prawdopodobnie najbardziej szkodliwym skutkiem kriokonserwacji niedojrzałych COC.
Wśród technik kriokonserwacji, witryfikacja to taka, która może być łatwiej stosowana w warunkach polowych. W porównaniu z powolnym (lub kontrolowanym tempem) zamrażania, witryfikacja jest szybsza i nie wymaga specjalnego sprzętu, takiego jak programowalna zamrażarka. Aby spełnić trzy podstawowe zasady witryfikacji (tj. wysoka lepkość, związana z wysokim stężeniem krioprotektantu, małymi objętościami i bardzo szybkim spadkiem temperatury), opracowano kilka pożywek i podpór, które są stosowane u kotów zarówno dla niedojrzałych, jak i dojrzałych oocytów. Zaczynając od prostego straws7, następnie opracowano urządzenia, aby osiągnąć cel "Minimalna głośność". Cryoloop8, otwarte słomki ciągnione (OPS)9, rynny plastikowe (słomka modyfikowana)10 i cryotubes11 były używane, dopóki nie zastosowano bardziej wydajnego urządzenia (tj. Cryotop)11, poprawiając przeżywalność i wznowienie mejozy. Cryotop (rysunek uzupełniający 1) jest dostępnym na rynku nośnikiem, który stał się planowym otwartym systemem witryfikacji. Opracowany do witryfikacji ludzkich oocytów i zarodków, składa się z małego paska folii przymocowanego do twardego plastikowego uchwytu, chronionego plastikową nakrętką rurki podczas przechowywania12. Dzięki swojej użyteczności i ekstremalnemu zmniejszeniu objętości witryfikacji (zaledwie 0,1 μL), co prowadzi również do niezwykle szybkiego tempa chłodzenia i ocieplania, ta substancja wspomagająca witryfikację jest coraz częściej stosowana u kilku gatunków, w tym u kota domowego, u którego jest stosowana z różnymi pożywkami13,14,15, 16,17.
Celem tego manuskryptu jest opisanie protokołu kolekcji-witryfikacji-ocieplania, z niewielkimi modyfikacjami w stosunku do pierwotnie opracowanego dla ludzkich oocytów, który wykorzystuje laboratoryjne podłoża i komercyjne wsparcie dla minimalnej objętości witryfikacji i może być łatwo zastosowany w warunkach polowych do kriokonserwacji niedojrzałych kocich COC.

<table><tbody><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td>/</td></tr><tr><td>Pipety i końcówki automatyczne</td><td>/</td><td>/</td><td>Potrzebne do pipetowania 20, 100, 240 i 300 &mikro; L</td></tr><tr><td>Skalpele chirurgiczne</td> <td>/</td><td>/</td><td>Rozmiar 10 jest zwykle ok</td></tr><tr><td>Dziób Bunsena</td> <td>/</td><td>/</td><td>/</td></tr> <tr><td>Zaciski</td> <td>/</td><td>/</td> <td>Niektóre małe (zacisk na komary) do izolacji jajników, niektóre większe (zacisk Klemmera) do pracy w ciekłym azocie</td></tr><tr><td>Cryotop</td><td>Kitazato (dystrybutor: MBT - Medical Biological Technologies)</td><td>01.CR</td><td>Dystrybutorzy i numer katalogowy mogą ulec zmianie w różnych krajach</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>/</td></tr><tr><td>Glikol etylenowy (EG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9129</td><td>/</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td>/</td></tr><tr><td>Szklane pipety Pasteura</td><td>/</td><td>/</td><td>Zalecana długość 230 mm (100+130)</td></tr><tr><td>Gobelets</td><td>/</td><td>/</td><td>Zgodnie z kanistrami zbiornika magazynowego</td></tr><tr><td>Etap ogrzewania</td> <td>/</td><td>/</td> <td>Wszystkie etapy ogrzewania są w porządku, o ile mogą utrzymać 38&ordm; C</td></tr><tr><td>Ciekły azot/</td><td></td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>/Medium 199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4530</td><td>/</td></tr><tr><td>Solanka fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td>/</td></tr><tr><td>Penicylina G sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td>/</td></tr><tr><td>Alkohol poliwinylowy (PVA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136</td><td>/</td></tr><tr><td>Płytka</td> <td>reprograficznaKitazato (dystrybutor: MBT - Medical Biological Technologies)</td><td>01.K-2</td><td>Dystrybutorzy i numer katalogowy mogą ulec zmianie w różnych krajach</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>/</td><td>/</td><td>Tak długo, jak operator może wybrać oocyty, inne mikroskopy stereoskopowe są w porządku</td></tr><tr><td>Zbiornik magazynowy</td><td>/</td><td>/</td><td>Każdy regularnie napełniany zbiornik jest w porządku</td></tr><tr><td>Siarczan streptomycyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9137</td><td>/</td></tr><tr><td>Styropian/skrzynka odporna na azot</td><td>/</td><td>/</td><td>Wszystkie skrzynki, które mogą zawierać ciekły azot, są w porządku, o ile operator czuje się komfortowo. Pudełko Kitazato nazywa się "Stojak chłodzący"</td></tr> <tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1888</td> <td>/</td></tr> <tr><td>Timery</td> <td>/</td><td></td> <td>/ Wszystkie timery, które można ustawić na czasy, aż 9 minut będzie w porządku</td></tr></tbody></table>

minimalna objętość witryfikacji niedojrzałych oocytów kotów

Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

W programach ochrony dzikich zwierząt, bankowanie gamet jest kluczowe dla ochrony zasobów genetycznych cennych osobników i rzadkich gatunków oraz dla promowania zachowania różnorodności biologicznej. U kotowatych większość gatunków jest zagrożona wyginięciem, a rasy domowe są wykorzystywane jako model zwiększający skuteczność protokołów bankowania plazmy zarodkowej. Wśród technik kriokonserwacji oocytów witryfikacja jest coraz bardziej popularna w rozrodzie wspomaganym przez ludzi i weterynarzy. Wykazano, że witryfikacja kriotopowa, która została pierwotnie opracowana dla ludzkich oocytów i zarodków, dobrze nadaje się do oocytów kotów. Metoda ta ma kilka zalet, takich jak wykonalność w warunkach polowych i szybkość procedury, co może być pomocne, gdy konieczne jest przetworzenie kilku próbek. Wydajność jest jednak silnie uzależniona od umiejętności operatora, potrzebna jest standaryzacja wewnątrz- i międzylaboratoryjna, a także szkolenie personelu. Protokół ten opisuje witryfikację niedojrzałych oocytów kotów o minimalnej objętości na komercyjnym podłożu w protokole przyjaznym dla pola krok po kroku, od pobrania oocytów do ocieplenia. Zgodnie z protokołem można oczekiwać zachowania integralności i żywotności oocytów w momencie ocieplenia (nawet do 90%), chociaż nadal istnieje możliwość poprawy wyników dojrzewania i rozwoju embrionalnego po ociepleniu.

Po witryfikacji i rozmrażaniu oocytów kota zgodnie z niniejszym protokołem (Rysunek 1 i Rysunek dodatkowy 1), ogromna większość gamet przeżywa. Po witryfikacji, wśród innych technik, żywotność można ocenić pod mikroskopem optycznym jako integralność morfologiczną22 lub z użyciem barwników witalnych. Jednym z nich jest diacetan fluoresceiny/jodek propidyny (FDA/PI), który umożliwia identyfikację komórek żywych (intensywna zielona fluorescencja) i martw...

Ten manuskrypt opisuje protokół minimalnej objętości witryfikacji niedojrzałych oocytów kotów za pomocą laboratoryjnych pożywek na komercyjnych podłożach. Obejmuje każdy etap, od izolacji oocytów od gonad ex vivo po witryfikację i ocieplenie.

Minimalna objętość witryfikacji niedojrzałych oocytów kotów

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

Protokół ten jest przydatny do długoterminowej ochrony oocytów kotów za pomocą techniki kriokonserwacji znanej jako witryfikacja, która ma kluczowe znaczenie dla zachowania płodności i różnorodności biologicznej gatunków zwierząt. Głównymi zaletami witryfikacji są jej szybkość, ponieważ można ją zakończyć w mniej niż 17 minut, oraz wykonalność w warunkach polowych, jeśli dostępny jest ciekły azot. Kot domowy jest realnym modelem dla dzikich, zagrożonych wyginięciem kotów.Opracowanie i optymalizacja protokołów kriokonserwacji pozwoliłyby na utworzenie biobanków gamet dla programów ochrony kotów. Zacznij od przygotowania płytki do witryfikacji repro z trzema stożkowymi dołkami w jednym rzędzie. Dodaj 20 mikrolitrów roztworu równoważącego do pierwszej studzienki i 300 mikrolitrów roztworu witryfikacyjnego do drugiej i trzeciej studzienki.Aby zrównoważyć kompleksy oocytów wzgórka lub COC, użyj pipety o małym otworze, aby przenieść jeden lub więcej kompleksów na dno pierwszego dołka. Powoli dodaj 20 mikrolitrów roztworu równoważącego do granicy kropli i odczekaj trzy minuty, a następnie dodaj kolejne 240 mikrolitrów roztworu równoważącego i odczekaj dziewięć minut. W oczekiwaniu przygot

minimum-volume-vitrification-of-immature-feline-oocytes

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ten manuskrypt opisuje eksperymentalne podejście do morfologicznego i biochemicznego charakterystyki oocytów koni. W szczególności niniejsza praca ilustruje, w jaki sposób zbierać niedojrzałe i dojrzałe oocyty koni za pomocą ultrasonograficznego pobierania komórek jajowych (OPU) oraz jak badać segregację chromosomów, morfologię wrzeciona, globalną acetylację histonów i ekspresję mRNA.

Analiza segregacji chromosomów, acetylacji histonów i morfologii wrzeciona w oocytach koni

Przedstawione tutaj są dwa protokoły enkapsulacji oocytów świń w warunkach hodowli 3D. W pierwszym kompleksy wzgórko-oocyty (COC) są zamknięte w kulkach fibrynowo-alginianowych. W drugim są one otoczone cząstkami fluorowanego proszku etylenu i propylenu (mikrobioreaktory). Oba systemy zapewniają optymalne warunki do utrzymania ich organizacji 3D.

Hydrożele alginianowe zdegradowane proteolitycznie i mikrobioreaktory hydrofobowe do enkapsulacji oocytów świń

Kriokonserwacja oocytów jest uznawana przez kilka międzynarodowych towarzystw naukowych za złoty standard zachowania płodności u kobiet po okresie dojrzewania. Odpowiednie strategie kliniczne i laboratoryjne zapewniają maksymalną skuteczność, efektywność i bezpieczeństwo zabiegów zachowujących płodność.

Zachowanie płodności poprzez witryfikację oocytów: perspektywy kliniczne i laboratoryjne

Protokół ma na celu dostarczenie standardowej metody witryfikacji oocytów dorosłych i młodych owiec. Obejmuje wszystkie etapy od przygotowania pożywki do dojrzewania in vitro do hodowli po ociepleniu. Oocyty są witryfikowane na etapie MII przy użyciu Cryotop, aby zapewnić minimalną niezbędną objętość.

Witryfikacja dojrzałych komórek jajowych pobranych in vitro z jajników dorosłych i przed okresem dojrzewania u owiec

Dedykowany zespół może zaoferować pacjentkom Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser możliwość przeprowadzenia kontrolowanej stymulacji jajników i kriokonserwacji oocytów podczas laparoskopowej plastyki pochwy.

Laparoskopowe pobieranie komórek jajowych i kriokonserwacja podczas waginoplastyki w leczeniu zespołu Mayera-Rokitansky'ego-Kustera-Hausera

Przedstawiono protokół witryfikacji tkanki jajnikowej, jako alternatywną metodę kriokonserwacji do powszechnie stosowanego protokołu powolnego zamrażania.

Witryfikacja tkanki kory jajnika w celu uzyskania szklistego stanu agregacji

Tutaj prezentujemy zoptymalizowaną metodę natychmiastowego usuwania części kompleksów cumulus-oocyt po pobraniu komórek jajowych, aby przyspieszyć proces obserwacji IVF, skracając czas potrzebny na usunięcie komórek ziarnistych, minimalizując narażenie oocytów na czynniki zewnętrzne i nie utrudniając rozwoju zarodka, ostatecznie poprawiając efektywność procedur laboratoryjnych IVF.

Natychmiastowe częściowe usunięcie kompleksów cumulus-oocyty: wyrafinowane podejście do szybkiej obserwacji zapłodnienia in vitro

Protokół ten określa ustandaryzowane metody izolacji i przetwarzania płynu pęcherzykowego, komórek somatycznych oraz niedojrzałych oocytów z procedur IVF, umożliwiając wysokiej jakości analizy molekularne i komórkowe. Te podejścia wspierają badania translacyjne dotyczące płodności, starzenia się reprodukcyjnego i dysfunkcji jajników, wykorzystując materiały zwykle odrzucane w opiece klinicznej.

Pobieranie ludzkiego płynu pęcherzykowego, komórek somatycznych mieszków mieszkowych oraz niedojrzałych oocytów od osób poddawanych zapłodnieniu in vitro

Ten protokół opisuje procedury dotyczące in vitro dojrzewania oocytów mysich, in vitro zapłodnienia i późniejszej kultury embrionów do etapu blastocysty.

Dojrzewanie in vitro komórek jajowych myszy, zapłodnienie i hodowlą zarodków przedimplantacyjnych

Informujemy tutaj o solidnej i efektywnej ekspresji białek fluorescencyjnych po wstrzyknięciu mRNA do niezapłodnionych oocytów Branchiostoma lanceolatum. Opracowanie techniki mikroiniekcji w tym podstawowym strunacie utoruje drogę dla dalekosiężnych innowacji technicznych w tym powstającym systemie modelowym, w tym obrazowania in vivo i manipulacji specyficznych dla genów.

Ekspresja białek fluorescencyjnych w Branchiostoma lanceolatum przez wstrzyknięcie mRNA do niezapłodnionych oocytów

Poznaj minimalną objętość witryfikacji niedojrzałych oocytów kotów dla biologii rozrodu. Ta metoda wspiera zachowanie płodności i bioróżnorodności gatunków felinowych poprzez szybką krioprezerwację.

Minimalna objętość witryfikacji niedojrzałych oocytów kotów

Przeglądaj więcej filmów