Name: Zautomatyzowana produkcja indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronów korowych i dopaminergicznych pochodzących z komórek macierzystych ze zintegrowanym monitorowaniem żywych komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-06T16:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Poznaj zautomatyzowane metody hodowli i różnicowania hiPSC w neurony korowe i dopaminergiczne z monitorowaniem żywych komórek. System zapewnia wysoką powtarzalność fenotypową i minimalizuje zmienność eksperymentalną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują pacjentom i ich rodzinom, którzy dostarczyli biomateriał do tego badania. Linie komórkowe użyte w badaniu pochodziły z kolekcji NINDS z Rutgers (ND41865 jako iPS#1) i laboratorium dr Tilo Kunatha (iPS#2). Prace te są częściowo wspierane przez Fundację NOMIS (PH), RiMod-FTD, wspólny program UE - Badania nad chorobami neurodegeneracyjnymi (JPND) (PH); Inicjatywa DZNE I2A (AD); PD-Strat, projekt finansowany przez ERA-Net ERACoSysMed (PH) oraz Foundational Data Initiative for Parkinson's Disease (FOUNDIN-PD) (PH, EB). FOUNDIN-PD jest częścią programu PATH to PD Fundacji Michaela J. Foxa. Autorzy dziękują Stevenowi Finkbeinerowi i Melanie Cobb (Gladstone Institutes) za wkład w ustanowienie ręcznego protokołu różnicowania neuronów mDA oraz Mahomi Suzuki (Yokogawa Electric Corporation) za pomoc w konfiguracji analizy wzrostu neurytów.

<ol><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Payne, N. L., Sylvain, A., O'Brien, C., Herszfeld, D., Sun, G., Bernard, C. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+modeling+and+treating+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22New+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Application of human induced pluripotent stem cells for modeling and treating neurodegenerative diseases.</a> New biotechnology. 32 (1), 212-228 (2015).</li>
<li>Wu, Y. Y., Chiu, F. L., Yeh, C. S., Kuo, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+and+challenges+for+the+use+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+modelling+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Opportunities and challenges for the use of induced pluripotent stem cells in modelling neurodegenerative disease.</a> Open Biology. 9 (1), 180177(2019).</li>
<li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular cell biology. 17 (3), 170-182 (2016).</li>
<li>Jain, S., Heutink, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+single+genes+to+gene+networks%3A+high-throughput-high-content+screening+for+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">From single genes to gene networks: high-throughput-high-content screening for neurological disease.</a> Neuron. 68 (2), 207-217 (2010).</li>
<li>Soares, F. A. C., Chandra, A., Thomas, R. J., Pedersen, R. A., Vallier, L., Williams, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+feasibility+of+scale+up+and+automation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+cultured+in+aggregates+in+feeder+free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Investigating the feasibility of scale up and automation of human induced pluripotent stem cells cultured in aggregates in feeder free conditions.</a> Journal of biotechnology. 173, 53-58 (2014).</li>
<li>Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+maintenance+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+automated+cell+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system.</a> Scientific reports. 5, 16647(2015).</li>
<li>Conway, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+96-well+Plate+Based+iPSC+Culture+and+Production+Using+a+Robotic+Liquid+Handling+System%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (99), e52755(2015).</li>
<li>Paull, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-throughput+derivation%2C+characterization+and+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">high-throughput derivation, characterization and differentiation of induced pluripotent stem cells.</a> Nature methods. 12 (9), 885-892 (2015).</li>
<li>Busskamp, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+neurogenesis+through+transcriptional+activation+in+human+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+systems+biology%22%5BJournal%5D)">Rapid neurogenesis through transcriptional activation in human stem cells.</a> Molecular systems biology. 10, 760(2014).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+single-step+induction+of+functional+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells.</a> Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).</li>
<li>Reinhardt, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+expansion+using+only+small+molecules+of+human+neural+progenitors+for+neurodegenerative+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling.</a> PloS one. 8 (3), 59252(2013).</li>
<li>Kriks, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+neurons+derived+from+human+ES+cells+efficiently+engraft+in+animal+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease.</a> Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).</li>
<li>Koch, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-Synuclein+affects+neurite+morphology%2C+autophagy%2C+vesicle+transport+and+axonal+degeneration+in+CNS+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+death+%26+disease%22%5BJournal%5D)">Alpha-Synuclein affects neurite morphology, autophagy, vesicle transport and axonal degeneration in CNS neurons.</a> Cell death & disease. 6, 1811(2015).</li>
<li>Korecka, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+Collapse+and+Altered+ER+Ca2%2B+Control+in+Human+Parkinson+Disease+Patient+iPSC-Derived+Neurons+with+LRRK2+G2019S+Mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+reports%22%5BJournal%5D)">Neurite Collapse and Altered ER Ca2+ Control in Human Parkinson Disease Patient iPSC-Derived Neurons with LRRK2 G2019S Mutation.</a> Stem cell reports. 12 (1), 29-41 (2019).</li>
<li>Mehta, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Huntington%27s+Disease+iPSC-Derived+Cortical+Neurons+Display+Altered+Transcriptomics%2C+Morphology%2C+and+Maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Human Huntington's Disease iPSC-Derived Cortical Neurons Display Altered Transcriptomics, Morphology, and Maturation.</a> Cell reports. 25 (4), 1081-1096 (2018).</li>
<li>Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-BLAST%3A+a+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC bioinformatics. 13, 134(2012).</li>
<li>Spandidos, A., Wang, X., Wang, H., Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PrimerBank%3A+a+resource+of+human+and+mouse+PCR+primer+pairs+for+gene+expression+detection+and+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">PrimerBank: a resource of human and mouse PCR primer pairs for gene expression detection and quantification.</a> Nucleic acids research. 38, Database issue 792(2010).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Wprowadzamy zautomatyzowany system hodowli komórkowych ze zintegrowanymi możliwościami obrazowania w celu standaryzacji hodowli hiPSC i różnicowania neuronów. Ze względu na minimalną interwencję użytkownika, zmienność eksperymentalna jest niska, co zapewnia odtwarzalność fenotypów komórkowych podczas różnicowania. Harmonogram oparty na kalendarzu wspiera organizację i równoległość eksperymentów oraz zapewnia wysoki stopień elastyczności w czasie przeprowadzania eksperymentów. Istniejące metody można łatwo dostosować, a spektrum dostępnych metod można zwiększyć. Dodatkowo można zastosować dużą liczbę formatów płytek testowych, co zwiększa elastyczność tego systemu. Minimalny system składający się z inkubatora CO2 , ramienia robota, cytometru komórkowego w jasnym polu i stacji obsługi cieczy stanowi podstawową jednostkę potrzebną do hodowli i różnicowania hiPSC, przy przystępnych kosztach dla akademickich laboratoriów badawczych. Połączenie zautomatyzowanego systemu hodowli komórkowych ze zautomatyzowanym systemem przechowywania w temperaturze -20 °C do przechowywania związków, bibliotekami RNAi lub bibliotekami CRISPR/Cas9 oraz integracja mikroskopu o wysokiej zawartości i wysokiej przepustowości umożliwiają przeprowadzanie badań przesiewowych fenotypów.
W obecnym badaniu zautomatyzowany system hodowli komórkowej wykorzystywał jednorazowe końcówki, a pożywka hodowlana była ponownie napełniana ręcznie do zbiornika, ograniczając w ten sposób użycie stacji obsługi cieczy do zmiany pożywki i innych procesów hodowlanych, zwłaszcza w nocy. Aby obejść to ograniczenie, metody można dostosować do użycia igieł zamiast jednorazowych końcówek, a po zainstalowaniu połączeń rurowych między przewodami mediów a workami na nośniki przechowywanymi w lodówce, zbiorniki na media mogą być automatycznie napełniane świeżymi mediami wstępnie podgrzanymi przez elementy grzejne. Zmniejszyłoby to ingerencję użytkownika spowodowaną ręcznym napełnianiem końcówek, pożywek hodowlanych i wymiany zbiorników.
Nasz zautomatyzowany system hodowli komórkowych ma kilka zalet. Jednym z nich jest system śledzenia kodów kreskowych. Płytki załadowane do systemu są identyfikowane za pomocą unikalnego kodu kreskowego, który jest odczytywany i zapisywany przez system, co pozwala na śledzenie próbek w trakcie i po wykonaniu metody. Kolejną zaletą jest możliwość tworzenia projektów dostosowanych do potrzeb użytkownika. Tutaj wgrane do systemu płytki hodowlane mogą być przypisane do konkretnego projektu i pogrupowane w partie. Strukturyzacja w partiach upraszcza wykonanie tej samej procedury dla wszystkich płyt z danej partii, ponieważ nie trzeba wybierać pojedynczych płytek. Dodatkowo edytor klas cieczy pozwala dostosować prędkość i wysokość pipetowania, a także parametry zasysania i dozowania dla każdego etapu transferu cieczy. Każdy proces jest dokumentowany w plikach dziennika, co pozwala prześledzić, jakie zadania zostały wykonane dla danej kultury lub płytki testowej.
Neurony i inne typy komórek pochodzące z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) są użytecznymi narzędziami in vitro do badania mechanizmów chorób neurodegeneracyjnych w określonych populacjach pacjentów (np. neurony dopaminergiczne w chorobie Parkinsona), oferując możliwość spersonalizowanych badań przesiewowych leków. Hodowla hiPSC jest bardzo czasochłonna i wymaga przeszkolonych osób do wykonywania złożonych protokołów różnicowania, zwykle ograniczonych do produkcji na małą skalę. Dostosowaliśmy hodowlę hiPSC bez karmienia do zautomatyzowanej hodowli i wdrożyliśmy dwa protokoły różnicowania neuronów, protokół szybkiego różnicowania neuronów korowych oparty na nadekspresji NGN2 pod promotorem tet-on10,11 oraz długoterminowy protokół oparty na małych cząsteczkach do generowania neuronów dopaminergicznych śródmózgowia (mDA)13. Prosty transfer i odtwarzalność ręcznych protokołów hodowli i różnicowania sprawia, że zautomatyzowany system hodowli jest bardzo przydatny. Ludzkie iPSC hodowane w zautomatyzowanym systemie hodowli komórek wykazywały spójną morfologię komórek macierzystych i wykazywały ekspresję ważnych markerów pluripotencji, odtwarzalnych między niezależnymi eksperymentami. Ponadto automatyzacja protokołu hodowli hiPSC sprzyjała hodowli i równoległej ekspansji większej liczby linii komórkowych. Zautomatyzowane kontrole zbieżności, które miały być przeprowadzane w nocy, pozwoliły zaoszczędzić czas, pozostawiając system wolny w ciągu dnia na dalsze etapy procesu przeprowadzane, gdy użytkownik był w laboratorium (np. pobieranie komórek lub ręczne ponowne powlekanie w celu rozróżnienia). Po osiągnięciu zdefiniowanego przez użytkownika progu konfluencji, komórki są pasażowane i ponownie powlekane płytkami pokrytymi macierzą zewnątrzkomórkową dostępnymi na układarce automatycznego systemu hodowli komórek. Każda runda pasażu trwa około 70 minut i generuje cztery płytki 1-dołkowe z jednej płytki macierzystej, co przekłada się na wydajność 20 pasaży w ciągu dnia.
Automatyzacja protokołu różnicowania NGN2 zakończyła się sukcesem i pozwoliła na wygenerowanie jednorodnej populacji komórek neuronalnych w różnych kanałach i porównywalnej z różnicowaniem ręcznym. Co więcej, koszty eksperymentalne badań przesiewowych na dużą skalę obejmujących wiele linii komórkowych lub eksperymentów przesiewowych z tysiącami warunków/związków testowych zostałyby zmniejszone ze względu na szybkie różnicowanie. Opłacalne i wysokoprzepustowe odczyty, w tym pomiary wzrostu neurytów w żywych komórkach, można łatwo opracować, wdrożyć i wykorzystać jako odczyty fenotypowe do modelowania choroby, jak pokazano wcześniej 14,15,16. W związku z tym dostosowaliśmy protokół NGN2 za pomocą komórek prekursorowych neuronów pochodzących z małych cząsteczek (smNPC), które konstytutywnie wykazują nadmierną ekspresję GFP. Komórki smNPC oferują dalsze korzyści, w tym niższe koszty pożywek hodowlanych (jedna trzecia kosztów hodowli iPSC) oraz czas potrzebny na zwiększenie skali eksperymentów. Wydajność komórek z smNPC jest od 7 do 10 razy wyższa niż w przypadku iPSC. Różnicujące się neurony były z powodzeniem monitorowane i obrazowane przez kilka dni przy użyciu w pełni zautomatyzowanego procesu obrazowania bez konieczności ręcznego barwienia przeciwciał lub znakowania chemicznego, co pozwoliło zaoszczędzić koszty i czas potrzebny na ręczne procedury, w tym samo obrazowanie. Obecne obrazowanie wewnętrznych 60 dołków 96-dołkowej płytki zajmuje około 16 minut na płytkę, gdy obrazowanych jest 25 pól na dołek, co oznacza, że dane do badań przesiewowych opartych na obrazowaniu dla 1000 związków można uzyskać i przeanalizować w ciągu jednego dnia. W przyszłości odczyt ten może zostać wykorzystany w złożonych badaniach przesiewowych w celu ratowania defektów wzrostu neurytów.
Ponadto demonstrujemy również transfer protokołu ręcznego różnicowania do generowania neuronów dopaminergicznych śródmózgowia (mDA) z iPSC. Ten protokół różnicowania oparty na małych cząsteczkach trwa 65 dni i jest pracochłonny ze względu na wiele etapów powlekania i częste zmiany podłoża, zwykle co 2 dni, co ogranicza produkcję neuronów mDA do kilku linii iPSC w tym samym czasie. Zautomatyzowany protokół różnicowania mDA ma tę wielką zaletę, że umożliwia skalowanie różnicowania do dziesiątek linii iPSC. Równolegle można różnicować do 30 linii komórkowych. Ponieważ różnicowanie opiera się głównie na zmianach mediów, prawie cały proces różnicowania może być przeprowadzony bez ingerencji człowieka. Korzystając z harmonogramu opartego na kalendarzu zautomatyzowanego systemu, mogliśmy zaplanować zmiany mediów zgodnie z krokami różnicowania. Jednym z ograniczeń pracy z tak dużą liczbą linii komórkowych i płytek hodowlanych był brak możliwości przeprowadzenia nocnych zmian pożywki. Głównym powodem jest fakt, że nasz system jest przystosowany do używania jednorazowych końcówek i ręcznego napełniania pożywek hodowlanych, co wymaga od użytkownika w laboratorium wykonania tego ręcznego kroku. Aby ułatwić proces wymiany nośników, płyty załadowane do systemu zostały przypisane do projektu i pogrupowane w partie. Wielkość partii została następnie dostosowana do liczby jednorazowych końcówek i objętości dostępnych pożywek hodowlanych. Jak wspomniano powyżej, ograniczenie to można łatwo przezwyciężyć poprzez wdrożenie igieł wielokrotnego użytku/zmywalnych i automatyczne uzupełnianie pożywki. Zautomatyzowane pasażowanie/ponowne powlekanie komórek, jak pokazano w przypadku iPSC, jest jednym z udogodnień oferowanych przez nasz zautomatyzowany system hodowli komórkowych. Przetestowaliśmy automatyczne ponowne powlekanie neuronów mDA w 25 dniu różnicowania. Jednak dysocjacja neuronów mDA wymaga dłuższej (40 min) inkubacji z enzymem dysocjacyjnym niż iPSC (8 min), wydłużając automatyczny proces ponownego powlekania do ponad 1 godziny na linię komórkową. W konsekwencji zautomatyzowane ponowne powlekanie 30 linii komórkowych w ciągu jednego dnia stało się niemożliwe. Przyspieszenie innych etapów automatycznego powlekania (transport płytek, pipetowanie) oraz dostosowanie systemu do użycia igieł i linii pożywki, która umożliwia pracę w ciągu jednej nocy, rozwiązałoby to ograniczenie. Pomimo wad, udało nam się przenieść protokół manualny do automatycznego różnicowania neuronów mDA produkujących kultury ze znacznymi ilościami komórek dodatnich MAP2 (neuron) i TH (neurony mDA).
Równoległe różnicowanie kilkudziesięciu linii komórkowych iPSC cieszy się dużym zainteresowaniem w projektach zajmujących się badaniem mechanizmów molekularnych chorób neurodegeneracyjnych, w tym choroby Parkinsona. Jednak szybsze wykonywanie zadań, przy mniejszej liczbie błędów i przy niższych kosztach jest dużym wyzwaniem. Dzięki automatyzacji prezentowanych tu protokołów (iPSC, smNPC i neuron mDA) mogliśmy przyspieszyć, obniżyć koszty i zwiększyć odtwarzalność w naszych projektach. Rozwój projektów takich jak FOUNDIN-PD (https://www.foundinpd.org/wp/) obejmujących setki linii komórkowych pacjentów wskazuje na potrzebę zautomatyzowanych protokołów hodowli i różnicowania. Nasze perspektywy na przyszłość obejmują transfer ręcznych trójwymiarowych (3D) modeli hodowli komórkowych do zautomatyzowanego systemu. Drobne modyfikacje w ustawieniach definicji płytki i użycie adapterów pozwolą na użycie komercyjnych lub niestandardowych płytek i komór mikroprzepływowych wymaganych do hodowli 3D. Co więcej, wdrożenie zautomatyzowanego modelu obrazowania bez znaczników pozwoli nam śledzić wzrost neuronów w czasie rzeczywistym i przełożyć zmiany w przeroscie neurytów, organizacji neuronów i śmierci komórek na lepsze zrozumienie mechanizmów choroby.

Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) są samoodnawiające się i mogą różnicować się w prawie każdym typie dorosłego komórki. Te cechy sprawiają, że hiPSC jest użytecznym narzędziem do modelowania chorób w badaniach podstawowych i odkrywaniu leków1. Ludzki iPSC zachowuje tło genetyczne dawcy, co pozwala na wyprowadzenie typów komórek istotnych dla choroby, które są najbardziej dotknięte/zaangażowane w przebieg choroby, na przykład różne podtypy neuronów dla chorób neurodegeneracyjnych2,3. Ponadto hiPSC pokonuje niektóre ograniczenia zwierzęcych i komórkowych modeli nadekspresji poprzez modelowanie chorób w kontekście człowieka i fizjologicznych poziomów ekspresji białek, a także okazał się cennym atutem w modelowaniu chorób od zaburzeń monogenowych, złożonych i epigenetycznych, a także chorób o późnym początku4.
Pomimo tych korzyści i możliwości, kilka ograniczeń hiPSC nadal wymaga rozwiązania. Obecne protokoły hodowli i różnicowania hiPSC nie są opłacalne, trudne do standaryzacji i są pracochłonne. Ręczne etapy hodowli mogą skutkować dużą zmiennością plonów i fenotypów ze względu na różnice we wzroście i spontaniczne różnicowanie hiPSC. W związku z tym należy zmniejszyć zmienność zależną od eksperymentatora poprzez wdrożenie bardziej ustandaryzowanych technik obsługi i uproszczenie protokołów, co można osiągnąć za pomocą automation5. Ustanowienie zautomatyzowanych protokołów hodowli i różnicowania hiPSC ustanowi wspólne standardy zarówno dla akademickich, jak i przemysłowych projektów badawczych, a także umożliwi tworzenie biologicznie istotnych modeli chorób i bardziej odtwarzalnych wyników.
Poprzednie prace próbowały automatyzacji kultur hiPSC6,7,8, ale ich protokoły były ograniczone do określonych formatów płytek do hodowli komórkowych zależnych od systemu i pozbawionych możliwości adaptacji do różnych formatów testów. Takie systemy są przydatne w łączeniu komórek, ale mogą nie być odpowiednie do automatycznego różnicowania w pożądane typy komórek, fenotypowania chorób i celów przesiewowych. Dodatkowo, opisana została zautomatyzowana platforma na dużą skalę do wyprowadzania, generowania i różnicowania hiPSC9, ale na skalę, którą można osiągnąć tylko przez wysokowydajne laboratoria zajmujące się produkcją linii, co wydaje się atrakcyjne, ale może być nieosiągalne dla wielu laboratoriów akademickich.
Opracowaliśmy w pełni zautomatyzowany system hodowli komórkowych oparty na stacji obsługi cieczy w środowisku filtrowanym przez HEPA (High-Efficiency Particulate Air) w połączeniu z inkubatorem CO2 o dużej pojemności, cytometrem obrazującym w jasnym polu i ramieniem robota do transportu płytek. Składniki te stanowią podstawę stabilnej i powtarzalnej hodowli i różnicowania hiPSC. Uzupełniliśmy system o zautomatyzowany system przechowywania w temperaturze -20 °C do przechowywania związków lub wirusów oraz szybki konfokalny obrazownik żywych komórek z wirującym dyskiem. Wygenerowano niestandardowe protokoły umożliwiające automatyczne wysiewanie komórek, zmiany pożywki, kontrole konfluencji, rozszerzanie komórek i generowanie płytek testowych z obróbką próbki i obrazowaniem płytek, dzięki czemu system jest kompatybilny z badaniami przesiewowymi o wysokiej zawartości i przepustowości. Zautomatyzowany system hodowli komórkowych i obrazowania jest obsługiwany za pomocą oprogramowania sterującego i dostosowanego do potrzeb użytkownika graficznego interfejsu użytkownika (GUI). Graficzny interfejs użytkownika umożliwia użytkownikom importowanie plików CSV zawierających parametry specyficzne dla linii komórkowej potrzebne do wykonania metody. Dodatkowo GUI umożliwia zaplanowanie wielu eksperymentów w dowolnej sekwencji za pomocą wbudowanego widoku kalendarza, co pozwala na pełną kontrolę nad czasem, w którym każda metoda się uruchamia.
Nasz zautomatyzowany system hodowli komórkowej wykorzystuje standardowe prędkości pipetowania, czasy przejścia, progi konfluencji, gęstości wysiewu i średnie objętości z elastycznością do hodowli komórek w różnych formatach płytek (format płytek 96-, 48-, 24-, 12-, 6- lub 1-dołkowych). Dostosowaliśmy niedawno opublikowany protokół krótkoterminowego różnicowania do przekształcania hiPSC w neurony, które mogą dać neurony TUBB3 dodatnie w ciągu 6 dni10,11. Ustaliliśmy również automatyczne różnicowanie i obrazowanie małocząsteczkowych neuronalnych komórek prekursorowych (smNPC) w neuronach konstytutywnie wyrażających GFP w ramach EF1a promotor12 i iPSC w neuronach dopaminergicznych śródmózgowia (mDA), adaptując wcześniej opublikowany protokół hamowania podwójnego SMAD13, który daje neurony mDA w ciągu 65 dni.

<table><tbody><tr><td><silny>Przeciwciała</silny><</td><td>silny>Dystrybutor</silny></td><td><silny>Numer katalogowy</silny></td><td><silny>Rozcieńczenie</silny></td></tr><tr><td><silny>marker pluripotencji iPSC</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mysz anty-SSEA4</td><td>Abcam</td><td>ab16287</td><td>1 do 33</td></tr><tr><td>Królik anty-Oct3/4</td><td>Abcam</td><td>ab19857</td><td>od 1 do 200</td></tr><tr><td><silne> markery neuronów NGN2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty-TUBB3</td><td>R & D</td><td>MAB1195</td><td>1 do 500</td></tr><tr><td>Królik anty-BRN2</td><td>NEB</td><td>12137</td><td>1 do 1,000</td></tr><tr><td><silne>mDA markery neuronów</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chicken anty-TH</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>12137</td><td>1 do 750</td></tr><tr><td>Mysie przeciwciała anty-MAP2</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-74421</td><td>1 do 750</td></tr><tr><td><silne>Przeciwciała drugorzędowe</silne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-kurczak IgY, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11039</td><td>1 do 2,000</td></tr><tr><td>Kozia anty-mysie IgG, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td>1 do 2,000</td></tr><tr><td>Kozia anty-mysia IgG, Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11032</td><td>1 do 2,000</td></tr><tr><td>Kozia anty-królicza IgG, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>1 do 2,000</td></tr><tr><td>Kozia anty-królik IgG, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>1 do 2,000</td></tr><tr><td>Kozia anty-królicza IgG, Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11012</td><td>1 do 2,000</td></tr><tr><td><silne>Przeciwbarwienie jąder</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechest 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>1 do 8,000</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><silne>Instrumenty</silne> </td><td>Distributor<</td><td>strong>Numer katalogowy</td><td>Opis/Zastosowanie</td></tr><tr><td>Agilent System TapeStation</td><td>Agilent technologies</td><td>4200</td><td>Automatyczna elektroforeza dla próbek DNA i RNA</td></tr><tr><td>Zautomatyzowane -20 &deg; System przechowywania C</td><td>Hamilton Storage Technologies</td><td>Sample Access Manager (SAM -20C, seria 3200)</td><td>Przechowywanie odczynników</td></tr><tr><td>Czytnik kodów kreskowych</td><td>Czytnik kodów kreskowych</td><td>Honeywell</td><td>Skaner kodów kreskowych</td>Orbit</tr><tr><td>Cytomat komórkowy Brightfield Zliczanie komórek CellVoyagem</td><td></td><td>Celigo</td><td>Confluence i </td></tr><tr><td>CellVoyager 7000</td><td>Yokogawa</td><td>CellVoyager 7000</td><td>Zautomatyzowany mikroskop konfokalny </td></tr><tr><td>Cytomat do hodowli komórkowych</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cytomat 24 C, CU</td><td>12 wózków widłowych o rozstawie 28 mm, 12 wózków widłowych o rozstawie 23 mm (łącznie 456 płytek)</td></tr><tr><td>Cytomat do rozmrażania próbek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cytomat 2-LIN, 60 DU (Jednostka susząca)</td><td>2 wózki widłowe o rozstawie 28 mm (łącznie 42 płyty)</td></tr><tr><td>Filtry HEPA</td><td>Hamilton Robotics</td><td>Hood Flow Star UV</td><td>Zmodyfikowany przez Hamilton Robotics</td></tr><tr><td>Stacja obsługi cieczy</td><td>Hamilton Robotics</td><td>Microlab</td><td>Star Kanały: 8x 1-ml, 4x 5 ml i 96-kanałowy</td></tr><tr><td>MPH Zbiornik mediów</td><td>Hamilton Robotics</td><td>188211APE</td><td>Zbiornik mediów/odczynników</td></tr><tr><td>System czystej wody</td><td>Veolia Water</td><td>ELGA PURELAB Classic</td><td>Dostarcza czystą wodę do stacji mycia igieł </td></tr><tr><td>System PCR QuantStudio 12K Flex w czasie rzeczywistym </td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>QSTUDIO12KOA</td><td>Maszyna do PCR w czasie rzeczywistym</td></tr><tr><td>Ramię robota</td><td>Hamilton Robotics</td><td>Rackrunner</td><td>Transport płyt</td></tr><tr><td>Stół obrotowy</td><td>Hamilton Robotics</td><td></td><td>Dostosuj orientację płyty</td></tr><tr><td>Zasilacz bezprzerwowy</td><td>APC</td><td>Smart UPS RT, Moc 10000 VA zasilanie</td><td>Zasilanie</td></tr><tr><td>awaryjne VIAFLO-pipety</td><td>Integra</td><td>4500</td><td>Pipeta elektroniczna</td></tr><tr><td>ViiA 7 System Real-Time PCR</td><td>Applied Biosystems</td><td>4453545</td><td>Maszyna</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> do PCR w czasie rzeczywistym<tr><td><silna>Materiały</mocna></td><td><silna>Dystrybutor</mocna></td><td><silna>Numer katalogowy</td><td>Notes</td></tr><tr><td>1-dołkowa płytka hodowlana (84 cm2)</td>6-dołkowe płytki hodowlane <td>Thermo Fischer Scientific</td><td>165218</td><td>Nunc OmniTray</td></tr><tr><td>(9,6 cm2)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657160</td><td>TC z pokrywką</td></tr><tr><td>12-dołkowa płytka hodowlana (3,9 cm2)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>665180</td><td>TC traktowana pokrywką</td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka hodowlana (0,32 cm2)</td><td>Perkin Elmer</td><td>6005558</td><td>CellCarrier-96</td></tr><tr><td>płytka Końcówki, 50-&mikro; L</td><td>Hamilton Robotics</td><td>235987</td><td>50-uL końcówki</td></tr><tr><td>Końcówki, 300-&mikro; L</td><td>Hamilton Robotics</td><td>235985</td><td>300-&mikro; L</td></tr><tr><td>końcówki Końcówki, 1000-&mikro; L</td><td>Hamilton Robotics</td><td>235939</td><td>1000-&mikro; Końcówki L</td></tr><tr><td>, 5 ml</td><td>Hamilton Robotics</td><td>184022</td><td>Końcówki 5 ml</td></tr><tr><td>Probówki, 15 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>Probówki 15 ml</td></tr><tr><td>Probówki, 50 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>Fiolki kriogeniczne 2,0 ml</td><td>Nalgene Sigma Aldrich</td><td>V5007</td><td>Kriowialiki</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plazmidy</td><td>Distributor<</td><td>strong>Numer katalogowy</td><td>Notes</td></tr><tr><td>pLV_hEF1a_rtTA3</td><td>Addgene</td><td>61472</td><td>Miły prezent od Rona Weissa</td></tr><tr><td>pLV_TRET_hNgn2_UBC_Puro</td><td>Addgene</td><td>61474</td><td>Uprzejmy prezent od Rona Weissa</td></tr><tr><td>pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 lentivirus</td><td>Takara Bio</td><td>631983</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><silny>Startery</strong</td><td>><silny>Sekwencja (naprzód)</silny></td><td><silny>Sekwencja (odwrotna)</silny></td><td><silny>Źródło</td></tr><tr><td><silny>iPSC pluripotencja</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OCT4 (ID 4505967a1)</td><td>CTTGAATCCCGAATGGAAAGGG</td><td>GTGTATATCCCAGGGTGTTCTC</td><td>PrimerBank</td></tr><tr><td>NANOG (ID 153945815c3)</td><td>CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA</td><td>CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC</td><td>PrimerBank</td></tr><tr><td>REX1 (ID 89179322c1)</td><td>AGAAACGGGCAAAGACAACACGTCTATTTCCGC</td><td></td><td>PrimerBank</td></tr><tr><td>NGN2 neurons</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MAP2 (ID 87578393c1)</td><td>CTCAGCACCGCTAACAGAGG</td><td>CATTGGCCTTCGGACAAG</td><td>PrimerBank</td></tr><tr><td>BRN2 (ID 380254475c1)</td><td>CGGCGGATCAAACTGGGATTT</td><td>TTGCCTGCGATCTTGTCTAT</td><td>PrimerBank</td></tr><tr><td>CUX2 (ID 291045458c2)</td><td>CGAGACCTCCACACTTCGTG</td><td>TGTTTTTCCGCCTCATTTCTCTG</td><td>PrimerBank</td></tr><tr><td>NCAM1 (ID 336285437c3)</td><td>TGTCCGATTCATAGTCCTGTCC</td><td>CTCACAGCGATAAGTGCCCTC</td><td>PrimerBank</td></tr><tr><td>SYNAPSIN1 (ID 91984783c3)</td><td>TGCTCAGCAGTACACGTACC</td><td>GACACTTGCGATGTCCTGGAA</td><td>PrimerBank</td></tr><tr><td>mDA neurony</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TH</td><td>CGGGCTTCTCGGACCAGAGGTA</td><td>CTCCTCGGGGGTGTACCACA</td><td>NCBI primer-BLAST</td></tr><tr><td>MAP2</td><td>GGATCAACGGAGAGCTGAC</td><td>TCAGGACTGTACAGCCTCA</td><td>NCBI primer-BLAST</td></tr><<tr><td>strong>Housekeeping genes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG</td><td>GAGCCCCAGCCCTCTCCATG</td><td>NCBI primer-BLAST</td></tr><tr><td>OAZ1</td><td>AGCAAGGACAGCTTTGCAGTT</td><td>ATGAAGACATGGTCGGCTCTCG</td><td>NCBI primer-BLAST</td></tr><tr><td>RPLPO</td><td>CCTCATATCCGGGGGAATGTG</td><td>GCAGCAGCTGGCACCTTATTG</td><td>NCBI primer-BLAST</td></tr><tr><td>RPL13A</td><td>GCCTACAAGAAAGTTTGCCTATC</td><td>TGGCTCTCTCTTCTCTCTCTCTC</td><td>NCBI starter-BLAST</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pożywki i odczynniki<</td><td>strong>Dystrybutor</td><td>Numer katalogowy</td><td>Użyj stężenia</td></tr><tr><td>Coating matrix</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extracellular matrix (Matrigel)</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>10 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Fibronektyna</td><td>Corning</td><td>356008</td><td>2 &m; g/ml</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td>5 - 10 &mu; g / ml</td></tr><tr><td>Poli-L-ornityna (PLO)</td><td>Sigma</td><td>P3655</td><td>0,1 mg / ml</td></tr> <tr><td>Pożywka hodowlana</td>iPSC pożywka hodowlana<<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>br/> (pożywka Essential 8 Flex)</td><td>Neurony Gibco</td><td>A2858501</td><td></td></tr><tr><td>NGN2 - NGN2 medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>0,909 ml (50 &mikro; M)</td></tr><tr><td>B27 suplement</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td>10 ml (1%)</td></tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31331093</td><td>484,75 mL</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>5 ml (2 mM)</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td>0,25 ml (2,5 &mikro; g/ml)</td></tr><tr><td>MEM Aminokwasy endogenne</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>5 ml (0,5%)</td></tr><tr><td>Suplement N2</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>5 ml (0,5%)</td></tr><tr><td>Pożywka neurobazalna</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>485 mL</td></tr><tr><td>mDA neurony - SRM medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>0,5 ml (55 &mikro; M)</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>5 ml (2 mM)</td></tr><tr><td>Knockout DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>12660012</td><td>409,5 ml</td></tr><tr><td>Zamiennik surowicy do nokautu (wymiana surowicy)</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td>75 ml (15%)</td></tr><tr><td>MEM Aminokwasy endogenne</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>5 ml (1%)</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>5 ml (1%)</td></tr><tr><td>mDA neurons - N2 medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 suplement</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td>10 ml (2%)</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>5 ml (2 mM)</td></tr><tr><td>Suplement N2</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>5 ml (1%)</td></tr><tr><td>Podłoże neuropodstawowe</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>475 ml</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>5 ml(1%)</td></tr><tr><td><silne>mDA neurony - Pożywka różnicująca</silna></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 suplement</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td>10 ml (2%)</td></tr><tr><td>Pożywka neurobazalna</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>485 ml</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>5 ml (1%)</td></tr><tr><td><silne>neurony NGN2 - Suplementy</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>czynnik neurotroficzny pochodzenia mózgowego (BDNF)</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td>10 ng / ml</td></tr><tr><td>CHIR99021 (CHIR)</td><td>R& D</td><td>4423/10</td><td>2 &mu; M</td></tr><tr><td>Doksycylina (dox)</td><td>Sigma</td><td>D9891</td><td>2.5 &mu; g / ml</td></tr><tr><td>Czynnik neurotroficzny pochodzenia glejowego (GDNF)</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>2-fosforan kwasu L-askorbinowego magnez (AA2)</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td>64 mg/L</td></tr><tr><td>Czynnik neurotroficzny-3 (NT-3)</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>Purmorphamine (PMA)</td><td>Cayman</td><td>10009634</td><td>0,5 &mu; M</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma</td><td>P8833-10MG</td><td>0,5 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Tiazovivin</td><td>Merk Millipore</td><td>420220-10MG</td><td>2 &mu; Neurony M</td></tr><tr><td>mDA - Suplementy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Czynnik neurotroficzny pochodzenia mózgowego (BDNF)</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>CHIR99021 (CHIR)</td><td>R& D</td><td>4423/10</td><td>3 & mu; M</td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Kajman</td><td>13197</td><td>10 &mikro; M</td></tr><tr><td>Dibutyryl-cAMP (db-cAMP)</td><td>Sigma</td><td>D0627</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu fibroblastów 8B (FGF-8b)</td><td>Peprotech</td><td>100-25</td><td>100 ng / mL</td></tr><tr><td>Czynnik neurotroficzny pochodzenia glejowego (GDNF)</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>20 ng / ml</td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy (AA1)</td><td>Sigma</td><td>A4403</td><td>0,2 mM</td></tr><tr><td>LDN193189 (LDN)</td><td>Kajman</td><td>11802</td><td>100 nM</td></tr><tr><td>Purmorphamine (Purm)</td><td>Kajmany</td><td>10009634</td><td>2 &mu; M</td></tr><tr><td>Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus (SHH)</td><td>R& D</td><td>1845-SH</td><td>100 ng / ml</td></tr><tr><td>SB431542 (SB)</td> <td>Kajmany</td><td>13031</td><td>10 &mu; M</td></tr><tr><td>Transformujący współczynnik wzrostu typu &szlig; 3 (TGF&szlig; 3)</td> <td>R & D</td><td>243-B3</td><td>1 ng / ml</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Kajmany</td><td>10005583</td><td>10 i mikro; Odczynniki do</td></tr> <tr><td>dysocjacji M</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do dysocjacji pojedynczych komórek (StemPro Accutase)</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>1x</td></tr><tr><td>UltraPure 0,5M EDTA, pH 8,0</td><td>Gibco</td><td>11575020</td><td>0,5 mM</td></tr><tr><td>zestaw do izolacji RNA i cDNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNA zestaw do izolacji</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>Rneasy MiniKit</td></tr><tr><td>Bufor do lizy RNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td>Bufor do lizy Trizol (RNA bufor do lizy</td></tr>)<tr><td>Odwrotna transkryptaza (zestaw)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18080-085</td><td>SuperScript III Reverse Transkryptaza</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Opis/Zastosowanie</td></tr><tr><td>Cell Culture Framework (CCF) (Graficzny interfejs użytkownika, GUI)</td><td>Hamilton Robotics</td><td>Dedykowany</td><td>interfejs użytkownika dla zautomatyzowanego systemu</td></tr><tr><td>Oprogramowanie CellPathFinder (oprogramowanie do analizy obrazu 1)</td><td>Oprogramowanie Yokogawa</td><td>CellPathfinder HCS</td><td>Narzędzie do analizy obrazu</td></tr><tr><td>System pomiarowy CellVoyager</td><td>Yokogawa</td><td>W zestawie Oprogramowanie sterujące mikroskopem CellVoyager 7000</td><td> </td></tr><tr><td>Oprogramowanie Columbus (oprogramowanie do analizy obrazu 2)</td> <td>Perkin Elmer</td><td>Columbus</td><td>Narzędzie do analizy obrazu</td></tr> Aplikacja <tr><td>qPCR oparta na chmurze</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Themo Fisher</td> Oprogramowanie do analizy chmury <td>dla danych qRT-PCR</td></tr><tr><td>Wenus oprogramowanie</td><td>Hamilton Robotics</td><td>VENUS Two Dynamic Schedular 5.1 Software</td><td>Oprogramowanie sterujące dla zautomatyzowanego systemu </td></tr></tbody></table>

zautomatyzowana produkcja indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronów korowych i dopaminergicznych pochodzących z komórek macierzystych ze zintegrowanym monitorowaniem żywych komórek

Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

Protokoły ręcznej hodowli i różnicowania dla ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) są trudne do standaryzacji, wykazują dużą zmienność i są podatne na spontaniczne różnicowanie się w niechciane typy komórek. Metody te są pracochłonne i nie są łatwe do przeprowadzenia w eksperymentach na dużą skalę. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowaliśmy zautomatyzowany system hodowli komórkowej sprzężony z wysokoprzepustowym systemem obrazowania i wdrożyliśmy protokoły utrzymywania wielu linii hiPSC równolegle i różnicowania neuronów. Opisujemy automatyzację krótkoterminowego protokołu różnicowania wykorzystującego nadekspresję neurogeniny-2 (NGN2) w celu wytworzenia neuronów korowych pochodzących z hiPSC w ciągu 6-8 dni oraz wdrożenie długoterminowego protokołu różnicowania w celu wygenerowania neuronów dopaminergicznych śródmózgowia pochodzących z hiPSC w ciągu 65 dni. Zastosowaliśmy również podejście NGN2 do małocząsteczkowych nerwowych komórek prekursorowych (smNPC) transdukowanych lentiwirusem GFP i ustaliliśmy test wzrostu neurytów na żywych komórkach. Przedstawiamy zautomatyzowany system z protokołami odpowiednimi do rutynowej hodowli hiPSC i różnicowania w neurony korowe i dopaminergiczne. Nasza platforma nadaje się do długoterminowych hodowli bez użycia rąk oraz badań przesiewowych na bazie związków hiPSC, RNAi i CRISPR/Cas9 o wysokiej zawartości/wysokiej przepustowości w celu identyfikacji nowych mechanizmów chorobowych i celów leków.

Pokazujemy automatyzację indukowanych przez człowieka hodowli pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) i różnicowanie neuronów zgodne z automatycznym obrazowaniem i analizą.

Zautomatyzowana produkcja indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronów korowych i dopaminergicznych pochodzących z komórek macierzystych ze zintegrowanym monitorowaniem żywych komórek

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are ...

Ogólnym celem tego badania jest pokazanie, w jaki sposób można wdrożyć zautomatyzowane procedury hodowli i różnicowania ludzkich komórek IPS w linie neuronalne, a także ich automatyczne obrazowanie. Ustandaryzowane zautomatyzowane procedury pozwalają na niską zmienność eksperymentalną, zapewniając jednocześnie wysoką odtwarzalność fenotypową. Ponadto system może być dostosowany do opracowywania nowych protokołów.Procedury zademonstrują Joachim Tager i Elisangela Bressan, doktoranci z naszego laboratorium. W graficznym interfejsie użytkownika zautomatyzowanego systemu kliknij opcję Widok procesu instrumentu zasobu i wybierz proces instrumentu zasobu. Kliknij uruchom proces instrumentu i uruchom kaptur HEPA i procesy ponownego ładowania.Wybierz zasoby do załadowania, otwórz drzwi i załaduj płytki do hodowli komórkowych i jednorazowe końcówki w odpowiednich pozycjach, jak wskazano na wyskakujących obrazach. Następnie przed zamknięciem należy odkazić drzwi za pomocą 70% etanolu i uruchomić proces odkażania. System będzie sterylizowany promieniowaniem UV przez 30 minut.Aby załadować płytki pożywką hodowlaną lub odczynnikiem dysocjacyjnym, należy wykonać krok uruchomienia okapu HEPA i otworzyć drzwi stacji obsługi cieczy. Po odkażeniu 70% etanolem umieść zbiorniki na pokładzie w wyznaczonej pozycji i zdejmij z nich pokrywę. Zamknij drzwi stacji obsługi cieczy, a następnie uruchom proces instrumentu zasobów InitHepaHood, aby wyłączyć okap HEPA.Aby wykonać metodę hodowli automatycznej, w widoku kalendarza graficznego interfejsu użytkownika kliknij przycisk Dodaj krok procesu i wybierz linię komórkową, która ma zostać użyta w eksperymencie. Użyj kreatora, aby wybrać projekt i oznaczyć partię, która ma zostać użyta. Kliknij skierowany w prawo grot strzałki i przejdź do następnej strony kreatora, aby wybrać krok procesu do wykonania.Na ostatniej stronie kreatora zaplanuj eksperyment i ustaw odpowiednie parametry szczegółów zmiennych niezbędnych do uruchomienia metody. Następnie kliknij przycisk OK. Po załadowaniu 50-mililitrowej probówki zawiesiną ludzkich komórek IPS, załaduj powlekane płytki hodowlane do odbioru komórek na półce i wykonaj wysiew płytek metodą probówek. Aby policzyć komórki w cytometrze obrazującym Brightfield, automatycznie przygotuj 384-dołkową płytkę liczącą z zawieszeniem komórek na pokładzie i użyj ramienia robota, aby przenieść 384-dołkową płytkę zliczającą z pokładu do cytometru obrazującego Brightfield.Po zliczeniu system przywróci płytkę do jej pierwotnej pozycji i przeniesie powlekaną kulturę lub płytkę testową z półki na platformę pipetową. Następnie system wysiewa komórki w zdefiniowanej przez użytkownika liczbie i objętościach odpowiednich dla płytki i miesza przez pipetowanie. Po wysianiu płytka zostanie przeniesiona do wytrząsarki pokładowej na 10 sekund z prędkością 500 obrotów na minutę w celu rozprowadzenia komórek, zanim zostanie przeniesiona do inkubatora dwutlenku węgla.Aby ocenić zautomatyzowaną konfluencję, należy wykonać metodę konfluencji kontrolnej i wybrać partię, która zawiera co najmniej jedną płytkę hodowlaną i nie zawiera płytek testowych. W sekcji szczegółów parametrów wprowadź iPSCf_2020 akwizycji obrazu w ustawieniach analizy obrazowania. Następnie system przeniesie pierwszą płytkę z inkubatora do cytometru obrazującego Brightfield i zobrazuje zbieg komórek.Aby zmienić pożywkę z płytkami do hodowli komórkowych lub testów, należy wykonać metodę zmiany podłoża na płytkach hodowlanych i wybrać partię zawierającą tylko płytki hodowlane. System przeniesie płytki na pokład i przechyli płytki, aby umożliwić aspirację supernatantu. Supernatant zostanie wyrzucony do modułu zbiórki odpadów i wyrzucone końcówki, a do każdej płytki zostanie dodanych 12 mililitrów świeżego podłoża.Następnie system ponownie przykryje płytki i wprowadzi je z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych. Alternatywnie, aby zmienić pożywkę na płytkach testowych, należy wykonać metodę zmiany podłoża na płytkach testowych. Aby podhodować komórki, należy wykonać metodę subhodowli przylegających komórek i wybrać partię zawierającą płytki hodowlane, które wymagają poduprawy.Po wyrzuceniu pożywki, system przemyje komórki jeden raz ośmioma mililitrami PBS na płytkę, a następnie doda do komórek osiem mililitrów 0,5 milimolowego EDTA. Po ośmiu minutach na pokładzie z opcją przechylania, EDTA zostanie zastąpiona 12 mililitrami świeżego podłoża na talerz. System będzie potrząsał płytkami z prędkością 2 000 obrotów na minutę przez jedną minutę, aby usunąć kolonie, a następnie rozwarstwia komórki za pomocą pięciu cykli pipetowania, aby rozbić kolonie na grudki o wielkości od 50 do 80 mikronów.Komórki zostaną następnie przeniesione do 50-mililitrowej probówki na pokładzie przed wysiewem ich w stosunku jeden do siedmiu. W przypadku zautomatyzowanego obrazowania komórek o wysokiej zawartości i wysokiej przepustowości należy wykonać metodę obrazowania i wybrać partię, która zawiera co najmniej jedną płytkę testową i nie zawiera płytek hodowlanych. Następnie system przeniesie płytkę testową do automatycznego mikroskopu konfokalnego w celu obrazowania.Upewnij się, że wybrałeś prawidłowe identyfikatory partii i płyt podczas wykonywania wymaganych kroków procesu. Kultury hiPSC powinny być codziennie monitorowane pod kątem wzrostu i analizowane pod kątem ich procentowej zbieżności w cytometrze obrazowania Brightfield. Po pasażowaniu i ręcznej lub automatycznej hodowli systemowej komórki wykazują typową ekspresję markera komórek macierzystych i pluripotencji.Neurony zróżnicowane w zautomatyzowanym systemie hodowli wykazują podobną morfologię i organizację sieci neuronalnych do neuronów hodowanych ręcznie. Po sześciu dniach różnicowania, automatycznie różnicujące się neurony korowe są dodatnie pod względem specyficznej dla neuronu ekspresji beta-tubuliny klasy III i markera górnej warstwy korowej. Po ośmiu dniach komórki wykazywały również ekspresję białka 2 związanego z mikrotubulami, cząsteczki adhezyjnej komórek nerwowych i synapsyny I, a także markerów neuronów korowych.W hiPSC obserwuje się bardzo niską ekspresję tych markerów lub jej brak. System ten może być również wykorzystany do ustanowienia automatycznego testu wzrostu neurytów na żywych komórkach, który umożliwia pomiar długości neurytów w ciągu 11 dni różnicowania bez ręcznej interwencji. Wykorzystanie zautomatyzowanego systemu hodowli do przeprowadzania zmian pożywki w ciągu 65-dniowego okresu hodowli ułatwia różnicowanie hiPSC w neurony dopaminergiczne śródmózgowia o oczekiwanej organizacji komórkowej i morfologii.Oprócz wzrostu neurytów, inne zautomatyzowane testy fenotypowe istotne dla badania neurodegeneracji, na przykład ogniska RNA translokacji TDP-43 i wychwyt fibryli alfa-synukleiny, można badać przy użyciu tego formatu o wysokiej przepustowości i wysokiej zawartości.

automated-production-human-induced-pluripotent-stem-cell-derived

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opracowaliśmy protokół indukcji neuroblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z zastosowaniem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów neuronalnych oraz typów komórek neuronalnych rozwijającego się OUN w celu regeneracji tkanki nerwowej.

Efektywne wyprowadzanie ludzkich progenitorów neuronalnych i neuronów z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z zastosowaniem indukcji małymi cząsteczkami

Protokoły różnicowania neuronalnego pluripotencjalnych ludzkich komórek macierzystych (hPSCs) są często czasochłonne i wymagają zaawansowanych umiejętności w hodowli komórkowej. W niniejszej pracy dostosowaliśmy procedurę różnicowania opartą na małych cząsteczkach do formatu płytek wielodobojowych, co umożliwia prostą, szybką i wydajną generację ludzkich neuronów w sposób kontrolowany.

Szybka i wydajna generacja neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w formacie płyt wielodołkowych

Ten film demonstruje metodę różnicowania ludzkich neuronalnych komórek progenitorowych (NPC) w neurony. NPC są wprowadzane do ustalonej kokultury neuronów korowych astrocytów myszy i szczurów, promując różnicowanie NPC w neurony. Różnicowanie potwierdza się poprzez wizualizację komórek pod mikroskopem konfokalnym.

Technika kohodowli do różnicowania ludzkich neuronalnych komórek progenitorowych w neurony

Film demonstruje metodę generowania pobudzających neuronów korowych z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC). Po indukcji doksycykliny hiPSC wykazują nadekspresję neurogeniny-2, czynnika transkrypcyjnego specyficznego dla neuronów. Dzięki zastosowaniu specyficznych pożywek i wspólnej hodowli z astrocytami, proces ten ułatwia różnicowanie się hiPSC w neurony z połączeniami synaptycznymi.

Różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w neurony na układach mikroelektrod

My, opierając się na wiedzy z biologii rozwojowej i opublikowanych badaniach, opracowaliśmy zoptymalizowany protokół do efektywnego generowania neuronów dopaminergicznych A9 śródmózgowia zarówno z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, jak i ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, co byłoby przydatne do modelowania chorób i terapii zastępczej w chorobie Parkinsona.

Ukierunkowane różnicowanie neuronów dopaminergicznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Dendrytyczne kolce neuronów piramidowych są miejscami najbardziej pobudzających synaps w korze mózgowej ssaków. Metoda ta opisuje ilościową analizę 3D morfologii kręgosłupa w ludzkich korowych piramidowych neuronach glutaminergicznym pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Trójwymiarowa kwantyfikacja kolców dendrytycznych z neuronów piramidowych pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Modyfikujemy i wdrażamy wcześniej opublikowany protokół opisujący szybkie, powtarzalne i efektywne różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) w pobudzające neurony korowe12. W szczególności nasza modyfikacja pozwala na kontrolę gęstości komórek neuronalnych i wykorzystanie ich na układach mikroelektrod do pomiaru właściwości elektrofizjologicznych na poziomie sieci.

Szybkie różnicowanie neuronalne indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do pomiaru aktywności sieci na układach mikroelektrod

Ten protokół opisuje szczegółową procedurę ponownego zawieszania i hodowli neuronów pochodzących z ludzkich komórek macierzystych, które wcześniej były odróżniane od progenitorów nerwowych in vitro przez wiele tygodni. Procedura ułatwia oparte na obrazowaniu testy neurytów, synaps i markerów neuronalnych o późnej ekspresji w formacie zgodnym z mikroskopią świetlną i badaniami przesiewowymi o wysokiej zawartości.

Powtórzenie po różnicowaniu ludzkich neuronów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych w celu przeprowadzenia badań przesiewowych neurytogenezy i dojrzewania synaps o wysokiej zawartości

Przedstawiony tutaj jest protokół generowania jednokomórkowej hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i ich późniejszego różnicowania w neuronalne komórki progenitorowe. Protokół jest prosty, solidny, skalowalny i odpowiedni do badań przesiewowych leków i zastosowań w medycynie regeneracyjnej.

Efektywne różnicowanie neuronalne przy użyciu hodowli jednokomórkowej ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Opisujemy metodę różnicowania rdzenia kręgowego, indukowanych przez człowieka astrocytów i neuronów pochodzących z pluripotencjalnych źródeł oraz ich wspólnej hodowli do zapisu elektrofizjologicznego.

Stworzenie platformy elektrofizjologicznej do modelowania ALS z wykorzystaniem specyficznych regionalnie astrocytów i neuronów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Dostępne systemy różnicowania komórek macierzystych pluripotencjalnych (PSC) do funkcjonalnych komórek są obecnie utrudnione przez problemy związane z poważną zmiennością między liniami i między partiami. Tutaj, używając różnicowania serca jako głównego przykładu, przedstawiamy protokół inteligentnego monitorowania i modulowania procesu różnicowania PSC w oparciu o uczenie maszynowe oparte na obrazie.

Strategia uczenia maszynowego oparta na obrazie żywych komórek do monitorowania różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poznaj zautomatyzowane metody hodowli i różnicowania hiPSC w neurony korowe i dopaminergiczne z monitorowaniem żywych komórek. System zapewnia wysoką powtarzalność fenotypową i minimalizuje zmienność eksperymentalną.

Zautomatyzowana produkcja indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronów korowych i dopaminergicznych pochodzących z komórek macierzystych ze zintegrowanym monitorowaniem żywych komórek (Wideo) | JoVE Journal

Zautomatyzowana produkcja indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronów korowych i dopaminergicznych pochodzących z komórek macierzystych ze zintegrowanym monitorowaniem żywych komórek

Przeglądaj więcej filmów