Zautomatyzowana produkcja indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronów korowych i dopaminergicznych pochodzących z komórek macierzystych ze zintegrowanym monitorowaniem żywych komórek
6 sierpnia 2020
Pokazujemy automatyzację indukowanych przez człowieka hodowli pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) i różnicowanie neuronów zgodne z automatycznym obrazowaniem i analizą.
Ogólnym celem tego badania jest pokazanie, w jaki sposób można wdrożyć zautomatyzowane procedury hodowli i różnicowania ludzkich komórek IPS w linie neuronalne, a także ich automatyczne obrazowanie. Ustandaryzowane zautomatyzowane procedury pozwalają na niską zmienność eksperymentalną, zapewniając jednocześnie wysoką odtwarzalność fenotypową. Ponadto system może być dostosowany do opracowywania nowych protokołów.
Procedury zademonstrują Joachim Tager i Elisangela Bressan, doktoranci z naszego laboratorium. W graficznym interfejsie użytkownika zautomatyzowanego systemu kliknij opcję Widok procesu instrumentu zasobu i wybierz proces instrumentu zasobu. Kliknij uruchom proces instrumentu i uruchom kaptur HEPA i procesy ponownego ładowania.
Wybierz zasoby do załadowania, otwórz drzwi i załaduj płytki do hodowli komórkowych i jednorazowe końcówki w odpowiednich pozycjach, jak wskazano na wyskakujących obrazach. Następnie przed zamknięciem należy odkazić drzwi za pomocą 70% etanolu i uruchomić proces odkażania. System będzie sterylizowany promieniowaniem UV przez 30 minut.
Aby załadować płytki pożywką hodowlaną lub odczynnikiem dysocjacyjnym, należy wykonać krok uruchomienia okapu HEPA i otworzyć drzwi stacji obsługi cieczy. Po odkażeniu 70% etanolem umieść zbiorniki na pokładzie w wyznaczonej pozycji i zdejmij z nich pokrywę. Zamknij drzwi stacji obsługi cieczy, a następnie uruchom proces instrumentu zasobów InitHepaHood, aby wyłączyć okap HEPA.
Aby wykonać metodę hodowli automatycznej, w widoku kalendarza graficznego interfejsu użytkownika kliknij przycisk Dodaj krok procesu i wybierz linię komórkową, która ma zostać użyta w eksperymencie. Użyj kreatora, aby wybrać projekt i oznaczyć partię, która ma zostać użyta. Kliknij skierowany w prawo grot strzałki i przejdź do następnej strony kreatora, aby wybrać krok procesu do wykonania.
Na ostatniej stronie kreatora zaplanuj eksperyment i ustaw odpowiednie parametry szczegółów zmiennych niezbędnych do uruchomienia metody. Następnie kliknij przycisk OK. Po załadowaniu 50-mililitrowej probówki zawiesiną ludzkich komórek IPS, załaduj powlekane płytki hodowlane do odbioru komórek na półce i wykonaj wysiew płytek metodą probówek. Aby policzyć komórki w cytometrze obrazującym Brightfield, automatycznie przygotuj 384-dołkową płytkę liczącą z zawieszeniem komórek na pokładzie i użyj ramienia robota, aby przenieść 384-dołkową płytkę zliczającą z pokładu do cytometru obrazującego Brightfield.
Po zliczeniu system przywróci płytkę do jej pierwotnej pozycji i przeniesie powlekaną kulturę lub płytkę testową z półki na platformę pipetową. Następnie system wysiewa komórki w zdefiniowanej przez użytkownika liczbie i objętościach odpowiednich dla płytki i miesza przez pipetowanie. Po wysianiu płytka zostanie przeniesiona do wytrząsarki pokładowej na 10 sekund z prędkością 500 obrotów na minutę w celu rozprowadzenia komórek, zanim zostanie przeniesiona do inkubatora dwutlenku węgla.
Aby ocenić zautomatyzowaną konfluencję, należy wykonać metodę konfluencji kontrolnej i wybrać partię, która zawiera co najmniej jedną płytkę hodowlaną i nie zawiera płytek testowych. W sekcji szczegółów parametrów wprowadź iPSCf_2020 akwizycji obrazu w ustawieniach analizy obrazowania. Następnie system przeniesie pierwszą płytkę z inkubatora do cytometru obrazującego Brightfield i zobrazuje zbieg komórek.
Aby zmienić pożywkę z płytkami do hodowli komórkowych lub testów, należy wykonać metodę zmiany podłoża na płytkach hodowlanych i wybrać partię zawierającą tylko płytki hodowlane. System przeniesie płytki na pokład i przechyli płytki, aby umożliwić aspirację supernatantu. Supernatant zostanie wyrzucony do modułu zbiórki odpadów i wyrzucone końcówki, a do każdej płytki zostanie dodanych 12 mililitrów świeżego podłoża.
Następnie system ponownie przykryje płytki i wprowadzi je z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych. Alternatywnie, aby zmienić pożywkę na płytkach testowych, należy wykonać metodę zmiany podłoża na płytkach testowych. Aby podhodować komórki, należy wykonać metodę subhodowli przylegających komórek i wybrać partię zawierającą płytki hodowlane, które wymagają poduprawy.
Po wyrzuceniu pożywki, system przemyje komórki jeden raz ośmioma mililitrami PBS na płytkę, a następnie doda do komórek osiem mililitrów 0,5 milimolowego EDTA. Po ośmiu minutach na pokładzie z opcją przechylania, EDTA zostanie zastąpiona 12 mililitrami świeżego podłoża na talerz. System będzie potrząsał płytkami z prędkością 2 000 obrotów na minutę przez jedną minutę, aby usunąć kolonie, a następnie rozwarstwia komórki za pomocą pięciu cykli pipetowania, aby rozbić kolonie na grudki o wielkości od 50 do 80 mikronów.
Komórki zostaną następnie przeniesione do 50-mililitrowej probówki na pokładzie przed wysiewem ich w stosunku jeden do siedmiu. W przypadku zautomatyzowanego obrazowania komórek o wysokiej zawartości i wysokiej przepustowości należy wykonać metodę obrazowania i wybrać partię, która zawiera co najmniej jedną płytkę testową i nie zawiera płytek hodowlanych. Następnie system przeniesie płytkę testową do automatycznego mikroskopu konfokalnego w celu obrazowania.
Upewnij się, że wybrałeś prawidłowe identyfikatory partii i płyt podczas wykonywania wymaganych kroków procesu. Kultury hiPSC powinny być codziennie monitorowane pod kątem wzrostu i analizowane pod kątem ich procentowej zbieżności w cytometrze obrazowania Brightfield. Po pasażowaniu i ręcznej lub automatycznej hodowli systemowej komórki wykazują typową ekspresję markera komórek macierzystych i pluripotencji.
Neurony zróżnicowane w zautomatyzowanym systemie hodowli wykazują podobną morfologię i organizację sieci neuronalnych do neuronów hodowanych ręcznie. Po sześciu dniach różnicowania, automatycznie różnicujące się neurony korowe są dodatnie pod względem specyficznej dla neuronu ekspresji beta-tubuliny klasy III i markera górnej warstwy korowej. Po ośmiu dniach komórki wykazywały również ekspresję białka 2 związanego z mikrotubulami, cząsteczki adhezyjnej komórek nerwowych i synapsyny I, a także markerów neuronów korowych.
W hiPSC obserwuje się bardzo niską ekspresję tych markerów lub jej brak. System ten może być również wykorzystany do ustanowienia automatycznego testu wzrostu neurytów na żywych komórkach, który umożliwia pomiar długości neurytów w ciągu 11 dni różnicowania bez ręcznej interwencji. Wykorzystanie zautomatyzowanego systemu hodowli do przeprowadzania zmian pożywki w ciągu 65-dniowego okresu hodowli ułatwia różnicowanie hiPSC w neurony dopaminergiczne śródmózgowia o oczekiwanej organizacji komórkowej i morfologii.
Oprócz wzrostu neurytów, inne zautomatyzowane testy fenotypowe istotne dla badania neurodegeneracji, na przykład ogniska RNA translokacji TDP-43 i wychwyt fibryli alfa-synukleiny, można badać przy użyciu tego formatu o wysokiej przepustowości i wysokiej zawartości.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia zautomatyzowane procedury hodowli i różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSCs) w linie neuronalne, wraz z ich zautomatyzowanym obrazowaniem. Wdrożenie standaryzowanych protokołów automatycznych minimalizuje zmienność eksperymentalną, zachowując jednocześnie wysoką powtarzalność fenotypową.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSCs)
- Różnicowanie neuronalne
- Automatyzacja hodowli komórkowych
Wprowadzenie
- hiPSC są kluczowe dla zrozumienia ludzkiego rozwoju i chorób.
- Zautomatyzowane systemy zwiększają niezawodność i wydajność procesów hodowli komórkowej.
- Różnicowanie neuronalne hiPSC może być wykorzystane w badaniach z zakresu neuronauki oraz w opracowywaniu leków.
Zastosowane metody
- Zautomatyzowane techniki hodowli komórkowych
- Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSCs)
- Obrazowanie w polu jasnym do oceny konfluencji oraz zautomatyzowana mikroskopia konfokalna do obrazowania
Główne wyniki
- Zautomatycowane różnicowanie prowadzi do powstania neuronów o morfologii i organizacji sieci zbliżonej do neuronów hodowanych manualnie.
- Wykazano ekspresję specyficznych markerów neuronalnych, kluczowych dla dojrzewania i funkcjonalności.
- Opracowano zautomatyzowany test wzrostu neurytów w żywych komórkach bez interwencji manualnej, co umożliwia prowadzenie badań podłużnych.
Wnioski
- Ten zautomatyzowany system ułatwia powtarzalną hodowlę hiPSC oraz różnicowanie neuronalne.
- Posiada on potencjał w zakresie rozwoju badań biologicznych i zastosowań terapeutycznych w neuronauce.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ręczne różnicowanie hiPSC charakteryzuje się wysoką zmiennością i pracochłonnymi procedurami, co ogranicza skalowalność w procesach walidacji celów i przesiewania fenotypowego. Zautomatyzowane systemy hodowli i obrazowania redukują zmienność eksperymentalną, zwiększają powtarzalność oraz umożliwiają wysokoprzepustowe badania przesiewowe związków, RNAi oraz CRISPR/Cas9. Wspiera to pewność predykcyjną we wczesnej fazie odkrywania leków poprzez dostarczanie istotnych dla choroby modeli neuronalnych o spójnej morfologii i ekspresji markerów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez nadekspresję NGN2 w celu szybkiej produkcji neuronów korowych w ciągu 6–8 dni.
- Wartość naukowa: Wspiera funkcjonalną walidację celów w neuronach dopaminergicznych poprzez długotrwałe różnicowanie trwające ponad 65 dni z oczekiwaną morfologią i organizacją.
- Wartość operacyjna: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez minimalizację spontanicznego różnicowania oraz zmienności między liniami hiPSC.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Wprowadza zautomatyzowany test wzrostu neurytów w żywych komórkach do pomiarów podłużnych przez 11 dni bez ingerencji manualnej.
- Wartość operacyjna: Integruje obrazowanie wysokotreściowe za pomocą mikroskopii w polu jasnym oraz konfokalnej w celu uzyskania ilościowych odczytów fenotypowych.
- Wartość operacyjna: Wspiera skalowalne formaty przesiewowe dla testów istotnych w kontekście neurodegeneracji, takich jak translokacja TDP-43 i pobieranie włókien alfa-synukleiny.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Dostarcza modeli neuronów korowych i dopaminergicznych istotnych dla przebiegu chorób, co pozwala na mechanistyczną redukcję ryzyka w modelach chorób neurodegeneracyjnych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość translacyjną od etapu odkryć po walidację przedkliniczną dzięki standaryzowanemu, powtarzalnemu różnicowaniu.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie decyzji o rozwoju projektów w oparciu o analizę ryzyka poprzez dostarczanie spójnych fenotypów neuronalnych do walidacji celów i szlaków sygnałowych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Zautomatyzowany system wspiera cały proces badawczy – od wczesnej walidacji celu, przez identyfikację związku wiodącego, aż po ocenę przedkliniczną – poprzez dostarczanie powtarzalnych kultur neuronalnych odpowiednich do przesiewu multimodalnego.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez szybką, potwierdzoną markerami dyferencjację neuronów korowych i dopaminergicznych.
- Screening: Zapewnia gotowość i powtarzalność testów dzięki zautomatyzowanemu wysiewaniu, wymianom pożywek oraz monitorowaniu konfluencji w formatach 384-dołkowych.
- Analityka: Umożliwia ilościowe pomiary wzrostu neurytów, ekspresji markerów oraz zmian fenotypowych w czasie dzięki zintegrowanemu obrazowaniu żywych komórek.
- Badania translacyjne: Wspiera ciągłość badań przedklinicznych poprzez generowanie neuronów dopaminergicznych o oczekiwanej organizacji komórkowej do modelowania chorób.
- Zastosowania instytucjonalne: Służy jako platforma wielokrotnego użytku do równoległego utrzymywania linii hiPSC i adaptacji do nowych protokołów, w tym screeningu CRISPR/Cas9 oraz RNAi.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna dzięki zredukowanej zmienności i wysokiej powtarzalności fenotypowej w różnicowaniu neuronów.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i skalowalność dzięki automatycznemu wysiewowi, wymianie pożywki oraz kontroli warunków środowiskowych.
- Wartość strategiczna: Usprawnione podejmowanie decyzji go/no-go dzięki możliwości prowadzenia szeroko zakrojonych badań przesiewowych z powtarzalnymi wynikami neuronalnymi.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko dzięki niezawodnym modelom istotnym dla danej choroby, służącym do walidacji celów i identyfikacji wiodących związków.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórek macierzystych, programowaniu automatyzacji oraz w procesach analizy obrazu.
- Zależne od zintegrowanej infrastruktury do dozowania cieczy, inkubacji oraz obrazowania konfokalnego/Brightfield.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie śledzenia partii, zarządzania identyfikatorami płytek oraz powtarzalności protokołów.
- Obejmuje kwestie adaptacji do różnych linii hiPSC i protokołów różnicowania, w tym prekursorów pochodzących z małych cząsteczek.
- Ograniczenia praktyczne obejmują złożoność konfiguracji systemu oraz konieczność walidacji przy integracji nowych testów.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:43
New Culture Plate and Tip Loading and Decontamination
1:35
Culture Medium and/or Dissociation Reagent Filling
2:09
Automated Method Execution
2:51
Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC) Seeding
4:09
Automated Confluence Assessment
4:47
Medium Change
5:37
Subcultivation
6:42
Automated High Content, High Throughput Imaging
7:14
Results: Representative Automated System-Produced hiPSC-Derived Cortical and Dopaminergic Neuron Characterization
8:58
Conclusion
