Wykrywanie ekspresji mikroRNA w nerkach myszy nefropatycznych z immunoglobuliną A
8 lipca 2020
mikroRNA biorą udział w patogenezie nefropatii IgA. Opracowaliśmy niezawodną metodę wykrywania poziomów ekspresji mikroRNA w nerkach mysiego modelu nefropatii IgA (myszy HIGA). Ta nowa metoda ułatwi sprawdzenie udziału miRNA w nefropatii IgA.
Metoda ta może być wykorzystana do łatwej weryfikacji zmiany mikroRNA w nefropatii IGA przy użyciu małego modelu zwierzęcego, co umożliwia badanie nefropatii IGA bez biopsji ludzkiej nerki. Protokół może dostarczyć nowych informacji na temat genetyki nefropatii IGA, co może potencjalnie pomóc w odkryciu nowych metod diagnostycznych i terapeutycznych dla choroby nerek. Po upewnieniu się, że mysz jest odpowiednio znieczulona, użyj nożyczek chirurgicznych i kleszczy, aby wykonać trzy- do czterocentymetrowe nacięcie linii środkowej w ścianie brzucha myszy i zidentyfikować obie strony nerki.
Naciąć żebra i przeponę, aby odsłonić serce. Po nacięciu prawego przedsionka należy wstrzyknąć PBS do lewej komory, aż kolor nerek zmieni się na bladożółty, co wskazuje, że całe ciało myszy jest wypełnione PBS. Przeciąć tętnicę nerkową, żyłę nerkową i moczowód, a następnie usunąć nerkę.
Homogenizować 30-miligramowe próbki nerek za pomocą homogenizatora krzemowego i 700 mikrolitrów odczynnika do lizy na bazie fenolu guanidyny w temperaturze pokojowej. Przenieść lizat do wirowej kolumny rozdrabniającej biopolimer i odwirować go przy 15 000 G przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Kontynuuj oczyszczanie RBNA zgodnie ze wskazówkami manuskryptu.
Po ostatnim płukaniu dodaj 30 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz do kolumny wirowej opartej na membranie krzemionkowej i odwiruj ją przy 8 000 G przez jedną minutę w celu wymycia RNA. Do syntezy cDNA przygotuj mieszankę główną z dwoma mikrolitrami mieszaniny kwasów nukleinowych, dwoma mikrolitrami mieszaniny odwrotnej transkryptazy i czterema mikrolitrami buforu w sumie osiem mikrolitrów na próbkę. Dodać osiem mikrolitrów mieszanki wzorcowej do każdego dołka ośmiodołkowego paska probówki.
Rozcieńczyć całkowite RNA w wodzie wolnej od nukleaz. Następnie dodaj 12 mikrolitrów całkowitego roztworu RNA do każdej studzienki paska. Umieść próbki w termocyklerze i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 60 minut, a następnie w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut.
Aby przeprowadzić ilościową reakcję PCR w czasie rzeczywistym, należy przygotować mieszaninę wzorcową zgodnie ze wskazówkami manuskryptu, a następnie dodać 22,5 mikrolitra mieszanki wzorcowej do każdej studzienki 96-dołkowej płytki reakcyjnej. Dodaj 2,5 mikrolitra przygotowanego cDNA do każdej studzienki. Umieść płytkę reakcyjną w aparacie do PCR w czasie rzeczywistym.
Następnie zaprogramuj go na początkową aktywację w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 15 minut, a następnie 40 cykli denaturacji w temperaturze 94 stopni Celsjusza przez 15 sekund, wyżarzanie w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez 30 sekund i przedłużenie w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 30 sekund. Ilościowe określenie ekspresji genów za pomocą metody delta-delta CT. Protokół ten został wykorzystany do zbadania poziomów ekspresji mikroRNA w nerkach myszy HIGA przy użyciu nerek myszy Balb / c jako kontroli.
Zmierzono poziomy ekspresji trzech mikroRNA związanych z nefropatią IGA. Względne poziomy ekspresji mikroRNA w obu grupach porównano za pomocą testu T, przy czym P mniejsze niż 0,05 jest statystycznie istotne. miR-155-5p ulegał ekspresji na 3,3-krotnie wyższych poziomach w grupie HIGA w porównaniu z grupą kontrolną, a miR-21-5p był wyrażany na 1,58-krotnie wyższych poziomach.
Ekspresja miR-1461-5p nie różniła się istotnie między obiema grupami. Podczas prób zastosowania tego protokołu ważne jest, aby nosić maskę, rękawiczki i czepek oraz utrzymywać stół laboratoryjny i narzędzia w czystości, aby zapobiec wpływowi nukleazy w środowisku na eksperyment. Ta eksperymentalna metoda jest obecnie stosowana w praktyce w naszym laboratorium.
Jego celem jest opracowanie nowych metod diagnostycznych i terapeutycznych w nefropatii IGA.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia wiarygodną metodę oznaczania poziomów ekspresji microRNA w nerkach mysiego modelu nefropatii IgA. Metoda ta pozwala na badanie udziału microRNA w nefropatii IgA bez konieczności przeprowadzania biopsji nerek u ludzi.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Nefrologia
- Badania nad mikroRNA
- Modele zwierzęce
Wstęp
- Nefropatia IgA to choroba nerek charakteryzująca się odkładaniem IgA w kłębuszkach.
- MikroRNA odgrywają istotną rolę w patogenezie wielu chorób, w tym schorzeń nerek.
- Zrozumienie ekspresji mikroRNA może dostarczyć informacji na temat mechanizmów powstawania chorób.
- Obecne metody badania mikroRNA często wymagają procedur inwazyjnych.
Cel badania
- Opracowanie metody oceny poziomów microRNA w mysim modelu nefropatii IgA.
- Ułatwienie badań nad genetycznymi aspektami nefropatii IgA.
- Zbadanie potencjalnych podejść diagnostycznych i terapeutycznych w chorobach nerek.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie myszy HIGA jako modelu nefropatii IgA.
- Podanie znieczulenia myszy przed zabiegiem chirurgicznym.
- Techniki chirurgiczne dostępu do nerek, w tym nacięcie w linii pośrodkowej i usunięcie organów.
- Perfuzja myszy roztworem PBS w celu przygotowania do ekstrakcji nerek.
Główne wyniki
- Opracowana metoda umożliwia łatwą weryfikację zmian w poziomie microRNA w nefropatii IgA.
- Wnioski uzyskane dzięki tej metodzie mogą doprowadzić do opracowania nowych narzędzi diagnostycznych.
- Potencjał odkrycia nowych strategii terapeutycznych w leczeniu nefropatii IgA.
- Eliminacja konieczności wykonywania biopsji nerek u ludzi w badaniach wstępnych.
Wnioski
- Metoda ta zwiększa zrozumienie roli microRNA w nefropatii IgA.
- Otwiera ona nowe możliwości badań nad genetyką chorób nerek.
- Podejście to może mieć znaczący wpływ na przyszłe rozwój diagnostyki i terapii.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia zespołom badawczo-rozwojowym z sektora biofarmaceutycznego profilowanie ekspresji mikroRNA w zwalidowanym modelu mysim nefropatii IgA, co wspiera walidację celów terapeutycznych oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w programach badawczych nad chorobami nerek. Dostarczając powtarzalną metodę wykrywania zmienionych poziomów miRNA bez konieczności wykonywania biopsji u ludzi, metoda ta ułatwia wczesne odkrywanie biomarkerów i celów terapeutycznych z wyższą pewnością prognostyczną. Podejście to jest zgodne z działaniami na etapie odkrywczym, mającymi na celu badanie mechanizmów chorobowych i priorytetyzację kandydatów do rozwoju przedklinicznego.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez ilościowe określenie zmian w ekspresji miRNA związanych z chorobą u myszy HIGA w porównaniu z grupą kontrolną.
- Wartość operacyjna: Zapewnia wiarygodny schemat postępowania w celu funkcjonalnej walidacji celu przy użyciu qRT-PCR do pomiaru poziomów miR-155-5p, miR-21-5p oraz miR-146a-5p.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez identyfikację miRNA o statystycznie istotnych zmianach krotności (np. 3,3-krotnie dla miR-155-5p) jako potencjalnych biomarkerów lub celów terapeutycznych.
Przesiewanie i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Dostarcza ilościowe, powtarzalne dane dotyczące ekspresji miRNA, odpowiednie do standaryzacji testów w kampaniach badań przesiewowych.
- Wartość operacyjna: Ustanawia standaryzowany protokół oczyszczania RNA i syntezy cDNA, kompatybilny z wysokoprzepustowymi platformami qRT-PCR.
- Gotowość testu: Generuje znormalizowane wartości CT przy użyciu metody delta-delta CT, co umożliwia porównywanie próbek i potwierdzanie trafień.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość translacyjna: Wykorzystanie istotnego dla choroby modelu mysiego HIGA w celu powiązania wyników odkryć z przedkliniczną walidacją szlaków zależnych od miRNA.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Umożliwia ocenę zmian w ekspresji miRNA powiązanych z odkładaniem się IgA, co zmniejsza niepewność co do mechanizmu działania celu przed identyfikacją wiodącego kandydata.
- Ciągłość przedkliniczna: Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka, zapewniając spójne i mierzalne odczyty z tkanki nerek we wszystkich grupach badawczych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum wczesnych etapów odkrywania leków, wspierając testowanie hipotez w walidacji celu oraz generując ilościowe wyniki dla przepływów pracy związanych z przesiewaniem i analityką, które stanowią podstawę decyzji dotyczących identyfikacji związków wiodących.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia wyjaśnienie szlaków sygnałowych poprzez pomiar zmian w ekspresji miRNA związanych z patogenezą nefropatii IgA w genetycznym modelu mysim.
- Przesiewanie: Dostarcza zestandaryzowanych, ilościowych danych dotyczących miRNA, które nadają się do oceny wpływu związków na docelowe szlaki w dalszych analizach.
- Analityka: Generuje wartości delta-delta CT oraz wskaźniki krotności zmiany (fold-change), co pozwala zespołom na porównywanie warunków i ocenę istotności statystycznej za pomocą testów T.
- Badania translacyjne: Łączy ustalenia dotyczące miRNA z fazy odkrywczej z ciągłością przedkliniczną dzięki zastosowaniu zwalidowanego modelu nefropatii IgA o istotności fenotypowej.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia wielokrotnie wykorzystywalny protokół ekstrakcji RNA i qRT-PCR, który można zastosować do wielu celów miRNA w projektach dotyczących chorób nerek.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dzięki bezpośredniemu pomiarowi dysregulacji miRNA w modelu choroby.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność i standaryzację poprzez zdefiniowane parametry oczyszczania RNA, syntezy cDNA oraz qRT-PCR (np. wirowanie 8,000 G, inkubacja w 37°C).
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go, dostarczając statystycznie istotnych danych o ekspresji (p<0.05) w celu priorytetyzacji celów o silnym powiązaniu z chorobą.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację biomarkerów opartych na miRNA lub celów terapeutycznych z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o wielkość krotności zmiany (fold-change) i powtarzalność.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w przeprowadzaniu operacji na gryzoniach, pracy z RNA oraz w technice qRT-PCR, aby zapobiec degradacji nukleolitycznej i zapewnić integralność próbek.
- Metoda zależy od dostępu do homogenizatora, wirówki, termocyklera oraz instrumentu do PCR w czasie rzeczywistym z detekcją fluorescencji.
- Konieczna jest standaryzacja między zespołami w zakresie ilości materiału wyjściowego RNA (30 mg nerki), objętości odczynników (700 μL odczynnika do lizy) oraz warunków cyklicznych (aktywacja w 95°C, 40 cykli).
- Wymagana jest adaptacja zestawów starterów dla konkretnych celów miRNA przy zachowaniu stałych temperatur przyłączania (55°C) i elongacji (70°C).
- Analiza ogranicza się do punktu końcowego RNA; nie zapewnia rozdzielczości przestrzennej ani rozdzielczości na poziomie pojedynczych komórek w obrębie tkanki nerki bez zastosowania dodatkowych metodologii.
