Name: Wykrywanie ekspresji mikroRNA w nerkach myszy nefropatycznych z immunoglobuliną A (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 39 s
Description: Poznaj metodę wykrywania mikroRNA w nerkach myszy HIGA z nefropatią IgA. Technika ta umożliwia badanie zmian ekspresji bez konieczności biopsji ludzkiej nerki, otwierając nowe możliwości diagnostyczne i terapeutyczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Sarah Williams z Edanz Group (www.edanzediting.com) za edycję szkicu tego rękopisu.

Eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Jichi i są zgodne z wytycznymi dotyczącymi użytkowania i opieki nad zwierzętami doświadczalnymi z Przewodnika dla zwierząt laboratoryjnych Uniwersytetu Medycznego w Jichi.
1. Pobieranie próbek nerek od myszy HIGA
UWAGA: Myszy HIGA wykazują stabilny fenotyp nefropatii IgA po 25 tygodniu życia8,9,10,11. Myszy Balb/c powinny być wybrane jako grupa kontrolna8,9,10,11. Uzyskano 25-tygodniowe samice myszy HIGA (n = 10) i 25-tygodniowe samice myszy Balb/c (n = 10). Konieczne jest wcześniejsze określenie liczby myszy potrzebnych do eksperymentów. Ten etap wymaga około 7–8 godzin dla próbki o wielkości 10 myszy HIGA i 10 myszy Balb/c.
<ol>
	<li>Przygotuj następujące przedmioty: myszy HIGA (25-tygodniowe, żeńskie), myszy Balb/c (25-tygodniowe, samica), aparat do znieczulenia wziewnego, izofluran, arkusz korkowy, szpilka, sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), strzykawki do wstrzykiwań, igły, nożyczki chirurgiczne i kleszcze.</li>
	<li>Znieczulij mysz HIGA za pomocą 4%-5% izofluranu za pomocą aparatu do znieczulenia wziewnego i zamontuj ją w pozycji grzbietowej na arkuszu korkowym za pomocą szpilek. Dostosuj stężenie izofluranu do 2%–3% jako dawkę podtrzymującą po indukcji znieczulenia. 
	UWAGA: Głębokość znieczulenia jest utrzymywana na poziomie, na którym ból związany z inwazyjnym zabiegiem zostaje całkowicie wyeliminowany. W szczególności stężenie izofluranu należy dostosować do 4-5% podczas wycinania tkanek takich jak klatka piersiowa. Depilacja i maść do oczu nie są konieczne. Nie ma potrzeby montowania myszy na poduszce grzewczej, jeśli zabieg można wykonać szybko.</li>
	<li>Wykonaj 3–4 cm nacięcie w linii środkowej ściany brzucha myszy za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy i dokładnie zidentyfikuj obie strony nerki.</li>
	<li>Naciąć żebra i przeponę nożyczkami chirurgicznymi i kleszczami, aby odsłonić serce. Po nacięciu prawego przedsionka wstrzyknąć PBS do lewej komory, aż kolor nerek zmieni się na bladożółty (ta procedura oznacza, że całe ciało myszy jest perfundowane PBS).</li>
	<li>Przeciąć tętnicę nerkową, żyłę nerkową i moczowód oraz usunąć nerkę. Podzielić nerkę na kawałki 30 mg do użycia w następnym kroku. 
	UWAGA: Patologia nefropatii IgA obejmuje głównie kłębuszki nerkowe w korze nerkowej (zewnętrzna część nerki). Chociaż trudno jest makroskopowo i całkowicie odróżnić korę i rdzeń, pożądane jest głównie zebranie zewnętrznej części nerki. Próbki te mogą być przechowywane w temperaturze –80 °C przez kilka miesięcy.</li>
</ol>
2. Oczyszczanie całkowitego RNA z próbek nerek
UWAGA: W tym kroku używany jest dostępny na rynku zestaw do izolacji miRNA do ekstrakcji całkowitego RNA. Dodatkowo stosowana jest kolumna wirowa z rozdrabnianiem biopolimerów. Zobacz tabelę materiałów, aby uzyskać dodatkowe informacje. Zestaw do izolacji miRNA zawiera kolumnę wirową na bazie membrany krzemionkowej, odczynniki do lizy na bazie fenolu/guanidyny, bufor do płukania guanidyny/etanolu (bufor do płukania 1), bufor do płukania etanolem (bufor do płukania 2) i wodę wolną od nukleaz. Ten krok wymaga około 3 godzin dla próbki o wielkości 10 myszy HIGA i 10 myszy kontrolnych.
<ol>
	<li>Przygotuj następujące elementy: probówki zbiorcze o pojemności 1,5 lub 2,0 ml, 100% etanol, chloroform, homogenizator krzemu, mikropipety, końcówki do pipet, wirówka, kolumna wirowa do rozdrabniania biopolimerów, kolumna wirowa na bazie membrany krzemionkowej, odczynniki do lizy na bazie fenolu/guanidyny, bufor do płukania guanidyny/etanolu (bufor do płukania 1), bufor do płukania etanolu (bufor do płukania 2) i woda wolna od nukleaz.</li>
	<li>Homogenizować 30 mg próbek nerek za pomocą homogenizatora krzemowego i 700 μl odczynnika do lizy na bazie fenolu/guanidyny w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: MiRNA w próbce są wrażliwe, dopóki nie zostaną wystawione na działanie odczynnika do lizy na bazie fenolu/guanidyny, dlatego te kroki należy wykonać niezwłocznie.</li>
	<li>Przenieść lizat do kolumny wirowej rozdrabniającej biopolimery i odwirować go przy 15 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Do filtratu dodać 140 μl chloroformu i energicznie mieszać przez 15 s. Pozostawić na 2–3 min, następnie odwirować przy 12 000 x g w temperaturze 4 °C przez 15 min.</li>
	<li>Delikatnie przenieść klarowny supernatant bez dotykania środkowej warstwy do nowej probówki zbiorczej i dodać określoną objętość (patrz poniżej) 100% etanolu. Wir przez 5 s. 
	UWAGA: Wymagane jest 100% etanol o objętości 1,5x większej niż otrzymany supernatant.</li>
	<li>Przenieść próbkę (górna granica 700 μl) do kolumny wirowej opartej na membranie krzemionkowej i odwirować próbkę w temperaturze pokojowej przez 15 s przy 8 000 x g. Po odwirowaniu należy wyrzucić filtrat.</li>
	<li>Dodać 700 μl buforu płuczącego 1 do kolumny wirowej opartej na membranie krzemionkowej i odwirować kolumnę w temperaturze pokojowej przez 15 s przy 8 000 x g. Po odwirowaniu należy wyrzucić filtrat.</li>
	<li>Dodać 500 μl buforu płuczącego 2 do kolumny wirowej opartej na membranie krzemionkowej i odwirować ją w temperaturze pokojowej przez 15 s przy 8 000 x g. Po odwirowaniu należy wyrzucić filtrat.</li>
	<li>Dodać 500 μl buforu płuczącego 2 do kolumny wirowej opartej na membranie krzemionkowej i odwirować ją w temperaturze pokojowej przez 15 s przy 8 000 x g. Po odwirowaniu należy wyrzucić filtrat.</li>
	<li>Ponownie odwirować kolumnę wirową na bazie membrany krzemionkowej, nie dodając niczego w celu usunięcia dodatkowego etanolu, przy 15 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu wyrzucić filtrat.</li>
	<li>Zmień rurkę przymocowaną do kolumny wirującej na nową probówkę zbiorczą.</li>
	<li>Dodać 30 μl wody wolnej od nukleaz do kolumny wirowej opartej na membranie krzemionkowej i odwirować ją przy 8 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Otrzymany roztwór o objętości 30 μl zawiera wysokie stężenie całkowitego RNA. Próbka ta może być przechowywana w temperaturze –80 °C przez kilka miesięcy.</li>
</ol>
3. Synteza cDNA z całkowitego RNA
UWAGA: W tym kroku używany jest dostępny na rynku zestaw do odwrotnej transkrypcji. Zobacz tabelę materiałów, aby uzyskać dodatkowe informacje. Ten zestaw zawiera mieszaninę kwasów nukleinowych, mieszaninę odwrotnej transkryptazy i bufor. Procedura ta musi być wykonywana na lodzie, aby zapobiec postępowi reakcji. Ten krok wymaga około 3 godzin dla próbki o wielkości 10 myszy HIGA i 10 myszy kontrolnych.
<ol>
	<li>Przygotuj następujące elementy: probówki zbiorcze o pojemności 1,5 ml, ośmiodołkowe probówki paskowe, mikropipety, końcówki do pipet, spektrofotometr, woda wolna od nukleaz, lód, mieszanina kwasów nukleinowych, mieszanina odwrotnej transkryptazy, bufor i termocykler.</li>
	<li>Zmierzyć stężenie całkowitego RNA za pomocą spektrofotometru. Następnie oblicz wymaganą objętość wody wolnej od nukleaz, tak aby 12 μl zawierało 1 μg całkowitego RNA.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę wzorcową o następującej zawartości: 2,0 μl mieszaniny kwasów nukleinowych, 2,0 μl mieszaniny odwrotnej transkryptazy i 4,0 μl buforu, co daje łącznie 8,0 μl na próbkę.</li>
	<li>Dodać 8 μl mieszanki wzorcowej do każdego dołka z ośmiodołkowymi probówkami paskowymi.</li>
	<li>Rozcieńczyć całkowite RNA w objętości wody wolnej od nukleaz obliczonej w ppkt 3.2. Następnie dodaj 12 μl całkowitego roztworu RNA (zawierającego 1 μg całkowitego RNA) do każdej studzienki ośmiodołkowych probówek paskowych.</li>
	<li>Inkubować próbkę w 8-dołkowych probówkach paskowych w temperaturze 37 °C przez 60 minut przy użyciu termocyklera. Następnie inkubować w temperaturze 95 °C przez 5 minut przy użyciu termocyklera. 
	UWAGA: Roztwór po inkubacji zawiera wysokie stężenie cDNA.</li>
	<li>Przenieś ten roztwór do probówki o pojemności 1,5 ml i dodaj 200 μl wody wolnej od nukleaz. 
	UWAGA: Otrzymane 200 μl roztworu można wykorzystać do qRT-PCR jako matrycę cDNA. Próbka ta może być przechowywana w temperaturze –80 °C przez około 1 rok.</li>
</ol>
4. qRT-PCR miRNA
UWAGA: W tym kroku używany jest komercyjnie dostępny zestaw do PCR. Zobacz tabelę materiałów, aby uzyskać dodatkowe informacje. Ten zestaw zawiera mieszankę PCR, uniwersalny podkład i wodę wolną od nukleaz. Próbki powinny być przygotowane w dwóch egzemplarzach, a dokładność wyników powinna być brana pod uwagę w każdym przypadku. Poziomy ekspresji miRNA określa się ilościowo metodą ΔΔCT. Ten krok wymaga około 4 godzin dla próbki o wielkości 10 myszy HIGA i 10 myszy kontrolnych.
<ol>
	<li>Przygotuj następujące elementy: probówkę zbiorczą o pojemności 1,5 ml, 96-dołkową płytkę reakcyjną, folię samoprzylepną do 96-dołkowej płytki reakcyjnej, mikropipety, końcówki do pipet, mieszankę PCR, uniwersalny starter, wodę wolną od nukleaz, startery specyficzne dla miRNA oraz przyrząd do PCR w czasie rzeczywistym.</li>
	<li>Przygotuj mieszankę wzorcową o następującej zawartości: 12,5 μl mieszanki PCR, 2,5 μl uniwersalnego startera, 1,25 μl 5 μM startera specyficznego dla miRNA i 6,25 μl wody wolnej od nukleaz na każdą studzienkę. 
	UWAGA: W tym teście użyto starterów specyficznych dla miRNA [RNA, U6 Small Nuclear 2 (RNU6-2), miR-155-5p, miR-146a-5p i miR-21-5p]. RNU6-2 został użyty jako endogenna kontrola14.</li>
	<li>Dodać 22,5 μl mieszanki wzorcowej do każdego dołka 96-dołkowej płytki reakcyjnej.</li>
	<li>Dodać 2,5 μl cDNA przygotowanego w kroku 3.7 do indywidualnego dołka płytki 96-dołkowej.</li>
	<li>Przykryj 96-dołkową płytkę reakcyjną folią adhezyjną, a następnie odwiruj przy 1 000 x g przez 30 s.</li>
	<li>Uruchom urządzenie do PCR w czasie rzeczywistym. Zaprogramuj przyrząd do PCR w następujący sposób: wstępna aktywacja w temperaturze 95 °C przez 15 minut, następnie 40 cykli denaturacji w temperaturze 94 °C przez 15 s, wyżarzanie w temperaturze 55 °C przez 30 s i przedłużenie w temperaturze 70 °C przez 30 s.</li>
	<li>Określić ilościowo ekspresję genów za pomocą metody ΔΔCT. Względne poziomy ekspresji określa się jako 2–ΔΔCT. 
	UWAGA: W celu wykluczenia z wyników należy wziąć pod uwagę nieprawidłowe krzywe amplifikacji PCR.</li>
</ol>

<ol><li>Rodrigues, J. C., Haas, M., Reich, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgA+Nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">IgA Nephropathy.</a> Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 12 (4), 677-686 (2017).</li>
<li>Szeto, C. C., Li, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+in+IgA+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Nephrology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs in IgA nephropathy.</a> Nature Reviews Nephrology. 10 (5), 249-256 (2014).</li>
<li>Wyatt, R. J., Julian, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgA+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">IgA nephropathy.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (25), 2402-2414 (2013).</li>
<li>Vishnoi, A., Rani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiRNA+Biogenesis+and+Regulation+of+Diseases%3A+An+Overview%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">MiRNA Biogenesis and Regulation of Diseases: An Overview.</a> Methods in Molecular Biology. 1509, 1-10 (2017).</li>
<li>Rupaimoole, R., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+therapeutics%3A+towards+a+new+era+for+the+management+of+cancer+and+other+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (3), 203-222 (2017).</li>
<li>Serino, G., Sallustio, F., Cox, S. N., Pesce, F., Schena, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+miR-148b+expression+promotes+aberrant+glycosylation+of+IgA1+in+IgA+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Abnormal miR-148b expression promotes aberrant glycosylation of IgA1 in IgA nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 814-824 (2012).</li>
<li>Serino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+a+retrospective+international+study%2C+circulating+miR-148b+and+let-7b+were+found+to+be+serum+markers+for+detecting+primary+IgA+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">In a retrospective international study, circulating miR-148b and let-7b were found to be serum markers for detecting primary IgA nephropathy.</a> Kidney International. 89 (3), 683-692 (2016).</li>
<li>Muso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+production+of+glomerular+extracellular+matrix+in+a+new+mouse+strain+of+high+serum+IgA+ddY+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Enhanced production of glomerular extracellular matrix in a new mouse strain of high serum IgA ddY mice.</a> Kidney International. 50 (6), 1946-1957 (1996).</li>
<li>Kurano, M., Yatomi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+gas+chromatography+mass+spectrometry+to+elucidate+metabolites+predicting+the+phenotypes+of+IgA+nephropathy+in+hyper+IgA+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Use of gas chromatography mass spectrometry to elucidate metabolites predicting the phenotypes of IgA nephropathy in hyper IgA mice.</a> Plos One. 14 (7), 0219403(2019).</li>
<li>Hyun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells+improve+renal+function+in+a+mouse+model+of+IgA+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells improve renal function in a mouse model of IgA nephropathy.</a> Cell Transplantation. 21 (11), 2425-2439 (2012).</li>
<li>Katsuma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+a+mouse+model+of+immunoglobulin+A+nephropathy+reveals+an+enhanced+PDGF-EDG5+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22The+Pharmacogenomics+Journal%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of a mouse model of immunoglobulin A nephropathy reveals an enhanced PDGF-EDG5 cascade.</a> The Pharmacogenomics Journal. 1 (3), 211-217 (2001).</li>
<li>Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+mRNA+and+protein+extraction+from+the+same+experimental+sample+using+a+commercially+available+column-based+RNA+preparation+kit%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit.</a> BioTechniques. 40 (1), 54-58 (2006).</li>
<li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+%28miRQC%29+study%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).</li>
<li>Sauer, E., Babion, I., Madea, B., Courts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evidence+based+strategy+for+normalization+of+quantitative+PCR+data+from+miRNA+expression+analysis+in+forensic+organ+tissue+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Science+International%3A+Genetics%22%5BJournal%5D)">An evidence based strategy for normalization of quantitative PCR data from miRNA expression analysis in forensic organ tissue identification.</a> Forensic Science International: Genetics. 13, 217-223 (2014).</li>
<li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+levels+of+miR-146a+and+miR-155+in+kidney+biopsy+and+urine+from+patients+with+IgA+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Markers%22%5BJournal%5D)">Elevated levels of miR-146a and miR-155 in kidney biopsy and urine from patients with IgA nephropathy.</a> Disease Markers. 30 (4), 171-179 (2011).</li>
<li>Hennino, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-21-5p+renal+expression+is+associated+with+fibrosis+and+renal+survival+in+patients+with+IgA+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">miR-21-5p renal expression is associated with fibrosis and renal survival in patients with IgA nephropathy.</a> Scientific Reports. 6, 27209(2016).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22How+to+Win+the+Battle+with+RNase%22">How to Win the Battle with RNase</a>. 2019 (2), Cold Spring Harbor Protocols. (2019).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Byliśmy w stanie zmierzyć poziomy ekspresji miRNA w nerkach mysiego modelu nefropatii IgA (myszy HIGA) przy użyciu tej nowej metody. Nefropatia IgA jest niewyjaśnioną chorobą, która wymaga dalszych badań w celu wyjaśnienia jej etiologii i celów terapeutycznych 1,3. Jednak pobieranie próbek ludzkich nerek jest wysoce inwazyjne. Ta nowa technika jest korzystna, ponieważ umożliwia badanie nefropatii IgA na małych zwierzętach i powinna ułatwić przyszłe badania nad ne...

Nefropatia immunoglobuliny A (IgA) jest rodzajem pierwotnego kłębuszkowego zapalenia nerek charakteryzującego się nieprawidłowym odkładaniem się IgA w okolicy kłębuszkowej nerki1,2. Jest to najczęstsze z pierwotnych kłębuszkowych zapaleń nerek i prowadzi do schyłkowej niewydolności nerek u 20%–40% pacjentów2. Przyczyna jest nadal nieznana, ale uporczywa infekcja błony śluzowej została zamieszana1,3. Kortykosteroidy, leki immunosupresyjne i inhibitory układu renina-angiotensyna zostały zaproponowane jako metody terapeutyczne1,3, ale nie zostały w pełni ustalone3. Dlatego konieczne są dalsze badania w celu wyjaśnienia etiologii i metod terapeutycznych leczenia nefropatii IgA.
mikroRNA (miRNA) to małe, niekodujące RNA, które odgrywają ważną rolę w regulacji ekspresji genów4,5. Zgłoszono, że miRNA są zaangażowane w patogenezę różnych chorób, a niektóre zostały zidentyfikowane jako biomarkery choroby i czynniki terapeutyczne4,5. W ostatnich latach odnotowano również związek między miRNA a patogenezą nefropatii IgA2,6,7. Na przykład wykazano, że miR-148b jest zaangażowany w nieprawidłowości strukturalne IgA u pacjentów z nefropatią IgA2,6,7, podczas gdy miR-148b i let-7b zostały udokumentowane jako nowe biomarkery do wykrywania nefropatii IgA7. Chociaż zrozumienie wpływu miRNA na nefropatię IgA może pomóc w dalszym wyjaśnieniu etiologii i leczenia2, standardowe metody profilowania miRNA w nefropatii IgA przy użyciu małych modeli zwierzęcych nie zostały jeszcze ustalone2.
Opracowaliśmy tutaj prostą i niezawodną metodę pomiaru poziomów ekspresji miRNA w nerkach mysiego modelu nefropatii IgA (myszy HIGA). Mysz HIGA jest charakterystycznym szczepem ddY wykazującym szczególnie wysoki poziom IgA w surowicy i nieprawidłowe odkładanie się IgA w kłębuszkach nerkowych8,9,10,11. Dlatego myszy HIGA mogą być używane jako mysi model nefropatii IgA8,9,10,11. Nasza metoda składa się z czterech głównych etapów: po pierwsze, chirurgiczne pobranie próbek nerek od myszy HIGA; po drugie, homogenizacja próbek i oczyszczanie całkowitego RNA za pomocą kolumny wirowej opartej na membranie krzemionkowej; po trzecie, synteza komplementarnego DNA (cDNA) z całkowitego RNA przy użyciu odwrotnej transkrypcji; i po czwarte, wykrywanie poziomów ekspresji miRNA za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR). Uzasadnienie tej metody i wiarygodność wyników są oparte na poprzednich raportach12,13. Pokazujemy, że jest to przydatna technika do dokładnego pomiaru poziomów ekspresji miRNA w mysim modelu nefropatii IgA i że może być wykorzystana do ułatwienia przyszłych badań nad miRNA w nefropatii IgA.

<table><tbody><tr><td>BALB/cCrSlc (25-tygodniowa, kobieta)</td><td>Japonia SLC, Inc.</td><td>brak</td><td>Mysz do sterowania</td></tr><tr><td>HIGA/NscSlc (25-tygodniowa, suczka)</td><td>Japonia SLC, Inc.</td><td>brak</td><td>Mysia nefropatia IgA model</td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 96-dołkowa płytka reakcyjna do qRT-PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4316813</td><td>96-dołkowa płytka reakcyjna</td></tr><tr><td>MicroAmp Optyczna folia samoprzylepna Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>4311971</td><td>do 96-dołkowej płytki reakcyjnej</td></tr><tr><td>Zestaw miScript II RT</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td>Zestaw eksperymentalny do syntezy cDNA</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini zestaw</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>Eksperymentalny zestaw do ekstrakcji całkowitego RNA</td></tr><tr><td>Test startera miScript (RNU6-2)</td><td>Qiagen</td><td>MS00033740</td><td>test miScript Primer specyficzny dla miRNA</td></tr> (<tr><td>miR-155-5p)</td><td>Qiagen</td><td>MS00001701</td><td>specyficzny dla miRNA starter</td></tr><tr><td>miScript Primer Assay (miR-146a-5p)</td><td>Qiagen</td><td>MS00001638</td><td>test miScript Primer specyficzny dla miRNA</td></tr><tr><td> (miR-21-5p)</td><td>Qiagen</td><td>MS00009079</td><td>specyficzny dla miRNA starter</td></tr><tr><td>miScript SYBR Zestaw do zielonego PCR</td><td>Qiagen</td><td>218073</td><td>Eksperymentalny zestaw do rozdrabniania PCR w czasie rzeczywistym</td></tr><tr><td>Niszczarka QIA</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td>biopolimerowa kolumna wirowa</td></tr><tr><td>QuantStudio 12K Flex Flex System do PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4472380</td> w <td>czasie rzeczywistym</td></tr><tr><td>Oprogramowanie QuantStudio 12K Flex Wersja 1.2.1.</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4472380</td><td>oprogramowanie przyrządu do PCR w czasie rzeczywistym Takara,</td></tr><tr><td>standard biomasheru</td><td>Takara Bio</td><td>9790B</td><td>homogenizator krzemu</td></tr></tbody></table>

wykrywanie ekspresji mikrorna w nerkach myszy nefropatycznych z immunoglobuliną a

Detection of MicroRNA Expression in the Kidneys of Immunoglobulin A Nephropathic Mice

Nefropatia immunoglobuliny A (IgA) jest rodzajem pierwotnego kłębuszkowego zapalenia nerek charakteryzującego się nieprawidłowym odkładaniem się IgA, prowadzącym do schyłkowej niewydolności nerek. W ostatnich latach odnotowano udział mikroRNA (miRNA) w patogenezie nefropatii IgA. Nie ma jednak ustalonej metody profilowania miRNA w nefropatii IgA przy użyciu małych modeli zwierzęcych. Dlatego opracowaliśmy wiarygodną metodę analizy miRNA w nerce mysiego modelu IgA (myszy HIGA). Celem tego protokołu jest wykrycie zmienionych poziomów ekspresji miRNA w nerkach myszy HIGA w porównaniu z poziomami w nerkach myszy kontrolnych. Krótko mówiąc, metoda ta składa się z czterech etapów: 1) uzyskania próbek nerek od myszy HIGA; 2) oczyszczanie całkowitego RNA z próbek nerek; 3) synteza komplementarnego DNA z całkowitego RNA; oraz 4) ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR) miRNA. Korzystając z tej metody, udało nam się wykryć poziomy ekspresji kilku miRNA (miR-155-5p, miR-146a-5p i miR-21-5p) w nerkach myszy HIGA. Ta nowa metoda może być zastosowana w innych badaniach profilujących miRNA w nefropatii IgA.

Zbadano poziomy ekspresji miRNA w nerkach myszy HIGA (n=10). Wynik ten uzyskano w pełni w oparciu o opisany protokół. Jako grupę kontrolną wybrano nerki myszy Balb/c (n=10). W obu grupach wybrano zwierzęta w wieku 25 tygodni. Od dostawcy dostępne były wyłącznie samice myszy HIGA. Wykryto poziomy ekspresji trzech miRNA (miR-15-5p, miR-146a-5p oraz miR-21-5p; Rysunek 1), o których wcześniej donoszono, że są powiązane z nefropatią IgA15,16</s...

mikroRNA biorą udział w patogenezie nefropatii IgA. Opracowaliśmy niezawodną metodę wykrywania poziomów ekspresji mikroRNA w nerkach mysiego modelu nefropatii IgA (myszy HIGA). Ta nowa metoda ułatwi sprawdzenie udziału miRNA w nefropatii IgA.

Wykrywanie ekspresji mikroRNA w nerkach myszy nefropatycznych z immunoglobuliną A

Immunoglobulin A (IgA) nephropathy is a type of primary glomerulonephritis characterized by the abnormal deposition of IgA, leading to the end-stage renal ...

Metoda ta może być wykorzystana do łatwej weryfikacji zmiany mikroRNA w nefropatii IGA przy użyciu małego modelu zwierzęcego, co umożliwia badanie nefropatii IGA bez biopsji ludzkiej nerki. Protokół może dostarczyć nowych informacji na temat genetyki nefropatii IGA, co może potencjalnie pomóc w odkryciu nowych metod diagnostycznych i terapeutycznych dla choroby nerek. Po upewnieniu się, że mysz jest odpowiednio znieczulona, użyj nożyczek chirurgicznych i kleszczy, aby wykonać trzy- do czterocentymetrowe nacięcie linii środkowej w ścianie brzucha myszy i zidentyfikować obie strony nerki.Naciąć żebra i przeponę, aby odsłonić serce. Po nacięciu prawego przedsionka należy wstrzyknąć PBS do lewej komory, aż kolor nerek zmieni się na bladożółty, co wskazuje, że całe ciało myszy jest wypełnione PBS. Przeciąć tętnicę nerkową, żyłę nerkową i moczowód, a następnie usunąć nerkę.Homogenizować 30-miligramowe próbki nerek za pomocą homogenizatora krzemowego i 700 mikrolitrów odczynnika do lizy na bazie fenolu guanidyny w temperaturze pokojowej. Przenieść lizat do wirowej kolumny rozdrabniającej biopolimer i odwirować go przy 15 000 G przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Kontynuuj oczyszczanie RBNA zgodnie ze wskazówkami manuskryptu.Po ostatnim płukaniu dodaj 30 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz do kolumny wirowej opartej na membranie krzemionkowej i odwiruj ją przy 8 000 G przez jedną minutę w celu wymycia RNA. Do syntezy cDNA przygotuj mieszankę główną z dwoma mikrolitrami mieszaniny kwasów nukleinowych, dwoma mikrolitrami mieszaniny odwrotnej transkryptazy i czterema mikrolitrami buforu w sumie osiem mikrolitrów na próbkę. Dodać osiem mikrolitrów mieszanki wzorcowej do każdego dołka ośmiodołkowego paska probówki.Rozcieńczyć całkowite RNA w wodzie wolnej od nukleaz. Następnie dodaj 12 mikrolitrów całkowitego roztworu RNA do każdej studzienki paska. Umieść próbki w termocyklerze i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 60 minut, a następnie w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut.Aby przeprowadzić ilościową reakcję PCR w czasie rzeczywistym, należy przygotować mieszaninę wzorcową zgodnie ze wskazówkami manuskryptu, a następnie dodać 22,5 mikrolitra mieszanki wzorcowej do każdej studzienki 96-dołkowej płytki reakcyjnej. Dodaj 2,5 mikrolitra przygotowanego cDNA do każdej studzienki. Umieść płytkę reakcyjną w aparacie do PCR w czasie rzeczywistym.Następnie zaprogramuj go na początkową aktywację w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 15 minut, a następnie 40 cykli denaturacji w temperaturze 94 stopni Celsjusza przez 15 sekund, wyżarzanie w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez 30 sekund i przedłużenie w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 30 sekund. Ilościowe określenie ekspresji genów za pomocą metody delta-delta CT. Protokół ten został wykorzystany do zbadania poziomów ekspresji mikroRNA w nerkach myszy HIGA przy użyciu nerek myszy Balb / c jako kontroli.Zmierzono poziomy ekspresji trzech mikroRNA związanych z nefropatią IGA. Względne poziomy ekspresji mikroRNA w obu grupach porównano za pomocą testu T, przy czym P mniejsze niż 0,05 jest statystycznie istotne. miR-155-5p ulegał ekspresji na 3,3-krotnie wyższych poziomach w grupie HIGA w porównaniu z grupą kontrolną, a miR-21-5p był wyrażany na 1,58-krotnie wyższych poziomach.Ekspresja miR-1461-5p nie różniła się istotnie między obiema grupami. Podczas prób zastosowania tego protokołu ważne jest, aby nosić maskę, rękawiczki i czepek oraz utrzymywać stół laboratoryjny i narzędzia w czystości, aby zapobiec wpływowi nukleazy w środowisku na eksperyment. Ta eksperymentalna metoda jest obecnie stosowana w praktyce w naszym laboratorium.Jego celem jest opracowanie nowych metod diagnostycznych i terapeutycznych w nefropatii IGA.

detection-microrna-expression-kidneys-immunoglobulin-nephropathic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten artykuł opisuje protokół hybrydyzacji in situ zoptymalizowany do kolormetrycznego wykrywania ekspresji mikroRNA w stałych odcinkach nerki z formaliną.

Hybrydyzacja in situ mikroRNA dla tkanek nerek utrwalonych formaliną

Ten protokół opisuje pełne badanie nerek, które powinno być przeprowadzone na mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych. Metody te pozwalają na szczegółową analizę funkcjonalną, strukturalną i mechanistyczną funkcji kłębuszków nerkowych, którą można zastosować do wszystkich mysich modeli choroby kłębuszków nerkowych.

Ocena czynności nerek w mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych

Tutaj prezentujemy protokół do mysiego znakowania in vivo białek powierzchniowych komórek kłębuszkowych za pomocą biotyny. Protokół ten zawiera informacje o tym, jak perfuzja nerek myszy, izolowanie kłębuszków nerkowych i przeprowadzanie endogennej immunoprecypitacji białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Izolacja kłębuszków nerkowych i znakowanie in vivo białek powierzchniowych komórek kłębuszków nerkowych

Ten artykuł przedstawia protokół wykrywania ekspresji mikroRNA w nerkach mysiego modelu ostrego uszkodzenia nerek za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym. Protokół ten kładzie nacisk na mysi model niedokrwiennego uszkodzenia nerek i staranną ekstrakcję próbek mikroRNA.

Ilościowa metoda wykrywania mikroRNA w nerce mysiego modelu niedokrwiennego uszkodzenia nerki

Opisujemy metodę oceny ekspresji mikroRNA w nerkach myszy z jednostronną niedrożnością moczowodu (UUO) za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją. Protokół ten jest odpowiedni do badania profili ekspresji mikroRNA nerek u myszy z UUO oraz w kontekście innych stanów patologicznych.

Ilościowa ocena ekspresji mikroRNA PCR w czasie rzeczywistym w nerce myszy z jednostronną niedrożnością moczowodu

Przedstawiamy metodę oceny ekspresji mikroRNA w nerkach i surowicy myszy z zależną od wieku niewydolnością nerek za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją.

Ilościowa ocena reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym ekspresji mikroRNA w nerkach i surowicy myszy z zależną od wieku niewydolnością nerek

Tutaj dostarczamy egzogenne, sztucznie syntetyzowane mimiki miRNA do nerki poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej wektora niewirusowego i nanocząsteczek polietyleniminy w kilku modelach myszy z chorobą nerek. Doprowadziło to do znacznej nadekspresji docelowego miRNA w nerce, co spowodowało zahamowanie progresji choroby nerek w kilku modelach mysich.

Dostarczanie egzogennego, sztucznie syntetyzowanego miRNA naśladującego mimikę do nerki przy użyciu nanocząstek polietyleniminy w kilku mysich modelach choroby nerek

Obecny protokół opisuje metodę śledzenia postępu tocznia u myszy. Przedstawiono dwie dodatkowe procedury w celu scharakteryzowania toczniowego zapalenia nerek w oparciu o naciek komórek i odkładanie się białek w nerkach.

Analizy białkomoczu, naciekania leukocytów przez nerki i odkładania się białek przez nerki u myszy MRL/lpr podatnych na toczeń

To badanie dostarcza danych eksperymentalnych do leczenia nefropatii immunoglobuliny A (IgAN) za pomocą Dioscyny (DIO), aktywnego składnika Dioscoreae Nipponicae Rhizoma (DNR), oraz paradygmatu do badania efektów ziołolecznictwa i podstawowych mechanizmów in vivo i in vitro.

Łagodzenie nefropatii IgA za pośrednictwem dioscyny poprzez hamowanie aktywacji komórek B in vivo i zmniejszanie produkcji IgA1 z niedoborem galaktozy in vitro

Ten protokół opisuje metodę wywoływania jednostronnej niedrożności moczowodu (UUO) u myszy w celu zbadania postępu zwłóknienia tkanek w nefropatii obturacyjnej. Obejmuje zabiegi chirurgiczne, opiekę pooperacyjną i metody oceny zwłóknienia.

Model jednostronnej niedrożności moczowodu do badania zwłóknienia śródmiąższowego nerek

Poznaj metodę wykrywania mikroRNA w nerkach myszy HIGA z nefropatią IgA. Technika ta umożliwia badanie zmian ekspresji bez konieczności biopsji ludzkiej nerki, otwierając nowe możliwości diagnostyczne i terapeutyczne.

Wykrywanie ekspresji mikroRNA w nerkach myszy nefropatycznych z immunoglobuliną A

Przeglądaj więcej filmów