Izolacja i wzbogacanie ludzkich komórek progenitorowych nabłonka płuc do hodowli organoidów

Hodowle organoidów 3D są proksymalne w dystalnym nabłonku płuc opracowanym przy użyciu tego protokołu. Zapewnienie wykonalnego modelu do badania podstawowych mechanizmów utrzymania tkanki płucnej lub przebudowy związanej z chorobą oraz stanowi skuteczną platformę do odkrywania i walidacji leków. Protokół ten jest zgodny z innymi podejściami do frakcjonowania komórkowego dysocjacji tkanek.

A ponieważ nabłonkowe komórki progenitorowe są izolowane z różnych przedziałów anatomicznych i zachowują swoją tożsamość pozycyjną in vitro, można je wykorzystać do modelowania regionalnych różnic w reakcjach płuc na bodźce egzogenne lub endogenne. Ta technika poziomu może być stosowana do izolacji różnych subpopulacji komórek nabłonkowych, w tym komórek progenitorowych specyficznych dla regionu, które można hodować w celu uzyskania specjalistycznego, zróżnicowanego potomstwa reprezentatywnego dla regionu pochodzenia. Po otrzymaniu tkanki płucnej należy oddzielić proksymalną tchawicę i oskrzela od dystalnego nabłonka płuc, który zawiera małe drogi oddechowe o średnicy dwóch milimetrów lub mniejszej, oraz otaczającej tkanki miąższowej.

Umieść próbki na pojedynczych sterylnych szalkach Petriego o wymiarach 150 na 15 milimetrów i pokrój próbkę tkanki dystalnej w kostkę na około centymetrowe kawałki sześcienne. Umieść kawałki w czystej 50-milimetrowej tubie i umyj chusteczki trzy razy świeżym schłodzonym HBSS na pranie. Po ostatnim umyciu przenieś chusteczki na nową szalkę Petriego i osusz kawałki sterylnymi chusteczkami zapobiegającymi kłaczeniu.

Następnie użyj kleszczy i nożyczek, aby usunąć jak najwięcej opłucnej trzewnej przed rozdrobnieniem tkanek na fragmenty o średnicy około dwóch milimetrów. Do trawienia fragmentów tkanek dodaj 50 mikrogramów na mililitr liberazy i 25 mikrogramów na mililitr DNA do 25 mililitrów sterylnego HBSS w 50-mililitrowej stożkowej probówce. I dodaj około dwóch do trzech gramów mielonej tkanki do probówki.

Następnie umieść chusteczki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wytrząsając w sposób ciągły z prędkością 900 obrotów na minutę przez 40 do 60 minut. Po 30 minutach użyj 10-mililitrowej strzykawki, aby rozprowadzić strawioną tkankę, aby zapobiec tworzeniu się grudek. Pod koniec inkubacji użyj 10-mililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 16, aby pięciokrotnie rozcierać tkankę.

Następnie użyj pipety o szerokim otworze, aby przepuścić zawiesinę przez szereg filtrów siatkowych pod podciśnieniem, jak wskazano. Po umyciu ostatniego sitka 20 mililitrami HBSS plus w celu zebrania pozostałych komórek, odwirować filtraty w celu zebrania wyizolowanych komórek. Po odrzuceniu supernatantów dodać jeden mililitr buforu do lizy czerwonych krwinek do granulek delikatnym pipetowaniem przed inkubacją komórek przez jedną minutę lodu.

Pod koniec inkubacji dodać 10 do 20 mililitrów HBSS plus bufor, aby zneutralizować lizę i zebrać pozostałe komórki przez odwirowanie. Zubożyć CD31-dodatnie komórki śródbłonka i CD45-dodatnie komórki odpornościowe z puli wszystkich komórek za pomocą mikrokulek CD31 i CD45 sprzężonych z monoklonalnymi przeciwciałami anty-ludzkimi CD31 i CD45 oraz kolumnami LS zgodnie z protokołem producenta. W przypadku barwienia powierzchni komórek w kierunku FACS należy dodać odpowiednie pierwszorzędowe przeciwciała o wymaganym stężeniu i inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności.

Pod koniec inkubacji przemyć komórki trzema mililitrami HBSS plus i oznaczyć komórki odpowiednim stężeniem przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z fluoroforem na 30-minutową inkubację na lodzie, jeśli jest to właściwe. Pod koniec inkubacji umyć komórki trzema mililitrami HBSS plus i ponownie zawiesić komórki w stężeniu jeden razy 10 do 7 komórek na mililitr HBSS plus przed przefiltrowaniem komórek do pięciomililitrowych rurek polistyrenowych przez nasadkę sitkową, aby zapewnić utworzenie zawiesiny pojedynczej komórki. Następnie dodaj jeden mikrogram na mililitr DAPI, aby zabarwić przepuszczalne komórki.

W celu wzbogacenia komórek progenitorowych nabłonka tkanek proksymalnych należy wyciąć proksymalne drogi oddechowe z płuc i użyć nożyczek, aby otworzyć drogi oddechowe wzdłuż ich długości, aby odsłonić światło. Przykryj tkanki w 50 mikrogramach na mililitr liberazy przez 20 minut inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza, ciągle wstrząsając mikserem. Pod koniec inkubacji przenieś tkankę do sterylnego naczynia o wymiarach 150 na 15 milimetrów i za pomocą skalpela delikatnie zeskrob powierzchnię dróg oddechowych, aby całkowicie usunąć komórki nabłonka światła z tkanki.

Następnie umyj naczynie pięcioma mililitrami sterylnego buforu HBSS plus, aby zebrać wszystkie usunięte komórki nabłonka światła i przenieść komórki do 50-mililitrowej stożkowej probówki wirówkowej. Kolejno rozcierać zawiesinę pięciokrotnie za pomocą pipety o pojemności 10 mililitrów, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową. Następnie zebrać zawiesinę przez odwirowanie.

Następnie ponownie zawiesić osad w świeżym HBSS plus bufor na lodzie. Użyj nożyczek, aby przeciąć pozostałą tkankę tchawiczo-oskrzelową wzdłuż jej pierścieni, aby wygenerować małe paski tkanki. W nowym naczyniu użyj jednostronnej żyletki, aby zmielić paski na mniejsze kawałki i przenieś kawałki tkanki do probówek C zawierających dwa mililitry liberazy na probówkę.

Następnie użyj drugiego protokołu ludzkiego płuca na automatycznym dysocjatorze gentleMACS, aby dalej mechanicznie dysocjować tkankę. Pod koniec dysocjacji przenieś około dwóch gramów mielonej tkanki proksymalnej do 50-mililitrowych stożkowych probówek zawierających 50 mikrogramów na mililitr liberazy i 25 mikrogramów na mililitr roztworu DNA. Pod koniec 45-minutowej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem, przefiltrować zawiesinę tkankową przez szereg sit, jak pokazano dla dystalnej tkanki płucnej, i dodać równą objętość HBSS plus bufor do filtratu, aby zatrzymać trawienie.

Dodaj izolowane luminalne komórki proksymalnych dróg oddechowych do probówki i zbierz komórki przez odwirowanie. Komórki można następnie wzbogacić poprzez izolację mikrokulek i wybarwić w celu uzyskania interesujących markerów powierzchni komórek, jak wykazano w przypadku dystalnych komórek tkanki płucnej. Proksymalne drogi oddechowe wyściełane pseudowarstwowym nabłonkiem zawierają liczne podstawowe komórki progenitorowe, które są immunoreaktywne dla białka błonowego NGFR.

Natomiast komórki nabłonkowe wyściełające pęcherzyki płucne obejmują podgrupę, która wykazuje immunoreaktywność błony wierzchołkowej z przeciwciałem monoklonalnym HTII-280 sugerującym ich tożsamość komórek pęcherzykowych typu II. Wyczerpanie kulek magnetycznych zanieczyszczających czerwoną krew, komórki układu odpornościowego i śródbłonka powoduje znaczne wzbogacenie populacji komórek nabłonka zarówno w dystalnych, jak i proksymalnych próbkach tkanek z odpowiednim wzrostem skuteczności FACS. Dalsze zubożenie FACS prowadzi do wysoce wzbogaconych populacji komórek dystalnych, które można dodatkowo frakcjonować na podstawie barwienia powierzchni NGFR lub HTII-280.

Dodatnie hodowle dystalnych komórek nabłonka płuc HTII-280 dają szybko rozwijające się organoidy o średniej wydajności tworzenia kolonii wynoszącej 10%Barwienie immunofluorescencyjne kultur w dniu 30 ujawnia, że światło zawierające organoidy składa się głównie z komórek dystalnego nabłonka płuc HTII-280 i SPC dodatnich. Proksymalne organoidy nabłonkowe płuc hodowane z komórek dodatnich NGFR powodują tworzenie się organoidów zawierających światło w 30 dniu hodowli ze średnią wydajnością tworzenia kolonii wynoszącą 7,8%Empiryczna optymalizacja asocjacji tkanki enzymatycznej ma kluczowe znaczenie dla zachowania epitopów powierzchniowych, umożliwiając barwienie immunofluorescencyjne i wzbogacanie żywotnych podzbiorów komórek nabłonka dla kolejnego generowania zorganizowanych kultur specyficznych dla regionu. Metodę tę można dostosować do identyfikacji i wzbogacania podzbiorów komórek immunologicznych, naczyniowych, zrębowych i nabłonkowych oraz opracowywania modeli kokultur przy użyciu platform 3D organoidowych chipów.

Niedawno opisaliśmy zastosowanie organoidów pęcherzykowych wygenerowanych tą techniką jako platformy do badania zakażenia SARS-CoV-2 ludzkiego nabłonka płuc oraz do walidacji leków na COVID-19.