Name: Izolacja i wzbogacanie ludzkich komórek progenitorowych nabłonka płuc do hodowli organoidów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: Poznaj metody izolacji i wzbogacania ludzkich komórek progenitorowych nabłonka płuc z tkanek proksymalnych i dystalnych. Techniki te umożliwiają hodowlę 3D organoidów do badań biologii płuc i odkrywania leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Doceniamy wsparcie ze strony Mizuno Takako w zakresie barwienia IFC oraz H i E, Vanessy Garcii w sekcji tkanek oraz Aniki S Chandrasekaran za pomoc w przygotowaniu manuskryptu. Prace te są wspierane przez National Institutes of Health (5RO1HL135163-04, PO1HL108793-08) oraz Celgene IDEAL Consortium.

<ol><li>Rackley, C. R., Stripp, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+and+maintaining+the+epithelium+of+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Building and maintaining the epithelium of the lung.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).</li>
<li>Montoro, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+airway+epithelial+hierarchy+includes+CFTR-expressing+ionocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes.</a> Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).</li>
<li>Plasschaert, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+atlas+of+the+airway+epithelium+reveals+the+CFTR-rich+pulmonary+ionocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte.</a> Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).</li>
<li>Barkauskas, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+2+alveolar+cells+are+stem+cells+in+adult+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).</li>
<li>Barkauskas, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+organoids%3A+current+uses+and+future+promise%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Lung organoids: current uses and future promise.</a> Development. 144 (6), 986-997 (2017).</li>
<li>Leeman, K. T., Fillmore, C. M., Kim, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+Stem+and+Progenitor+Cells+in+Tissue+Homeostasis+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+in+Development+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Lung Stem and Progenitor Cells in Tissue Homeostasis and Disease.</a> Stem Cells in Development and Disease. 107, 207-233 (2014).</li>
<li>Rawlins, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Scgb1a1%28%2B%29+Clara+Cells+in+the+Long-Term+Maintenance+and+Repair+of+Lung+Airway+but+Not+Alveolar%2C+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The Role of Scgb1a1(+) Clara Cells in the Long-Term Maintenance and Repair of Lung Airway but Not Alveolar, Epithelium.</a> Cell Stem Cell. 4 (6), 525-534 (2009).</li>
<li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).</li>
<li>Chang, W. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmp4+is+essential+for+the+formation+of+the+vestibular+apparatus+that+detects+angular+head+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Genetics%22%5BJournal%5D)">Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements.</a> Plos Genetics. 4 (4), 1000050(2008).</li>
<li>McQualter, J. L., Bertoncello, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+Review%3A+Deconstructing+the+Lung+to+Reveal+Its+Regenerative+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise Review: Deconstructing the Lung to Reveal Its Regenerative Potential.</a> Stem Cells. 30 (5), 811-816 (2012).</li>
<li>Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTII-280%2C+a+Biomarker+Specific+to+the+Apical+Plasma+Membrane+of+Human+Lung+Alveolar+Type+II+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">HTII-280, a Biomarker Specific to the Apical Plasma Membrane of Human Lung Alveolar Type II Cells.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58 (10), 891-901 (2010).</li>
<li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch-Dependent+Differentiation+of+Adult+Airway+Basal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Notch-Dependent Differentiation of Adult Airway Basal Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 8 (6), 639-648 (2011).</li>
<li>Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tissue+cultures%3A+current+trends+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond.</a> Cell and Tissue Research. 352 (1), 123-131 (2013).</li>
<li>Hynds, R. E., Giangreco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+Review%3A+The+Relevance+of+Human+Stem+Cell-Derived+Organoid+Models+for+Epithelial+Translational+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise Review: The Relevance of Human Stem Cell-Derived Organoid Models for Epithelial Translational Medicine.</a> Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).</li>
<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis+in+a+dish%3A+Modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), (2014).</li>
<li>Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+test+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Organoids test drug response.</a> Nature Cell Biology. 20 (6), 634(2018).</li>
<li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li>
<li>Nikolic, M. Z., Rawlins, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+Organoids+and+Their+Use+To+Study+Cell-Cell+Interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pathobiology+Reports%22%5BJournal%5D)">Lung Organoids and Their Use To Study Cell-Cell Interaction.</a> Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+and+neurospheres--re-evaluating+the+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship.</a> Nature Methods. 2 (5), 333-336 (2005).</li>
<li>Chua, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+luminal+epithelial+progenitors+can+generate+prostate+organoids+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture.</a> Nature Cell Biology. 16 (10), 951-961 (2014).</li>
<li>Teisanu, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+two+distinct+bronchiolar+progenitors+during+lung+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Cellular+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of two distinct bronchiolar progenitors during lung injury and repair.</a> American Journal of Respiratory and Cellular Molecular Biology. 44 (6), 794-803 (2011).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+epithelial+progenitors+are+region+specific+and+show+differential+responses+to+bleomycin-induced+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Airway epithelial progenitors are region specific and show differential responses to bleomycin-induced lung injury.</a> Stem Cells. 30 (9), 1948-1960 (2012).</li>
<li>Benam, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+airway-on-a-chip+enables+analysis+of+human+lung+inflammation+and+drug+responses+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro.</a> Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).</li>
<li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li>
<li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Human+Lung+Alveolus-on-a-chip+Model+of+Intravascular+Thrombosis+for+Assessment+of+Therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Primary Human Lung Alveolus-on-a-chip Model of Intravascular Thrombosis for Assessment of Therapeutics.</a> Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).</li>
<li>Mulay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+infection+of+primary+human+lung+epithelium+for+COVID-19+modeling+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 infection of primary human lung epithelium for COVID-19 modeling and drug discovery.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisujemy wiarygodną metodę izolacji zdefiniowanych subpopulacji komórek płuc z ludzkiej tkanki płucnej do analizy molekularnej lub funkcjonalnej i modelowania choroby. Kluczowymi elementami metod są zdolność do osiągnięcia dysocjacji tkanek z zachowaniem epitopów powierzchniowych, które umożliwiają wzbogacenie świeżo wyizolowanych komórek za pośrednictwem przeciwciał, oraz optymalizacja metod hodowli w celu wydajnego generowania organoidów nabłonkowych specyficznych dla regionu. Koncentrujemy się na odzyskiwaniu i wzbog...

Przestrzenie powietrzne ludzkiego układu oddechowego można podzielić na strefy przewodzące i oddechowe, które pośredniczą odpowiednio w transporcie gazów i ich późniejszej wymianie przez barierę nabłonkowo-mikronaczyniową. Przewodzące drogi oddechowe obejmują tchawicę, oskrzela, oskrzeliki i oskrzeliki końcowe, podczas gdy przestrzenie oddechowe obejmują oskrzeliki oddechowe, przewody pęcherzykowe i pęcherzyki płucne. Wyściółka nabłonkowa tych przestrzeni powietrznych zmienia swój skład wzdłuż osi proksymo-dystalnej, aby dostosować się do unikalnych wymagań każdej funkcjonalnie odrębnej strefy. Pseudostratyfikowany nabłonek tchawiczo-oskrzelowych dróg oddechowych składa się z trzech głównych typów komórek, podstawnych, wydzielniczych i orzęsionych, oprócz mniej licznych typów komórek, w tym zaroślowych, neuroendokrynnych i jonocytów1,2,3. W drogach oddechowych oskrzelików występują morfologicznie podobne typy komórek nabłonkowych, chociaż istnieją różnice w ich liczebności i właściwościach funkcjonalnych. Na przykład komórki podstawne są mniej obfite w oskrzelowych drogach oddechowych, a komórki wydzielnicze zawierają większy odsetek komórek maczugowych w porównaniu z komórkami surowiczymi i kubkowymi, które dominują w tchawiczo-oskrzelowych drogach oddechowych. Komórki nabłonkowe strefy oddechowej obejmują słabo zdefiniowany prostopadłościenny typ komórek w oskrzelikach oddechowych, oprócz komórek pęcherzyków płucnych typu I (ATI) i typu II (ATII) przewodów pęcherzykowych i pęcherzyków płucnych1, 4. 
Tożsamość typów komórek macierzystych i progenitorowych nabłonka, które przyczyniają się do utrzymania i odnowy nabłonka w każdej strefie, nie jest w pełni opisana i w dużej mierze wywnioskowana z badań na modelach zwierzęcych5,6,7,8. Badania na myszach wykazały, że albo komórki podstawne pseudostratyfikowanych dróg oddechowych, albo komórki maczugowe dróg oddechowych oskrzelików lub komórki ATII nabłonka pęcherzyków płucnych, służą jako nabłonkowe komórki macierzyste w oparciu o zdolność do nieograniczonego samoodnawiania się i multipotencjalnego różnicowania7,9,10,11,12. Pomimo niemożności przeprowadzenia badań genetycznych nad linią genealogiczną w celu oceny macierzystych typów komórek nabłonka płuc ludzkich, dostępność modeli hodowlanych opartych na organoidach do oceny potencjału funkcjonalnego nabłonkowych komórek macierzystych i progenitorowych stanowi narzędzie do badań porównawczych między myszą a człowiekiem13,14,15,16,17.
Opisujemy metody izolacji typów komórek nabłonkowych z różnych regionów ludzkiego płuca i ich hodowli za pomocą systemu organoidów 3D do podsumowania regionalnych typów komórek. Podobne metody zostały opracowane do analizy funkcjonalnej i modelowania chorób komórek nabłonkowych z innych układów narządów18,19,20,21. Metody te stanowią platformę do identyfikacji regionalnych nabłonkowych komórek progenitorowych, do prowadzenia badań mechanistycznych nad ich regulacją i mikrośrodowiskiem, a także do modelowania chorób i odkrywania leków. Mimo że badania komórek progenitorowych nabłonka płuc przeprowadzone na modelach zwierzęcych mogą odnieść korzyści z analizy, zarówno in vivo, jak i in vitro, wgląd w tożsamość ludzkich komórek progenitorowych nabłonka płuc był w dużej mierze zależny od ekstrapolacji z organizmów modelowych. W związku z tym metody te stanowią pomost do powiązania tożsamości i zachowania typów komórek nabłonka płuc u ludzi z badaniami badającymi regulację komórek macierzystych / progenitorowych.

<table><tbody><tr><td>Izolacja</td><td></td><td></td><td></td>komórek</tr><tr><td>10 ml Sterylne strzykawki, końcówka Luer-Lok Fisher</td><td>scientific</td><td>BD 309646</td><td></td></tr><tr><td>30 ml Sterylne strzykawki, końcówka Luer-Lok</td> Worki <td>VWR</td><td>BD302832</td><td></td></tr><tr><td>Biohazard</td><td>VWR</td><td>89495-440</td><td></td></tr><tr><td>Worki Biohazard</td><td>VWR</td><td>89495-440</td><td></td></tr><tr><td>Pierścień łączący</td><td>Pluriselect</td><td>41-50000-03</td><td></td></tr><tr><td>Deoksyrybonukleaza (lot#SLBF7798V)</td><td>sigma Aldrich</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe szalki Petriego</td><td>Corning/Falcon</td><td>25373-187</td><td></td></tr><tr><td>Lejek</td><td>Pluriselect</td><td>42-50000</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Corning</td><td>21-023</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM Research Grade</td><td>sigma Aldrich</td><td>5401127001</td><td></td></tr><tr><td>igła 16G</td><td>VWR</td><td>305198</td><td></td></tr><tr><td>igła 18G</td><td>VWR</td><td>305199</td><td></td></tr><tr><td>PluriStrainer 100 &mikro; m (Sitko komórkowe)</td><td>Pluriselect</td><td>43-50100-51</td><td></td></tr><tr><td>Filtr siatkowy PluriStrainer 300 &micro; m (Sitko komórkowe)</td><td>Pluriselect</td><td>43-50300-03</td><td></td></tr><tr><td>Filtr siatkowy PluriStrainer 40 & mikro; m (Sitko komórkowe)</td><td>Pluriselect</td><td>43-50040-51</td><td></td></tr><tr><td>Filtr siatkowy PluriStrainer 500 &micro; m (Sitko komórkowe)</td><td>Pluriselect</td><td>43-50500-03</td><td></td></tr><tr><td>Filtr siatkowy PluriStrainer 70 & mikro; m (Sitko do komórek)</td><td>Pluriselect</td><td>43-50070-51</td><td></td></tr><tr><td>Żyletki</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy czerwonych krwinek</td><td>eBioscience</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt" s</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS C Rurki</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS Octo Disocjator</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-095-937</td><td></td></tr><tr><td>Leica ASP 300s Procesor</td><td></td><td></td><td></td>tkanek</tr><tr><td>LS Kolumny</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand**</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>05-412-503</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>05-412-503</td><td></td></tr><tr><td>HBSS+ Bufor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>15290018</td><td>2ml</td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M), pH 8,0, bez RNaz</td><td>Thermo fisher</td><td>scientific AM9260G</td><td>500&micro; l</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca Gemini</td><td>Bio-Products</td><td>100-106</td><td>10ml</td></tr><tr><td>HBSS Zbilansowany roztwór soli Hanka 1X 500 ml</td><td>VWR</td><td>45000-456</td><td>500ml butelka</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>15630080</td><td>5ml</td></tr><tr><td>Mieszanina antybiotyków penicylina-streptomycyna-neomycyna (PSN)</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>15640055</td><td>5ml</td></tr><tr><td>Lista przeciwciała dla FACS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anty-human CD326 (EpCAM) Przeciwciało</td><td>BioLegend</td><td>369820</td><td>1:50</td></tr><tr><td>BD CompBead Anti-Mouse Ig, K/ Zestaw cząstek kontroli negatywnej</td><td>Fisher Scientific</td><td>BDB552843</td><td></td></tr><tr><td>CD31 MicroBead Kit, ludzki</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-935</td><td>20&micro; l / 107 całkowita liczba komórek</td></tr><tr><td>CD45 Mikrokulki, ludzkie</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-801</td><td>20&mikro; l / 107 łączna liczba komórek</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542-10MG</td><td>1:10000</td></tr><tr><td>FITC anty-ludzki CD235a</td><td>BioLegend</td><td>349104</td><td>1:100</td></tr><tr><td>FITC anty-ludzki CD31</td><td>BioLegend</td><td>303104</td><td>1:100</td></tr><tr><td>FITC anty-ludzki CD45</td><td>BioLegend</td><td>304054</td><td>1:100</td></tr><tr><td>FITC anty-mysie przeciwciało IgM</td><td>BioLegend</td><td>406506</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Mysi IgM anty ludzki HT2-280</td><td>Terrace Biotech</td><td>TB-27AHT2-280</td><td>1:300</td></tr><tr><td>PE anty-ludzki CD271(NGFR)</td><td>BioLegend</td><td>345106</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Skład pożywek do hodowli organoidów</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MRC-5</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>PneumaCult -ALI Medium</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5001</td><td></td></tr><tr><td>Nabłonek małych dróg oddechowych Pożywka do wzrostu komórek</td><td>PromoCell</td><td>C-21170</td><td></td></tr><tr><td>ThinCert Wkładki do hodowli tkankowych, sterylny</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662641</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (inhibitor ROCK) 100mM zapas (1000x)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>72302</td><td></td></tr><tr><td>Mysz Podłoże podstawowe:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Thermo fisher naukowy</td><td>15290018</td><td>50 &mikro; l</td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>11330032</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>dla płodu Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Insulina-Transferyna-Selen (ITS -G) (100X)</td><td>ThermoFisher</td><td>naukowy 41400045</td><td>500 &mikro; l</td></tr><tr><td>Mieszanina antybiotyków penicylina-streptomycyna-neomycyna (PSN)</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>15640055</td><td>500 &micro; l</td></tr><tr><td>SB431542 Inhibitor szlaku TGF-&beta (zapas 100 mM)</td> <td>Komórka macierzysta</td><td>72234</td><td>5 i mikro; l</td></tr><tr><td>Wykaz przeciwciał do immunohistochemii</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór demaskujący antygen</td>, <td>wektor</td><td>H-3300</td><td>937 i mikro na bazie kwasu cytrynowego; l w 100 ml wody</td></tr><tr><td>Histogel</td><td>Thermo Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td>pierwotne</tr><tr><td>Anty HT2-280</td><td>Terracebiotech</td><td>TB-27AHT2-280</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne FOXJ1 (2A5)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-9965-82</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Ludzkie układy R i D przeciwciał uteroglobiny/SCGB1A1</td><td></td><td>MAB4218</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Keratyna 5 Poliklonalne przeciwciało kurczaka, oczyszczone [Poly9059]</td><td>Biolegend</td><td>905901</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne MUC5AC (45M1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MA5-12178</td><td>1:300</td></tr><tr><td>PDPN / Podoplanina Przeciwciało (klon 8.1.1)</td><td>LifeSpan Biosciences</td><td>LS-C143022-100</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Oczyszczone mysie przeciwciało anty-E-Kadheryna</td><td>BD biosciences</td><td>610182</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Przeciwciało Sox-2</td><td>Santa Cruz biotechnologies</td><td>sc-365964</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td>drugorzędowe</tr><tr><td>Osioł anty-królik lgG, 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21206</td><td>1:500</td></tr><tr><td>FITC przeciwciało anty-mysie IgM</td><td>BioLegend</td><td>406506</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało przeciw chomikowi IgG (H+L), Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21113</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało wtórne anty-mysie IgG1 z adsorbcją, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21121</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało wtórne anty-mysie IgG2a z adsorbacją krzyżową, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21131</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało wtórne anty-mysie IgG2a z adsorbcją, Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21134</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało wtórne anty-mysie IgG2b z adsorbacją krzyżową, Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21144</td><td>1:500</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immunohistochemiczny roztwór</td><td></td><td></td><td>blokujący 3% BSA, o.4% Triton-x100 w TBS (sól fizjologiczna na bazie Tris)</td></tr><tr><td>Roztwór</td><td></td><td></td> do inkubacji immunohistochemicznej <td>3% BSA, ).1% Triton-X100 w TBS</td></tr><tr><td>Immunohistochemiczny roztwór</td><td></td><td></td> myjący <td>TBS z 0,1% Tween 20</td></tr></tbody></table>

izolacja i wzbogacanie ludzkich komórek progenitorowych nabłonka płuc do hodowli organoidów

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Modele organoidów nabłonkowych służą jako cenne narzędzia do badania podstawowej biologii układu narządów i do modelowania chorób. Hodowane jako organoidy, nabłonkowe komórki progenitorowe mogą samoodnawiać się i generować zróżnicowane potomstwo, które wykazuje funkcje komórkowe podobne do ich odpowiedników in vivo. W tym miejscu opisujemy krok po kroku protokół izolowania specyficznych dla regionu komórek progenitorowych z ludzkich płuc i generowania kultur organoidów 3D jako narzędzia eksperymentalnego i walidacyjnego. Definiujemy proksymalne i dystalne obszary płuc w celu wyizolowania komórek progenitorowych specyficznych dla regionu. Wykorzystaliśmy kombinację dysocjacji enzymatycznej i mechanicznej, aby wyizolować wszystkie komórki z płuc i tchawicy. Specyficzne komórki progenitorowe zostały następnie pofrakcjonowane z komórek pochodzenia proksymalnego lub dystalnego za pomocą sortowania komórek związanych z fluorescencją (FACS) w oparciu o markery powierzchniowe specyficzne dla typu komórki, takie jak NGFR do sortowania komórek podstawnych i HTII-280 do sortowania komórek pęcherzykowych typu II. Izolowane podstawowe lub pęcherzykowe komórki progenitorowe typu II wykorzystano do wygenerowania 3D kultur organoidowych. Zarówno dystalne, jak i proksymalne komórki progenitorowe tworzyły organoidy o skuteczności tworzenia kolonii wynoszącej 9-13% w okolicy dystalnej i 7-10% w okolicy proksymalnej po posiewie 5000 komórek / studzienki w 30 dniu. Dystalne organoidy utrzymywały HTII-280+ komórki pęcherzykowe typu II w hodowli, podczas gdy organoidy proksymalne różnicowały się w komórki rzęskowe i wydzielnicze do 30 dnia. Te 3D hodowle organoidów mogą być wykorzystywane jako narzędzie eksperymentalne do badania biologii komórki nabłonka płuc i nabłonkowych interakcji mezenchymalnych, a także do opracowywania i walidacji strategii terapeutycznych ukierunkowanych na dysfunkcję nabłonka w chorobie.

Wyjściowa tkanka płucna 
Tchawica i oskrzela pozapłucne (Rysunek 1A) posłużyły jako tkanka wyjściowa do izolacji komórek nabłonkowych proksymalnych dróg oddechowych i późniejszej generacji organoidów proksymalnych. Dystalna tkanka płucna obejmująca zarówno miąższ, jak i małe drogi oddechowe o średnicy mniejszej niż 2 mm (Rysunek 1A) została wykorzystana do izolacji komórek nabłonkowych małych dróg oddechowych i pęcherzyków płucnych (dystalny ...

Ten artykuł zawiera szczegółową metodologię metod dysocjacji tkanek i frakcjonowania komórkowego, umożliwiając wzbogacenie żywotnych komórek nabłonkowych z bliższych i dalszych obszarów ludzkiego płuca. W tym przypadku podejścia te są stosowane do analizy funkcjonalnej komórek progenitorowych nabłonka płuc poprzez wykorzystanie modeli hodowli organoidów 3D.

Izolacja i wzbogacanie ludzkich komórek progenitorowych nabłonka płuc do hodowli organoidów

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...

Hodowle organoidów 3D są proksymalne w dystalnym nabłonku płuc opracowanym przy użyciu tego protokołu. Zapewnienie wykonalnego modelu do badania podstawowych mechanizmów utrzymania tkanki płucnej lub przebudowy związanej z chorobą oraz stanowi skuteczną platformę do odkrywania i walidacji leków. Protokół ten jest zgodny z innymi podejściami do frakcjonowania komórkowego dysocjacji tkanek.A ponieważ nabłonkowe komórki progenitorowe są izolowane z różnych przedziałów anatomicznych i zachowują swoją tożsamość pozycyjną in vitro, można je wykorzystać do modelowania regionalnych różnic w reakcjach płuc na bodźce egzogenne lub endogenne. Ta technika poziomu może być stosowana do izolacji różnych subpopulacji komórek nabłonkowych, w tym komórek progenitorowych specyficznych dla regionu, które można hodować w celu uzyskania specjalistycznego, zróżnicowanego potomstwa reprezentatywnego dla regionu pochodzenia. Po otrzymaniu tkanki płucnej należy oddzielić proksymalną tchawicę i oskrzela od dystalnego nabłonka płuc, który zawiera małe drogi oddechowe o średnicy dwóch milimetrów lub mniejszej, oraz otaczającej tkanki miąższowej.Umieść próbki na pojedynczych sterylnych szalkach Petriego o wymiarach 150 na 15 milimetrów i pokrój próbkę tkanki dystalnej w kostkę na około centymetrowe kawałki sześcienne. Umieść kawałki w czystej 50-milimetrowej tubie i umyj chusteczki trzy razy świeżym schłodzonym HBSS na pranie. Po ostatnim umyciu przenieś chusteczki na nową szalkę Petriego i osusz kawałki sterylnymi chusteczkami zapobiegającymi kłaczeniu.Następnie użyj kleszczy i nożyczek, aby usunąć jak najwięcej opłucnej trzewnej przed rozdrobnieniem tkanek na fragmenty o średnicy około dwóch milimetrów. Do trawienia fragmentów tkanek dodaj 50 mikrogramów na mililitr liberazy i 25 mikrogramów na mililitr DNA do 25 mililitrów sterylnego HBSS w 50-mililitrowej stożkowej probówce. I dodaj około dwóch do trzech gramów mielonej tkanki do probówki.Następnie umieść chusteczki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wytrząsając w sposób ciągły z prędkością 900 obrotów na minutę przez 40 do 60 minut. Po 30 minutach użyj 10-mililitrowej strzykawki, aby rozprowadzić strawioną tkankę, aby zapobiec tworzeniu się grudek. Pod koniec inkubacji użyj 10-mililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 16, aby pięciokrotnie rozcierać tkankę.Następnie użyj pipety o szerokim otworze, aby przepuścić zawiesinę przez szereg filtrów siatkowych pod podciśnieniem, jak wskazano. Po umyciu ostatniego sitka 20 mililitrami HBSS plus w celu zebrania pozostałych komórek, odwirować filtraty w celu zebrania wyizolowanych komórek. Po odrzuceniu supernatantów dodać jeden mililitr buforu do lizy czerwonych krwinek do granulek delikatnym pipetowaniem przed inkubacją komórek przez jedną minutę lodu.Pod koniec inkubacji dodać 10 do 20 mililitrów HBSS plus bufor, aby zneutralizować lizę i zebrać pozostałe komórki przez odwirowanie. Zubożyć CD31-dodatnie komórki śródbłonka i CD45-dodatnie komórki odpornościowe z puli wszystkich komórek za pomocą mikrokulek CD31 i CD45 sprzężonych z monoklonalnymi przeciwciałami anty-ludzkimi CD31 i CD45 oraz kolumnami LS zgodnie z protokołem producenta. W przypadku barwienia powierzchni komórek w kierunku FACS należy dodać odpowiednie pierwszorzędowe przeciwciała o wymaganym stężeniu i inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności.Pod koniec inkubacji przemyć komórki trzema mililitrami HBSS plus i oznaczyć komórki odpowiednim stężeniem przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z fluoroforem na 30-minutową inkubację na lodzie, jeśli jest to właściwe. Pod koniec inkubacji umyć komórki trzema mililitrami HBSS plus i ponownie zawiesić komórki w stężeniu jeden razy 10 do 7 komórek na mililitr HBSS plus przed przefiltrowaniem komórek do pięciomililitrowych rurek polistyrenowych przez nasadkę sitkową, aby zapewnić utworzenie zawiesiny pojedynczej komórki. Następnie dodaj jeden mikrogram na mililitr DAPI, aby zabarwić przepuszczalne komórki.W celu wzbogacenia komórek progenitorowych nabłonka tkanek proksymalnych należy wyciąć proksymalne drogi oddechowe z płuc i użyć nożyczek, aby otworzyć drogi oddechowe wzdłuż ich długości, aby odsłonić światło. Przykryj tkanki w 50 mikrogramach na mililitr liberazy przez 20 minut inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza, ciągle wstrząsając mikserem. Pod koniec inkubacji przenieś tkankę do sterylnego naczynia o wymiarach 150 na 15 milimetrów i za pomocą skalpela delikatnie zeskrob powierzchnię dróg oddechowych, aby całkowicie usunąć komórki nabłonka światła z tkanki.Następnie umyj naczynie pięcioma mililitrami sterylnego buforu HBSS plus, aby zebrać wszystkie usunięte komórki nabłonka światła i przenieść komórki do 50-mililitrowej stożkowej probówki wirówkowej. Kolejno rozcierać zawiesinę pięciokrotnie za pomocą pipety o pojemności 10 mililitrów, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową. Następnie zebrać zawiesinę przez odwirowanie.Następnie ponownie zawiesić osad w świeżym HBSS plus bufor na lodzie. Użyj nożyczek, aby przeciąć pozostałą tkankę tchawiczo-oskrzelową wzdłuż jej pierścieni, aby wygenerować małe paski tkanki. W nowym naczyniu użyj jednostronnej żyletki, aby zmielić paski na mniejsze kawałki i przenieś kawałki tkanki do probówek C zawierających dwa mililitry liberazy na probówkę.Następnie użyj drugiego protokołu ludzkiego płuca na automatycznym dysocjatorze gentleMACS, aby dalej mechanicznie dysocjować tkankę. Pod koniec dysocjacji przenieś około dwóch gramów mielonej tkanki proksymalnej do 50-mililitrowych stożkowych probówek zawierających 50 mikrogramów na mililitr liberazy i 25 mikrogramów na mililitr roztworu DNA. Pod koniec 45-minutowej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem, przefiltrować zawiesinę tkankową przez szereg sit, jak pokazano dla dystalnej tkanki płucnej, i dodać równą objętość HBSS plus bufor do filtratu, aby zatrzymać trawienie.Dodaj izolowane luminalne komórki proksymalnych dróg oddechowych do probówki i zbierz komórki przez odwirowanie. Komórki można następnie wzbogacić poprzez izolację mikrokulek i wybarwić w celu uzyskania interesujących markerów powierzchni komórek, jak wykazano w przypadku dystalnych komórek tkanki płucnej. Proksymalne drogi oddechowe wyściełane pseudowarstwowym nabłonkiem zawierają liczne podstawowe komórki progenitorowe, które są immunoreaktywne dla białka błonowego NGFR.Natomiast komórki nabłonkowe wyściełające pęcherzyki płucne obejmują podgrupę, która wykazuje immunoreaktywność błony wierzchołkowej z przeciwciałem monoklonalnym HTII-280 sugerującym ich tożsamość komórek pęcherzykowych typu II. Wyczerpanie kulek magnetycznych zanieczyszczających czerwoną krew, komórki układu odpornościowego i śródbłonka powoduje znaczne wzbogacenie populacji komórek nabłonka zarówno w dystalnych, jak i proksymalnych próbkach tkanek z odpowiednim wzrostem skuteczności FACS. Dalsze zubożenie FACS prowadzi do wysoce wzbogaconych populacji komórek dystalnych, które można dodatkowo frakcjonować na podstawie barwienia powierzchni NGFR lub HTII-280.Dodatnie hodowle dystalnych komórek nabłonka płuc HTII-280 dają szybko rozwijające się organoidy o średniej wydajności tworzenia kolonii wynoszącej 10%Barwienie immunofluorescencyjne kultur w dniu 30 ujawnia, że światło zawierające organoidy składa się głównie z komórek dystalnego nabłonka płuc HTII-280 i SPC dodatnich. Proksymalne organoidy nabłonkowe płuc hodowane z komórek dodatnich NGFR powodują tworzenie się organoidów zawierających światło w 30 dniu hodowli ze średnią wydajnością tworzenia kolonii wynoszącą 7,8%Empiryczna optymalizacja asocjacji tkanki enzymatycznej ma kluczowe znaczenie dla zachowania epitopów powierzchniowych, umożliwiając barwienie immunofluorescencyjne i wzbogacanie żywotnych podzbiorów komórek nabłonka dla kolejnego generowania zorganizowanych kultur specyficznych dla regionu. Metodę tę można dostosować do identyfikacji i wzbogacania podzbiorów komórek immunologicznych, naczyniowych, zrębowych i nabłonkowych oraz opracowywania modeli kokultur przy użyciu platform 3D organoidowych chipów.Niedawno opisaliśmy zastosowanie organoidów pęcherzykowych wygenerowanych tą techniką jako platformy do badania zakażenia SARS-CoV-2 ludzkiego nabłonka płuc oraz do walidacji leków na COVID-19.

isolation-enrichment-human-lung-epithelial-progenitor-cells-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten protokół skutecznie kieruje endodermę pochodzącą z embrionalnych komórek macierzystych myszy do dojrzałych komórek nabłonka dróg oddechowych. Ta technika różnicowania wykorzystuje trójwymiarowe, zdecelularizowane rusztowania płuc do kierowania specyfikacją linii płuc w zdefiniowanych, wolnych od surowicy warunkach hodowli.

Generowanie komórek nabłonka dróg oddechowych myszy pochodzących z ESC przy użyciu bezkomórkowych rusztowań płuc

Artykuł opisuje stopniowe różnicowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do trójwymiarowych organoidów całego płuca zawierających zarówno proksymalne, jak i dystalne komórki nabłonkowe płuc wraz z mezenchymą.

Generowanie 3D organoidów całych płuc z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do modelowania biologii i chorób rozwojowych płuc

Protokół przedstawia metodę pozyskiwania ludzkich organoidów płucnych z pierwotnych tkanek płuc, rozszerzania organoidów płuc i wywoływania różnicowania proksymalnego w celu wygenerowania organoidów dróg oddechowych 3D i 2D, które wiernie kopiują nabłonek ludzkich dróg oddechowych.

Ustalanie ludzkich organoidów płuc i różnicowanie proksymalne w celu wytworzenia dojrzałych organoidów dróg oddechowych

Ostatnie postępy w protokołach różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych pozwalają na stopniowe wyprowadzanie typów komórek specyficznych dla narządów. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe kroki dotyczące utrzymania i ekspansji komórek podstawnych dróg oddechowych pochodzących z iPSC oraz ich różnicowania w nabłonek śluzowo-rzęskowy w kulturach na granicy faz powietrze-ciecz.

Wytwarzanie kultur komórek nabłonka dróg oddechowych na granicy faz powietrze-ciecz z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przedstawiona tutaj jest powtarzalna, przystępna cenowo i solidna metoda izolacji i ekspansji pierwotnych komórek nabłonka oskrzeli do długoterminowego biobankowania i generowania zróżnicowanych komórek nabłonkowych przez hodowlę na granicy powietrze-ciecz.

Izolowanie komórek nabłonka oskrzeli z wyciętej tkanki płucnej w celu biobankowania i tworzenia dobrze zróżnicowanych kultur granicy faz powietrze-ciecz

Opisujemy protokół izolowania mysich krypt jelita cienkiego i hodowania organoidów 3D jelit z krypt. Dodatkowo opisujemy metodę generowania organoidów z pojedynczej jelitowej komórki macierzystej przy braku podnabłonkowej niszy komórkowej.

Hodowla 3D organoidów z krypt jelit mysich i pojedynczej komórki macierzystej do badań nad organoidami

Ten artykuł opisuje generowanie złożonego, wielokomórkowego modelu bariery dróg oddechowych, składającego się z nabłonka płuc pochodzącego z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), mezenchymów, komórek śródbłonka i makrofagów w hodowli na granicy powietrza i cieczy.

Hodowla komórek nabłonkowych, mezenchymalnych, śródbłonkowych i odpornościowych pochodzących z iPSC w celu modelowania integralności bariery dróg oddechowych w zdrowiu i chorobie płuc

Przedstawiamy metodę izolacji i hodowli progenitorowych komórek ziarnistych neuronów móżdżku oraz neuronów ziarnistych móżdżku z myszy w okresie postnatalnym. <br...

Izolacja i hodowla postnatalnych progenitorów neuronów ziarnistych oraz neuronów z móżdżku myszy

Endotelialne komórki progenitorowe tworzące kolonie (ECFCs) stanowią obiecujące narzędzie do badania homeostazy i regeneracji naczyń krwionośnych.1,2 Niniejsza praca przedstawia nową metodę izolacji i ekspansji ECFC z heparynowanej krwi obwodowej dorosłego człowieka bez użycia surowicy zwierzęcej, z wykorzystaniem puli lizatu płytek krwi człowieka (pHPL), co zmniejsza ryzyko immunizacji przeciwko białkom bydlęcym.

Izolacja i wielkoskalowa ekspansja dorosłych ludzkich endotelialnych komórek progenitorowych zdolnych do tworzenia kolonii

Niniejszy artykuł przedstawia metodę izolacji i hodowli zarodków przepiórki lub kury na etapie HH14.- komórki endokardialne zastawki oraz mezenchymalne komórki poduszeczki zastawkowej w stadium HH25.

Izolacja i hodowla zarodkowych komórek progenitorowych zastawek ptasich

Poznaj metody izolacji i wzbogacania ludzkich komórek progenitorowych nabłonka płuc z tkanek proksymalnych i dystalnych. Techniki te umożliwiają hodowlę 3D organoidów do badań biologii płuc i odkrywania leków.

Izolacja i wzbogacanie ludzkich komórek progenitorowych nabłonka płuc do hodowli organoidów

Przeglądaj więcej filmów