Name: Izolacja jąder ze świeżo zamrożonych guzów mózgu dla sekwencji RNA pojedynczego jądra i sekwencji ATAC (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-25T13:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: Poznaj protokół izolacji jąder z zamrożonych guzów mózgu do sekwencjonowania RNA i ATAC pojedynczych jąder. Metoda umożliwia badania transkrypcyjne i epigenetyczne gliomów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Single Cell Open Lab (scOpenLab) przy Niemieckim Centrum Onkologii (DKFZ) za pomocne dyskusje. Badania te były wspierane przez German Cancer Aid, grant Max-Eder Program nr 70111964 (S.T.).

Świeżo mrożone próbki glejaka zostały pobrane z banku tkanek Narodowego Centrum Chorób Nowotworowych (NCT) w Heidelbergu, Niemcy. Wykorzystanie materiału pacjenta zostało zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną na Wydziale Medycznym w Heidelbergu i uzyskano świadomą zgodę od wszystkich pacjentów włączonych do badania.
1. Przygotowanie eksperymentalne
<ol>
	<li>Wszystkie czynności należy wykonywać na lodzie lub w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wstępnie schłodzić probówki, naczynia, żyletki, leżaczki i tłuczki do temperatury 4 °C.</li>
	<li>Przygotuj wszystkie z wyprzedzeniem. te są stabilne w temperaturze pokojowej. Zalecana jest filtracja sterylna, szczególnie w przypadku sacharozy. Preparaty wyjściowe są modyfikowane z Corces et al.19. Patrz tabele 1-7.</li>
	<li>Wyjąć próbki z zamrażarki w ciekłym azocie lub temperaturze -80 °C i przechowywać na suchym lodzie do etapu 2.1.</li>
</ol>
2. Sekcja i dysocjacja tkanek
<ol>
	<li>Przenieść świeżo zamrożoną próbkę tkanki (10–60 mg) na wstępnie schłodzoną szalkę Petriego. Świeżo zamrożoną tkankę zmielić/posiekać żyletką na małe kawałki na lodzie.</li>
	<li>Dodać 500 μl schłodzonego buforu do lizy jąder do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 ml. Umieść kawałki tkanki w probówce o pojemności 1,5 ml zawierającej bufor do lizy jąder i przenieś do Douncer (tabela materiałów). 
	UWAGA: Istnieją dwa tłuczki homogenizatora Dounce: tłuczek "luźny" lub "A" do wstępnej redukcji próbki oraz tłuczek "ciasny" lub "B" do pełnej homogenizacji próbki.</li>
	<li>Odbijaj kawałki tkanki "luźnym" tłuczkiem przez około 20 uderzeń, aż tarcie zostanie zmniejszone. Jeżeli obecne są zanieczyszczenia, próbkę można wstępnie oczyścić przez filtrację za pomocą sitka o średnicy 100 mm.</li>
	<li>Odbijaj "ciasnym" tłuczkiem przez 20 uderzeń, aby uzyskać pełną homogenizację tkanek.</li>
	<li>Przenieść homogenat (około 500 μl) do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 2 ml. Dodać 1 ml schłodzonego buforu do lizy. Delikatnie wymieszaj i inkubuj na lodzie przez 5 minut. Delikatnie wymieszać końcówką pipety o szerokim otworze i powtórzyć 1-2 razy podczas inkubacji.</li>
	<li>Przefiltrować cały homogenat za pomocą siatki sitowej o wielkości 30 μm, zebrać do probówki Falcon o pojemności 15 ml i przenieść z powrotem do nowej, wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 2 ml. Pojedyncze sitko jest zazwyczaj wystarczające dla całego homogenatu.</li>
	<li>Sprawdź pod mikroskopem świetlnym, aby zweryfikować usunięcie dużych zanieczyszczeń i nienaruszoną membranę jądrową. Jądra muszą być okrągłe, a błona jądrowa nie powinna być zniekształcona. Jeśli szczątki są obecne, jądra mogą być ponownie filtrowane.</li>
	<li>Odwirować jądra przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C na wirówce stołowej. Usunąć supernatant, pozostawiając ~50 μL z osadem zawierającym jądra. Delikatnie zawiesić osad w kolejnym 1 ml buforu do lizy jąder i inkubować przez 5 minut na lodzie.</li>
	<li>Odwirować jądra przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4°C. Usunąć supernatant bez naruszania osadu, dodać 500 ml 1x buforu homogenizacyjnego (HB) (Tabela 4) i inkubować przez 5 minut bez ponownego zawieszania. Następnie ponownie zawieś jądra w kolejnym 1,0 ml 1x HB.</li>
	<li>Odwirować jądra przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i delikatnie zawiesić jądra w 200 μl 1x HB w nowej probówce o pojemności 2,0 ml.</li>
</ol>
3. Wirowanie gradientowe
<ol>
	<li>Dodać 200 μl 50% roztworu jodiksanolu (Tabela 5), aby uzyskać końcowe stężenie 25% jodiksanolu. Dobrze wymieszać 10 razy pipetą ustawioną na 300 ml.</li>
	<li>Dodać 300 μl 29% roztworu jodiksanolu (Tabela 6) pod 25% mieszaninę. Użyj cienkiej końcówki P1000, aby uniknąć mieszania się warstw.</li>
	<li>Dodać 300 μl 35% roztworu jodiksanolu (tabela 7) pod 29% mieszaninę. Użyj cienkiej końcówki P1000, aby uniknąć mieszania się warstw. 
	Przestroga: Ten krok wymaga stopniowego zdejmowania końcówki pipety podczas pipetowania, aby uniknąć nadmiernego przemieszczania objętości.</li>
	<li>Umieścić próbki w wirówce z odchylanym wiadrem, wirować przez 20 minut w temperaturze 3 500 x g w temperaturze 4°C przy wyłączonym hamulcu.</li>
	<li>Delikatnie usunąć próbki bez wstrząsania i obserwować pod światłem. Pomiędzy drugą a trzecią warstwą powinien być widoczny wyraźny biały pas jąder o czystości 95% (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
</ol>
4. Izolacja jąder
<ol>
	<li>Zasysaj górne warstwy aż do powstania białego pasma jąder na interfazie 29%-35%.</li>
	<li>Zebrać pasmo jąder w objętości 200 ml, przenieść do świeżej probówki i przefiltrować filtrem 20 μm (tabela materiałów). 
	UWAGA: Jądra nie muszą być ponownie zawieszane przed filtracją.</li>
	<li>Sprawdź pod mikroskopem świetlnym, aby zweryfikować usunięcie dużych zanieczyszczeń i nienaruszoną membranę jądrową. Jądra muszą być okrągłe, a błona jądrowa nie powinna być zniekształcona.</li>
	<li>Policz jądra za pomocą barwienia błękitem trypanowym na hemocytometrze i podwielokrotne jądra dla snRNA-seq/snATAC-seq.</li>
</ol>
5. Pojedyncze jądra RNA i sekwencja ATAC
<ol>
	<li>Natychmiast przetworzyć jądra za pomocą ekspresji genów jednokomórkowych i zestawów odczynników ATAC dla jednej komórki (tabela materiałów). 
	UWAGA: Stężenia próbek jąder dla systemu 10x Genomics wynoszą 1500-3000 jąder na μL dla snRNA-seq i 3500-7000 jąder na m μL dla snATAC-seq. Jądra można rozcieńczać za pomocą 1x PBS.</li>
	<li>Sekwencjonowanie powstałych bibliotek w ośrodku Genomics Core Facility.</li>
	<li>Wykonaj analizę kontroli jakości danych. Jądra są włączane do dalszej analizy, jeśli zawierają unikalny identyfikator molekularny (UMI) >1000, liczbę genów >500 i procent genów mitochondrialnych <5% i mieszczą się w zakresie średnich + trzech odchyleń standardowych UMI i genów.</li>
</ol>

<ol><li>Huse, J. T., Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+brain+cancer%3A+advances+in+the+molecular+pathology+of+malignant+glioma+and+medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting brain cancer: advances in the molecular pathology of malignant glioma and medulloblastoma.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (5), 319-331 (2010).</li>
<li>Kreso, A., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+cancer+stem+cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Evolution of the cancer stem cell model.</a> Cell Stem Cell. 14 (3), 275-291 (2014).</li>
<li>Filbin, M. G., Suva, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gliomas+Genomics+and+Epigenomics%3A+Arriving+at+the+Start+and+Knowing+It+for+the+First+Time%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Gliomas Genomics and Epigenomics: Arriving at the Start and Knowing It for the First Time.</a> Annual Review of Pathology. 11, 497-521 (2016).</li>
<li>Ferris, S. P., Hofmann, J. W., Solomon, D. A., Perry, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+gliomas%3A+from+morphology+to+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Archive%22%5BJournal%5D)">Characterization of gliomas: from morphology to molecules.</a> Virchows Archive. 471 (2), 257-269 (2017).</li>
<li>Louis, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2016+World+Health+Organization+Classification+of+Tumors+of+the+Central+Nervous+System%3A+a+summary%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary.</a> Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).</li>
<li>Eckel-Passow, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+Groups+Based+on+1p%2F19q%2C+IDH%2C+and+TERT+Promoter+Mutations+in+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Glioma Groups Based on 1p/19q, IDH, and TERT Promoter Mutations in Tumors.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2499-2508 (2015).</li>
<li>Suzuki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+landscape+and+clonal+architecture+in+grade+II+and+III+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutational landscape and clonal architecture in grade II and III gliomas.</a> Nature Genetics. 47 (5), 458-468 (2015).</li>
<li>Cancer Genome Atlas Research. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive%2C+Integrative+Genomic+Analysis+of+Diffuse+Lower-Grade+Gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).</li>
<li>Noushmehr, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+CpG+island+methylator+phenotype+that+defines+a+distinct+subgroup+of+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a CpG island methylator phenotype that defines a distinct subgroup of glioma.</a> Cancer Cell. 17 (5), 510-522 (2010).</li>
<li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IDH1+and+IDH2+mutations+in+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">IDH1 and IDH2 mutations in gliomas.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (8), 765-773 (2009).</li>
<li>Yan, H., Bigner, D. D., Velculescu, V., Parsons, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+metabolic+enzymes+are+at+the+origin+of+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Mutant metabolic enzymes are at the origin of gliomas.</a> Cancer Research. 69 (24), 9157-9159 (2009).</li>
<li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+genome+sequencing%3A+current+state+of+the+science%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-cell genome sequencing: current state of the science.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175-188 (2016).</li>
<li>Tanay, A., Regev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+single-cell+genomics+from+phenomenology+to+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Scaling single-cell genomics from phenomenology to mechanism.</a> Nature. 541 (7637), 331-338 (2017).</li>
<li>Wu, M., Singh, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Flow+Cytometry+for+Single-Cell+Protein+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Flow Cytometry for Single-Cell Protein Analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1346, 69-83 (2015).</li>
<li>Schwartzman, O., Tanay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+epigenomics%3A+techniques+and+emerging+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-cell epigenomics: techniques and emerging applications.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (12), 716-726 (2015).</li>
<li>Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Multiomics%3A+Multiple+Measurements+from+Single+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Multiomics: Multiple Measurements from Single Cells.</a> Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).</li>
<li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+chromatin+accessibility+reveals+principles+of+regulatory+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation.</a> Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).</li>
<li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+single-nucleus+RNA-seq+with+DroNc-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq.</a> Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).</li>
<li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+ATAC-seq+protocol+reduces+background+and+enables+interrogation+of+frozen+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues.</a> Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).</li>
<li>Slyper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+and+single-nucleus+RNA-Seq+toolbox+for+fresh+and+frozen+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors.</a> Nature Medicine. 26 (5), 792-802 (2020).</li>
<li>Mathys, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomic+analysis+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomic analysis of Alzheimer's disease.</a> Nature. 570 (7761), 332-337 (2019).</li>
<li>Krishnaswami, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+single+nuclei+for+RNA-seq+to+capture+the+transcriptome+of+postmortem+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons.</a> Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).</li>
<li>Al-Dalahmah, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+RNA-seq+identifies+Huntington+disease+astrocyte+states%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus RNA-seq identifies Huntington disease astrocyte states.</a> Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 19(2020).</li>
<li>Jakel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+human+oligodendrocyte+heterogeneity+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Altered human oligodendrocyte heterogeneity in multiple sclerosis.</a> Nature. 566 (7745), 543-547 (2019).</li>
<li>Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+single-cell+transcriptomic+data+across+different+conditions%2C+technologies%2C+and+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species.</a> Nature Biotechnology. , (2018).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+single-cell+analysis+of+transcriptional+and+epigenetic+states+in+the+human+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Integrative single-cell analysis of transcriptional and epigenetic states in the human adult brain.</a> Nature Biotechnology. 36 (1), 70-80 (2018).</li>
<li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Integration+of+Single-Cell+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Integration of Single-Cell Data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li>
<li>Bready, D., Placantonakis, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Pathogenesis+of+Low-Grade+Glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Molecular Pathogenesis of Low-Grade Glioma.</a> Neurosurgery Clinics of North America. 30 (1), 17-25 (2019).</li>
<li>Venteicher, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoupling+genetics%2C+lineages%2C+and+microenvironment+in+IDH-mutant+gliomas+by+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Decoupling genetics, lineages, and microenvironment in IDH-mutant gliomas by single-cell RNA-seq.</a> Science. 355 (6332), (2017).</li>
<li>Tirosh, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+supports+a+developmental+hierarchy+in+human+oligodendroglioma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq supports a developmental hierarchy in human oligodendroglioma.</a> Nature. 539 (7628), 309-313 (2016).</li>
<li>Weng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Transcriptomics+Uncovers+Glial+Progenitor+Diversity+and+Cell+Fate+Determinants+during+Development+and+Gliomagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Transcriptomics Uncovers Glial Progenitor Diversity and Cell Fate Determinants during Development and Gliomagenesis.</a> Cell Stem Cell. 24 (5), 707-723 (2019).</li>
<li>Neftel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Integrative+Model+of+Cellular+States%2C+Plasticity%2C+and+Genetics+for+Glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An Integrative Model of Cellular States, Plasticity, and Genetics for Glioblastoma.</a> Cell. 178 (4), 835-849 (2019).</li>
<li>Al-Ali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+chromatin+accessibility+reveals+intratumoral+epigenetic+heterogeneity+in+IDH1+mutant+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus chromatin accessibility reveals intratumoral epigenetic heterogeneity in IDH1 mutant gliomas.</a> Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 201(2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Dziedzina heterogeniczności wewnątrznowotworowej znajduje się na ekscytującym etapie, a nowe testy i platformy są opracowywane w celu rzucenia wyzwania i poszerzenia istniejącej wiedzy. Heterogeniczność wewnątrz guza jest kluczowym czynnikiem, który przyczynia się do progresji choroby i oporności na obecne metody leczenia glejaków28. Ostatnie badania nad guzami mózgu skupiły się na tym ważnym aspekcie, wykorzystując testy transkryptomiczne i epigenomiczne pojedynczych komórek, aby lepiej scharakte...

Rozlane glejaki niższego stopnia (LGG), najczęstszy pierwotny guz mózgu u dorosłych, to nowotwory naciekowe, które często pojawiają się w półkuli mózgowej. LGG wykazują zarówno niejednorodność między-, jak i wewnątrzguzową, która jest napędzana nie tylko przez populację guza, ale także przez niezłośliwe komórki misternie zaangażowane w rozwój i progresję guza1,2,3,4,5.
W ciągu ostatniej dekady nastąpiła lawina danych genomicznych zebranych w dziedzinie glejaków. Dane te pochodzą głównie z badań sekwencjonowania guzów masowych i w ogromnym stopniu przyczyniły się do charakterystyki molekularnej oraz obecnej klasyfikacji guzów mózgu5,6,7,8,9,10,11. Jednak, mimo że badania te ujawniły szeroki krajobraz molekularny związany z glejakami, nadal istnieje rozczarowujący brak postępów w zakresie interwencji terapeutycznej. Jedną z przeszkód w oporności na leczenie w guzach mózgu jest niejednorodność wewnątrz guza. Aby rozwiązać ten problem, różne badania koncentrują się na heterogeniczności genomicznej, transkryptomicznej, proteomicznej i epigenetycznej obecnej w guzie na poziomie pojedynczej komórki12,13,14,15,16,17.
Chociaż w ciągu ostatnich kilku lat nastąpił niezwykły postęp technologiczny w dziedzinie pojedynczych komórek, jednym z głównych czynników ograniczających jest dostępność świeżych próbek potrzebnych do izolacji komórek i przeprowadzenia tych eksperymentów. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, podjęto kilka udanych prób przeprowadzenia testów, takich jak snRNA-seq i snATAC-seq z zamrożonych tkanek, przy użyciu jąder, a nie komórek18,19. Większość z tych metod opiera się na sortowaniu komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) lub strategiach filtracji. Zarówno podejścia oparte na pojedynczych komórkach, jak i pojedynczych jądrach mają swoje mocne i słabe strony. Podejścia jednokomórkowe utrzymują transkrypty mitochondrialne, które, choć mogą być pouczające, mogą również zmniejszać pokrycie transkryptomu ze względu na ich dużą obfitość. Metody izolacji pojedynczych jąder eliminują wysoki procent frakcji mitochondrialnej, umożliwiając w ten sposób bardziej dogłębne pokrycie transkryptów jądrowych20.
Istnieją różne komercyjnie dostępne platformy, które były używane w ostatnich latach do testowania danych genomicznych pojedynczych komórek, w tym sekwencja RNA i sekwencja ATAC. Jedną z najbardziej znanych platform jest platforma 10x Genomics Chromium do ekspresji genów pojedynczych komórek i profilowania ATAC pojedynczej komórki. Ponieważ platforma działa za pomocą komór mikroprzepływowych, wszelkie zanieczyszczenia lub agregaty mogą zatkać system, prowadząc do utraty danych, odczynników i cennych próbek klinicznych. Dlatego powodzenie badań pojedynczych komórek zależy w dużej mierze od dokładnej izolacji pojedynczych komórek/jąder.
Protokół, który tutaj zademonstrujemy, jest nieco zmodyfikowaną kombinacją protokołów DroNc-seq i Omni-ATAC-seq i wykorzystuje podobne podejście do ostatnich badań, które wykorzystują sekwencję snRNA do zrozumienia zaburzeń neurologicznych i typów komórek neuronalnych w ludzkim mózgu18,19,21,22,23,24. Protokół wykorzystuje kombinację enzymatyczno-mechanicznej dysocjacji zamrożonych próbek, a następnie filtracji i wirowania gradientowego, co pozwala na szybką i dokładną izolację pojedynczych jąder ze świeżo zamrożonych tkanek glejaka. Z powodzeniem wykorzystaliśmy ten protokół do wygenerowania danych snRNA-seq i snATAC-seq z tego samego preparatu jąder z próbek guza mózgu.

<table><tbody><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>21115-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator Dounce</td><td>Aktywny motyw</td><td>40401</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R1021</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Jodixanol (aka Optiprep)</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>07820</td><td></td></tr><tr><td>MAC Inteligentne filtry siatkowe (30 i mikro; m)</td> <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td></td></tr><tr><td>Inteligentne filtry siatkowe MACS (100 &mikro; m)</td> <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-463</td><td></td></tr><tr><td>Mg(Ac)2</td><td>Sigma</td><td>63052-100ML</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Abcam</td><td>ab142227</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji jąder: Nuclei EZ Prep</td><td>Sigma</td><td>NUC101-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek fenylometanosulfonylu (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Filtry do wstępnej separacji (20 i mikro; m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-101-812</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do sejfów 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030120086</td><td></td></tr><tr><td>Probówki z zamkiem 2,0 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td></td></tr><tr><td>Jednokomórkowy ATAC</td><td>10x Genomics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ekspresja genów jednokomórkowych</td><td>10x Genomika</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet o szerokim otworze (1000 &mikro; L)</td> <td>Themo Fisher Scientific</td><td>2079GPK</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet szerokootworowych (200 i mikro; L)</td> <td>Themo Fisher Naukowy</td><td>2069GPK</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja jąder ze świeżo zamrożonych guzów mózgu dla sekwencji rna pojedynczego jądra i sekwencji atac

Nuclei Isolation from Fresh Frozen Brain Tumors for Single-Nucleus RNA-seq and ATAC-seq

Dorosłe glejaki rozlane wykazują niejednorodność między- i wewnątrznowotworową. Do niedawna większość wysiłków związanych z profilowaniem molekularnym na dużą skalę koncentrowała się na masowych podejściach, które doprowadziły do klasyfikacji molekularnej guzów mózgu. W ciągu ostatnich pięciu lat sekwencjonowanie pojedynczych komórek uwypukliło kilka ważnych cech glejaków. W większości tych badań wykorzystano świeże próbki guza mózgu do izolacji pojedynczych komórek przy użyciu cytometrii przepływowej lub metod separacji opartych na przeciwciałach. Idąc dalej, wykorzystanie świeżo mrożonych próbek tkanek z biobanków zapewni większą elastyczność w zastosowaniach jednokomórkowych. Co więcej, wraz z postępem w dziedzinie pojedynczych komórek, kolejnym wyzwaniem będzie wygenerowanie danych multiomicznych z pojedynczej komórki lub tego samego przygotowania próbki, aby lepiej rozwikłać złożoność guza. Dlatego ważne dla tej dziedziny będą proste i elastyczne protokoły, które umożliwiają generowanie danych dla różnych metod, takich jak sekwencjonowanie RNA pojedynczego jądra (snRNA-seq) i test pojedynczego jądra dla chromatyny dostępnej dla transpozazy z sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości (snATAC-seq).
Ostatnie osiągnięcia w dziedzinie pojedynczych komórek w połączeniu z dostępnymi instrumentami mikroprzepływowymi, takimi jak platforma genomiczna 10x, ułatwiły zastosowanie pojedynczych komórek w laboratoriach badawczych. Aby zbadać heterogeniczność guza mózgu, opracowaliśmy ulepszony protokół izolacji pojedynczych jąder ze świeżo mrożonych glejaków. Protokół ten łączy istniejące protokoły jednokomórkowe i łączy etap homogenizacji, po którym następuje filtracja i wirowanie gradientowe za pośrednictwem buforu. Otrzymane próbki są czystymi zawiesinami pojedynczych jąder, które można wykorzystać do wygenerowania danych dotyczących ekspresji genów pojedynczego jądra i dostępności chromatyny z tego samego preparatu jąder.

Genomika pojedynczych jąder jest rozwijającą się dziedziną z ograniczoną liczbą dostępnych danych i protokołów. Krytycznym czynnikiem wpływającym na wynik analiz pojedynczych jąder jest izolacja czystych i nienaruszonych jąder. Połączyliśmy dwa opublikowane protokoły (protokoły DroNc-seq oraz Omni-ATAC-seq), aby w stosunkowo krótkim czasie wyizolować wysokiej jakości i czyste jądra z mrożonych bloków tkanki glejaka, zachowując tym samym stabilność transkryptów (Rysunek 1).
<p class="jove...

Niejednorodność wewnątrznowotworowa jest nieodłączną cechą nowotworów, w tym glejaków. Opracowaliśmy prosty i wydajny protokół, który wykorzystuje kombinację i wirowania gradientowego do izolowania pojedynczych jąder ze świeżo mrożonych tkanek glejaka do badań sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra i ATAC.

Izolacja jąder ze świeżo zamrożonych guzów mózgu dla sekwencji RNA pojedynczego jądra i sekwencji ATAC

Adult diffuse gliomas exhibit inter- and intra-tumor heterogeneity. Until recently, the majority of large-scale molecular profiling efforts have focused ...

Celem naszej metody jest wyizolowanie jąder ze świeżo zamrożonych guzów, a ten sam preparat jąder może być wykorzystany do badań transkrypcyjnych i epigenetycznych. Dlatego możemy zadać kilka kluczowych pytań, takich jak: jak guzy ewoluują podczas progresji i jak terapie wpływają na skład guza? Największą zaletą tej metody jest to, że jest prosta, skraca czas przetwarzania, a co najważniejsze, daje wysokiej jakości jądra.Brak etapu sortowania zmniejsza naprężenia w jądrach. Drugą zaletą jest jego zdolność do stosowania na archiwalnych zamrożonych nowotworach. Procedurę zademonstruje Ashwin Narayanan, doktor habilitowany z mojego laboratorium.Rozpocząć od przeniesienia od 10 do 60 miligramów świeżo zamrożonej próbki tkanki na wstępnie schłodzoną szalkę Petriego. Świeżo zamrożoną tkankę zmielić lub posiekać żyletką na małe kawałki na lodzie. Dodać 500 mikrolitrów schłodzonego buforu do lizy jąder na tkankę na szalce Petriego.Następnie przenieś mieszaninę do leżaczka. Odbijaj kawałki tkanki luźnym tłuczkiem przez około 20 uderzeń, aż tarcie zostanie zmniejszone. Następnie odbijaj go ciasnym tłuczkiem przez 20 uderzeń, aby uzyskać pełną homogenizację tkanek.Przenieś homogenat do wstępnie schłodzonej dwumililitrowej probówki i dodaj jeden mililitr schłodzonego buforu do lizy do leżaczka, przepłucz go i dodaj do probówki. Wymieszaj go delikatnie i inkubuj na lodzie przez pięć minut, mieszając końcówką pipety o szerokim otworze raz do dwóch razy podczas inkubacji. Przefiltruj cały homogenat za pomocą 30-mililitrowej siatki sitowej i zbierz do 15-mililitrowej probówki Falcon.Następnie przenieś go z powrotem do nowej, wstępnie schłodzonej dwumililitrowej tuby. Pojedyncze sitko jest zazwyczaj wystarczające dla całego homogenatu. Sprawdź próbkę pod mikroskopem świetlnym, aby sprawdzić, czy usunięto duże zanieczyszczenia i czy membrana jądrowa jest nienaruszona.Jądra nie muszą być okrągłe, a błona jądrowa nie powinna być zniekształcona. Jeśli obecne są zanieczyszczenia, powtórz filtrację. Następnie odwiruj jądra na wirówce stołowej przez pięć minut.Usunąć supernatant, pozostawiając około 50 mikrolitrów osadu zawierającego jądra. Delikatnie zawieś osad w kolejnym mililitrze buforu do lizy jąder i inkubuj go przez pięć minut na lodzie. Powtórzyć wirowanie, a następnie usunąć supernatant bez naruszania osadu.Dodać 500 mililitrów HB i inkubować próbkę przez pięć minut bez ponownego zawieszania. Następnie ponownie zawieś jądra w kolejnym mililitrze HB. Wirować przez kolejne pięć minut, a następnie usunąć supernatant. Ponownie zawiesić jądra w 200 mikrolitrach HB i przenieść zawiesinę do nowej dwumililitrowej probówki.Dodać 200 mikrolitrów 50% roztworu jodu do jąder, aby uzyskać końcowe stężenie 25% jodiksanolu i wymieszać 10 razy pipetą ustawioną na 300 mikrolitrów. Następnie dodaj 300 mikrolitrów 29% roztworu jodu pod 25% mieszaninę za pomocą cienkiej końcówki P1000, aby uniknąć mieszania warstw. Dodaj 300 mikrolitrów 35% roztworu jodiksanolu pod 29% mieszaninę z cienką końcówką P1000, a następnie powoli ją usuń.Umieścić próbki w wirówce z odchylanym wiadrem i wirować je przez 20 minut w temperaturze 3,500 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza z odłamaniem. Delikatnie usunąć próbki bez wstrząsania i obserwować je pod światłem. Między drugą a trzecią warstwą powinien być widoczny wyraźny biały pas jąder o czystości 95%.Aby wyizolować jądra, należy zassać górne warstwy, aby odsłonić białe pasmo jąder na granicy faz. Zbierz pasmo jąder w objętości 200 mililitrów i przenieś je do świeżej probówki. Następnie przefiltruj go filtrem o średnicy 20 mikrometrów.Sprawdź jądra pod mikroskopem świetlnym, aby sprawdzić, czy usunięto duże zanieczyszczenia i czy błona jądrowa jest nienaruszona. Powinny być okrągłe, a błona jądrowa nie powinna być zniekształcona. Policz jądra za pomocą barwienia błękitem trypanowym na hemocytometrze i podziel je na porcje dla snRNA-seq lub snATAC-seq.Różne etapy filtracji wraz z wirowaniem gradientowym pozwalają na izolację czystych jąder, przy czym większość zanieczyszczeń jest odrzucana. Ten sam preparat izolowanych jąder może być stosowany zarówno do sekwencji RNA pojedynczych jąder, jak i pojedynczych jąder ATAC-seq. Ponieważ izolowane jądra pochodzą z tej samej próbki, wygenerowane dane mogą być współosadzone przy użyciu pakietów R, takich jak Seurat, w celu wygenerowania klastrów i zapewnienia perspektywy multiomicznej.Aby ustalić, czy protokół jest porównywalny z opublikowanymi zbiorami danych, uzyskane dane porównano z czterema publicznie dostępnymi badaniami sekwencyjnymi RNA pojedynczych jąder związanych z ośrodkowym układem nerwowym. Wszystkie zestawy danych zostały połączone, a rozkład liczby UMI i genów został zwizualizowany za pomocą wykresu skrzypcowego. Uzyskany wynik wskazuje, że metoda jest porównywalna z najnowszym protokołem snRNA-seq.Podczas próbowania tego protokołu ważne jest, aby zachować szczególną ostrożność i nie mieszać warstw podczas wirowania gradientowego i izolacji jąder.

nuclei-isolation-from-fresh-frozen-brain-tumors-for-single-nucleus

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film opisuje protokół izolacji pojedynczych jąder ze świeżo zamrożonej tkanki glejaka. Wyizolowane pojedyncze jądra mogą być wykorzystane jako próbki do technik sekwencjonowania, takich jak sekwencjonowanie RNA pojedynczego jądra (snRNA) i test pojedynczych jąder do sekwencjonowania chromatyny dostępnej dla transpozazy (snATAC) w celu uzyskania głębszego wglądu w niejednorodność między- i wewnątrznowotworową obserwowaną w glejaku ośrodkowych tkanek nerwowych.

Izolacja jąder ze świeżo mrożonych tkanek glejaka: metoda uzyskiwania nienaruszonych jąder z próbek guza glejaka

Tutaj prezentujemy protokół szybkiego izolowania wysokiej jakości jąder ze świeżej lub zamrożonej tkanki do dalszego masowo równoległego sekwencjonowania RNA. Uwzględniamy opcje detergencyjno-mechanicznego i hipotoniczno-mechanicznego rozbijania tkanek oraz lizy komórek, które można wykorzystać do izolacji jąder.

Izolacja dorosłych jąder rdzenia kręgowego do masowo równoległego sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra

Izolacja pojedynczych jąder opiera się na dysocjacji i przenikaniu błony komórkowej za pomocą detergentów, etapach, które wymagają optymalizacji i są podatne na wprowadzanie artefaktów technicznych. Demonstrujemy bezdetergentowy i bezenzymatyczny protokół szybkiej izolacji nienaruszonych jąder bezpośrednio z całej tkanki, uzyskując jądra odpowiednie do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra (snRNA-Seq) lub ATAC-seq.

Izolacja jąder z całej tkanki metodą bezdetergentową i enzymatyczną

Opracowaliśmy metodę, która wzbogaca i izoluje ludzkie populacje astrocytów ze świeżo zamrożonej tkanki do wykorzystania w dalszych analizach molekularnych.

Izolacja populacji astrocytów dorosłych ludzi ze świeżo zamrożonej kory mózgowej przy użyciu sortowania jąder aktywowanych fluorescencją

Tutaj prezentujemy protokół izolowania wysokiej jakości jąder z zamrożonych nerek myszy, który poprawia reprezentację typów komórek rdzeniastych nerek i pozwala uniknąć artefaktów ekspresji genów spowodowanych dysocjacją enzymatyczną tkanki.

Izolacja jąder z nerki dorosłej myszy w celu sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra

Tutaj prezentujemy protokół izolacji jąder z błyskawicznie zamrożonych, zarchiwizowanych tkanek wątroby dla jednojądrowego sekwencjonowania RNA, sekwencji ATAC i multiomiki stawów (sekwencja RNA i sekwencja ATAC).

Izolacja jąder z zamrożonej tkanki wątroby w celu multiomiki jednokomórkowej

Tutaj prezentujemy protokół opisujący przygotowanie jąder komórkowych. Po mikrodysekcji i enzymatycznej dysocjacji tkanki serca na pojedyncze komórki, komórki progenitorowe zamrożono, a następnie wyizolowano czyste żywe komórki, które wykorzystano do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra i testu pojedynczego jądra dla chromatyny dostępnej dla transpozazy z wysokoprzepustowymi analizami sekwencjonowania.

Izolacja jąder z komórek progenitorowych serca myszy w celu profilowania epigenomu i ekspresji genów w rozdzielczości pojedynczej komórki

Badanie opisuje prosty, szybki i częściowo zautomatyzowany protokół izolowania wysokiej jakości jąder z zamrożonych tkanek ssaków do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder.

Prosty, szybki i częściowo zautomatyzowany protokół izolacji pojedynczych jąder z zamrożonych tkanek ssaków w celu sekwencjonowania pojedynczego jądra

Sukces transkryptomiki i multiomiki pojedynczej komórki/pojedynczego jądra w dużej mierze zależy od jakości komórek/jąder. Dlatego izolowanie komórek/jąder od tkanek i ich oczyszczanie musi być wysoce ustandaryzowane. Protokół ten opisuje przygotowanie jąder z mózgu i szpiku kostnego do dalszego testu multiomu pojedynczego jądra.

Wysokiej jakości preparatyka jąder mózgu i szpiku kostnego do oznaczania wieloomów pojedynczych jąder

Protokół zapewnia niezawodne i zoptymalizowane podejście do izolacji jąder z próbek guzów litych do sekwencjonowania wieloomowego przy użyciu platformy 10x Genomics, w tym zalecenia dotyczące warunków dysocjacji tkanek, kriokonserwacji zawiesin pojedynczych komórek i oceny izolowanych jąder.

Zoptymalizowana izolacja jąder ze świeżych i mrożonych próbek guzów litych do sekwencjonowania wieloomowego

Tutaj wprowadzamy kompleksowy protokół do generowania i dalszej analizy organoidów ludzkiego mózgu za pomocą sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki i pojedynczego jądra.

Generowanie i dalsza analiza transkryptomów pojedynczych komórek i jąder w organoidach mózgowych

Poznaj protokół izolacji jąder z zamrożonych guzów mózgu do sekwencjonowania RNA i ATAC pojedynczych jąder. Metoda umożliwia badania transkrypcyjne i epigenetyczne gliomów.

Izolacja jąder ze świeżo zamrożonych guzów mózgu dla sekwencji RNA pojedynczego jądra i sekwencji ATAC

Przeglądaj więcej filmów