Łagodzenie przyczepiania się komórek krwiopochodnych do metalowych implantów poprzez immobilizację peptydów pochodzących z CD47

Protokół ten obejmuje nowatorską strategię chemiczną polegającą na dołączaniu peptydów terapeutycznych do powierzchni metalicznych i może poprawić biokompatybilność szerokiej gamy biomateriałów metalicznych. Jest to uniwersalna i solidna technika dołączania peptydów i białek terapeutycznych do gołych metalowych powierzchni bioimplantów. Wykorzystaliśmy tę technologię, aby poprawić biokompatybilność stentów metalicznych poprzez dołączenie peptydów CD47 w celu zapobiegania reakcjom zapalnym, które są wywoływane przez stentowanie.

Rozpocznij od umycia kuponów foliowych ze stali nierdzewnej lub krążków siatkowych 2-izopropanolem w wytrząsarce przez pięć minut. Wykonaj to płukanie dwukrotnie, a następnie przemyj próbki dwukrotnie chloroformem przez 10 minut na pranie. Oczyszczone próbki ze stali nierdzewnej umieścić w piekarniku w temperaturze 220 stopni Celsjusza na 30 minut.

Zanurz upieczone folie lub krążki siatkowe w 0,5% wodnym roztworze PABT i inkubuj je w wytrząsarce przez godzinę. Próbki zmodyfikowane PABT przemyć pięciokrotnie dejonizowaną wodą destylowaną. Przenieść próbki do nowej fiolki i powtórzyć mycie.

Próbki należy traktować za pomocą TCEP przez 15 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce. Odgazować dejonizowaną wodę destylowaną w kolbie okrągłodennej za pomocą urządzenia wytwarzającego podciśnienie, takiego jak liofilizator, i pięciokrotnie umyć folie lub krążki siatkowe odgazowaną wodą. Przenieść próbki do nowej fiolki i powtórzyć płukanie.

Przygotuj pięć mililitrów 1% roztworu PEI-PDT, rozcieńczając 212,5 mikrolitrów podstawowego PEI-PDT i 125 mikrolitrów 0,4 molowego octanu sodu w odgazowanej wodzie. Inkubować umyte próbki ze stali nierdzewnej z 1% PEI-PDT. Zastąp powietrze argonem, szczelnie zamknij fiolki i mieszaj je na wytrząsarce przez godzinę.

Natychmiast przystąp do koniugacji peptydów lub przechowuj próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do jednego tygodnia. Przygotuj jeden miligram na mililitr ludzkiego roztworu podstawowego peptydu CD47, rozpuszczając ludzki peptyd CD47 w odgazowanym 50% kwasie octowym, a następnie przygotuj roztwór roboczy, rozpuszczając 500 mikrolitrów bulionu w 4,5 mililitra odgazowanego PBS. Umyte próbki pokryte PEI-PDT inkubować roztworem roboczym peptydu CD47 w temperaturze pokojowej, wytrząsając przez jedną godzinę.

Po zakończeniu umyć próbki pokryte peptydem CD47 zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Po pokryciu folii metalowych peptydem CD47 lub zaszyfrowanym peptydem, pokrój ćwierćcalowe rurki PVC na trzy kawałki o długości 38 centymetrów i włóż do ośmiu niezmodyfikowanych, zaszyfrowanych peptydów lub folii metalowych modyfikowanych peptydem CD47 do trzech różnych probówek. Zbierz 30 mililitrów krwi od zdrowych dawców ludzkich wolnych od jakichkolwiek leków przeciwpłytkowych, wstępnie ładując strzykawkę jednym mililitrem 4% cytrynianu sodu, aby zapobiec krzepnięciu pobranej krwi.

Umieść 10 mililitrów krwi w każdej probówce za pomocą 10-mililitrowej strzykawki i połącz końce metalowymi adapterami. Umieść probówki wypełnione krwią na kołach aparatu pętlowego Chandlera i przepuszczaj krew wzdłuż metalowych folii, obracając koło w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny. Spuść krew z probówek i zutylizuj ją zgodnie z wymaganiami IRB, a następnie przetnij probówki skalpelem, aby odzyskać folie.

Przygotować 2% roztwór aldehydu glutarowego, rozcieńczając 70% roztwór w buforze kakodylanu sodu 0,1 molowym chlorkiem sodu. Inkubuj folie w 2% roztworze aldehydu glutarowego przez 15 minut i przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Przed analizą folii metalowych umyj je trzykrotnie PBS.

Podgrzej osiem mililitrów PBS w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przygotuj 10-milimolowy roztwór podstawowy barwnika CFDA, dodając 90 mikrolitrów DMSO do jednej fiolki CFDA, a następnie przygotuj roztwór roboczy, dodając 75 mikrolitrów podstawowego CFDA do ciepłego PBS. Odwróć rurkę kilka razy, aby wymieszać i przykryj ją folią aluminiową.

Umieść każdą folię w jednym mililitrze barwnika CFDA na 24-dołkowej płytce. Przykryj płytkę folią aluminiową i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut, a następnie umyj folie trzykrotnie w PBS i zobrazuj je za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Stężenie kowalencyjnie związanego sprzężonego peptydu CD47 TAMRA określono ilościowo w celu określenia maksymalnej gęstości immobilizacji peptydu na powierzchni metalu.

Maksymalna retencja peptydu wynosiła około 180 nanogramów na centymetr kwadratowy, co osiągnięto przy stężeniu wejściowym 100 mikrogramów na mililitr. Immobilizacja sprzężonego peptydu CD47 TAMRA na zmodyfikowanych powierzchniach metalowych została dodatkowo potwierdzona za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, która wykazała jednolitą fluorescencję emitowaną z powierzchni krążków siatkowych potraktowanych sprzężonym peptydem TAMRA CD47. Wykryto tylko minimalną fluorescencję na powierzchni siatek kontrolnych, które nie miały modyfikacji, wykluczając w ten sposób niespecyficznie związany peptyd sprzężony TAMRA CD47 jako główne źródło fluorescencji.

Potwierdzono również, że powierzchnie pokryte peptydem CD47 wykazują drastyczne zmniejszenie przyczepiania komórek krwiopochodnych w porównaniu z zaszyfrowanymi zmodyfikowanymi i niezmodyfikowanymi kontrolami peptydowymi. Monocyty wyizolowane z komórek kożucha szczura wyhodowano na foliach ze stali nierdzewnej modyfikowanych gołym metalem i peptydami CD47. Na funkcjonalizowanych powierzchniach zaobserwowano 58% osłabienie ostrego przyczepiania monocytów, ich konwersji do makrofagów i proliferacji makrofagów.

Podczas prób stosowania tego protokołu bardzo ważne jest, aby jak najszybciej wykonać czynności związane z odgazowaną wodą lub odczynnikami, a także zminimalizować narażenie na działanie tlenu. Nasza technologia selektywnie moduluje interakcję komórkową z powierzchniami metalowymi, a typowy test identyfikacji typu komórki, taki jak RT-PCR, cytometria przepływowa i immunofluorescencja, jest zgodny z tą techniką. Technologia ta, opracowana dla szeregu bioaktywnych peptydów, może odegrać zasadniczą rolę w zwiększeniu biokompatybilności na granicy faz materiału tkankowego.