Opóźnione dostarczanie komórek macierzystych do mięśnia sercowego po urazie reperfuzyjnym niedokrwiennym w modelu mysim

Uszkodzenie niedokrwienne indukuje wrogie środowisko prozapalne, wpływając na przeżycie przeszczepionych komórek. Nasz protokół przedstawia alternatywną metodę dostarczania leków biologicznych poprzez obejście początkowej odpowiedzi immunologicznej na uraz. Główną zaletą tego protokołu jest to, że umożliwia podanie środków terapeutycznych w ciągu tygodnia po urazie, naśladując leczenie w środowisku klinicznym.

Skupiamy się przede wszystkim na modelu uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego i przeszczepianiu komórek STEM. Jednak podejście to może być również wykorzystane w modelach chorób zapalnych, które wiążą się z wprowadzeniem terapii biologicznych. Zacznij od autoklawowania wszystkich narzędzi chirurgicznych.

Jeśli podczas jednej sesji ma być wykonanych kilka operacji, wyczyść narzędzia po każdym zwierzęciu i ponownie wysterylizuj je za pomocą sterylizatora z gorącymi kulkami. Podskórnie podaj środek przeciwbólowy, zważ zwierzę i wprowadź wagę do respiratora. Ogol lewą stronę klatki piersiowej od mostka do poziomu ramienia i nałóż krem do depilacji, aby usunąć nadmiar sierści.

Aby zapobiec zapadaniu się płuc, utrzymuj dodatnie końcowe ciśnienie wydechowe na poziomie dwóch centymetrów wody do procedury reperfuzji niedokrwiennej i zmień je na trzy centymetry wody w przypadku procedury opóźnionego wstrzykiwania komórek. Po znieczuleniu myszy zaintubuj ją rurką dotchawiczą o rozmiarze 20 G i przenieś do kontrolowanej poduszki grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała od 35 do 37 stopni Celsjusza. Umieść mysz w pozycji leżącej bocznej z końcem czaszki po lewej stronie i końcem ogonowym po prawej.

Wyszoruj obszar chirurgiczny na przemian za pomocą wacików z jodonu i alkoholu, a następnie nałóż maść okulistyczną na oba oczy. Użyj skalpela z ostrzem numer 10, aby wykonać pionowe nacięcie 2,5 milimetra na prawo od skrajnego lewego sutka w polu widzenia, a następnie użyj nożyczek, aby przeciąć powierzchowne warstwy mięśni, aż mięsień międzyżebrowy i żebra będą widoczne. Unosząc żebra i otaczającą tkankę, przetnij przestrzeń międzyżebrową między czwartym a piątym żebrem, a następnie włóż zwijacz powieki w otwartą przestrzeń.

Cofnij osierdzie za pomocą zakrzywionych kleszczy, przesuwając płuco do góry i poza widok. Przełóż nylonowy szew 9-0 przez mięsień sercowy pod tętnicą LAD 2,5 milimetra dystalnie do lewej małżowiny usznej, utrzymując płynny i spójny ruch, aby zapobiec rozerwaniu tkanki lub przebiciu głównego naczynia krwionośnego. Zawiąż luźny kwadratowy węzeł, a następnie umieść jeden centymetr rurki polietylenowej w luźnym węźle.

Zabezpiecz szew wokół rurki i potwierdź niedokrwienie przez bladość i arytmię komorową, a następnie zwolnij po 35 minutach. Po wyjęciu rurki odczekaj pięć minut, aby potwierdzić ponowną perfuzję mięśnia sercowego. Umieść rurkę cewnika dożylnego o rozmiarze 24 w jamie klatki piersiowej w jednej przestrzeni międzyżebrowej po prawej stronie otworu.

Użyj szwów wchłanialnych 6-0, aby zamknąć nacięcie międzyżebrowe w prosty przerywany wzór, a warstwę mięśniową w ciągłym wzorze szwów. Po zamknięciu powierzchownej warstwy mięśniowej wyjmij rurkę klatki piersiowej, jednocześnie pobierając powietrze z klatki piersiowej za pomocą jednomililitrowej strzykawki tuberkulinowej o pojemności jednego mililitra. Zamknij nacięcie skóry wchłanialnym szwem 6-0 w ciągłym poziomym wzorze materaca.

Po zakończeniu podaj podskórnie 1,5 mililitra ciepłej soli fizjologicznej i nałóż potrójną maść z antybiotykiem na miejsce nacięcia, aby zapobiec infekcji. Przenieś mysz do klatki bez ściółki lub klatki z przykrytą ściółką na ciepłej podkładce i temperaturze od 35 do 37 stopni Celsjusza, aż w pełni się zregeneruje. Po przygotowaniu i zaintubowaniu myszy zgodnie z wcześniejszym opisem, usuń szew z warstwy skóry za pomocą nożyczek i kleszczy, a następnie użyj skalpela numer 10, aby wykonać nacięcie w tym samym miejscu, co poprzednia operacja.

Kontynuuj przecinanie tkanki bliznowatej, aż szew warstwy mięśniowej będzie widoczny, a następnie użyj nożyczek i kleszczy, aby usunąć szew i rozciąć warstwę mięśniową. Usuń szwy trzymające żebra razem i kontynuuj przecinanie mięśnia międzyżebrowego z poprzedniego nacięcia. Umieść zwijacz powieki w przestrzeni międzyżebrowej i zlokalizuj obszar poprzedniego podwiązania.

Załaduj 300 000 mezenchymalnych komórek STEM zawieszonych w 20 mikrolitrach PBS do strzykawki insulinowej o rozmiarze 30 i lekko zegnij igłę, aby uzyskać odpowiedni kąt do wstrzyknięcia. Poruszając się w kierunku wierzchołka w kierunku podstawy serca, włóż strzykawkę do okolicy okołozawałowej, aż otwór igły znajdzie się całkowicie wewnątrz mięśnia sercowego, a następnie powoli wstrzyknij komórki do mięśnia sercowego, odczekaj trzy sekundy i wyjmij igłę. Uważnie obserwuj serce przez trzy minuty, aby upewnić się, że nie ma nieprawidłowej reakcji na komórki, takiej jak migotanie komór.

Po trzech minutach umieść rurkę cewnika dożylnego o rozmiarze 24 w jamie klatki piersiowej w jednej przestrzeni międzyżebrowej po prawej stronie otworu. Zamknij warstwy mięśni międzyżebrowych i skóry i wyjmij rurkę klatki piersiowej, jak opisano wcześniej. Podaj podskórnie 1,5 mililitra ciepłej soli fizjologicznej i nałóż potrójną maść z antybiotykiem na miejsce nacięcia, aby zapobiec infekcji.

Przenieś mysz do klatki bez ściółki lub klatki z przykrytą ściółką na ciepłej podkładce, aż w pełni się wyleczy. Pooperacyjne echokardiogram i elektrokardiogram wykonano w dniu poprzedzającym implantację komórek STEM, potwierdzając zawał i zmniejszoną czynność skurczową komór. Dalsza analiza danych wykazała, że frakcja wyrzutowa i frakcyjne skrócenie uległy zmniejszeniu u myszy, które doznały urazu niedokrwiennego, podczas gdy końcowa objętość rozkurczowa i skurczowa wzrosła.

Barwienie trichromem mięśnia sercowego Massona siedem dni po urazie wykazało zwiększone odkładanie się kolagenu i ścieńczenie ściany lewej komory w sercach myszy, które doznały urazu niedokrwiennego. Obrazowanie bioluminescencyjne in vivo lub BLI wykonano następnego dnia po implantacji mezenchymalnych komórek STEM. Przykładem skutecznego dostarczania MSCs jest sygnał BLI w porównaniu z myszami, które miały wywołane uszkodzenie reperfuzyjne niedokrwienne, ale nie otrzymały MSC.

Próbując tego protokołu, należy pamiętać, że małe celowe ruchy podczas przecinania przestrzeni międzyżebrowych, podwiązywania naczynia i wstrzykiwania komórek są niezbędne do zapobiegania nadmiernemu uszkodzeniu serca lub płuc w polu widzenia. Procedury te oferują możliwość monitorowania czynności serca po przeszczepie za pomocą ultradźwięków, żywotności komórek za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego lub dalszych technik molekularnych lub biochemicznych w zależności od zastosowanej terapii.