Name: Opóźnione dostarczanie komórek macierzystych do mięśnia sercowego po urazie reperfuzyjnym niedokrwiennym w modelu mysim (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Odkryj metodę opóźnionego dostarczania komórek macierzystych do uszkodzonego mięśnia sercowego w modelu mysim. Technika ta omija początkową odpowiedź immunologiczną po urazie niedokrwienno-reperfusyjnym, poprawiając przeżywalność i retencję komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Eksperymenty przeprowadzono na samicach myszy C57BL/6 w wieku 10-12 tygodni i masie ciała 20-25 g. Wszystkie procedury na zwierzętach były zgodne ze standardami określonymi w Przewodniku opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych (Instytut Zasobów Zwierząt Laboratoryjnych, Narodowa Akademia Nauk, Bethesda, MD, USA) i zostały zatwierdzone przez Mayo Clinic College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Przygotowanie i intubacja
<ol>
	<li>Autoklawuj wszystkie narzędzia chirurgiczne przed zabiegiem. Jeśli podczas jednej sesji ma być wykonanych wiele operacji, wyczyść narzędzia po każdym zwierzęciu i ponownie wysterylizuj za pomocą sterylizatora z gorącymi kulkami.</li>
	<li>Znieczulić myszy 3,5-4% izofluranem w stężeniu 1 l/minO2 w komorze indukcyjnej.</li>
	<li>Buprenorfinę SR w dawce 1 mg/kg (przeciwbólową) podawać podskórnie, zważyć zwierzę i wprowadzić masę ciała do respiratora.</li>
	<li>Ogol lewą stronę klatki piersiowej od mostka do poziomu ramienia i nałóż krem do depilacji, aby usunąć nadmiar sierści.</li>
	<li>W przypadku procedury reperfuzji niedokrwiennej należy utrzymać dodatnie ciśnienie końcowo-wydechowe (PEEP) na respiratorze na poziomie 2cmH 2O. W przypadku procedury opóźnionego wstrzykiwania komórek zmień PEEP na 3 cmH2O, aby zapobiec zapadaniu się płuc.</li>
	<li>Zaintubować zwierzę za pomocą rurki dotchawiczej o sile 20 G, przenieść do kontrolowanej poduszki grzewczej w celu utrzymania temperatury ciała 35-37 °C.</li>
	<li>Umieść mysz na respiratorze w pozycji bocznej z końcem czaszki po lewej stronie i końcem ogonowym po prawej.</li>
	<li>Utrzymuj znieczulenie na poziomie 2-2,5% izofluranu w stężeniu 1 l/minO2 przez pozostałą część zabiegu.</li>
	<li>Wyszoruj obszar operowany na przemian wacikami z jodonem i alkoholem trzy razy i nałóż maść okulistyczną na oba oczy.</li>
</ol>
2. Uszkodzenie reperfuzyjne niedokrwienne
<ol>
	<li>Za pomocą skalpela z ostrzem #10 wykonaj pionowe nacięcie 2,5 mm na prawo od skrajnego lewego sutka w polu view.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek przetnij powierzchowne warstwy mięśni, aż mięśnie międzyżebrowe i żebra będą widoczne.</li>
	<li>Unosząc żebra i otaczającą tkankę, przetnij przestrzeń międzyżebrową między 4. a 5. żebrem, a następnie włóż retraktor powiek w otwartą przestrzeń.</li>
	<li>Cofnij osierdzie za pomocą zakrzywionych kleszczy, przesuwając płuco do góry i poza zasięgiem wzroku.</li>
	<li>Uwidocznij tętnicę LAD i za pomocą nylonowego szwu 9-0 przejdź przez mięsień sercowy pod tętnicą 2,5 mm dystalnie do lewej małżowiny usznej i zawiąż luźny kwadratowy węzeł.</li>
	<li>Wytnij 1 cm rurki polietylenowej i umieść ją w luźnym węźle.</li>
	<li>Zabezpiecz szew wokół rurki, potwierdź niedokrwienie, a następnie zwolnij po 35 min. 
	UWAGA: Potwierdź niedokrwienie bladość i arytmię komorową.</li>
	<li>Po zwolnieniu podwiązania i usunięciu rurki należy odczekać 5 minut, aby potwierdzić reperfuzję mięśnia sercowego.</li>
	<li>Umieść rurkę cewnika dożylnego 24 G w jamie klatki piersiowej w jednej przestrzeni międzyżebrowej po prawej stronie otworu.</li>
	<li>Zamknij nacięcie międzyżebrowe wchłanialnym szwem 6-0 w prostym przerywanym wzorze.</li>
	<li>Zamknij warstwę mięśniową za pomocą wchłanialnego szwu 6-0 w ciągłym wzorze szwów.</li>
	<li>Po zamknięciu powierzchownej warstwy mięśniowej należy zdjąć rurkę piersiową, jednocześnie pobierając powietrze z klatki piersiowej za pomocą strzykawki tuberkulinowej o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Zamknij nacięcie skóry wchłanialnym szwem 6-0 w ciągłym poziomym wzorze materaca 
	UWAGA: Szwy nylonowe i nieciągły wzór szwów mogą być również stosowane do warstwy skóry.</li>
	<li>Podawać podskórnie 1,5 ml ciepłej soli fizjologicznej i nakładać maść z potrójnym antybiotykiem na miejsce nacięcia, aby zapobiec infekcji.</li>
	<li>Wyłączyć izofluran i pozwolić zwierzęciu oddychać przez wentylator na 100%O2 do momentu, gdy będzie w stanie oddychać w sposób ciągły bez pomocy.</li>
	<li>Przenieś mysz do klatki bez ściółki lub klatki z przykrytą ściółką (ręcznik papierowy lub zasłona) na ciepłej podkładce o temperaturze 35-37 °C, aż do całkowitego wyzdrowienia.</li>
</ol>
3. Dostarczanie mezenchymalnych komórek macierzystych myszy
UWAGA: Szczep myszy użyty do zabiegu jest linią wsobną i jest uważany za genetycznie identyczny. Mezenchymalne komórki macierzyste uzyskano od zwierząt tego samego szczepu i, zgodnie z projektem protokołu, immunosupresja nie została wywołana1.
<ol>
	<li>Wykonaj etapy przygotowania i intubacji, tak jak wcześniej dla pierwszego zabiegu.</li>
	<li>Usuń szew z warstwy skóry za pomocą nożyczek i kleszczy.</li>
	<li>Za pomocą skalpela #10 wykonaj nacięcie w tym samym miejscu, co podczas poprzedniej operacji.</li>
	<li>Kontynuuj używanie skalpela do przecinania tkanki bliznowatej, aż pojawi się szew warstwy mięśniowej</li>
	<li>Za pomocą nożyczek i kleszczy usuń szew i rozetnij warstwę mięśniową.</li>
	<li>Wizualizuj i usuń szwy łączące żebra i kontynuuj przecinanie mięśnia międzyżebrowego z poprzedniego nacięcia. 
	UWAGA: Płuca mogły przylgnąć do ściany klatki piersiowej, jeśli tak się stanie, użyj lub zakrzywionych kleszczy, aby ostrożnie je oddzielić i uwolnić.</li>
	<li>Umieść zwijacz powieki w przestrzeni międzyżebrowej i zlokalizuj obszar poprzedniego podwiązania.</li>
	<li>Załaduj mezenchymalne komórki macierzyste (3,0 x 105), zawieszone w 20 μl PBS, do strzykawki insulinowej 30 G, lekko zgnij igłę w razie potrzeby, aby uzyskać odpowiedni kąt wstrzyknięcia. 
	UWAGA: Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) wyizolowano z tkanki tłuszczowej 4-6-tygodniowych myszy C56BL/6. Komórki wczesnego pasażu (p3) zostały transdukowane wektorem wyrażającym gen lucyferazy świetlika pod promotorem CMV, aby umożliwić monitorowanie żywotności komórek in vivo. Mysie MSC pochodzące z tkanki tłuszczowej scharakteryzowano za pomocą cytometrii przepływowej, a komórki były dodatnie dla CD44, CD29, CD90 i CD105, ale ujemne dla markera krwiotwórczego CD4514. Przed wstrzyknięciem MSCs hodowano przez co najmniej jedno pasaż, aby uniknąć utraty komórek w procesie rozmrażania.</li>
	<li>Poruszając się w kierunku wierzchołka w kierunku podstawy serca, włóż strzykawkę w obszar okołozawałowy, aż otwór igły znajdzie się całkowicie wewnątrz mięśnia sercowego.</li>
	<li>Po wejściu do środka powoli wstrzyknij komórki do mięśnia sercowego, odczekaj 3 s, a następnie wyjmij igłę.</li>
	<li>Uważnie obserwuj serce przez 3 minuty, aby upewnić się, że nie ma nieprawidłowych reakcji na komórki, takich jak migotanie komór.</li>
	<li>Umieść rurkę cewnika dożylnego 24 G w jamie klatki piersiowej w jednej przestrzeni międzyżebrowej po prawej stronie otworu.</li>
	<li>Zamknij warstwy międzyżebrowe, mięśniowe i skórne i usuń rurkę klatki piersiowej w taki sam sposób, jak w przypadku pierwszego zabiegu.</li>
	<li>Podawać podskórnie 1,5 ml ciepłej soli fizjologicznej i nakładać maść z potrójnym antybiotykiem na miejsce nacięcia, aby zapobiec infekcji.</li>
	<li>Wyłączyć izofluran i pozwolić zwierzęciu oddychać przez wentylator na 100%O2 do momentu, gdy będzie w stanie oddychać w sposób ciągły bez pomocy.</li>
	<li>Przenieś mysz do klatki bez ściółki lub klatki z przykrytą ściółką (ręcznik papierowy lub zasłona) na ciepłej podkładce o temperaturze 35-37 °C, aż do całkowitego wyzdrowienia.</li>
</ol>
4. Opieka pooperacyjna po obu zabiegach
<ol>
	<li>Obserwuj zwierzę w sposób ciągły, aż do momentu ustalenia spontanicznego oddechu, leżenia mostka i normalnego ruchu.</li>
	<li>Obserwację należy kontynuować co 15-30 minut przez co najmniej 3 godziny w dniu zabiegu.</li>
	<li>Sprawdzaj myszy pod kątem rozejścia się rany lub nietypowego bólu raz dziennie przez 5 dni, a następnie 2-3 razy w tygodniu.</li>
	<li>Jeśli zwierzę wykazuje oznaki bólu (np. wygięty grzbiet, minimalny ruch, grymas lub niechlujna sierść) po 72 godzinach od operacji, należy podać dodatkową dawkę leku przeciwbólowego Buprenorfina SR.</li>
</ol>

<ol><li>Franchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Myocardial+Microenvironment+Modulates+the+Biology+of+Transplanted+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Imaging+Biology%22%5BJournal%5D)">The Myocardial Microenvironment Modulates the Biology of Transplanted Mesenchymal Stem Cells.</a> Molecular Imaging Biology. , (2020).</li>
<li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+cardiomyocyte+renewal+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for cardiomyocyte renewal in humans.</a> Science. 324 (5923), 98-102 (2009).</li>
<li>Writing Group, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+Disease+and+Stroke+Statistics-2016+Update%3A+A+Report+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 133 (4), 38(2016).</li>
<li>Gersh, B. J., Simari, R. D., Behfar, A., Terzic, C. M., Terzic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+cell+repair+therapy%3A+a+clinical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Mayo+Clinic+Protocol%22%5BJournal%5D)">Cardiac cell repair therapy: a clinical perspective.</a> Mayo Clinic Protocol. 84 (10), 876-892 (2009).</li>
<li>Terzic, A., Behfar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+heart+failure+therapy+headed+for+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Regenerative heart failure therapy headed for optimization.</a> European Heart Journal. 35 (19), 1231-1234 (2014).</li>
<li>Beegle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxic+preconditioning+of+mesenchymal+stromal+cells+induces+metabolic+changes%2C+enhances+survival%2C+and+promotes+cell+retention+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Hypoxic preconditioning of mesenchymal stromal cells induces metabolic changes, enhances survival, and promotes cell retention in vivo.</a> Stem Cells. 33 (6), 1818-1828 (2015).</li>
<li>Kubli, D. A., Gustafsson, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+mitophagy%3A+the+yin+and+yang+of+cell+death+control%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and mitophagy: the yin and yang of cell death control.</a> Circulation Research. 111 (9), 1208-1221 (2012).</li>
<li>Psaltis, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+monitoring+of+oxidative+stress+in+transplanted+mesenchymal+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22JACC+Cardiovascular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Noninvasive monitoring of oxidative stress in transplanted mesenchymal stromal cells.</a> JACC Cardiovascular Imaging. 6 (7), 795-802 (2013).</li>
<li>Peet, C., Ivetic, A., Bromage, D. I., Shah, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+monocytes+and+macrophages+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac monocytes and macrophages after myocardial infarction.</a> Cardiovasc Research. 16 (6), 1101-1112 (2020).</li>
<li>Swirski, F. K., Nahrendorf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardioimmunology%3A+the+immune+system+in+cardiac+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cardioimmunology: the immune system in cardiac homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (12), 733-744 (2018).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Stem+Cells+Promote+the+Resolution+of+Cardiac+Inflammation+After+Ischemia+Reperfusion+Via+Enhancing+Efferocytosis+of+Neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Stem Cells Promote the Resolution of Cardiac Inflammation After Ischemia Reperfusion Via Enhancing Efferocytosis of Neutrophils.</a> Journal of the American Heart Association. 9 (5), 014397(2020).</li>
<li>Saxena, A., Russo, I., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+as+a+therapeutic+target+in+myocardial+infarction%3A+learning+from+past+failures+to+meet+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Inflammation as a therapeutic target in myocardial infarction: learning from past failures to meet future challenges.</a> Translational Research. 167 (1), 152-166 (2016).</li>
<li>Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biological+Basis+for+Cardiac+Repair+After+Myocardial+Infarction%3A+From+Inflammation+to+Fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis.</a> Circulation Research. 119 (1), 91-112 (2016).</li>
<li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ponad 85 milionów ludzi na całym świecie cierpi na choroby układu krążenia3. Wysokie rozpowszechnienie tych zdarzeń niedokrwiennych uzasadnia dalszy rozwój i ekspansję alternatywnych terapii wspomagających regenerację uszkodzonych tkanek. Tradycyjne metody wykorzystują procedurę reperfuzji niedokrwiennej w ostrym stanie, a następnie podawanie środków terapeutycznych1. Reakcje zapalne osiągają szczyt między 3-4 dniami po incydencie niedokrwiennym serca, z naciekiem neutrofil...

Choroby układu krążenia pozostają najczęstszą przyczyną zachorowalności i śmiertelności na całym świecie. Stwierdzono, że zdarzenia niedokrwienne serca są szkodliwe dla ogólnej funkcji mięśnia sercowego i otaczających komórek1. Tylko ̴0.45-1.0% kardiomiocytów będzie się regenerować co roku po wystąpieniu uszkodzenia mięśnia sercowego2. Pomimo rosnącego popytu i nieodłącznego skupienia się na opracowywaniu metod leczenia, terapie wspomagające regenerację uszkodzonych tkanek były trudne do opracowania i nadal wymagają dalszej optymalizacji3,4,5. Terapie komórkami macierzystymi zostały wprowadzone jako alternatywna ścieżka odmładzania uszkodzonej tkanki po zdarzeniu niedokrwiennym; Jednak postęp tych terapii został zakwestionowany przez ograniczoną przeżywalność i zatrzymywanie komórek w uszkodzonym obszarze6.
Mikrośrodowisko serca po zdarzeniu niedokrwiennym można scharakteryzować jako niedotlenienie, prooksydacyjne i prozapalne, stwarzając nieprzyjazne warunki dla terapeutycznych komórek macierzystych, które muszą się przystosować do przetrwania7,8. Ponieważ odpowiedź immunologiczna jest wyzwalana w wyniku urazu, naiwne limfocyty, makrofagi, neutrofile i komórki tuczne próbują naprawić uszkodzenie, usuwając umierające komórki i modulując proces przebudowy tkanek9,10,11. W ciągu pierwszych 3 dni po niedokrwieniu stan zapalny osiąga szczyt wraz z uwalnianiem cytokin prozapalnych z dużą liczbą neutrofili i monocytów w obszarze10,12. Po 7 dniach znaczna część stanu zapalnego ustąpiła i rozpoczyna się przejście do komórek naprawczych, trwające aż do zakończenia kaskady przebudowy, około 14 dni u myszy13. Nasza metoda chirurgiczna jest potencjalnym alternatywnym podejściem do wprowadzania leków biologicznych do mięśnia sercowego w celu ominięcia szczytowej wrodzonej odpowiedzi immunologicznej po uszkodzeniu reperfuzyjnym niedokrwiennym. Jednocześnie pozwoli to na badanie wszelkich metod leczenia w stanie podostrego/przewlekłego niedokrwienia, w którym mogą występować różne zmienne do rozważenia w porównaniu z ostrym zawałem mięśnia sercowego.

<table><tbody><tr><td>0,9% Irygacja NaCl, USP</td><td>Baxter</td><td>0338-0048-04</td><td></td></tr><tr><td>11x12" Obłożnica chirurgiczna Press n' Seal, autoklawowalna</td><td>SAI Infusion Technologies</td><td>PSS-SD</td><td></td></tr><tr><td>24G 3/4" Rurka do cewnika dożylnego</td><td>Jelco</td><td>4053</td><td></td></tr><tr><td>28G x 1/2" 1mL strzykawka alergiczna</td><td>BD</td><td>305500</td><td>Wstrzyknięcie przeciwbólowej</td></tr><tr><td>strzykawki insulinowej 30G x 1/2" 3/10cc</td><td>Ulticare</td><td>08222.0933.56</td><td>Iniekcja komórek macierzystych</td></tr><tr><td>6-0 S-29, 12" Szew Vicryl</td><td>Ethicon</td><td>J556G</td><td>Międzyżebrowe, powierzchowne nacięcie warstwy mięśni i skóry</td></tr><tr><td>9-0 BV100-4, 5" Szew ethilon</td><td>Ethicon</td><td>2829G</td><td>Podwiązanie tętnicy LAD</td></tr><tr><td>Podkład chłonny</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>14-206-64</td><td>Do spodu zwierzęcia</td></tr><tr><td>Wkładki nasączone alkoholem, 2-warstwowe, średnie</td><td>Coviden</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>Maska przeciwmgielna na twarz</td><td>Fał</td><td>49235</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do zeza Bonn, zakrzywione,</td><td>Fine Science Tools</td><td>14085-09</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina HCL SR LAB 1mg/ml, 5 ml</td><td>ZooPharm Apteka</td><td></td><td>Buprenorfina narkotyczny środek przeciwbólowy sformułowany w postaci polimeru, który spowalnia wchłanianie, wydłużając czas działania (72 godziny czasu trwania działalności gospodarczej).</td></tr><tr><td>Uchwyty do igieł Castroviejo, zakrzywione</td><td>Fine Science Tools</td><td>12061-01</td><td></td></tr><tr><td>Curity sterylne gąbki z gazy</td><td>Coviden</td><td>397310</td><td></td></tr><tr><td>Delikatne kleszczyki do wiązania szwów, 45 wygięte pod kątem</td><td>Fine Science Tools</td><td>11063-07</td><td></td></tr><tr><td>Elektryczna maszynka do golenia</td><td>Wahl</td><td></td><td>Usuwanie futra</td></tr><tr><td>Izofluran 100 ml</td><td>Cardinal Health</td><td>PI23238</td><td>Anestezjolog</td></tr><tr><td>Fartuch</td><td></td><td></td><td></td>laboratoryjny</tr><tr><td>Monoject 1 ml strzykawka podskórna</td><td>Coviden</td><td>8881501400</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki do tęczówki Moria, zakrzywione, ząbkowane (x2)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11370-31</td><td></td></tr><tr><td>Retraktor wziernika Moria</td><td>Fine Science Tools</td><td>17370-53</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do intubacji dotchawiczej myszy</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nair krem do depilacji</td><td>Johnson & Johnson</td><td></td><td>Usuwanie sierści</td></tr><tr><td>Optixcare lubrykant do oczu plus</td><td>Aventix</td><td></td><td>Sterylny lubrykant do oczu</td></tr><tr><td>Wentylator Physiosuite</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PolyE Rurki polietylenowe</td><td>Aparat Harvarda</td><td>72-0191</td><td>Tymczasowe uciskanie tętnicy LAD</td></tr><tr><td>Wymazy powidonowo-jodowe</td><td>PDI</td><td>S41125</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel, 10-ostrzowy</td><td>Bard-Parker</td><td>371610</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne 3-calowe aplikatory z bawełnianą końcówką</td><td>Cardinal Health</td><td>C15055-003</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne 6-calowe aplikatory z bawełnianą końcówką stożkową</td><td>Puritan</td><td>25-826-5WC</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne rękawiczki</td><td>Cardinal Health</td><td>N8830</td><td></td></tr><tr><td>Woreczki do sterylizacji</td><td>Medline</td><td>MPP100525GS</td><td></td></tr><tr><td>Czapka</td><td></td> <td>chirurgiczna</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop chirurgiczny</td><td>Leica</td><td>M125</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze do wiązania szwów, proste (x2)</td><td>Fine Science Tools</td><td>10825-10</td><td></td></tr><tr><td>Taśma chirurgiczna Transpore</td><td>3M</td><td>1527-1</td><td></td></tr><tr><td>Maść z potrójnym antybiotykiem</td><td>G& W Laboratories</td><td>11-2683ILNC2</td><td>Miejscowe stosowanie w celu zapobiegania infekcji</td></tr><tr><td>Vannas-T&uuml; Nożyczki sprężynowe bingen, zakrzywione</td><td>Fine Science Tools</td><td>15004-08</td><td></td></tr><tr><td>Waporyzator Vetflo</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

opóźnione dostarczanie komórek macierzystych do mięśnia sercowego po urazie reperfuzyjnym niedokrwiennym w modelu mysim

Delayed Intramyocardial Delivery of Stem Cells after Ischemia Reperfusion Injury in a Murine Model

Istnieje duże zainteresowanie wykorzystaniem komórek macierzystych (SC) do odzyskiwania funkcji serca u osób z urazami mięśnia sercowego. Najczęściej terapia komórkami macierzystymi serca jest badana poprzez dostarczanie SC jednocześnie z indukcją uszkodzenia mięśnia sercowego. Podejście to ma jednak dwa istotne ograniczenia: wczesne, wrogie, prozapalne środowisko niedokrwienne może wpływać na przeżycie przeszczepionych SC i nie reprezentuje scenariusza podostrego zawału, w którym prawdopodobnie zostaną zastosowane SC. W tym miejscu opisujemy dwuczęściową serię zabiegów chirurgicznych mających na celu indukcję uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego i dostarczenie mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC). Ta metoda podawania komórek macierzystych może pozwolić na dłuższą żywotność i zatrzymanie wokół uszkodzonej tkanki poprzez obejście początkowej odpowiedzi immunologicznej. Model uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego został wywołany u myszy, któremu towarzyszyło dostarczenie mezenchymalnych komórek macierzystych (3,0 x 105), stabilnie eksprymujących lucyferazy genu reporterowego świetlika pod konstytutywnie eksprymowanym promotorem CMV, domięśniowo 7 dni później. Zwierzęta zostały zobrazowane za pomocą ultradźwięków i obrazowania bioluminescencyjnego w celu potwierdzenia urazu i wstrzyknięcia komórek. Co ważne, nie stwierdzono dodatkowego wskaźnika powikłań podczas wykonywania tego dwuzabiegowego podejścia do porodu SC. Ta metoda podawania komórek macierzystych, w połączeniu z wykorzystaniem najnowocześniejszych genów reporterowych, może pozwolić na badanie in vivo żywotności i retencji przeszczepionych SC w sytuacji przewlekłego niedokrwienia powszechnie obserwowanego klinicznie, przy jednoczesnym obejściu początkowej odpowiedzi prozapalnej. Podsumowując, opracowaliśmy protokół opóźnionego dostarczania komórek macierzystych do mięśnia sercowego, który może być wykorzystany jako potencjalne nowe podejście do promowania regeneracji uszkodzonej tkanki.

W dniu 0 u myszy wywołano uraz niedokrwienno-reperfuzyjny, po czym w dniu poprzedzającym implantację komórek macierzystych wykonano pooperacyjne badanie echokardiograficzne i elektrokardiograficzne. Analiza ultradźwiękowa i elektrokardiograficzna potwierdziła wystąpienie zawału oraz zmniejszenie funkcji skurczowej komory (Rycina 1A-D). Dalsza analiza danych wykazała, że frakcja wyrzutowa i skrócenie frakcyjne były zmniejszone u myszy z niedokrwiennym uszkodzeniem, natomiast ...

Komórki macierzyste są stale badane jako potencjalne metody leczenia osób z uszkodzeniem mięśnia sercowego, jednak ich zmniejszona żywotność i retencja w uszkodzonej tkance może wpłynąć na ich długoterminową skuteczność. W tym manuskrypcie opisujemy alternatywną metodę dostarczania komórek macierzystych w mysim modelu uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego.

Opóźnione dostarczanie komórek macierzystych do mięśnia sercowego po urazie reperfuzyjnym niedokrwiennym w modelu mysim

There is significant interest in the use of stem cells (SCs) for the recovery of cardiac function in individuals with myocardial injuries. Most commonly, ...

Uszkodzenie niedokrwienne indukuje wrogie środowisko prozapalne, wpływając na przeżycie przeszczepionych komórek. Nasz protokół przedstawia alternatywną metodę dostarczania leków biologicznych poprzez obejście początkowej odpowiedzi immunologicznej na uraz. Główną zaletą tego protokołu jest to, że umożliwia podanie środków terapeutycznych w ciągu tygodnia po urazie, naśladując leczenie w środowisku klinicznym.Skupiamy się przede wszystkim na modelu uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego i przeszczepianiu komórek STEM. Jednak podejście to może być również wykorzystane w modelach chorób zapalnych, które wiążą się z wprowadzeniem terapii biologicznych. Zacznij od autoklawowania wszystkich narzędzi chirurgicznych.Jeśli podczas jednej sesji ma być wykonanych kilka operacji, wyczyść narzędzia po każdym zwierzęciu i ponownie wysterylizuj je za pomocą sterylizatora z gorącymi kulkami. Podskórnie podaj środek przeciwbólowy, zważ zwierzę i wprowadź wagę do respiratora. Ogol lewą stronę klatki piersiowej od mostka do poziomu ramienia i nałóż krem do depilacji, aby usunąć nadmiar sierści.Aby zapobiec zapadaniu się płuc, utrzymuj dodatnie końcowe ciśnienie wydechowe na poziomie dwóch centymetrów wody do procedury reperfuzji niedokrwiennej i zmień je na trzy centymetry wody w przypadku procedury opóźnionego wstrzykiwania komórek. Po znieczuleniu myszy zaintubuj ją rurką dotchawiczą o rozmiarze 20 G i przenieś do kontrolowanej poduszki grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała od 35 do 37 stopni Celsjusza. Umieść mysz w pozycji leżącej bocznej z końcem czaszki po lewej stronie i końcem ogonowym po prawej.Wyszoruj obszar chirurgiczny na przemian za pomocą wacików z jodonu i alkoholu, a następnie nałóż maść okulistyczną na oba oczy. Użyj skalpela z ostrzem numer 10, aby wykonać pionowe nacięcie 2,5 milimetra na prawo od skrajnego lewego sutka w polu widzenia, a następnie użyj nożyczek, aby przeciąć powierzchowne warstwy mięśni, aż mięsień międzyżebrowy i żebra będą widoczne. Unosząc żebra i otaczającą tkankę, przetnij przestrzeń międzyżebrową między czwartym a piątym żebrem, a następnie włóż zwijacz powieki w otwartą przestrzeń.Cofnij osierdzie za pomocą zakrzywionych kleszczy, przesuwając płuco do góry i poza widok. Przełóż nylonowy szew 9-0 przez mięsień sercowy pod tętnicą LAD 2,5 milimetra dystalnie do lewej małżowiny usznej, utrzymując płynny i spójny ruch, aby zapobiec rozerwaniu tkanki lub przebiciu głównego naczynia krwionośnego. Zawiąż luźny kwadratowy węzeł, a następnie umieść jeden centymetr rurki polietylenowej w luźnym węźle.Zabezpiecz szew wokół rurki i potwierdź niedokrwienie przez bladość i arytmię komorową, a następnie zwolnij po 35 minutach. Po wyjęciu rurki odczekaj pięć minut, aby potwierdzić ponowną perfuzję mięśnia sercowego. Umieść rurkę cewnika dożylnego o rozmiarze 24 w jamie klatki piersiowej w jednej przestrzeni międzyżebrowej po prawej stronie otworu.Użyj szwów wchłanialnych 6-0, aby zamknąć nacięcie międzyżebrowe w prosty przerywany wzór, a warstwę mięśniową w ciągłym wzorze szwów. Po zamknięciu powierzchownej warstwy mięśniowej wyjmij rurkę klatki piersiowej, jednocześnie pobierając powietrze z klatki piersiowej za pomocą jednomililitrowej strzykawki tuberkulinowej o pojemności jednego mililitra. Zamknij nacięcie skóry wchłanialnym szwem 6-0 w ciągłym poziomym wzorze materaca.Po zakończeniu podaj podskórnie 1,5 mililitra ciepłej soli fizjologicznej i nałóż potrójną maść z antybiotykiem na miejsce nacięcia, aby zapobiec infekcji. Przenieś mysz do klatki bez ściółki lub klatki z przykrytą ściółką na ciepłej podkładce i temperaturze od 35 do 37 stopni Celsjusza, aż w pełni się zregeneruje. Po przygotowaniu i zaintubowaniu myszy zgodnie z wcześniejszym opisem, usuń szew z warstwy skóry za pomocą nożyczek i kleszczy, a następnie użyj skalpela numer 10, aby wykonać nacięcie w tym samym miejscu, co poprzednia operacja.Kontynuuj przecinanie tkanki bliznowatej, aż szew warstwy mięśniowej będzie widoczny, a następnie użyj nożyczek i kleszczy, aby usunąć szew i rozciąć warstwę mięśniową. Usuń szwy trzymające żebra razem i kontynuuj przecinanie mięśnia międzyżebrowego z poprzedniego nacięcia. Umieść zwijacz powieki w przestrzeni międzyżebrowej i zlokalizuj obszar poprzedniego podwiązania.Załaduj 300 000 mezenchymalnych komórek STEM zawieszonych w 20 mikrolitrach PBS do strzykawki insulinowej o rozmiarze 30 i lekko zegnij igłę, aby uzyskać odpowiedni kąt do wstrzyknięcia. Poruszając się w kierunku wierzchołka w kierunku podstawy serca, włóż strzykawkę do okolicy okołozawałowej, aż otwór igły znajdzie się całkowicie wewnątrz mięśnia sercowego, a następnie powoli wstrzyknij komórki do mięśnia sercowego, odczekaj trzy sekundy i wyjmij igłę. Uważnie obserwuj serce przez trzy minuty, aby upewnić się, że nie ma nieprawidłowej reakcji na komórki, takiej jak migotanie komór.Po trzech minutach umieść rurkę cewnika dożylnego o rozmiarze 24 w jamie klatki piersiowej w jednej przestrzeni międzyżebrowej po prawej stronie otworu. Zamknij warstwy mięśni międzyżebrowych i skóry i wyjmij rurkę klatki piersiowej, jak opisano wcześniej. Podaj podskórnie 1,5 mililitra ciepłej soli fizjologicznej i nałóż potrójną maść z antybiotykiem na miejsce nacięcia, aby zapobiec infekcji.Przenieś mysz do klatki bez ściółki lub klatki z przykrytą ściółką na ciepłej podkładce, aż w pełni się wyleczy. Pooperacyjne echokardiogram i elektrokardiogram wykonano w dniu poprzedzającym implantację komórek STEM, potwierdzając zawał i zmniejszoną czynność skurczową komór. Dalsza analiza danych wykazała, że frakcja wyrzutowa i frakcyjne skrócenie uległy zmniejszeniu u myszy, które doznały urazu niedokrwiennego, podczas gdy końcowa objętość rozkurczowa i skurczowa wzrosła.Barwienie trichromem mięśnia sercowego Massona siedem dni po urazie wykazało zwiększone odkładanie się kolagenu i ścieńczenie ściany lewej komory w sercach myszy, które doznały urazu niedokrwiennego. Obrazowanie bioluminescencyjne in vivo lub BLI wykonano następnego dnia po implantacji mezenchymalnych komórek STEM. Przykładem skutecznego dostarczania MSCs jest sygnał BLI w porównaniu z myszami, które miały wywołane uszkodzenie reperfuzyjne niedokrwienne, ale nie otrzymały MSC.Próbując tego protokołu, należy pamiętać, że małe celowe ruchy podczas przecinania przestrzeni międzyżebrowych, podwiązywania naczynia i wstrzykiwania komórek są niezbędne do zapobiegania nadmiernemu uszkodzeniu serca lub płuc w polu widzenia. Procedury te oferują możliwość monitorowania czynności serca po przeszczepie za pomocą ultradźwięków, żywotności komórek za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego lub dalszych technik molekularnych lub biochemicznych w zależności od zastosowanej terapii.

delayed-intramyocardial-delivery-stem-cells-after-ischemia

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

W niniejszym materiale wideo zaprezentowano sposób wykorzystania szybkiego i wiarygodnego modelu do badania procesów patobiologicznych i patofizjologicznych niedokrwienia mięśnia sercowego.

Ligacja LAD: mysi model zawału mięśnia sercowego

Dostarczanie komórek do mięśnia sercowego w mysich modelach chorób sercowo-naczyniowych, takich jak nadciśnienie czy zawał mięśnia sercowego, jest szeroko stosowane do testowania potencjału terapeutycznego różnych typów komórek w badaniach regeneracyjnych. Dlatego szczegółowy opis i przejrzysta wizualizacja tego zabiegu chirurgicznego pomogą określić ograniczenia i zalety analiz terapeutycznych komórek sercowo-naczyniowych u małych gryzoni.

Dostarczanie komórek do mięśnia sercowego: obserwacje w mysich sercach

Przezskórne wstrzyknięcie do mięśnia sercowego pod kontrolą echokardiografii stanowi efektywną, niezawodną i celowaną metodę dostarczania czynników transferu genów lub komórek do mysiego serca. Postępując zgodnie z krokami opisanymi w tym protokole, operator może szybko stać się kompetentny w tej wszechstronnej, minimalnie inwazyjnej technice.

Iniekcja przezklatkowa domięśniowa pod kontrolą USG u myszy

Nowatorskie strategie terapeutyczne w medycynie regeneracyjnej serca wymagają obszernych i szczegółowych badań na dużych przedklinicznych modelach zwierzęcych, zanim będą mogły być rozważane do zastosowania u ludzi. W tym miejscu demonstrujemy technikę przezskórnego wstrzykiwania domięśniowego do mięśnia sercowego pod kontrolą echokardiografii kontrastowej u królików, która jest cenna dla hipotezy testującej skuteczność takich nowatorskich terapii.

Przezskórna iniekcja domięśniowa pod kontrolą echokardiografii z kontrastem i dostarczanie komórek w dużym modelu przedklinicznym

Staraliśmy się stworzyć świński model niewydolności serca wywołanej zablokowaniem lewej tętnicy obwodowej i szybką stymulacją, aby przetestować efekt i bezpieczeństwo domięśniowego podawania komórek macierzystych w terapiach komórkowych.

Opracowanie świńskiego modelu niewydolności serca po zawale mięśnia sercowego do leczenia komórkami macierzystymi

Terapia oparta na komórkach macierzystych pojawiła się jako skuteczna strategia naprawy uszkodzonych tkanek serca po zawale mięśnia sercowego. Zapewniamy optymalną aplikację in vivo do przeszczepu komórek macierzystych przy użyciu hydrożeli żelatynowych, które mogą być sieciowane enzymatycznie.

Domięśniowe przeszczepienie hydrożeli iniekcyjnej obciążających MSC po zawale mięśnia sercowego w modelu mysim

Dostarczanie komórek pod kontrolą ultradźwięków w miejscu zawału mięśnia sercowego u myszy jest bezpiecznym, skutecznym i wygodnym sposobem przeszczepu komórek.

Indukowana ultradźwiękami indukowana pluripotencjalna implantacja kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych u myszy z zawałem mięśnia sercowego

Ten artykuł zawiera szczegółowe informacje na temat zoptymalizowanego protokołu wstrzykiwań domięśniowych pod kontrolą echokardiografii w szczurzych modelach zawału mięśnia sercowego przy użyciu igły 29 G x 88 mm. Technika ta zapewnia solidne, precyzyjne i powtarzalne dostarczanie środków terapeutycznych bezpośrednio do strefy okołozawałowej.

Iniekcja pod kontrolą echokardiografii w celu ukierunkowanego i niezawodnego dostarczania komórek macierzystych do mięśnia sercowego w szczurzym modelu zawału mięśnia sercowego

Uraz chirurgiczny wywołuje odpowiedź zapalną. Wiadomo, że cytokiny i ligandy endogenne modulują wielkość zawału mięśnia sercowego po niedokrwieniu i reperfuzji. Przedstawiamy zmodyfikowany model niedokrwienia i reperfuzji u myszy z zamkniętą klatką piersiową, wykorzystujący obciążniki wiszące w celu zminimalizowania efektów torakotomii.

Mysi model zamkniętoklatkowy niedokrwienia i reperfuzji mięśnia sercowego

Opisujemy modele umiarkowanego i ciężkiego uszkodzenia nerek wywołanego niedokrwieniem i reperfuzją, w których myszy przechodzą jednostronne zaciskanie szypułki nerki, po którym następuje równoczesna lub opóźniona nefrektomia przeciwległa. Modele te konsekwentnie powodują dysfunkcję nerek i zwłóknienie pourazowe, ale ciężkość urazu i przeżycie zależą od pochodzenia myszy, wieku i sprzętu chirurgicznego.

Model niedokrwienno-reperfuzyjny ostrego uszkodzenia nerek i zwłóknienia pourazowego u myszy

Odkryj metodę opóźnionego dostarczania komórek macierzystych do uszkodzonego mięśnia sercowego w modelu mysim. Technika ta omija początkową odpowiedź immunologiczną po urazie niedokrwienno-reperfusyjnym, poprawiając przeżywalność i retencję komórek.

Opóźnione dostarczanie komórek macierzystych do mięśnia sercowego po urazie reperfuzyjnym niedokrwiennym w modelu mysim

Przeglądaj więcej filmów