Name: Ocena funkcjonalna wariantów BRCA1 za pomocą edytorów bazowych za pośrednictwem CRISPR (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Poznaj metodę oceny funkcjonalnej wariantów BRCA1 za pomocą edytorów bazowych CRISPR. Technika ta pozwala na precyzyjne mutowanie endogennego genu, co umożliwia dokładniejszą predykcję ryzyka raka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Badawczą Korei (granty 2017M3A9B4062419, 2019R1F1A1057637 i 2018R1A5A2020732 dla Y.K.).

<ol><li>Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA1+and+BRCA2%3A+different+roles+in+a+common+pathway+of+genome+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (1), 68-78 (2011).</li>
<li>Kuchenbaecker, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risks+of+Breast%2C+Ovarian%2C+and+Contralateral+Breast+Cancer+for+BRCA1+and+BRCA2+Mutation+Carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Risks of Breast, Ovarian, and Contralateral Breast Cancer for BRCA1 and BRCA2 Mutation Carriers.</a> Journal of the American Medical Association. 317 (23), 2402-2416 (2017).</li>
<li>Millot, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+for+functional+analysis+of+BRCA1+variants+of+uncertain+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">A guide for functional analysis of BRCA1 variants of uncertain significance.</a> Human Mutation. 33 (11), 1526-1537 (2012).</li>
<li>Santos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenicity+evaluation+of+BRCA1+and+BRCA2+unclassified+variants+identified+in+Portuguese+breast%2Fovarian+cancer+families%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Pathogenicity evaluation of BRCA1 and BRCA2 unclassified variants identified in Portuguese breast/ovarian cancer families.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 16 (3), 324-334 (2014).</li>
<li>Starita, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Multiplex+Homology-Directed+DNA+Repair+Assay+Reveals+the+Impact+of+More+Than+1%2C000+BRCA1+Missense+Substitution+Variants+on+Protein+Function%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">A Multiplex Homology-Directed DNA Repair Assay Reveals the Impact of More Than 1,000 BRCA1 Missense Substitution Variants on Protein Function.</a> American Journal of Human Genetics. 103 (4), 498-508 (2018).</li>
<li>Anantha, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+mutational+landscapes+of+BRCA1+for+homology-directed+repair+and+therapy+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Functional and mutational landscapes of BRCA1 for homology-directed repair and therapy resistance.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transience+of+transient+overexpression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The transience of transient overexpression.</a> Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).</li>
<li>Quann, K., Jing, Y., Rigoutsos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-transcriptional+regulation+of+BRCA1+through+its+coding+sequence+by+the+miR-15%2F107+group+of+miRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Post-transcriptional regulation of BRCA1 through its coding sequence by the miR-15/107 group of miRNAs.</a> Frontiers in Genetics. 6, 242(2015).</li>
<li>Saunus, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranscriptional+regulation+of+the+breast+cancer+susceptibility+gene+BRCA1+by+the+RNA+binding+protein+HuR%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Posttranscriptional regulation of the breast cancer susceptibility gene BRCA1 by the RNA binding protein HuR.</a> Cancer Research. 68 (22), 9469-9478 (2008).</li>
<li>Knott1, G. J., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+guides+the+future+of+genetic+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering.</a> Science. 361, 866-869 (2018).</li>
<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).</li>
<li>Hess, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+using+dCas9-targeted+somatic+hypermutation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Directed evolution using dCas9-targeted somatic hypermutation in mammalian cells.</a> Nature Methods. 13 (12), 1036-1042 (2016).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+base+editing+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided base editing in mouse embryos.</a> Nature Biotechnology. 35 (5), 435-437 (2017).</li>
<li>Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+editing+of+a+target+base+in+genomic+DNA+without+double-stranded+DNA+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage.</a> Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).</li>
<li>Park, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Base+Editing+via+RNA-Guided+Cytidine+Deaminases+in+Xenopus+laevis+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules+and+Cells%22%5BJournal%5D)">Targeted Base Editing via RNA-Guided Cytidine Deaminases in Xenopus laevis Embryos.</a> Molecules and Cells. 40 (11), 823-827 (2017).</li>
<li>Kweon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR-based+base-editing+screen+for+the+functional+assessment+of+BRCA1+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">A CRISPR-based base-editing screen for the functional assessment of BRCA1 variants.</a> Oncogene. 39 (1), 30-35 (2020).</li>
<li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).</li>
<li>Nageshwaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+Guide+RNA+Cloning+for+Mammalian+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).</li>
<li>Findlay, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+classification+of+BRCA1+variants+with+saturation+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Accurate classification of BRCA1 variants with saturation genome editing.</a> Nature. 562 (7726), 217-222 (2018).</li>
<li>Kweon, J., Kim, D. E., Jang, A. H., Kim, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas-based+customization+of+pooled+CRISPR+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas-based customization of pooled CRISPR libraries.</a> PLoS One. 13 (6), 0199473(2018).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+library+of+TAL+effector+nucleases+spanning+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A library of TAL effector nucleases spanning the human genome.</a> Nature Biotechnology. 31 (3), 251-258 (2013).</li>
<li>Sayers, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GenBank%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">GenBank.</a> Nucleic Acids Research. 47 (1), 94-99 (2019).</li>
<li>Hwang, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Web-based+design+and+analysis+tools+for+CRISPR+base+editing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Web-based design and analysis tools for CRISPR base editing.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 542(2018).</li>
<li>Kim, D., Kim, D. E., Lee, G., Cho, S. I., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+target+specificity+of+CRISPR+RNA-guided+adenine+base+editors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide target specificity of CRISPR RNA-guided adenine base editors.</a> Nature Biotechnology. 37 (4), 430-435 (2019).</li>
<li>Clement, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPResso2+provides+accurate+and+rapid+genome+editing+sequence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">CRISPResso2 provides accurate and rapid genome editing sequence analysis.</a> Nature Biotechnology. 37 (3), 224-226 (2019).</li>
<li>Hu, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolved+Cas9+variants+with+broad+PAM+compatibility+and+high+DNA+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity.</a> Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).</li>
<li>Nishimasu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+CRISPR-Cas9+nuclease+with+expanded+targeting+space%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space.</a> Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).</li>
<li>Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N., Kleinstiver, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unconstrained+genome+targeting+with+near-PAMless+engineered+CRISPR-Cas9+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants.</a> Science. , (2020).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+target+specificities+of+CRISPR+RNA-guided+programmable+deaminases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide target specificities of CRISPR RNA-guided programmable deaminases.</a> Nature Biotechnology. 35 (5), 475-480 (2017).</li>
<li>Zuo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosine+base+editor+generates+substantial+off-target+single-nucleotide+variants+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos.</a> Science. 364 (6437), 289-292 (2019).</li>
<li>Jin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosine%2C+but+not+adenine%2C+base+editors+induce+genome-wide+off-target+mutations+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice.</a> Science. 364 (6437), 292-295 (2019).</li>
<li>Grunewald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+off-target+RNA+editing+induced+by+CRISPR-guided+DNA+base+editors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA base editors.</a> Nature. 569 (7756), 433-437 (2019).</li>
<li>Doman, J. L., Raguram, A., Newby, G. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+minimization+of+Cas9-independent+off-target+DNA+editing+by+cytosine+base+editors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Evaluation and minimization of Cas9-independent off-target DNA editing by cytosine base editors.</a> Nature Biotechnology. 38 (5), 620-628 (2020).</li>
<li>Gaudelli, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+base+editing+of+A%2AT+to+G%2AC+in+genomic+DNA+without+DNA+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage.</a> Nature. 551 (7681), 464-471 (2017).</li>
<li>Anzalone, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Search-and-replace+genome+editing+without+double-strand+breaks+or+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA.</a> Nature. 576 (7785), 149-157 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje prostą metodę oceny funkcjonalnej wariantów BRCA1 przy użyciu edytora zasad cytozyny medytowanego przez CRISPR. W protokole opisano metody projektowania gRNA w docelowym locus i budowy plazmidowych DNA, z których ulegają one ekspresji. Edytory zasad cytozyny indukują konwersję nukleotydów w oknie aktywnym (w przypadku BE3 nukleotydy 4–8 w PAM-dystalnym końcu sekwencji docelowych gRNA). Badacz powinien starannie dobierać sekwencje docelowe, ponieważ wszystkie cytozyny w oknie aktywnym mogą by...

Gen podatności na raka piersi typu 1 (BRCA1) jest powszechnie znanym genem supresorowym. Ponieważ gen BRCA1 odpowiada za naprawę uszkodzeń DNA, mutacje w tym genie prowadzą do zwiększonego ryzyka rozwoju nowotworów u danej osoby1. Rak piersi, jajnika, prostaty i trzustki są powiązane z dziedzicznymi mutacjami utraty funkcji (LOF) genu BRCA12. Ocena funkcjonalna i identyfikacja wariantów BRCA1 mogą pomóc w zapobieganiu i diagnozowaniu różnych chorób. W celu zbadania funkcji wariantów BRCA1 opracowano i szeroko stosowano kilka metod badania patogenności wariantów BRCA1, takich jak testy żywotności embrionalnych komórek macierzystych, testy z reporterem fluorescencyjnym oraz testy wrażliwości na leki terapeutyczne3,4,5,6. Choć metody te pozwoliły ocenić funkcję wielu wariantów BRCA1, podejścia oparte na egzogennej ekspresji wariantów BRCA1 niosą ze sobą ograniczenia związane z nadekspresją, która może wpływać na regulację downstream, dawkę genu oraz fałdowanie białek7. Ponadto testy te nie mogą być wykorzystywane do badania regulacji posttranskrypcyjnej, takiej jak splicing mRNA, stabilność transkryptu oraz wpływ regionów niekodujących8,9.
System CRISPR-Cas9 umożliwia ukierunkowaną edycję genomu w żywych komórkach i organizmach10. Poprzez pojedyncze przewodniące RNA, Cas9 może indukować pęknięcia obu nici (DSBs) w DNA chromosomowym w specyficznych loci genomowych, aby aktywować dwie ścieżki naprawy DNA: podatną na błędy ścieżkę niehomologicznego łączenia końców (NHEJ) oraz bezbłędną ścieżkę naprawy kierowanej homologią (HDR)11. HDR jest precyzyjnym mechanizmem naprawczym; jednakże DSBs indukowane przez nukleazę Cas9 w celu HDR często prowadzą do niepożądanych mutacji w postaci insercji i delecji (indel). Dodatkowo, proces ten wymaga homologicznych matryc donorowych DNA do naprawy uszkodzeń DNA i charakteryzuje się stosunkowo niską wydajnością. Niedawno nickaza Cas9 (nCas9) została połączona z domenami cytydynodeaminazy w celu wprowadzania substytucji C:G na T:A, bez konieczności stosowania homologicznych matryc DNA i indukowania pęknięć obu nici DNA12,13,14,15. Wykorzystując edytor zasad cytozyny, opracowaliśmy nową metodę analizy funkcjonalnej wariantów BRCA116.
W niniejszym badaniu wykorzystaliśmy edytor zasad cytozynowych BE314, oparty na systemie CRISPR, który indukuje efektywne mutacje punktowe C:G na T:A, w celu przeprowadzenia oceny funkcjonalnej wariantów BRCA1, co pozwoliło na pomyślną identyfikację funkcji kilku wariantów BRCA1 (Rycina 1).
<img alt="Schemat procesu mutagenezy CRISPR w komórkach z podziałem na ścieżki patogenne i łagodne oraz etapy przepływu pracy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61557/61557fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Przegląd schematu oceny funkcjonalnej.(A) Schemat przedstawiający ocenę funkcjonalną BRCA1. Ponieważ utrata funkcji (LOF) BRCA1 wpływa na żywotność komórek, w przypadku patogennej mutacji BRCA1 komórki giną wraz ze wzrostem liczby pasaży. (B) Etapy oceny funkcjonalnej BRCA1. Ramka przerywana jest opcjonalna. Można ją zastąpić kotransfekcją DNA plazmidów eksprymujących gRNA oraz BE3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61557/61557fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R3136</td><td>Enzym restrykcyjny</td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1113903</td><td>Lek do selekcji transdukowanych komórek</td></tr><tr><td>BsaI</td><td>NEB</td><td>R0535</td><td>Enzym restrykcyjny</td></tr><tr><td>DNeasy Blood & Zestaw tkanek</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>Zestaw do przygotowania genomowego DNA</td></tr><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td>Pożywka do komórek HEK293T/17</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Gibco</td><td>16000036</td><td>Supplemetal do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji FuGENE HD</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td>Odczynnik do transfekcji</td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2611L</td><td>Zestaw montażowy Gibson</td></tr><tr><td>Iscove' s zmodyfikowany Dulbecco" s medium</td><td>Gibco</td><td>12440046</td><td>Pożywka dla komórek HAP1</td></tr><tr><td>lentiCas9-Blast</td><td>Addgene</td><td>52962</td><td>Plazmidy DNA do klonowania lentiBE3</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668027</td><td>Odczynnik do transfekcji</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td>Materiały do transfekcji</td></tr><tr><td>pCMV-BE3</td><td>Addgene</td><td>73021</td><td>Plazmidy DNA dla lentiBE3 klonowanie</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>Elastyczny metal do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Phusion Polimeraza DNA o wysokiej wierności</td><td>NEB</td><td>M0530SQ</td><td>Polimeraza o wysokiej wierności</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td>Plazmidy DNA do przygotowania wirusa.</td></tr><tr><td>pRG2</td><td>Addgene</td><td>104174</td><td>wektor klonowania gRNA</td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td>Plazmidy DNA do przygotowania wirusa.</td></tr><tr><td>Zestaw QIAprep Spin Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>Zestaw do przygotowania plazmidowego DNA</td></tr><tr><td>QIAquick Zestaw do ekstrakcji żelu</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Zestaw do ekstrakcji żelu</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Zestaw do oczyszczania Qiagen</td><td></td><td>28104</td><td>PCR Zestaw do</td></tr><tr><td>szybkiego ligowania NEB</td><td></td><td>M2200</td><td>Ligaza do klonowania gRNA</td></tr><tr><td>Endonukleaza T7 I</td><td>NEB</td><td>M0302</td><td>Materiały do oznaczania T7E1</td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NEB</td><td>R0145</td><td>Enzym restrykcyjny</td></tr></tbody></table>

ocena funkcjonalna wariantów brca1 za pomocą edytorów bazowych za pośrednictwem crispr

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Ostatnie badania badały ryzyko związane z mutacjami genu BRCA1 za pomocą różnych metod oceny funkcjonalnej, takich jak fluorescencyjne testy reporterowe, testy żywotności embrionalnych komórek macierzystych i testy wrażliwości terapeutycznej opartej na lekach. Chociaż wyjaśniono wiele wariantów BRCA1, testy te obejmujące użycie egzogennych wariantów BRCA1 są związane z problemami z nadekspresją i nie mogą być stosowane do regulacji potranskrypcyjnej. Aby rozwiązać te ograniczenia, wcześniej opisaliśmy metodę analizy funkcjonalnej wariantów BRCA1 za pomocą edytora zasad cytozyny za pośrednictwem CRISPR, które indukują ukierunkowaną substytucję nukleotydów w żywych komórkach. Korzystając z tej metody, zidentyfikowaliśmy warianty, których funkcje pozostają niejednoznaczne, w tym c.-97C>T, c.154C>T, c.3847C>T, c.5056C>T i c.4986+5G>A, i potwierdziliśmy, że edytory bazowe za pośrednictwem CRISPR są użytecznymi narzędziami do reklasyfikacji wariantów o niepewnym znaczeniu w BRCA1. W tym miejscu opisujemy protokół analizy funkcjonalnej wariantów BRCA1 przy użyciu edytora zasad cytozyny opartego na CRISPR. Protokół ten zawiera wytyczne dotyczące wyboru miejsc docelowych, analizy funkcjonalnej i oceny wariantów BRCA1.

Podejścia eksperymentalne opisane w niniejszym protokole umożliwiają funkcjonalną ocenę endogennych wariantów BRCA1 generowanych za pomocą edytorów zasad cytozynowych opartych na systemie CRISPR. Aby dobrać odpowiednie linie komórkowe do oceny funkcjonalnej wariantów BRCA1, badacze powinni potwierdzić, że BRCA1 jest genem niezbędnym w wybranych liniach komórkowych. Na przykład, w pierwszej kolejności dokonaliśmy transfekcji Cas9 i gRNA do linii komórkowych HAP1 w celu zakłócenia BRCA1,...

Osoby z mutacjami BRCA1 mają wyższe ryzyko zachorowania na raka, co gwarantuje dokładną ocenę funkcji wariantów BRCA1. W tym artykule opisaliśmy protokół oceny funkcjonalnej wariantów BRCA1 przy użyciu edytorów zasad cytozyny za pośrednictwem CRISPR, które umożliwiają ukierunkowaną konwersję C:G do T:A w żywych komórkach.

Ocena funkcjonalna wariantów BRCA1 za pomocą edytorów bazowych za pośrednictwem CRISPR

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter ...

Dzięki skutecznej indukcji mutacji punktowych za pomocą edytora zasad cytozynowych za pośrednictwem CRISPR, można zidentyfikować funkcjonalność wariantów BRCA1, która jest ważna w zapobieganiu chorobom i diagnozowaniu. Zaletą tej techniki jest to, że bezpośrednio mutuje endogenną ekspresję BRCA1, co pozwala przezwyciężyć ograniczenia oceny funkcjonalnej przy użyciu egzogennej ekspresji BRCA1. Identyfikacja mutacji powodujących utratę funkcji BRCA1 może być wykorzystana do przewidywania prawdopodobieństwa wystąpienia nowotworów związanych z mutacjami BRCA1, takich jak rak piersi, jajnika, prostaty i trzustki.Może być również używany do znajdowania potencjalnych celów leków poprzez poszukiwanie niezbędnych genów, których żywotność jest zmniejszona przez wyczerpanie funkcjonalne. Na początek uzyskaj sekwencję genomu BRCA1 z GenBank w NCBI i przeszukaj 20 miejsc docelowych par zasad za pomocą sekwencji motywu sąsiadującego z protospacerem, NGGNCCN, wokół interesującej mutacji. Mutacja, która jest przedmiotem zainteresowania, powinna być zlokalizowana w obrębie czterech do ośmiu nukleotydów w PAM-dystalnym końcu docelowych sekwencji przewodnika RNA.Zamów dwa uzupełniające się oligonukleotydy na przewodnik RNA. W przypadku oligonukleotydów do przodu dodaj CACCG do końca 5' sekwencji prowadzącej, a dla oligonukleotydów odwrotnych dodaj AAC do końca 5' i C do końca 3'. Po otrzymaniu oligonukleotydów należy je ponownie zawiesić w wodzie destylowanej do końcowego stężenia 100 mikromolowych.Wymieszaj dwa uzupełniające się oligonukleotydy do końcowego stężenia 10 mikromolów z buforem ligacyjnym T4 i podgrzej je do 95 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie schłodzić do temperatury pokojowej w celu wyżarzania. Trawić pRG2 za pomocą enzymu restrykcyjnego Bsa1 przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie uruchomić strawiony produkt na 1% żelu agarozowym i oczyścić pasmo o odpowiedniej wielkości. Zligować wyżarzony duplex oligonukleotydowy do wektora DNA za pomocą zakupionej ligazy DNA zgodnie z protokołem producenta i przekształcić je w komórki kompetentne DH5-alfa.Dodać transformanty do płytki agarowej zawierającej 100 mikrogramów na mililitr ampicyliny i inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Oczyść DNA osocza z kilku transformantów i przeanalizuj ich przewodnikowe sekwencje RNA za pomocą sekwencjonowania Sangera ze starterami, które przygotowują promotor U6. Wysiewaj pięć razy od 10 do piątej komórki HAP1-BE3 na studzienkę na 24-dołkowych płytkach na dzień przed transfekcją i hoduj je, aby osiągnąć 70 do 80% konfluencji do transfekcji.Transfect BRCA1 celuje w przewodnikowe RNA za pomocą zakupionych odczynników do transfekcji zgodnie z protokołem producenta. Użyj jednego mikrograma przewodnika RNA BRCA1, aby indukować konwersję CG do TA w miejscach docelowych BRCA1, a następnie inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i subkulturować co trzy do czterech dni. Zbierz granulki komórek trzy, 10 i 24 dni po transfekcji, aby przeanalizować wydajność edycji bazy.Ekstrakcja genomowego DNA za pomocą zestawu do oczyszczania genomowego DNA. Zaprojektuj pierwsze startery PCR do amplifikacji miejsc docelowych BRCA1. Chociaż nie ma ograniczeń co do wielkości pierwszego produktu PCR, zaleca się rozmiar produktu mniejszy niż jeden kilozasad, aby skutecznie amplifikować określony region.Zaprojektuj drugie startery PCR znajdujące się wewnątrz pierwszego produktu PCR, biorąc pod uwagę rozmiar amplikonu zgodnie z długością odczytu NGS. Aby dołączyć niezbędne sekwencje do analizy NGS, dodaj dodatkowe sekwencje do końców 5' drugich starterów PCR. Amplifikacja miejsc docelowych BRCA1 na genomowym DNA uzyskanym z trzech punktów czasowych przy użyciu polimerazy o wysokiej wierności.Do pierwszej reakcji PCR użyj 100 nanogramów genomowego DNA do amplifikacji w ciągu 15 cykli. Do drugiej reakcji PCR użyj jednego mikrolitra pierwszego produktu PCR do amplifikacji przez 20 cykli. Uruchom pięć mikrolitrów drugiego produktu PCR na 2% żelu agarozowym i potwierdź rozmiar.Następnie dołącz niezbędne sekwencje do analizy NGS poprzez amplifikację drugiego produktu PCR przy użyciu starterów wymienionych w rękopisie tekstowym. Amplifikuj każdą próbkę za pomocą różnych zestawów starterów. Użyj jednego mikrolitra drugiego produktu PCR do 30 cykli amplifikacji za pomocą polimerazy o wysokiej wierności.Uruchom pięć mikrolitrów produktu PCR na 2% żelu agarozowym, aby potwierdzić rozmiar i oczyścić amplikon za pomocą komercyjnego zestawu do czyszczenia PCR. Wymieszaj każdą próbkę w równych ilościach, aby utworzyć bibliotekę NGS. Określić ilościowo bibliotekę NGS za pomocą spektrofotometru i rozcieńczyć ją do stężenia jednego nanomola za pomocą buforu do reskrypcji lub 10 milimolowych Tris-HCl przy pH 8,5.Przygotować 100 mikrolitrów biblioteki rozcieńczonej do odpowiedniego stężenia wsadowego. Jako kontrola połączono PhiX z rozcieńczoną próbką. Załaduj bibliotekę na kartridżę i uruchom NGS zgodnie z protokołem producenta.Uzyskaj ponad 10 000 odczytów na docelowy amplikon w celu dogłębnej analizy podstawowej wydajności edycji. Protokół ten został wykorzystany do przeprowadzenia oceny funkcjonalnej endogennych wariantów BRCA1 generowanych przez edytory zasad cytozyny oparte na CRISPR. CAS-9 i przewodnikowe RNA transfekowano do linii komórkowych HAP1 w celu zakłócenia BRCA1, a także analizowano częstość mutacji.Częstość mutacji zmniejszyła się znacznie w czasie w liniach komórkowych HAP1, co wskazuje, że BRCA1 jest niezbędnym genem dla żywotności komórek w tych komórkach. Aby zbadać, czy warianty podstawione od CG do TA wpływają na funkcję BRCA1, plazmidy DNA i kodujące RNA prowadzące, które mogą indukować każdą mutację, zostały transfekowane tak, aby miały linie komórkowe HAP1-BE3. Przeanalizowano też częstości substytucji.Względne częstości substytucji 3598C do T, patogennego wariantu, który indukuje mutację nonsensowną, dramatycznie się zmniejszyły. Natomiast te od 4527C do T, łagodnego wariantu, który indukuje mutację nonsensowną, pozostały podobne z czasem. Stwierdzono, że częstość substytucji nukleotydów tych trzech wariantów zmniejszała się w sposób zależny od czasu.Ponieważ konieczne jest uzyskanie wysokiej początkowej częstości mutacji, aby wyraźnie rozpoznać zmianę żywotności komórek wraz z upływem daty, priorytetem jest ustalenie zoptymalizowanych warunków transfekcji. Procedura ta może być stosowana do weryfikacji innych nieznanych wariantów genetycznych, takich jak BRCA VUS. Może dostarczyć wskazówek na temat patogenności nieznanych wariantów pochodzących od pacjentów i ich leczenia.

functional-assessment-brca1-variants-using-crispr-mediated-base

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Przedstawiamy metodę testowania wariantów BRCA1 w teście opartym na hodowli tkankowej dla homologicznej naprawy pęknięć DNA, polegającą na usunięciu endogennego białka BRCA1 z komórki za pomocą RNAi i zastąpieniu go mutantem punktowym BRCA1 zawierającym zmianę kodującą.

Identyfikacja wpływu mutacji BRCA1 na rekombinację homologiczną z wykorzystaniem komórek wykazujących endogenną ekspresję BRCA1 typu dzikiego

Ten film opisuje metodę przesiewową w celu identyfikacji transgenicznych muszek Drosophila, których genom został zmodyfikowany za pomocą CRISPR-Cas9. CRISPR-Cas9 to potężne narzędzie do edycji genomu, które zrewolucjonizowało sposób, w jaki naukowcy mogą manipulować genomem organizmu. W przykładowym protokole zobaczymy, jak zidentyfikować mutanty generowane przez CRISPR, w których insercja sekwencji transaktywacyjnej zastępuje pierwszy ekson genu bezgałęziowego (bnl), tworząc w ten sposób linię...

Badania przesiewowe pod kątem modyfikacji genomu: metoda identyfikacji mutantów generowanych przez CRISPR u Drosophila

Ten film wyjaśnia koncepcję edytorów zasad cytozynowych za pośrednictwem CRISPR do indukowania celowanej substytucji nukleotydów.

Narzędzia do edycji zasad za pośrednictwem CRISPR: technika edycji genomu w celu wywołania ukierunkowanej substytucji zasad

Wzbogacanie gDNA do sekwencjonowania NGS jest łatwym i potężnym narzędziem do badania mutacji konstytucyjnych. W tym artykule przedstawiamy procedurę analizy w prosty sposób pełnej sekwencji 11 genów biorących udział w naprawie uszkodzeń DNA.

Wzbogacanie gDNA za pomocą technologii opartej na transpozazie do analizy NGS całej sekwencji genów BRCA1, BRCA2 i 9 biorących udział w naprawie uszkodzeń DNA

Ten protokół opisuje przebieg pracy systemu edycji genów opartego na CRISPR/Cas9 do naprawy mutacji punktowych w komórkach ssaków. W tym przypadku stosujemy kombinatoryczne podejście do edycji genów ze szczegółową strategią eksperymentalną do pomiaru powstawania indel w miejscu docelowym - w istocie, analizując mutagenezę na miejscu.

Standardowa metodologia badania mutagenności na miejscu w funkcji naprawy mutacji punktowej katalizowanej przez CRISPR/Cas9 i SsODN w komórkach ludzkich

CRISPR-Cas to potężna technologia do inżynierii złożonych genomów roślin i zwierząt. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół skutecznej edycji ludzkiego genomu przy użyciu różnych endonukleaz Cas. Zwracamy uwagę na ważne kwestie i parametry projektowe, aby zoptymalizować wydajność edycji.

Edycja genomu w liniach komórkowych ssaków przy użyciu CRISPR-Cas

Celem tego protokołu jest umożliwienie bezproblemowej edycji genomu C. elegans za pomocą CRISPR/Cas9 przy użyciu złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych i markera co-CRISPR dpy-10 do badań przesiewowych. Protokół ten może być stosowany do dokonywania różnych modyfikacji genetycznych u C. elegans, w tym insercji, delecji, wymiany genów i podstawiania kodonów.

Edycja CRISPR/Cas9 genu rbm-3.2 C. elegans przy użyciu markera przesiewowego dpy-10 Co-CRISPR i złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych.

Ten protokół opisuje wysokoprzepustowy proces edycji genów CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) do analizy sieci klastrów mikroRNA, który pozwala na szybkie wygenerowanie panelu genetycznie zmodyfikowanych linii komórkowych zawierających unikalne kombinacje delecji członków klastra miRNA o wielkości 35 kb w jednym eksperymencie.

Narzędzie do edycji genów CRISPR do analizy sieci klastrów mikroRNA

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzić efektywną edycję zasady adeninowej bez ograniczeń PAM, aby zbudować precyzyjny model choroby danio pręgowanego za pomocą zSpRY-ABE8e.

Wydajna edycja bazy bez PAM do modelowania chorób genetycznych człowieka u danio pręgowanego za pomocą zSpRY-ABE8e

Istotną przeszkodą dla technologii takich jak CRISPR są zdarzenia niezgodne z celem, które mogą zakłócić działanie ważnych genów. "Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing" (CIRCLE-seq) jest techniką opracowaną w celu identyfikacji niezamierzonych miejsc rozszczepienia. Metoda ta mapuje aktywność CRISPR-Cas9 w całym genomie z wysoką czułością i bez uprzedzeń.

CIRCLE-Seq do badania edycji genów poza celem

Dostarczanie edytorów genomu jako RNA jest szczególnie skuteczną metodą modyfikacji genomów komórek pierwotnych ssaków i linii komórkowych. Celem tego protokołu jest dostarczenie edytorów genomu jako mRNA do pierwotnych komórek ssaków i linii komórkowych, po którym następuje ukierunkowane sekwencjonowanie i analiza Illumina w celu ilościowego określenia wyników edycji.

Edycja genomu w pierwotnych komórkach ssaków poprzez elektroporację edytora RNA

Poznaj metodę oceny funkcjonalnej wariantów BRCA1 za pomocą edytorów bazowych CRISPR. Technika ta pozwala na precyzyjne mutowanie endogennego genu, co umożliwia dokładniejszą predykcję ryzyka raka.

Ocena funkcjonalna wariantów BRCA1 za pomocą edytorów bazowych za pośrednictwem CRISPR

Przeglądaj więcej filmów