Ocena funkcjonalna wariantów BRCA1 za pomocą edytorów bazowych za pośrednictwem CRISPR

Dzięki skutecznej indukcji mutacji punktowych za pomocą edytora zasad cytozynowych za pośrednictwem CRISPR, można zidentyfikować funkcjonalność wariantów BRCA1, która jest ważna w zapobieganiu chorobom i diagnozowaniu. Zaletą tej techniki jest to, że bezpośrednio mutuje endogenną ekspresję BRCA1, co pozwala przezwyciężyć ograniczenia oceny funkcjonalnej przy użyciu egzogennej ekspresji BRCA1. Identyfikacja mutacji powodujących utratę funkcji BRCA1 może być wykorzystana do przewidywania prawdopodobieństwa wystąpienia nowotworów związanych z mutacjami BRCA1, takich jak rak piersi, jajnika, prostaty i trzustki.

Może być również używany do znajdowania potencjalnych celów leków poprzez poszukiwanie niezbędnych genów, których żywotność jest zmniejszona przez wyczerpanie funkcjonalne. Na początek uzyskaj sekwencję genomu BRCA1 z GenBank w NCBI i przeszukaj 20 miejsc docelowych par zasad za pomocą sekwencji motywu sąsiadującego z protospacerem, NGGNCCN, wokół interesującej mutacji. Mutacja, która jest przedmiotem zainteresowania, powinna być zlokalizowana w obrębie czterech do ośmiu nukleotydów w PAM-dystalnym końcu docelowych sekwencji przewodnika RNA.

Zamów dwa uzupełniające się oligonukleotydy na przewodnik RNA. W przypadku oligonukleotydów do przodu dodaj CACCG do końca 5' sekwencji prowadzącej, a dla oligonukleotydów odwrotnych dodaj AAC do końca 5' i C do końca 3'. Po otrzymaniu oligonukleotydów należy je ponownie zawiesić w wodzie destylowanej do końcowego stężenia 100 mikromolowych.

Wymieszaj dwa uzupełniające się oligonukleotydy do końcowego stężenia 10 mikromolów z buforem ligacyjnym T4 i podgrzej je do 95 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie schłodzić do temperatury pokojowej w celu wyżarzania. Trawić pRG2 za pomocą enzymu restrykcyjnego Bsa1 przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie uruchomić strawiony produkt na 1% żelu agarozowym i oczyścić pasmo o odpowiedniej wielkości. Zligować wyżarzony duplex oligonukleotydowy do wektora DNA za pomocą zakupionej ligazy DNA zgodnie z protokołem producenta i przekształcić je w komórki kompetentne DH5-alfa.

Dodać transformanty do płytki agarowej zawierającej 100 mikrogramów na mililitr ampicyliny i inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Oczyść DNA osocza z kilku transformantów i przeanalizuj ich przewodnikowe sekwencje RNA za pomocą sekwencjonowania Sangera ze starterami, które przygotowują promotor U6. Wysiewaj pięć razy od 10 do piątej komórki HAP1-BE3 na studzienkę na 24-dołkowych płytkach na dzień przed transfekcją i hoduj je, aby osiągnąć 70 do 80% konfluencji do transfekcji.

Transfect BRCA1 celuje w przewodnikowe RNA za pomocą zakupionych odczynników do transfekcji zgodnie z protokołem producenta. Użyj jednego mikrograma przewodnika RNA BRCA1, aby indukować konwersję CG do TA w miejscach docelowych BRCA1, a następnie inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i subkulturować co trzy do czterech dni. Zbierz granulki komórek trzy, 10 i 24 dni po transfekcji, aby przeanalizować wydajność edycji bazy.

Ekstrakcja genomowego DNA za pomocą zestawu do oczyszczania genomowego DNA. Zaprojektuj pierwsze startery PCR do amplifikacji miejsc docelowych BRCA1. Chociaż nie ma ograniczeń co do wielkości pierwszego produktu PCR, zaleca się rozmiar produktu mniejszy niż jeden kilozasad, aby skutecznie amplifikować określony region.

Zaprojektuj drugie startery PCR znajdujące się wewnątrz pierwszego produktu PCR, biorąc pod uwagę rozmiar amplikonu zgodnie z długością odczytu NGS. Aby dołączyć niezbędne sekwencje do analizy NGS, dodaj dodatkowe sekwencje do końców 5' drugich starterów PCR. Amplifikacja miejsc docelowych BRCA1 na genomowym DNA uzyskanym z trzech punktów czasowych przy użyciu polimerazy o wysokiej wierności.

Do pierwszej reakcji PCR użyj 100 nanogramów genomowego DNA do amplifikacji w ciągu 15 cykli. Do drugiej reakcji PCR użyj jednego mikrolitra pierwszego produktu PCR do amplifikacji przez 20 cykli. Uruchom pięć mikrolitrów drugiego produktu PCR na 2% żelu agarozowym i potwierdź rozmiar.

Następnie dołącz niezbędne sekwencje do analizy NGS poprzez amplifikację drugiego produktu PCR przy użyciu starterów wymienionych w rękopisie tekstowym. Amplifikuj każdą próbkę za pomocą różnych zestawów starterów. Użyj jednego mikrolitra drugiego produktu PCR do 30 cykli amplifikacji za pomocą polimerazy o wysokiej wierności.

Uruchom pięć mikrolitrów produktu PCR na 2% żelu agarozowym, aby potwierdzić rozmiar i oczyścić amplikon za pomocą komercyjnego zestawu do czyszczenia PCR. Wymieszaj każdą próbkę w równych ilościach, aby utworzyć bibliotekę NGS. Określić ilościowo bibliotekę NGS za pomocą spektrofotometru i rozcieńczyć ją do stężenia jednego nanomola za pomocą buforu do reskrypcji lub 10 milimolowych Tris-HCl przy pH 8,5.

Przygotować 100 mikrolitrów biblioteki rozcieńczonej do odpowiedniego stężenia wsadowego. Jako kontrola połączono PhiX z rozcieńczoną próbką. Załaduj bibliotekę na kartridżę i uruchom NGS zgodnie z protokołem producenta.

Uzyskaj ponad 10 000 odczytów na docelowy amplikon w celu dogłębnej analizy podstawowej wydajności edycji. Protokół ten został wykorzystany do przeprowadzenia oceny funkcjonalnej endogennych wariantów BRCA1 generowanych przez edytory zasad cytozyny oparte na CRISPR. CAS-9 i przewodnikowe RNA transfekowano do linii komórkowych HAP1 w celu zakłócenia BRCA1, a także analizowano częstość mutacji.

Częstość mutacji zmniejszyła się znacznie w czasie w liniach komórkowych HAP1, co wskazuje, że BRCA1 jest niezbędnym genem dla żywotności komórek w tych komórkach. Aby zbadać, czy warianty podstawione od CG do TA wpływają na funkcję BRCA1, plazmidy DNA i kodujące RNA prowadzące, które mogą indukować każdą mutację, zostały transfekowane tak, aby miały linie komórkowe HAP1-BE3. Przeanalizowano też częstości substytucji.

Względne częstości substytucji 3598C do T, patogennego wariantu, który indukuje mutację nonsensowną, dramatycznie się zmniejszyły. Natomiast te od 4527C do T, łagodnego wariantu, który indukuje mutację nonsensowną, pozostały podobne z czasem. Stwierdzono, że częstość substytucji nukleotydów tych trzech wariantów zmniejszała się w sposób zależny od czasu.

Ponieważ konieczne jest uzyskanie wysokiej początkowej częstości mutacji, aby wyraźnie rozpoznać zmianę żywotności komórek wraz z upływem daty, priorytetem jest ustalenie zoptymalizowanych warunków transfekcji. Procedura ta może być stosowana do weryfikacji innych nieznanych wariantów genetycznych, takich jak BRCA VUS. Może dostarczyć wskazówek na temat patogenności nieznanych wariantów pochodzących od pacjentów i ich leczenia.