Różnicowanie monocytów w fenotypowo odrębne makrofagi po leczeniu egzosomami pochodzącymi z ludzkich komórek macierzystych krwi pępowinowej (CB-SC)

Terapia Stem Cell Educator została opracowana w celu leczenia cukrzycy typu I i innych chorób autoimmunologicznych. Metoda ta została opracowana w celu zbadania mechanizmu molekularnego leżącego u podstaw moderacji immunologicznej terapii Stem Cell Educator za pomocą egzosomów uwalnianych przez CB-SC. Protokół ten zawiera wskazówki, jak oczyszczać egzosomy z hodowli ludzkich komórek macierzystych krwi pępowinowej i określać ich immunologiczną modulację monocytów.

Procedurę zademonstruje Wei Hu, doktorant z mojego laboratorium. Na początek należy trzykrotnie odwirować kondycjonowaną pożywkę pochodzącą z CB-SC, zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym, zbierając supernatant do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów po każdym odwirowaniu. Po trzecim odwirowaniu przefiltrować otrzymany supernatant filtrem o pojemności 0,22 mikrolitra i przenieść 15 mililitrów pożywki do każdej 10 kilodaltonowej jednostki filtra odśrodkowego.

Wiruje przy 4 000 x g przez 30 minut w celu wyizolowania skoncentrowanej pożywki egzosomowej. Przenieś skoncentrowane egzosomy do probówki ultrawirówkowej. Następnie granuluj egzosomy w temperaturze 100 000 x g przez 80 minut w czterech stopniach Celsjusza.

Następnie wyrzuć supernatant i ponownie zawieś granulowane egzosomy w 10 mililitrach PBS. Wykonaj końcowe ultrawirowanie, aby zebrać osad egzomu i ponownie zawiesić go w 200 mikrolitrach PBS. Dodaj 30 milionów ludzkich PBMC do 15-mililitrowej probówki i odwiruj przy 300 x g przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza.

Ponownie zawieś komórki w 300 mikrolitrach zimnego PBS i dodaj 60 mikrolitrów mikrogranulek CD14. Dobrze wymieszaj i inkubuj komórki na lodzie przez 15 minut. Dodaj jeszcze sześć mililitrów zimnego PBS i wiruj przy 300 x g przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza.

Następnie ponownie zawieś granulowane komórki w 500 mikrolitrach buforu do pracy na zimno. Umieść kolumnę separacyjną w separatorze magnetycznym i umyj ją trzykrotnie dwoma mililitrami buforu do pracy na zimno. Przenieś zawieszone komórki do kolumny rozdzielającej i pozwól im przejść.

Ponownie umyj kolumnę trzy razy dwoma mililitrami buforu na pranie. Następnie podnieś kolumnę z separatora magnetycznego i umieść ją na 15-mililitrowej probówce wirówkowej na lodzie. Eluować komórki CD14 dodatnie za pomocą dwóch mililitrów buforu do pracy na zimno i odwirowywać przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu osadzenia komórek.

Ponownie zawiesić osad w dwóch mililitrach zimnego chemicznego podłoża surowicy zdefiniowanej i przenieść 50 mikrolitrów do 1,5 mililitrowej probówki. Otrzymane komórki należy wybarwić 10 mikrolitrami przeciwciał monoklonalnych anty-ludzkich CD14 sprzężonych z Krome Orange przez 20 minut. Dodaj jeden mililitr PBS i wiruj przy 300 x g przez 10 minut, aby granulować komórki.

Ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 mikrolitrach PBS i przenieść go do pięciomililitrowej probówki. Określić czystość monocytów CD14+ za pomocą cytometrii przepływowej. Wysiewaj milion otrzymanych oczyszczonych monocytów na sześciodołkowej płytce poddanej działaniu kultur tkankowych i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla.

Po inkubacji odrzucić supernatant i delikatnie dodać dwa mililitry wstępnie podgrzanej, chemicznej, zdefiniowanej pożywki hodowlanej bez surowicy o temperaturze 37 stopni, a następnie dodać 80 mikrogramów egzosomów pochodzących z CB-SC do kultury monocytów na sześciodołkowej płytce o całkowitej objętości dwóch mililitrów. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% dwutlenkiem węgla przez trzy do czterech dni. Następnie zobrazuj morfologię komórki za pomocą odwróconego mikroskopu przy 200-krotnym powiększeniu.

Dodaj jeden mililitr buforu dysocjacji komórek na bazie PBS, aby odłączyć komórki poprzez pipetowanie w górę iw dół, a następnie zebrać pozostałe komórki za pomocą skrobaka do komórek. Zebrać komórki, odwirowując przy 1 690 x g przez pięć minut i ponownie zawiesić je w 200 mikrolitrach PBS. Dodaj pięć mikrolitrów blokera FC, aby zablokować niespecyficzne wiązanie, a następnie dodaj przeciwciała.

Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Dodaj jeden mililitr PBS do inkubowanych komórek i odwiruj je przy 300 x g przez 10 minut. Zawiesić osad w 200 mikrolitrach PBS i dodać pięć mikrolitrów jodku propidium na próbkę.

Przenieś komórki do nowej pięciomililitrowej rurki przepływowej i wykonaj cytometrię przepływową, aby ocenić poziomy ekspresji CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 i CD209. Fenotyp i czystość CB-SC badano za pomocą cytometrii przepływowej z markerami związanymi z CB-SC. Analiza wykazała wysokie poziomy ekspresji CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 i galektyny 9, ale nie zaobserwowano ekspresji CD34.

Analiza cytometrii przepływowej potwierdza również ekspresję markerów specyficznych dla egzomu, CD9, CD 81 i CD63 na egzosomach pochodzących z CB-SC. Morfologię wielkości egzosomów scharakteryzowano za pomocą TEM, a rozkład wielkości określono za pomocą DLS. Western blot dodatkowo dowodzi ekspresji markera związanego z egzomem Alix bez ekspresji markera związanego z ER, kalneksyny.

Bezpośrednią interakcję znakowanego Dio CB-SC-Exo z PBMC zaobserwowano przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Aby lepiej określić, która populacja komórek wchodzi w interakcję z tarczą oznaczoną jako CB-SC-Exo, różne przedziały komórkowe zostały bramkowane markerami specyficznymi dla komórek, takimi jak CD3 dla limfocytów T, CD11C dla mieloidalnych komórek dendrytycznych, CD14 dla monocytów, CD19 dla komórek B i CD56 dla komórek NK. Monocyty były przede wszystkim celem egzosomów pochodzących z CB-SC, ponieważ wykazywały wyższą medianę intensywności fluorescencji niż inne komórki odpornościowe.

Monocyty traktowane egzosomem z powodzeniem różnicowały się w morfologie wrzecionowate. Stwierdzono wzrost poziomu markerów związanych z M2, takich jak CD163, CD206 i CD209 po leczeniu egzosomami pochodzącymi z CB-SC. Porównanie fenotypowe między konwencjonalnymi makrofagami M2 a makrofagami M2 indukowanymi egzomem CB-SC nie wykazało istotnych różnic.

Kluczowym krokiem w tym protokole jest dodanie egzosomów pochodzących z CB-SC do monocytu kultury na sześciodołkowej płytce i inkubacja przez trzy do czterech dni, co było potrzebne do różnicowania komórki do innych makrofagów typu 2 o morfologii wrzecionowatej. Następnie zamierzamy zbadać składniki molekuł wewnątrz egzosomów pochodzących z CB-SC, które przyczyniły się do indukcji różnicowania monocytów do makrofagów typu 2.