Name: Różnicowanie monocytów w fenotypowo odrębne makrofagi po leczeniu egzosomami pochodzącymi z ludzkich komórek macierzystych krwi pępowinowej (CB-SC) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Poznaj protokół izolacji egzosomów z komórek macierzystych krwi pępowinowej i ich wpływ na różnicowanie monocytów w makrofagi M2. Metoda ta wspiera badania nad immunomodulacją w medycynie regeneracyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Panu Poddarowi i Panu Ludwigowi za hojne wsparcie finansowe za pośrednictwem Fundacji Hackensack UMC. Doceniamy Laurę Zhao za redakcję w języku angielskim.

<ol><li>Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+educator+therapy+and+induction+of+immune+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Diabetes+Reports%22%5BJournal%5D)">Stem cell educator therapy and induction of immune balance.</a> Current Diabetes Reports. 12 (5), 517-523 (2012).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+type+1+diabetes+via+islet+beta+cell+regeneration+following+immune+modulation+by+cord+blood-derived+multipotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells.</a> BMC Medicine. 10 (1), 3(2012).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+insulin+resistance+in+type+2+diabetes+via+immune+modulation+of+cord+blood-derived+multipotent+stem+cells+%28CB-SCs%29+in+stem+cell+educator+therapy%3A+phase+I%2FII+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medicine%22%5BJournal%5D)">Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial.</a> BMC Medicine. 11, 160(2013).</li>
<li>Delgado, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+autoimmune+T-cell+memory+by+stem+cell+educator+therapy%3A+phase+1%2F2+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Modulation of autoimmune T-cell memory by stem cell educator therapy: phase 1/2 clinical trial.</a> EBioMedicine. 2 (12), 2024-2036 (2015).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+regrowth+in+alopecia+areata+patients+following+Stem+Cell+Educator+therapy+BMC%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine%22%5BJournal%5D)">Hair regrowth in alopecia areata patients following Stem Cell Educator therapy BMC.</a> Medicine. 13 (1), 87(2015).</li>
<li>Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+secretion%2C+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+And+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annual Review of Cell And Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).</li>
<li>Abak, A., Abhari, A., Rahimzadeh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+in+cancer%3A+small+vesicular+transporters+for+cancer+progression+and+metastasis%2C+biomarkers+in+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Exosomes in cancer: small vesicular transporters for cancer progression and metastasis, biomarkers in cancer therapeutics.</a> PeerJ. 6, 4763(2018).</li>
<li>Adamiak, M., Sahoo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+in+myocardial+repair%3A+advances+and+challenges+in+the+development+of+next-generation+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Exosomes in myocardial repair: advances and challenges in the development of next-generation therapeutics.</a> Molecular Therapy. 26 (7), 1635-1643 (2018).</li>
<li>Akyurekli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+review+of+preclinical+studies+on+the+therapeutic+potential+of+mesenchymal+stromal+cell-derived+microvesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Review+and+Report%22%5BJournal%5D)">A systematic review of preclinical studies on the therapeutic potential of mesenchymal stromal cell-derived microvesicles.</a> Stem Cell Review and Report. 11 (1), 150-160 (2015).</li>
<li>Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Released+exosomes+contribute+to+the+immune+modulation+of+cord+blood-derived+stem+cells+%28CB-SC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Released exosomes contribute to the immune modulation of cord blood-derived stem cells (CB-SC).</a> Frontiers in Immunology. (11), 165(2020).</li>
<li>Jacobson, G., Kårsnäs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Important+parameters+in+semi-dry+electrophoretic+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Important parameters in semi-dry electrophoretic transfer.</a> Electrophoresis. 11 (1), 46-52 (1990).</li>
<li>Dykstra, M. J., Reuss, L. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDykstra%2C+MJ+%22Biological+Electron+Microscopy%3A+Theory%2C+Techniques%2C+and+Troubleshooting%22">Biological Electron Microscopy: Theory, Techniques, and Troubleshooting</a>. , Springer Science & Business Media. (2011).</li>
<li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+extracellular+vesicles%3A+general+methodologies+and+latest+trends%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends.</a> BioMed Research International. 2018, 8545347(2018).</li>
<li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+sample+collection%2C+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li>
<li>Orecchioni, M., Ghosheh, Y., Pramod, A. B., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization%3A+different+gene+signatures+in+M1%28LPS%2B%29+vs.+classically+and+M2%28LPS-%29+vs.+alternatively+activated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization: different gene signatures in M1(LPS+) vs. classically and M2(LPS-) vs. alternatively activated macrophages.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1084(2019).</li>
</ol>

Dr Zhao jest założycielem Tianhe Stem Cell Biotechnology Inc. Dr Zhao jest wynalazcą technologii Stem Cell Educator. Wszyscy pozostali autorzy nie mają żadnych interesów finansowych, które mogą mieć związek ze zgłoszoną pracą.

Zastosowanie egzosomów to rozwijająca się dziedzina diagnostyki klinicznej, opracowywania leków i medycyny regeneracyjnej. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół dotyczący przygotowania egzosomów pochodzących z CB-SC oraz badania funkcjonalnego egzosomów na różnicowanie ludzkich monocytów. Obecny protokół wykazał, że funkcjonalne egzosomy pochodzące z CB-SC są izolowane przez sekwencyjne wirowanie i ultrawirowanie o wysokiej czystości i wykazujące modulację immunologiczną na monocytach.
<p class="jove_conte...

Komórki macierzyste krwi pępowinowej (CB-SC) są unikalnym typem komórek macierzystych zidentyfikowanych na podstawie ludzkiej krwi pępowinowej i różnią się od innych znanych typów komórek macierzystych, takich jak mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) i hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC)1. Opierając się na ich unikalnych właściwościach modulacji immunologicznej i zdolności do ścisłego przylegania do powierzchni szalek Petriego, opracowaliśmy nową technologię oznaczoną jako terapia Stem Cell Educator (SCE) w badaniach klinicznych2,3. Podczas terapii SCE komórki jednojądrzaste krwi obwodowej pacjenta (PBMC) są pobierane i krążą przez separator komórkowy i są hodowane wspólnie z przylegającym CB-SC in vitro. Te "wykształcone" komórki (PBMC traktowane CB-SC) są następnie zwracane do krążenia pacjenta w systemie zamkniętej pętli. Badania kliniczne wykazały już kliniczne bezpieczeństwo i skuteczność terapii SCE w leczeniu chorób autoimmunologicznych, w tym cukrzycy typu 1 (T1D)2,4 i łysienie plackowate (AA)5.
Egzosomy to rodzina nanocząstek o średnicach 30\u2012150 nm i występująca we wszystkich pożywkach do hodowli biopłynów i komórek6. Egzosomy są wzbogacone wieloma bioaktywnymi cząsteczkami, w tym lipidami, mRNA, białkami i mikroRNA (miRNA), i odgrywają ważną rolę w komunikacji międzykomórkowej. Ostatnio egzosomy stały się bardziej atrakcyjne dla badaczy i firm farmaceutycznych ze względu na ich potencjał terapeutyczny w klinikach7,8,9. Ostatnio nasze badania mechanistyczne wykazały, że egzosomy uwalniane przez CB-SC przyczyniają się do modulacji immunologicznej terapii SCE10.
Tutaj opisujemy protokół badania mechanizmu terapii SCE ukierunkowanej na monocyty przez egzosomy uwalniane przez CB-SC. Po pierwsze, egzosomy uwolnione przez CB-SC wyizolowano z kondycjonowanych pożywek pochodzących z CB-SC przy użyciu metod ultrawirowania i zwalidowano za pomocą cytometrii przepływowej, western blot (WB) i dynamicznego rozpraszania światła (DLS). Po drugie, egzosomy pochodzące z CB-SC zostały oznaczone zielonym fluorescencyjnym barwnikiem lipofilowym: Dio. Po trzecie, hodowano je wspólnie z PBMC w celu zbadania dodatniego odsetka egzosomów pochodzących z CB-SC znakowanych Dio w różnych subpopulacjach PBMC za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół ten zawiera wskazówki do badania działania egzosomów leżących u podstaw modulacji immunologicznej komórek macierzystych.

<table><tbody><tr><td>Probówka do mikrowirówek 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Probówka stożkowa 15 ml</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka</td><td>Falcon</td><td>351147</td><td>Kultura nietkankowa płytka</td></tr><tr><td>3,3'-Diostadecyloxacarbocyanina(Dio)</td><td>Millipore sigma</td><td>D4292-20MG</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 & st.; </td></tr><tr><td>C 300 Mesh Grids</td><td>Ted Pella</td><td>1GC300</td><td></td></tr><tr><td>Probówka stożkowa 50 ml</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td>Płytka do hodowli tkankowej</td></tr><tr><td>96-dołkowa</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td>Płytka do hodowli tkankowej</td></tr><tr><td>ACK Liza Buffer</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Amicon-15 10kDa Wirówka Fliter</td><td>Millipore sigma</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human Alix</td><td>Biolegend</td><td>634501</td><td>sklep w 4 > C, RRID: AB_2268110</td></tr><tr><td>Anti-Human Calnexin</td><td>Biolegend</td><td>699401</td><td>sklepie w temperaturze 4 & C, RRID: AB_2728519</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ludzkie CD11c, Pe-Cy7</td><td>BD Bioscience</td><td>561356</td><td>przechowywać w temperaturze 4 & deg; C, RRID: AB_10611859</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ludzkie CD14, Karma Orange</td><td>Beckman Coulter</td><td>B36294</td><td>przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C, RRID: AB_2728099</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ludzkie CD163, PE</td><td>BD Bioscience</td><td>556018</td><td>przechowywać w temperaturze 4 stopni; C, RRID: AB_396296</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ludzkie CD19, PC5</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM2643U</td><td>przechowywać w temperaturze 4 stopni; C, RRID: AB_131160</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ludzkie CD206, FITC</td><td>BD Bioscience</td><td>551135</td><td>przechowywać w temperaturze 4 stopni; C, RRID: AB_394065</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ludzkie CD209, Brilliant Violet 421</td><td>BD Bioscience</td><td>564127</td><td>przechowywać w temperaturze 4 stopni; C, RRID: AB_2738610</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ludzkie CD270, PE</td><td>Biolegend</td><td>318806</td><td>przechowywać w temperaturze 4 stopni; C, RRID: AB_2203703</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ludzkie CD3, Pacfic Blue</td><td>Biolegend</td><td>300431</td><td>przechowywać w temperaturze 4 stopni; C, RRID: AB_1595437</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ludzkie CD34, APC</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM2427U</td><td>przechowywać w temperaturze 4 stopni; C, RRID: N/A Przeciwciało</td></tr><tr><td>anty-ludzkie CD4, APC</td><td>BD Bioscience</td><td>555349</td><td>przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C, RRID: AB_398593</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ludzkie CD45, Pe-Cy7</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM3548U</td><td>przechowywać w temperaturze 4 stopni; C, RRID: AB_1575969</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ludzkie CD56, PE</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM2073U</td><td>przechowywać w temperaturze 4 stopni; C, RRID: AB_131195</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ludzkie CD63, PE</td><td>BD Bioscience</td><td>561925</td><td>przechowywać w temperaturze 4 stopni; C, RRID: AB_10896821</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ludzkie CD8, APC-Alexa Fluor 750</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94686</td><td>przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C, RRID: N/A Przeciwciało</td></tr><tr><td>anty-ludzkie CD80, APC</td><td>Beckman Coulter</td><td>B30642</td><td>przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C, RRID: N/A Przeciwciało</td></tr><tr><td>anty-ludzkie CD81, FITC</td><td>BD Bioscience</td><td>561956</td><td>przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C, RRID: AB_394049</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ludzkie CD86, APC-Alexa Fluor 750</td><td>Beckman Coulter</td><td>B30646</td><td>przechowywać w 4 & stopniach; C, RRID: N/A Przeciwciało</td></tr><tr><td>anty-ludzkie CD9, FITC</td><td>ThermoScientic</td><td>MA5-16860</td><td>przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C, RRID: AB_2538339</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ludzkiej galektyny 9, Brilliant Violet 421</td><td>Biolegend</td><td>348919</td><td>przechowywać w temperaturze 4 stopni; C, RRID: AB_2716134</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ludzkie OCT3/4, eFluor660</td><td>ThermoScientic</td><td>50-5841-82</td><td>przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C, RRID: AB_11218882</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ludzkie SOX2, Alexa Fluor 488</td><td>ThermoScientic</td><td>53-9811-82</td><td>przechowywać w 4 & stopni; C, RRID: AB_2574479</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek BCA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Millipore Sigma</td><td>A1933</td><td></td></tr><tr><td>Płaszcz Buffy</td><td>New York Blood Center</td><td></td><td>40-60 ml / jednostkę</td></tr><tr><td>Skrobak do komórek</td><td>Falcon</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowa półmikrokuweta</td><td>VWR</td><td>97000590</td><td></td></tr><tr><td>Bufor dysocjacyjny</td><td>Gibco</td><td>131510014</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Preparaty do liczenia komórek Dual-1450015</td><td></td><td></td><td>Chanber Odczynnik do</td> wykrywania</tr><tr><td>egzosomów i ludzkich CD63</td><td>Bio-Rad Scientific</td><td>10606D</td><td>przechowywać w temperaturze 4 stopni; C</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS gęstość wspaniała pożywka</td><td>GE Health</td><td>17-1440-03</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Rotor o stałym kącie nachylenia (25&deg;)</td><td>Thermo Scientifc</td><td>75003698</td><td>Maxium 24 700 x g</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy Gallios</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>3 lasery 10 Color Max</td></tr><tr><td>Ludzka krew pępowinowa</td><td>Cryo-Cell International</td><td></td><td>40-100 ml / jednostkę</td></tr><tr><td>Ludzki blok Fc BD</td><td>Bioscience</td><td>564220</td><td>przechowywać pod adresem 4 & st.; C</td></tr><tr><td>Membrana PVDF Immun-Blot</td><td>Bio-Rad</td><td>1620177</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP Filtr strzykawkowy, 0,22 i mikro; m</td><td>Millipore Sigma</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90 Ultracentrówka</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna MP4</td><td>BioExpress</td><td>S-3500-1</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010049</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Jodek propidium</td><td>BD Bioscience</td><td>56-66211E</td><td>przechowywać w 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Mikroskop Nikon Eclipse Ti2</td><td>Instrumenty Nikon Inc</td><td>Eclipse Ti2</td><td>Wersja oprogramowania NIS-Elements 5.11.02</td></tr><tr><td>Hochest 33342</td><td>Thermo Scientifc</td><td>62249</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Revert microsopy</td><td>Fisher scientific</td><td>12563518</td><td></td></tr><tr><td>Rotor 41 Ti</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td>Maxium 41 000 obr./min</td></tr><tr><td>Wirówka Sorvall St 16R Thermo</td><td> Scientifc</td><td>75004381</td><td></td></tr><tr><td>Wahadłowy wirnik kubełkowy</td><td>Thermo Scientifc</td><td>75003655</td><td></td></tr><tr><td>TC-20 licznik komórek</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2 ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transmisyjna mikroskopia elektronowa</td><td>JEOL</td><td>JEM-2100 PLUS</td><td></td></tr><tr><td>Probówka ultrawirówkowa</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>X'VIVO 15 Pożywka bez surowicy</td><td>Lonza</td><td>BEBP04-744Q</td><td>1000 ml Pożywka hodowlana, przechowywać w temperaturze 4 stopni; Z</td></tr></tbody></table>

różnicowanie monocytów w fenotypowo odrębne makrofagi po leczeniu egzosomami pochodzącymi z ludzkich komórek macierzystych krwi pępowinowej (cb-sc)

Differentiation of Monocytes into Phenotypically Distinct Macrophages After Treatment with Human Cord Blood Stem Cell (CB-SC)-Derived Exosomes

Terapia Edukatora Komórek Macierzystych (SCE) jest nowatorskim podejściem klinicznym do leczenia cukrzycy typu 1 i innych chorób autoimmunologicznych. Terapia SCE polega na krążeniu komórek jednojądrzastych krwi izolowanego pacjenta (np. limfocytów i monocytów) przez maszynę do aferezy, kohodowli komórek jednojądrzastych krwi pacjenta z przylegającymi komórkami macierzystymi pochodzącymi z krwi pępowinowej (CB-SC) w urządzeniu SCE, a następnie zwraca te "wykształcone" komórki odpornościowe do krwi pacjenta. Egzosomy to nano-rozmiarowe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe o długości fali od 30 do 150 nm występujące we wszystkich płynach biologicznych i pożywkach do hodowli komórkowych. Aby dokładniej zbadać mechanizmy molekularne leżące u podstaw terapii SCE i określić działanie egzosomów uwalnianych z CB-SC, badamy, które komórki fagocytują te egzosomy podczas leczenia CB-SC. Poprzez wspólną hodowlę egzosomów pochodzących z CB-SC znakowanych Dio z ludzkimi komórkami jednojądrzastymi krwi obwodowej (PBMC), stwierdziliśmy, że egzosomy pochodzące z CB-SC były głównie pobierane przez ludzkie monocyty CD14-dodatnie, co prowadzi do różnicowania monocytów w makrofagi typu 2 (M2), o wrzecionowatej morfologii i ekspresji powierzchniowych markerów molekularnych związanych z M2. W tym miejscu przedstawiamy protokół izolacji i charakterystyki egzosomów pochodzących z CB-SC oraz protokół kohodowli egzosomów pochodzących z CB-SC z ludzkimi monocytami i monitorowania różnicowania M2.

Wstępnie fenotyp i czystość CB-SC zbadano za pomocą cytometrii przepływowej z wykorzystaniem markerów związanych z CB-SC, takich jak wspólny antygen leukocytarny CD45 oraz specyficzne dla komórek ES czynniki transkrypcyjne OCT3/4 i SOX2. CB-SC wykazują wysoki poziom ekspresji CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 i galektyny 9, lecz brak ekspresji CD34 (Rysunek 1A). Analiza cytometryczna potwierdziła ekspresję markerów specyficznych dla egzosomów, w tym CD9, CD81 i CD63, na egzosomach pochodzących z CB-...

Aplikacja egzosomów to nowe narzędzie do opracowywania leków i medycyny regeneracyjnej. Ustanawiamy protokół izolacji egzosomów o wysokiej czystości, aby wyizolować egzosomy z nowo zidentyfikowanych komórek macierzystych zwanych CB-SC do badań mechanistycznych. Zajmujemy się również wspólną hodowlą egzosomów pochodzących z CB-SC z ludzkimi monocytami, co prowadzi do ich różnicowania w fenotypowo odrębne makrofagi.

Różnicowanie monocytów w fenotypowo odrębne makrofagi po leczeniu egzosomami pochodzącymi z ludzkich komórek macierzystych krwi pępowinowej (CB-SC)

Stem Cell Educator (SCE) therapy is a novel clinical approach for the treatment of type 1 diabetes and other autoimmune diseases. SCE therapy circulates ...

Terapia Stem Cell Educator została opracowana w celu leczenia cukrzycy typu I i innych chorób autoimmunologicznych. Metoda ta została opracowana w celu zbadania mechanizmu molekularnego leżącego u podstaw moderacji immunologicznej terapii Stem Cell Educator za pomocą egzosomów uwalnianych przez CB-SC. Protokół ten zawiera wskazówki, jak oczyszczać egzosomy z hodowli ludzkich komórek macierzystych krwi pępowinowej i określać ich immunologiczną modulację monocytów.Procedurę zademonstruje Wei Hu, doktorant z mojego laboratorium. Na początek należy trzykrotnie odwirować kondycjonowaną pożywkę pochodzącą z CB-SC, zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym, zbierając supernatant do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów po każdym odwirowaniu. Po trzecim odwirowaniu przefiltrować otrzymany supernatant filtrem o pojemności 0,22 mikrolitra i przenieść 15 mililitrów pożywki do każdej 10 kilodaltonowej jednostki filtra odśrodkowego.Wiruje przy 4 000 x g przez 30 minut w celu wyizolowania skoncentrowanej pożywki egzosomowej. Przenieś skoncentrowane egzosomy do probówki ultrawirówkowej. Następnie granuluj egzosomy w temperaturze 100 000 x g przez 80 minut w czterech stopniach Celsjusza.Następnie wyrzuć supernatant i ponownie zawieś granulowane egzosomy w 10 mililitrach PBS. Wykonaj końcowe ultrawirowanie, aby zebrać osad egzomu i ponownie zawiesić go w 200 mikrolitrach PBS. Dodaj 30 milionów ludzkich PBMC do 15-mililitrowej probówki i odwiruj przy 300 x g przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza.Ponownie zawieś komórki w 300 mikrolitrach zimnego PBS i dodaj 60 mikrolitrów mikrogranulek CD14. Dobrze wymieszaj i inkubuj komórki na lodzie przez 15 minut. Dodaj jeszcze sześć mililitrów zimnego PBS i wiruj przy 300 x g przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza.Następnie ponownie zawieś granulowane komórki w 500 mikrolitrach buforu do pracy na zimno. Umieść kolumnę separacyjną w separatorze magnetycznym i umyj ją trzykrotnie dwoma mililitrami buforu do pracy na zimno. Przenieś zawieszone komórki do kolumny rozdzielającej i pozwól im przejść.Ponownie umyj kolumnę trzy razy dwoma mililitrami buforu na pranie. Następnie podnieś kolumnę z separatora magnetycznego i umieść ją na 15-mililitrowej probówce wirówkowej na lodzie. Eluować komórki CD14 dodatnie za pomocą dwóch mililitrów buforu do pracy na zimno i odwirowywać przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu osadzenia komórek.Ponownie zawiesić osad w dwóch mililitrach zimnego chemicznego podłoża surowicy zdefiniowanej i przenieść 50 mikrolitrów do 1,5 mililitrowej probówki. Otrzymane komórki należy wybarwić 10 mikrolitrami przeciwciał monoklonalnych anty-ludzkich CD14 sprzężonych z Krome Orange przez 20 minut. Dodaj jeden mililitr PBS i wiruj przy 300 x g przez 10 minut, aby granulować komórki.Ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 mikrolitrach PBS i przenieść go do pięciomililitrowej probówki. Określić czystość monocytów CD14+ za pomocą cytometrii przepływowej. Wysiewaj milion otrzymanych oczyszczonych monocytów na sześciodołkowej płytce poddanej działaniu kultur tkankowych i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla.Po inkubacji odrzucić supernatant i delikatnie dodać dwa mililitry wstępnie podgrzanej, chemicznej, zdefiniowanej pożywki hodowlanej bez surowicy o temperaturze 37 stopni, a następnie dodać 80 mikrogramów egzosomów pochodzących z CB-SC do kultury monocytów na sześciodołkowej płytce o całkowitej objętości dwóch mililitrów. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% dwutlenkiem węgla przez trzy do czterech dni. Następnie zobrazuj morfologię komórki za pomocą odwróconego mikroskopu przy 200-krotnym powiększeniu.Dodaj jeden mililitr buforu dysocjacji komórek na bazie PBS, aby odłączyć komórki poprzez pipetowanie w górę iw dół, a następnie zebrać pozostałe komórki za pomocą skrobaka do komórek. Zebrać komórki, odwirowując przy 1 690 x g przez pięć minut i ponownie zawiesić je w 200 mikrolitrach PBS. Dodaj pięć mikrolitrów blokera FC, aby zablokować niespecyficzne wiązanie, a następnie dodaj przeciwciała.Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Dodaj jeden mililitr PBS do inkubowanych komórek i odwiruj je przy 300 x g przez 10 minut. Zawiesić osad w 200 mikrolitrach PBS i dodać pięć mikrolitrów jodku propidium na próbkę.Przenieś komórki do nowej pięciomililitrowej rurki przepływowej i wykonaj cytometrię przepływową, aby ocenić poziomy ekspresji CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 i CD209. Fenotyp i czystość CB-SC badano za pomocą cytometrii przepływowej z markerami związanymi z CB-SC. Analiza wykazała wysokie poziomy ekspresji CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 i galektyny 9, ale nie zaobserwowano ekspresji CD34.Analiza cytometrii przepływowej potwierdza również ekspresję markerów specyficznych dla egzomu, CD9, CD 81 i CD63 na egzosomach pochodzących z CB-SC. Morfologię wielkości egzosomów scharakteryzowano za pomocą TEM, a rozkład wielkości określono za pomocą DLS. Western blot dodatkowo dowodzi ekspresji markera związanego z egzomem Alix bez ekspresji markera związanego z ER, kalneksyny.Bezpośrednią interakcję znakowanego Dio CB-SC-Exo z PBMC zaobserwowano przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Aby lepiej określić, która populacja komórek wchodzi w interakcję z tarczą oznaczoną jako CB-SC-Exo, różne przedziały komórkowe zostały bramkowane markerami specyficznymi dla komórek, takimi jak CD3 dla limfocytów T, CD11C dla mieloidalnych komórek dendrytycznych, CD14 dla monocytów, CD19 dla komórek B i CD56 dla komórek NK. Monocyty były przede wszystkim celem egzosomów pochodzących z CB-SC, ponieważ wykazywały wyższą medianę intensywności fluorescencji niż inne komórki odpornościowe.Monocyty traktowane egzosomem z powodzeniem różnicowały się w morfologie wrzecionowate. Stwierdzono wzrost poziomu markerów związanych z M2, takich jak CD163, CD206 i CD209 po leczeniu egzosomami pochodzącymi z CB-SC. Porównanie fenotypowe między konwencjonalnymi makrofagami M2 a makrofagami M2 indukowanymi egzomem CB-SC nie wykazało istotnych różnic.Kluczowym krokiem w tym protokole jest dodanie egzosomów pochodzących z CB-SC do monocytu kultury na sześciodołkowej płytce i inkubacja przez trzy do czterech dni, co było potrzebne do różnicowania komórki do innych makrofagów typu 2 o morfologii wrzecionowatej. Następnie zamierzamy zbadać składniki molekuł wewnątrz egzosomów pochodzących z CB-SC, które przyczyniły się do indukcji różnicowania monocytów do makrofagów typu 2.

differentiation-monocytes-into-phenotypically-distinct-macrophages

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film opisuje metodę in vitro do generowania makrofagów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Wytwarzanie makrofagów z iPSC zachodzi w trzech etapach: (i) agregacja iPSC w zawiesinie w celu utworzenia trójwymiarowych ciał zarodkowych (EB), które różnicują się w komórki mezodermalne, (ii) tworzenie komórek prekursorowych makrofagów ze zróżnicowanych EB oraz (iii) różnicowanie komórek prekursorowych makrofagów w dojrzałe, funkcjonalne makrofagi.

Różnicowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych w makrofagi

Makrofagi pochodzące z monocytów są ważnymi komórkami wrodzonego układu odpornościowego. W tym miejscu opisujemy łatwy w użyciu model in vitro do generowania tych komórek. Korzystając z wirowania gradientowego, izolacji ujemnych kulek i określonych warunków hodowli komórek, można wygenerować makrofagi pochodzące z monocytów do badań fenotypowych i funkcjonalnych.

Model in vitro do badania heterogeniczności różnicowania i polaryzacji ludzkich makrofagów

Prezentujemy prosty i skuteczny protokół do generowania ludzkich makrofagów. Płaszcze kożuchowe są przetwarzane przez wirowanie gradientowe o podwójnej gęstości, a izolowane monocyty są następnie różnicowane do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem. Maksymalizuje to wydajność makrofagów i ułatwia pobieranie komórek do kolejnych eksperymentów.

Izolacja ludzkich monocytów przez wirowanie z podwójnym gradientem i ich różnicowanie do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem

Tutaj prezentujemy protokół, który generuje duże ilości mysich monocytów z heterogenicznego szpiku kostnego do zastosowań translacyjnych. W porównaniu z innymi, ta nowa metoda pomaga zmniejszyć liczbę uśmierconych zwierząt i obniżyć koszty, unikając kosztownych metod, takich jak magnetyczna separacja komórek o wysokim gradimencie (MACS).

Izolacja i wstrzyknięcie dożylne monocytów pochodzących ze szpiku kostnego myszy

Niedojrzałe komórki dendrytyczne mogą być selektywnie różnicowane w tolerogenne lub dojrzałe komórki dendrytyczne, aby regulować równowagę między odpornością a tolerancją. W pracy przedstawiono sposób generowania z niedojrzałych komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów (moDC), tolerogennych in vitro i dojrzałych moDC, które różnią się fenotypami metabolicznymi.

Wytwarzanie niedojrzałych, dojrzałych i tolerogennych komórek dendrytycznych o różnych fenotypach metabolicznych

Przedstawiono protokół dla hodowli komórkowej makrofagów makrofagów stymulujących tworzenie kolonii (M-CSF) zróżnicowanych ludzkich makrocytów pochodzących z monocytów. Protokół wykorzystuje krioprezerwację monocytów w połączeniu z ich masowym różnicowaniem do makrofagów. Następnie zebrane makrofagi można następnie wysiać w studzienkach hodowlanych o wymaganej gęstości komórek do przeprowadzenia eksperymentów.

Posiew czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów Zróżnicowane ludzkie makrofagi pochodzące z monocytów

To badanie porównuje dwie różne metody izolacji ludzkich monocytów w celu uzyskania in vitro komórek dendrytycznych (DC). Monocyty są selekcjonowane przez przyleganie lub ujemnie wzbogacane przez separację magnetyczną. Wydajność i żywotność monocytów wraz z żywotnością, proliferacją MDDC i ekspresją markera powierzchniowego CD11c/CD14 zostaną porównane między obiema metodami.

Charakterystyka ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów za pomocą obrazowania cytometrii przepływowej: porównanie dwóch protokołów izolacji monocytów

Tutaj prezentujemy protokół charakterystyki immunofenotypowej i indukowanego cytokinami różnicowania hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych CD34+ pochodzących z krwi pępowinowej do czterech linii szpikowych. Zastosowania tego protokołu obejmują badania nad wpływem mutacji choroby szpikowej lub małych cząsteczek na różnicowanie szpiku komórek CD34+.

Różnicowanie szpikowe ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych CD34+ pochodzących z krwi pępowinowej

Ten protokół opisuje solidne generowanie makrofagów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych oraz metody ich późniejszej charakterystyki. Ekspresja markerów powierzchniowych komórek, ekspresja genów i testy funkcjonalne są wykorzystywane do oceny fenotypu i funkcji tych makrofagów pochodzących z iPSC.

Produkcja i charakterystyka ludzkich makrofagów z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Osteoklasty są kluczowymi komórkami resorpcyjnymi kości w organizmie. Protokół ten opisuje wiarygodną metodę różnicowania in vitro osteoklastów z ludzkich monocytów krwi obwodowej. Metoda ta może być wykorzystana jako ważne narzędzie do lepszego zrozumienia biologii osteoklastów w homeostazie i chorobach.

Różnicowanie funkcjonalnych osteoklastów z monocytów CD14+ ludzkiej krwi obwodowej

Monocyty i makrofagi to bardzo plastyczne i reprogramowalne komórki odpornościowe, kluczowe dla zdrowia i choroby. Wyczuwają i reagują na szeroki zakres bodźców, przyjmując określone programy różnicowania i fenotypy. Ustandaryzowaliśmy model in vitro do badania polaryzacji i przeprogramowania makrofagów, zapewniając cenne narzędzie do badań.

Przeprogramowanie modelu ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów do testów in vitro

Poznaj protokół izolacji egzosomów z komórek macierzystych krwi pępowinowej i ich wpływ na różnicowanie monocytów w makrofagi M2. Metoda ta wspiera badania nad immunomodulacją w medycynie regeneracyjnej.

Różnicowanie monocytów w fenotypowo odrębne makrofagi po leczeniu egzosomami pochodzącymi z ludzkich komórek macierzystych krwi pępowinowej (CB-SC) (Wideo) | JoVE Journal

Różnicowanie monocytów w fenotypowo odrębne makrofagi po leczeniu egzosomami pochodzącymi z ludzkich komórek macierzystych krwi pępowinowej (CB-SC)

Przeglądaj więcej filmów