Obrazowanie żywych komórek w superrozdzielczości struktur subkomórkowych
13 stycznia 2021
Prezentowany tutaj jest protokół do obrazowania żywych komórek w nienaruszonej tkance w superrozdzielczości. Ustandaryzowaliśmy warunki obrazowania bardzo wrażliwej populacji dorosłych komórek macierzystych w ich natywnym środowisku tkankowym. Technika ta polega na zrównoważeniu rozdzielczości czasowej i przestrzennej, aby umożliwić bezpośrednią obserwację zjawisk biologicznych w żywej tkance.
Nasz protokół wykorzystuje regularne sondy fluoroforowe i proste techniki przygotowania próbek, które utrzymują obrazowaną komórkę w stanie fizjologicznym w celu zbadania wysoce dynamicznego procesu komórkowego i szczegółowych struktur subkomórkowych. Technika ta pozwala nam badać procesy komórkowe w super rozdzielczości i w warunkach fizjologicznych przez dłuższy czas bez poświęcania ani specjalnej lub tymczasowej rozdzielczości. Zacznij od pocięcia membrany dializacyjnej o masie cząsteczkowej od 12 do 14 kilodaltonów na małe kawałki i namoczenia kawałków w 100 mikrolitrach pożywki z żywych komórek przez około pięć minut.
Podczas moczenia membran pokrój zewnętrzny pierścień 50-mililitrowej rurki na małe kawałki i wysterylizuj kawałki w 70% etanolu. W celu wycięcia i zamontowania jąder przenieś dziesięć dwu- do trzydniowych, znieczulonych samców much do naczynia preparacyjnego pod mikroskopem preparacyjnym i użyj cienkich kleszczy do usunięcia jąder. Po zebraniu wszystkich jąder umyj je dwa razy w pożywce z żywych komórek i za pomocą końcówki pipety rozprowadź od 100 do 150 mikrolitrów pożywki z żywych komórek do przygotowanego naczynia ze szklanym dnem.
Użyj cienkich kleszczy, aby przenieść jądra muchy na środek naczynia i usuń wszystko, z wyjątkiem około 10 mikrolitrów pożywki. Szybko umieść wstępnie zwilżoną membranę na jądrach i umieść na membranie dwa do trzech małych plastikowych ciężarków. Natychmiast dodaj od 100 do 150 mikrolitrów świeżej pożywki z żywych komórek i umieść pierścień z powrotem na podwyższonej stronie naczynia.
Umieść szkiełko nakrywkowe z powrotem na pierścieniu i zakręć kawałkiem bibułki w wodzie przed umieszczeniem papieru na szkiełku nakrywkowym. Następnie przykryj naczynie pokrywką i zabezpiecz naczynie na stoliku mikroskopu o super rozdzielczości. W przypadku obrazowania komórek macierzystych linii zarodkowej otwórz oprogramowanie do obrazowania i włącz światło przechodzące.
Użyj obiektywu 63X, aby skupić się na tkance jąder i włączyć lasery. Kliknij Na żywo", aby zlokalizować rozrodcze komórki macierzyste. Dostosuj ostrość i kliknij Rozmiar ramki"aby ustawić rozmiar klatki w zakresie od 512 na 512 do 1024 na 1024 pikseli i Uśrednianie"aby ustawić średnią klatki na jeden lub dwa.
Kliknij Master Gain"aby ustawić wzmocnienie mnożenia elektronów na mniej niż 800, i Lasery"aby ustawić moc lasera na 1% do 2%Powiększ obszar lub komórkę zainteresowania, aby skrócić czas akwizycji obrazu i zmniejszyć wybielanie zdjęć, a także potwierdź, że obraz został optymalnie skonfigurowany przed kliknięciem Rozpocznij eksperyment"aby rozpocząć przechwytywanie obrazu poklatkowego. Jeśli Airyscan Acquisition nie jest skonfigurowany optymalnie, kliknij Optymalny"w rozmiarach ramki, Z-Stack i Obszar skanowania"sekcje i zoptymalizuj przedział czasu, liczbę wycinków Z i czas trwania obrazowania poklatkowego, zgodnie z projektem eksperymentalnym i typem próbki. Po zobrazowaniu wybierz Przetwarzanie, Przetwarzanie wsadowe i Przetwarzanie Airyscan, a następnie wybierz obrazy do przetworzenia.
Następnie kliknij Uruchom proces"aby uzyskać obrazy w super rozdzielczości. Obrazowanie żywych komórek jąder drosophila eksprymujących alfa-tubulinę GFP we wczesnym stadium rozwoju komórek rozrodczych przy użyciu mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem umożliwia wizualizację asymetrycznej intensywności sygnałów GFP w dwóch centrosomach, jako jaśniejszy sygnał w centrosomie macierzystym i stosunkowo słabszy sygnał w centrosomach potomnych. Różnica w jasności jest prawdopodobnie odzwierciedlona przez asymetrię czasową zarodkowania mikrotubul, ale szczegółowej morfologii i ilości mikrotubul nie można rozwiązać za pomocą mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem.
W przeciwieństwie do tego, obrazowanie w super rozdzielczości żywych komórek umożliwia wizualizację i kwantyfikację morfologii i liczby mikrotubul. Ta ulepszona rozdzielczość ujawnia również wzorce asymetrycznego zarodkowania mikrotubul, wydłużenia i zwiększonej interakcji z błoną jądrową. Obrazowanie żywych komórek pozwala również na wizualizację asymetrycznego wgłębienia błony jądrowej, ale nie pojedynczych mikrotubul, które bezpośrednio wchodzą do jądra.
W przeciwieństwie do tego, ta technika super rozdzielczości żywych komórek pozwala na bezpośrednią obserwację tych zdarzeń poprzez jednoczesne obrazowanie zarówno mikrotubul, jak i blaszki jądrowej. Podczas metafazy oba siostrzane centromery można wykryć jako jeden sygnał za pomocą mikroskopii wirującego dysku, chociaż nie można zaobserwować centralnego przyczepienia mikrotubul. W przeciwieństwie do tego, obrazowanie na żywo w super rozdzielczości umożliwia wizualizację przyczepienia centromerów mikrotubul we wczesnej fazie profazy.
Pamiętaj, aby umieścić membranę na jądrach, aby upewnić się, że nie poruszają się ani nie unoszą podczas obrazowania oraz aby zoptymalizować ustawienia mikroskopu, aby uniknąć wybielania zdjęć i fototoksyczności. Istnieje wiele sposobów zastosowania tej metody, takich jak badanie dynamiki białek, stresu liniowego lub mechanizmów obronnych i procesów komórkowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia metodę obrazowania żywych komórek w rozdzielczości super-rozdzielczej w nienaruszonym tkance, mającą na celu badanie dynamicznych procesów komórkowych w populacji dorosłych komórek macierzystych w ich naturalnym środowisku. Metoda ta zapewnia równowagę między rozdzielczością czasową a przestrzenną, aby efektywnie obserwować zjawiska biologiczne w żywej tkance.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Biologia komórki
- Mikroskopia
- Obrazowanie żywych komórek
Wstęp
- Znaczenie utrzymania warunków fizjologicznych podczas obrazowania
- Wyzwania związane z obserwacją dynamicznych procesów komórkowych
- Porównanie z tradycyjnymi technikami mikroskopowymi
Zastosowane metody
- Obrazowanie żywych komórek w superrozdzielczości
- Jądra Drosophila jako układ biologiczny
- Zastosowanie sond fluoroforowych i konfokalnej mikroskopii z dyskiem obrotowym
Główne wyniki
- Ulepszona wizualizacja dynamiki i morfologii mikrotubul
- Wykazanie asymetrycznej nukleacji mikrotubul oraz ich oddziaływań z błoną jądrową
- Umożliwienie obserwacji przyłączania centromerów podczas metafazy i profazy
Wnioski
- Niniejsze badanie wykazuje skuteczność obrazowania w superrozdzielczości w obserwacji dynamiki komórkowej.
- Opisana metoda znacząco przyczynia się do zrozumienia procesów komórkowych w biologii rozwoju.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Obrazowanie żywych komórek w tkankach nienaruszonych z nadrozdzielczością umożliwia wierną obserwację dynamicznych procesów subkomórkowych w warunkach fizjologicznych, co wypełnia krytyczną lukę w walidacji celów i ograniczaniu ryzyka mechanistycznego. Dzięki zachowaniu rozdzielczości przestrzennej i czasowej bez konieczności stosowania specjalistycznych sond lub silnego oświetlenia, metoda ta wspiera niezawodny screening fenotypowy oraz rozwój testów w systemach istotnych dla przebiegu chorób. Jej kompatybilność z endogennymi fluoroforami o niskiej intensywności rozszerza możliwość zastosowania w przepływach pracy na wczesnym etapie odkrywania leków, gdzie pewność co do celu i wartość prognostyczna są kluczowe.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia bezpośrednią wizualizację wiązania z celem oraz lokalizacji subkomórkowej w kontekście tkanki natywnej, co zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną.
- Wartość operacyjna: Wspiera testowanie hipotez dotyczących dynamiki białek i tworzenia kompleksów bez artefaktów utrwalania.
- Wartość translacyjna: Ułatwia ocenę wiarygodności celu w modelach istotnych dla przebiegu chorób, takich jak nisze komórek macierzystych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Zapewnia ilościowe odczyty morfologii mikrotubul, wzorców nukleacji i oddziaływań organelli w celu standaryzacji testu.
- Wartość operacyjna: Umożliwia obrazowanie time-lapse przy niskiej fototoksyczności, co wspiera podłużne kampanie przesiewowe.
- Wartość translacyjna: Generuje reprodukowalne dane o wysokiej zawartości (high-content), odpowiednie do walidacji trafień i optymalizacji związków wiodących.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Łączy etapy odkryć i badań przedklinicznych poprzez obserwację procesów komórkowych w nienaruszonej tkance w warunkach bliskich fizjologicznym.
- Wartość operacyjna: Pozwala na zachowanie morfologii tkanki i funkcji komórkowych podczas przedłużonego obrazowania, co wspiera badania podłużne.
- Wartość translacyjna: Umożliwia obserwacje powiązane z biomarkerami, takie jak przebudowa błony jądrowej i asymetria centrosomów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, dostarczając odczytów w superrozdzielczości, które wspierają decyzje dotyczące walidacji celu oraz identyfikacji związków wiodących przed podjęciem inwestycji w badania przedkliniczne.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia badanie dynamiki cytoszkieletu oraz oddziaływań nukleocytozolicznych w żywej tkance w oparciu o postawione hipotezy.
- Screening: Dostarcza ilościowe i powtarzalne wyniki obrazowania, odpowiednie do standaryzacji testów oraz oceny efektów działania związków.
- Analityka: Generuje zbiory danych w superrozdzielczości, umożliwiając kwantyfikację liczby mikrotubul, szybkości ich wydłużania oraz organizacji przestrzennej na potrzeby analiz porównawczych.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość obserwacji od poziomu subkomórkowego do fenotypów na poziomie tkanki w niszach komórek macierzystych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę obrazowania, którą można zastosować w różnych typach komórek i modelach chorób bez konieczności modyfikacji sond.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną poprzez wyjaśnienie mechanizmów subkomórkowych niewidocznych w mikroskopii ograniczonej dyfrakcją.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację dzięki immobilizacji preparatów, obrazowaniu przy niskiej mocy lasera oraz przepływom pracy w przetwarzaniu wsadowym.
- Wartość strategiczna: Redukuje odsetek niepowodzeń na późnych etapach poprzez poprawę wierności walidacji celów w kontekstach istotnych fizjologicznie.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia podejmowanie decyzji o rozwoju z uwzględnieniem ryzyka dzięki mechanicznemu ograniczaniu ryzyka w odniesieniu do celów cytoszkieletowych i nukleoszkieletowych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z żywą tkanką, mikroskopii superrozdzielczej oraz w procesach przetwarzania obrazu.
- Zależne od dostępu do systemów superrozdzielczych z funkcją Airyscan lub równoważną oraz komór z kontrolą środowiskową.
- Wymaga standaryzacji przygotowania preparatów, ich montowania oraz składu medium pomiędzy różnymi użytkownikami i ośrodkami.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metod do różnej kruchości tkanek, autofluorescencji oraz dostępności genetycznej poza jądrami Drosophila.
- Ograniczone potrzebą genetycznego znakowania celów kompatybilnymi fluoroforami, takimi jak EGFP lub mCherry, w locus endogennych.
