Name: Obrazowanie żywych komórek w superrozdzielczości struktur subkomórkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Poznaj metodę obrazowania żywych komórek w superrozdzielczości struktur subkomórkowych w tkance Drosophila. Technika umożliwia badanie dynamicznych procesów komórkowych przy zachowaniu warunków fizjologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Integrated Imaging Core na Uniwersytecie Johnsa Hopkinsa za mikroskopy i oprogramowanie do analizy danych. Dziękujemy J. Snedekerowi i Q. E. Yu za korektę i sugestie, a także członkom laboratorium X.C. za pomocne dyskusje i sugestie. Wspierany przez NIGMS/NIH R35GM127075, Instytut Medyczny Howarda Hughesa, Fundację Davida i Lucile Packardów oraz fundusze start-upowe Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa (X.C.).

1. Przygotowanie koktajlu obrazowania żywych komórek (żywe nośniki komórkowe)
<ol>
	<li>Uzupełnij pożywkę Drosophila firmy Schneider o 15% płodową surowicę bydlęcą (FBS) i 0,6x penicylinę/streptomycynę. Dostosuj pH do około 7,0.</li>
	<li>Tuż przed użyciem pożywki należy dodać insulinę do końcowego stężenia 200 μg/mL. 
	UWAGA: To podłoże ma kluczowe znaczenie dla utrzymania prawidłowego podziału komórek i rozwoju jądra Drosophila podczas obrazowania poklatkowego10,14.</li>
</ol>
2. Przygotowanie naczynia do hodowli komórek ze szklanym dnem
<ol>
	<li>Dla jądra Drosophila należy użyć naczynia do hodowli komórek ze szklanym dnem pokrytym poli L-lizyną o średnicy 35 mm. Wewnętrzna studzienka naczynia ma szklane dno o średnicy 23 mm i bok o rzędnej 1 mm (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A-a). 
	UWAGA: Wybierz miskę ze szklanym dnem, która pozwala na krótszą odległość roboczą, większą aperturę numeryczną i obiektyw o większym powiększeniu; Te cechy mają kluczowe znaczenie dla uzyskania obrazu o wysokiej rozdzielczości.</li>
	<li>Należy użyć membrany do dializy (MWCO: 12–14 kD), która umożliwia wymianę gazową. Pokrój membranę na małe kawałki. 
	UWAGA: Kawałki membrany powinny być mniejsze niż szklana powierzchnia naczynia, ale wystarczająco duże, aby przykryć próbkę.</li>
	<li>Namocz błonę w 100 μl żywej pożywki komórkowej przez ~5 min. Nie używaj suchej membrany na próbce, ponieważ może to ją uszkodzić. Membrana pomaga zapobiegać stresowi hipoksyjnemu.</li>
	<li>Przygotuj 2-3 lekkie kawałki szkła lub plastiku do nałożenia na membranę, aby tkanka nie unosiła się na wodzie. Aby to zrobić, najpierw weź zewnętrzny pierścień probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i pokrój go na małe kawałki. Następnie przed użyciem wysterylizuj kawałki 70% etanolem. 
	UWAGA: Ten krok zapewnia, że próbka pozostaje na powierzchni podczas obrazowania i nie unosi się na wodzie, co ma kluczowe znaczenie dla uzyskania optymalnych wyników.</li>
	<li>Przygotuj pierścień o średnicy ~25 mm i umieść go na podwyższonej stronie naczynia. Połóż na nim szkiełko nakrywkowe, aby wygenerować dwie komory. Dolna komora będzie zawierać próbkę, podczas gdy górna komora będzie służyć jako komora wilgotnościowa, aby zapobiec wysychaniu próbki.
	<ol>
		<li>Aby wykonać ten pierścień, odetnij zewnętrzny pierścień z probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, co pozwoli mu bezpiecznie zmieścić się na podwyższonej stronie naczynia o średnicy 35 mm. Podobny pierścień można wykonać w inny sposób, na przykład za pomocą gumki lub plastikowej opaski zaciskowej, aby dopasować się do podwyższonej strony naczynia, aby prawidłowo utrzymać szkiełko nakrywkowe bez ingerencji w próbkę. 
		UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie, szczególnie w przypadku próbek wrażliwych na naprężenia, takie jak warunki niedotlenienia oraz zmiany temperatury i wilgotności.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Sekcja jąder od samców much i montaż
<ol>
	<li>Weź ~10 młodych samców much (w wieku 2-3 dni) i wypreparuj jądra w pożywce z żywych komórek, aby uzyskać ~10 par dorosłych jąder Drosophila.
	<ol>
		<li>Wypreparuj muchy pod mikroskopem preparacyjnym w naczyniu separacyjnym za pomocą drobnych kleszczy. 
		UWAGA: Szczep Drosophila melanogaster (muszka owocowa) przenosi transgen UAS-α-tubulina-GFP napędzany przez wczesny sterownik komórek rozrodczych nanos-Gal4.</li>
		<li>Wygeneruj następujące szczepy Drosophila melanogaster przy użyciu technologii CRISPR-Cas9: Lamin-mCherry (znacznik C-końcowy) i CENP-A-Dendra2-CENP-A [znacznik w miejscu wewnętrznym (między 118. a 119. kodonem). 
		UWAGA: Chociaż do każdego eksperymentu potrzebne jest tylko jedno jądro doskonałej jakości, zamontowanie wystarczającej liczby tkanek (15-20) lub komórek zapewni, że będzie co najmniej jedna zdrowa próbka z doskonałymi sygnałami fluorescencyjnymi do obrazowania poklatkowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyj jądra dwukrotnie w pożywce z żywych komórek w naczyniu separacyjnym.
	<ol>
		<li>Użyj pipety, aby dodać pożywkę, a następnie usuń żywy nośnik komórkowy jako etap mycia.</li>
		<li>Usuń nadmiar tkanki za pomocą kleszczy. Wszelkie dodatkowe tkanki będą zakłócać obrazowanie. 
		UWAGA: Do mycia nie należy używać soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), ponieważ może to wpływać na dynamikę niektórych składników komórkowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 100–150 μl pożywki z żywych komórek do naczynia (przygotowanego w kroku 2.1) i rozprowadzić na szklanej powierzchni za pomocą końcówki do pipet. Rozprowadzenie podłoża na powierzchni pozwoli chusteczce prawidłowo przykleić się do naczynia.</li>
	<li>Przenieś jądra do naczynia za pomocą cienkich kleszczyków i przynieś je do środka naczynia (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A-b). 
	UWAGA: Unikaj przenoszenia zanieczyszczeń, ponieważ zakłóci to obrazowanie i może obniżyć jakość obrazu.</li>
	<li>Usuń nadmiar pożywki z żywych komórek (pozostaw około 10 μl pożywki), aby tkanka mogła się spłaszczyć i prawidłowo przykleić do naczynia. Wykonaj ten krok szybko, aby uniknąć wysuszenia próbki.</li>
	<li>Umieść wstępnie zwilżoną membranę (przygotowaną w kroku 2.2 i 2.3) na jądrach (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A-c).</li>
	<li>Umieść 2-3 małe plastikowe ciężarki (przygotowane w kroku 2.4) na membranie, aby próbka nie unosiła się na wodzie, i szybko dodaj 100-150 μl żywej pożywki komórkowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A-d). 
	UWAGA: Szybkie i delikatne dodawanie podłoża gwarantuje, że próbka nie wyschnie ani nie ulegnie przemieszczeniu.</li>
	<li>Umieść plastikowy pierścień (przygotowany w kroku 2.5) na podwyższonej stronie naczynia (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B-a).</li>
	<li>Umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 22 mm na wierzchu pierścienia (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B-b). W ten sposób powstają dwie komory.</li>
	<li>Weź kawałek bibuły, zwilż go wodą, a następnie zakręć i połóż na szkiełku nakrywkowym, aby stworzyć wilgotną komorę (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B-c). Zamknij pokrywę naczynia (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B-d) i rozpocznij obrazowanie żywych komórek. 
	UWAGA: Jeśli sample jest wrażliwe na światło, wykonaj sekcję 3 w ciemności.</li>
</ol>
4. Obrazowanie żywych komórek męskich komórek macierzystych linii zarodkowej (GSC) Drosophila in situ
<ol>
	<li>Umieść naczynie pod mikroskopem o wysokiej rozdzielczości i zabezpiecz je za pomocą stage clamps.
	<ol>
		<li>Otwórz oprogramowanie do obrazowania, włącz światło przechodzące i użyj obiektywu 63x, aby ustawić ostrość na tkance jądra za pomocą pokrętła ostrości. 
		UWAGA: Jeśli występują trudności ze zlokalizowaniem próbki za pomocą obiektywu 63x, najpierw użyj obiektywu 40x lub 20x przed przełączeniem na obiektyw 63x.</li>
		<li>Włącz lasery, kliknij przycisk Na żywo i znajdź GSC z optymalną pozycją i stanem. Unikaj jąder, które mają niski sygnał fluorescencyjny lub mają piastę (niszę) z dala od powierzchni. 
		UWAGA: W jądrach Drosophila GSC są przymocowane do piasty.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dostosuj ostrość dla GSC i zidentyfikuj odpowiednie ustawienia dla próbki, w tym moc lasera, wzmocnienie zwielokrotnienia elektronów (EM), uśrednianie i powiększenie w trybie Airyscan. Użyj poniższych ustawień jako przykładu dla jąder Drosophila wykazujących ekspresję EGFP oznaczoną α-tubuliną we wczesnym stadium rozwoju komórek rozrodczych.
	<ol>
		<li>Ustaw rozmiar klatki z zakresu od 512 x 512 pikseli do 1024 x 1024 pikseli, klikając opcję Rozmiar ramki.</li>
		<li>Ustaw średnią klatki na 1 lub 2, klikając Averaging. 
		UWAGA: Zwiększenie rozmiaru klatki (>1024 x 1024 pikseli) i wykonanie większej liczby uśredniania (tj. więcej niż 2) może spowodować fotowybielanie lub fototoksyczność.</li>
		<li>Ustaw moc lasera na 1%–2%, klikając Lasers. 
		UWAGA: Zwiększenie mocy lasera może również prowadzić do fotowybielania lub fototoksyczności.</li>
		<li>Ustaw wzmocnienie EM poniżej zalecanego poziomu (< 800), klikając Master Gain. 
		UWAGA: Wyższe wzmocnienie EM może generować artefakty.</li>
		<li>Powiększ obszar lub komórkę zainteresowania, aby skrócić czas akwizycji obrazu i zmniejszyć fotowybielanie. Pozwala to również okazowi przetrwać przez dłuższy czas.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozpocznij przechwytywanie obrazu poklatkowego w trybie Airyscan, klikając przycisk Rozpocznij eksperyment.
	<ol>
		<li>Zanim klikniesz Rozpocznij eksperyment, upewnij się, że pobieranie jest optymalnie skonfigurowane.</li>
		<li>Jeśli wyświetli się ostrzeżenie z komunikatem "Akwizycja Airyscan nie jest skonfigurowana optymalnie", kliknij Optymalna w sekcji rozmiaru klatki, kliknij Optymalna w sekcji z-stack, a następnie kliknij Optymalna dla sekcji obszaru skanowania (do obrazowania w superrozdzielczości wymagane jest powiększenie co najmniej 1,3</li>).
	</ol>
	</li>
	<li>Zoptymalizuj przedział czasowy, liczbę plasterków z i czas trwania obrazowania poklatkowego zgodnie z projektem eksperymentalnym i typem próbki, tak aby jakość obrazu nie była zagrożona, a komórki nie zostały zatrzymane na poszczególnych etapach cyklu komórkowego.
	<ol>
		<li>Jako przykład parametry obrazowania poklatkowego jąder Drosophila wykazujących ekspresję α-tubuliny znakowanej EGFP we wczesnej linii zarodkowej przedstawiono w następujących krokach.</li>
		<li>W przypadku obrazowania poklatkowego trwającego dłużej niż 5 godzin, obraz w 10-minutowym odstępie czasu z 1% mocą lasera i wykonaj do 30 plasterków z w każdym punkcie czasowym.</li>
		<li>W przypadku wysoce dynamicznych procesów komórkowych, takich jak dynamika mikrotubul, ustaw 2-minutowy odstęp między punktami czasowymi, wykonaj 1–2 godziny obrazowania poklatkowego przy 1% mocy lasera i wykonaj do 30 plasterków Z w każdym punkcie czasowym.</li>
		<li>W przypadku rzadkich zdarzeń komórkowych, takich jak dynamika chromatyny od anafazy do wczesnej telofazy (zdarzenia 2-3 min), ustaw obrazowanie żywych komórek z 1-minutowym odstępem między punktami czasowymi, wykonaj 30-minutowe obrazowanie poklatkowe przy 1% mocy lasera i wykonaj do 30 plasterków Z w każdym punkcie czasowym. 
		UWAGA: Parametry te mogą się różnić dla różnych próbek, więc konieczna będzie zmiana w celu optymalnego wykorzystania dla konkretnej próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj obrazowanie poklatkowe lub obrazowanie migawkowe na żywo, w zależności od czułości próbki i projektu eksperymentalnego. 
	UWAGA: Krótki film trwa 15–30 minut, a długi film trwa dłużej niż 5 godzin.</li>
	<li>Jeśli próbka jest bardzo czuła i nie można jej zbadać za pomocą obrazowania poklatkowego za pomocą mikroskopu o wysokiej rozdzielczości, jak to często ma miejsce w przypadku samców GSC Drosophila, wykonaj migawkę na żywo w superrozdzielczości (SRLS) próbki na różnych etapach cyklu komórkowego (jak pokazano na Rysunek 2, <silna klasa="xfig">Rysunek 3, <silna klasa="xfig">Rysunek 4).
	<ol>
		<li>Jeśli wychwytywane jest rzadkie zdarzenie biologiczne w komórce lub białko będące przedmiotem zainteresowania ma niski poziom ekspresji, należy wykonać SRLS.</li>
		<li>W przypadku SRLS znajdź komórkę na określonym etapie cyklu komórkowego, który Cię interesuje. Na przykład, jeśli koncentrujesz się na wiązaniu mikrotubul z kinetochorem, użyj komórki w prometafazie lub metafazie. 
		UWAGA: Pomoże to zapewnić, że uzyskasz wysokiej jakości obraz interesującej komórki we właściwym czasie, bez ryzyka fototoksyczności próbki lub bielenia fluoroforów, co może wystąpić podczas dłuższego filmu.</li>
		<li>Jeśli używasz SRLS, zobrazuj różne interesujące etapy cyklu komórkowego w wielu komórkach i ułóż te obrazy w porządku chronologicznym. 
		UWAGA: Można to wykorzystać do skonstruowania czasowej kolejności zdarzeń przy jednoczesnej maksymalizacji zdrowia sygnału i tkanek, aby uzyskać doskonałą rozdzielczość czasową zdarzenia dla szczególnie wrażliwych próbek lub próbek o słabym sygnale.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Przetwarzanie obrazów komórek na żywo przez Airyscan
<ol>
	<li>Po pobraniu obrazu za pomocą oprogramowania do obrazowania wybierz opcję Przetwarzanie, kliknij opcję Partia, a następnie wybierz opcję Airyscan Processing (Przetwarzanie Airyscan).
	<ol>
		<li>Wybierz obrazy do przetworzenia, a następnie kliknij przycisk Uruchom/Przetwarzaj, aby uzyskać obrazy w super rozdzielczości.</li>
		<li>Wykonaj przetwarzanie przy użyciu ustawienia domyślnego. 
		UWAGA: Przetwarzanie Airyscan będzie działać tylko wtedy, gdy ustawienia obrazowania są prawidłowo skonfigurowane dla obrazowania Airyscan.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Breedijk, R. M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+live-cell+super-resolution+technique+demonstrated+by+imaging+germinosomes+in+wild-type+bacterial+spores%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A live-cell super-resolution technique demonstrated by imaging germinosomes in wild-type bacterial spores.</a> Scientific Reports. 10 (1), 5312(2020).</li>
<li>Maddox, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+mitotic+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Imaging the mitotic spindle.</a> Methods in Enzymology. 505, 81-103 (2012).</li>
<li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+microscopy+-+tips+and+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Live-cell microscopy - tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li>
<li>Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%3A+A+method+for+super+resolution+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): A method for super resolution fluorescence imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (6), 075143(2013).</li>
<li>Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+photoactivated+localization+microscopy+of+nanoscale+adhesion+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics.</a> Nature Methods. 5 (5), 417-423 (2008).</li>
<li>Vicidomini, G., Bianchini, P., Diaspro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+super-resolved+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">STED super-resolved microscopy.</a> Nature Methods. 15 (3), 173-182 (2018).</li>
<li>Huff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Airyscan+detector+from+ZEISS%3A+confocal+imaging+with+improved+signal-to-noise+ratio+and+super-resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution.</a> Nature Methods. 12 (12), (2015).</li>
<li>Huff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+2D+superresolution+mode+for+ZEISS+Airyscan%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The new 2D superresolution mode for ZEISS Airyscan.</a> Nature Methods. 14 (12), 1223(2017).</li>
<li>Korobchevskaya, K., Lagerholm, B., Colin-York, H., Fritzsche, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+potential+of+Airyscan+microscopy+for+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Photonics%22%5BJournal%5D)">Exploring the potential of Airyscan microscopy for live cell imaging.</a> Photonics. 4 (4), 41(2017).</li>
<li>Ranjan, R., Snedeker, J., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+centromeres+differentially+coordinate+with+mitotic+machinery+to+ensure+biased+sister+chromatid+segregation+in+germline+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Asymmetric centromeres differentially coordinate with mitotic machinery to ensure biased sister chromatid segregation in germline stem cells.</a> Cell Stem Cell. 25 (5), 666-681 (2019).</li>
<li>Kahney, E. W., Ranjan, R., Gleason, R. J., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetry+from+asymmetry+or+asymmetry+from+symmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Symposia+on+Quantitative+Biology%22%5BJournal%5D)">Symmetry from asymmetry or asymmetry from symmetry.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 82, 305-318 (2017).</li>
<li>Wooten, M., Ranjan, R., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+histone+inheritance+in+asymmetrically+dividing+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Asymmetric histone inheritance in asymmetrically dividing stem cells.</a> Trends in Genetics. 36 (1), 30-43 (2020).</li>
<li>Wooten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+histone+inheritance+via+strand-specific+incorporation+and+biased+replication+fork+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Asymmetric histone inheritance via strand-specific incorporation and biased replication fork movement.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 26 (8), 732-743 (2019).</li>
<li>Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nature Protocols. 2 (10), 2467-2473 (2007).</li>
<li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).</li>
<li>Sivaguru, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+performance+of+airyscan+and+structured+illumination+superresolution+microscopy+in+the+study+of+the+surface+texture+and+3D+shape+of+pollen%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Comparative performance of airyscan and structured illumination superresolution microscopy in the study of the surface texture and 3D shape of pollen.</a> Microscopy Research and Technique. 81 (2), 101-114 (2018).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Metody mikroskopii superrozdzielczej zapewniają rozdzielczość przestrzenną do 10 s nanometrów 4,5,6. Metody mikroskopii STORM i PALM pozwalają na uzyskanie rozdzielczości od 20 do 50 nm (rozdzielczość XY), natomiast mikroskopia STED oferuje rozdzielczość od 20 do 100 nm (rozdzielczość XY). Rozdzielczość przestrzenna mikroskopii SIM jest ograniczona do 100 do 130 nm15. Jednak ze względu na wysoką gęstość fotonów i dług...

Wizualizacja struktur subkomórkowych i dynamiki białek w żywych komórkach z rozdzielczością wykraczającą poza granicę dyfrakcji światła jest zazwyczaj bardzo trudne1-3. Chociaż opracowano wiele technik superrozdzielczych, takich jak mikroskopia stochastyczno-optyczna-rekonstrukcyjna (STORM), mikroskopia lokalizacji aktywowanej światłem (PALM) i wymuszona emisja-depletion (STED)4,5,6 mikroskopia, komplikacje w przygotowaniu próbki, a także potrzeba utrzymania żywotności i aktywności ex vivo, ograniczają stosowanie konwencjonalnej mikroskopii superrozdzielczej do obrazowanie żywych próbek. Konwencjonalna mikroskopia konfokalna nie jest w stanie osiągnąć rozdzielczości przestrzennej większej niż ~230 nm XY i często jest niewystarczająca do obserwacji skomplikowanych podstruktur komórkowych5,6. Jednak najnowsze osiągnięcie w mikroskopii konfokalnej, obrazowanie superrozdzielcze Airyscan, jest w stanie osiągnąć około 140 nm (rozdzielczość XY)7,8 i ma stosunkowo proste przygotowanie próbki, które jest kompatybilne z obrazowaniem na żywo. Ponieważ ten system detekcji obrazowania wymaga długiego czasu akwizycji, jego wysoka rozdzielczość przestrzenna odbywa się kosztem rozdzielczości czasowej9. Dlatego potrzebna jest metoda, która zapewni, że obrazowanie żywych komórek zostanie rozszerzone o wysoką rozdzielczość przestrzenną.
Tutaj opracowaliśmy metodę obserwacji żywych komórek w nienaruszonej tkance w jej optymalnej rozdzielczości, aby rozszyfrować struktury subkomórkowe za pomocą szczegółowych informacji przestrzennych. Metoda ta została zaprojektowana w taki sposób, aby próbki mogły być stabilnie montowane przez długi czas (~ 10 godzin) bez przesuwania się lub degeneracji. Żywe pożywki komórkowe stosowane w tej technice mogą wspomagać funkcje komórkowe i zapobiegać fotowybielaniu do 10 godzin pod mikroskopem o wysokiej rozdzielczości. Wreszcie, protokół ten minimalizuje większość naprężeń spowodowanych ciągłym oświetleniem laserów przez dłuższy czas, takich jak niedotlenienie, zmiany wilgotności i temperatury, a także wyczerpanie składników odżywczych.
Korzystając z tego protokołu do obrazowania męskich komórek macierzystych linii zarodkowej (GSC) Drosophila, byliśmy w stanie zaobserwować, jak asymetryczna aktywność mikrotubul pozwala na preferencyjne interakcje z epigenetycznie odrębnymi chromatydami siostrzanymi10,11,12,13. Tego typu zdarzenia komórkowe są bardzo dynamiczne i bardzo trudne do wizualizacji w żywych komórkach przy użyciu innych metod obrazowania o wysokiej rozdzielczości, takich jak STORM, PALM lub STED. Przewidujemy, że metoda ta stanie się bardzo przydatna dla biologów komórkowych, ponieważ dążą oni do zrozumienia dynamicznych struktur subkomórkowych żywych komórek znajdujących się w tkankach. Istnieje wiele obszarów, w których można zastosować tę metodę, takich jak badanie dynamiki białek; zrozumienie ruchu komórek; oraz śledzenie linii i procesy różnicowania komórkowego, a także inne możliwe zastosowania.

<table><tbody><tr><td>Adobe Illustrator CS6 (oprogramowanie do tworzenia figurek)</td><td>Membrana</td> do dializy <td>Adobe N/A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Spectra/Por 1-4 Standardowa membrana do dializy RC</td><td>Nr kat. 08-67121</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Nr kat. 26140079</td><td>15% (V/V)</td></tr><tr><td>Fidżi (oprogramowanie do analizy)</td><td>NIH</td><td>N/A</td><td>Kwantyfikacja</td></tr> <tr><td>intensywności fluorescencji obrazuSzalki do hodowli komórek ze szklanym dnem (FluroDish)</td><td>World Precision Instrument, Inc.</td><td>FD35PDL-100</td><td></td></tr><tr><td>Imaris (oprogramowanie do rekonstrukcji obrazu)</td><td>Bitplane</td><td>N/A</td><td>Rekonstrukcja obrazu 3D</td></tr><tr><td>Olej do zdjęć</td><td>Zeiss</td><td>Immersol 518F/30 &deg; C</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>Kot. Nr 15550</td><td>200 &mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>Nr kat. - 15140-122</td><td>0,6x</td></tr><tr><td>Schneider Drosophila media</td><td>Invitrogen</td><td>Nr kat. - 11720-034</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>wyposażony w kamerę evolve (fotometria), wykorzystujący obiektyw Zeiss 63x (1,4 NA).</td></tr><tr><td>Bibułka</td><td>Kimwipe</td><td>N/A</td><td>Na mokro do tworzenia wilgotnej komory</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny LSM 800 z modułem superrozdzielczym AiryScan</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>wyposażony w bardzo czułe detektory GaAsP (Gallium Arsenide Phosphide) przy użyciu obiektywu Zeiss 63x (1,4 NA)</td></tr><tr><td>ZEN (oprogramowanie do obrazowania)</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie żywych komórek w superrozdzielczości struktur subkomórkowych

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

Od dawna istnieje kluczowy kompromis między rozdzielczością przestrzenną a czasową w obrazowaniu. Obrazowanie poza granicą dyfrakcji światła było tradycyjnie ograniczone do stosowania tylko na utrwalonych próbkach lub żywych komórkach poza tkanką znakowaną silnym sygnałem fluorescencyjnym. Obecne techniki obrazowania żywych komórek o wysokiej rozdzielczości wymagają użycia specjalnych sond fluorescencyjnych, wysokiego oświetlenia, wielokrotnej akwizycji obrazu z przetwarzaniem po akwizycji lub często kombinacji tych procesów. Te warunki wstępne znacznie ograniczają próbki biologiczne i konteksty, do których można zastosować tę technikę.
Tutaj opisujemy metodę wykonywania poklatkowego obrazowania żywych komórek w superrozdzielczości (~140 nm XY) na żywo in situ. Technika ta jest również kompatybilna z niską intensywnością fluorescencji, na przykład EGFP lub mCherry endogennie znakowanymi przy genach o niskiej ekspresji. Jako dowód słuszności zasady użyliśmy tej metody do wizualizacji wielu struktur subkomórkowych w jądrze Drosophila. Podczas preparowania tkanek zarówno struktura komórkowa, jak i morfologia tkanek są utrzymywane w obrębie wypreparowanego jądra. Tutaj używamy tej techniki do obrazowania dynamiki mikrotubul, interakcji między mikrotubulami a błoną jądrową, a także przyłączania mikrotubul do centromerów.
Ta technika wymaga specjalnych procedur w zakresie przygotowania próbek, montażu próbek i ich unieruchomienia. Dodatkowo próbki muszą być przechowywane przez kilka godzin po sekcji bez uszczerbku dla funkcji i aktywności komórek. Chociaż zoptymalizowaliśmy warunki obrazowania na żywo w super rozdzielczości, szczególnie w męskich komórkach macierzystych linii rozrodczej (GSC) Drosophila i progenitorowych komórkach rozrodczych w wypreparowanej tkance jąder, technika ta ma szerokie zastosowanie do wielu różnych typów komórek. Możliwość obserwacji komórek w ich warunkach fizjologicznych bez poświęcania rozdzielczości przestrzennej lub czasowej będzie nieocenionym narzędziem dla badaczy poszukujących odpowiedzi na kluczowe pytania w biologii komórki.

Obrazowanie żywych komórek poza limitem dyfrakcyjnym w tkankach Drosophila, zwłaszcza w przypadku GSC, daje możliwość zbadania dynamiki zdarzeń subkomórkowych w kontekście przebiegu cyklu komórkowego. Niedawne badanie z wykorzystaniem tego protokołu wykazało, że aktywność mikrotubul w centrosomie macierzystym w porównaniu z centrosomem potomnym jest czasowo asymetryczna w GSC10. Centrosom macierzysty emituje mikrotubule około 4 godziny przed wejściem w mitozę, podczas gdy centrosom potomn...

Prezentowany tutaj jest protokół do obrazowania żywych komórek w nienaruszonej tkance w superrozdzielczości. Ustandaryzowaliśmy warunki obrazowania bardzo wrażliwej populacji dorosłych komórek macierzystych w ich natywnym środowisku tkankowym. Technika ta polega na zrównoważeniu rozdzielczości czasowej i przestrzennej, aby umożliwić bezpośrednią obserwację zjawisk biologicznych w żywej tkance.

Obrazowanie żywych komórek w superrozdzielczości struktur subkomórkowych

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

Nasz protokół wykorzystuje regularne sondy fluoroforowe i proste techniki przygotowania próbek, które utrzymują obrazowaną komórkę w stanie fizjologicznym w celu zbadania wysoce dynamicznego procesu komórkowego i szczegółowych struktur subkomórkowych. Technika ta pozwala nam badać procesy komórkowe w super rozdzielczości i w warunkach fizjologicznych przez dłuższy czas bez poświęcania ani specjalnej lub tymczasowej rozdzielczości. Zacznij od pocięcia membrany dializacyjnej o masie cząsteczkowej od 12 do 14 kilodaltonów na małe kawałki i namoczenia kawałków w 100 mikrolitrach pożywki z żywych komórek przez około pięć minut.Podczas moczenia membran pokrój zewnętrzny pierścień 50-mililitrowej rurki na małe kawałki i wysterylizuj kawałki w 70% etanolu. W celu wycięcia i zamontowania jąder przenieś dziesięć dwu- do trzydniowych, znieczulonych samców much do naczynia preparacyjnego pod mikroskopem preparacyjnym i użyj cienkich kleszczy do usunięcia jąder. Po zebraniu wszystkich jąder umyj je dwa razy w pożywce z żywych komórek i za pomocą końcówki pipety rozprowadź od 100 do 150 mikrolitrów pożywki z żywych komórek do przygotowanego naczynia ze szklanym dnem.Użyj cienkich kleszczy, aby przenieść jądra muchy na środek naczynia i usuń wszystko, z wyjątkiem około 10 mikrolitrów pożywki. Szybko umieść wstępnie zwilżoną membranę na jądrach i umieść na membranie dwa do trzech małych plastikowych ciężarków. Natychmiast dodaj od 100 do 150 mikrolitrów świeżej pożywki z żywych komórek i umieść pierścień z powrotem na podwyższonej stronie naczynia.Umieść szkiełko nakrywkowe z powrotem na pierścieniu i zakręć kawałkiem bibułki w wodzie przed umieszczeniem papieru na szkiełku nakrywkowym. Następnie przykryj naczynie pokrywką i zabezpiecz naczynie na stoliku mikroskopu o super rozdzielczości. W przypadku obrazowania komórek macierzystych linii zarodkowej otwórz oprogramowanie do obrazowania i włącz światło przechodzące.Użyj obiektywu 63X, aby skupić się na tkance jąder i włączyć lasery. Kliknij Na żywo", aby zlokalizować rozrodcze komórki macierzyste. Dostosuj ostrość i kliknij Rozmiar ramki"aby ustawić rozmiar klatki w zakresie od 512 na 512 do 1024 na 1024 pikseli i Uśrednianie"aby ustawić średnią klatki na jeden lub dwa.Kliknij Master Gain"aby ustawić wzmocnienie mnożenia elektronów na mniej niż 800, i Lasery"aby ustawić moc lasera na 1% do 2%Powiększ obszar lub komórkę zainteresowania, aby skrócić czas akwizycji obrazu i zmniejszyć wybielanie zdjęć, a także potwierdź, że obraz został optymalnie skonfigurowany przed kliknięciem Rozpocznij eksperyment"aby rozpocząć przechwytywanie obrazu poklatkowego. Jeśli Airyscan Acquisition nie jest skonfigurowany optymalnie, kliknij Optymalny"w rozmiarach ramki, Z-Stack i Obszar skanowania"sekcje i zoptymalizuj przedział czasu, liczbę wycinków Z i czas trwania obrazowania poklatkowego, zgodnie z projektem eksperymentalnym i typem próbki. Po zobrazowaniu wybierz Przetwarzanie, Przetwarzanie wsadowe i Przetwarzanie Airyscan, a następnie wybierz obrazy do przetworzenia.Następnie kliknij Uruchom proces"aby uzyskać obrazy w super rozdzielczości. Obrazowanie żywych komórek jąder drosophila eksprymujących alfa-tubulinę GFP we wczesnym stadium rozwoju komórek rozrodczych przy użyciu mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem umożliwia wizualizację asymetrycznej intensywności sygnałów GFP w dwóch centrosomach, jako jaśniejszy sygnał w centrosomie macierzystym i stosunkowo słabszy sygnał w centrosomach potomnych. Różnica w jasności jest prawdopodobnie odzwierciedlona przez asymetrię czasową zarodkowania mikrotubul, ale szczegółowej morfologii i ilości mikrotubul nie można rozwiązać za pomocą mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem.W przeciwieństwie do tego, obrazowanie w super rozdzielczości żywych komórek umożliwia wizualizację i kwantyfikację morfologii i liczby mikrotubul. Ta ulepszona rozdzielczość ujawnia również wzorce asymetrycznego zarodkowania mikrotubul, wydłużenia i zwiększonej interakcji z błoną jądrową. Obrazowanie żywych komórek pozwala również na wizualizację asymetrycznego wgłębienia błony jądrowej, ale nie pojedynczych mikrotubul, które bezpośrednio wchodzą do jądra.W przeciwieństwie do tego, ta technika super rozdzielczości żywych komórek pozwala na bezpośrednią obserwację tych zdarzeń poprzez jednoczesne obrazowanie zarówno mikrotubul, jak i blaszki jądrowej. Podczas metafazy oba siostrzane centromery można wykryć jako jeden sygnał za pomocą mikroskopii wirującego dysku, chociaż nie można zaobserwować centralnego przyczepienia mikrotubul. W przeciwieństwie do tego, obrazowanie na żywo w super rozdzielczości umożliwia wizualizację przyczepienia centromerów mikrotubul we wczesnej fazie profazy.Pamiętaj, aby umieścić membranę na jądrach, aby upewnić się, że nie poruszają się ani nie unoszą podczas obrazowania oraz aby zoptymalizować ustawienia mikroskopu, aby uniknąć wybielania zdjęć i fototoksyczności. Istnieje wiele sposobów zastosowania tej metody, takich jak badanie dynamiki białek, stresu liniowego lub mechanizmów obronnych i procesów komórkowych.

super-resolution-live-cell-imaging-of-subcellular-structures

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy metodę obrazowania w super-rozdzielczości, aby zbadać strukturalną organizację bakteryjnego pierścienia FtsZ, niezbędnego aparatu do podziału komórek.  Metoda ta opiera się na analizach ilościowych obrazów z mikroskopii lokalizacji aktywowanej fotoaktywowaną (PALM) i może być stosowana do innych bakteryjnych białek cytoszkieletu.

Obrazowanie w superrozdzielczości maszynerii podziału bakteryjnego

Opisujemy, jak przeprowadzić badania oparte na fotoaktywowanej mikroskopii lokalizacyjnej (PALM) pęcherzyków w stałych, hodowanych neuronach. Kluczowe elementy naszego protokołu obejmują znakowanie pęcherzyków za pomocą chimer fotokonwertowalnych, zbieranie rzadkich próbek surowych obrazów za pomocą systemu mikroskopii o wysokiej rozdzielczości oraz przetwarzanie surowych obrazów w celu uzyskania obrazu o super rozdzielczości.

Obrazowanie w superrozdzielczości pęcherzyków neuronalnych o gęstym rdzeniu

Czasoprzestrzenne informacje o dynamicznych białkach wewnątrz żywych komórek są kluczowe dla zrozumienia biologii. Rodzaj mikroskopii superrozdzielczej, zwany szybką mikroskopią oświetlenia strukturalnego 3D (f3D-SIM), ujawnia unikalne informacje na temat cytokinetycznego pierścienia Z u bakterii: zarówno jego wygląd podobny do koralików, jak i szybką dynamikę FtsZ w pierścieniu.

Obrazowanie cytokinetycznego pierścienia Z w superrozdzielczości u żywych bakterii przy użyciu szybkiej mikroskopii oświetlenia strukturalnego 3D (f3D-SIM)

Czterowymiarowe (4D) obrazowanie jest wykorzystywane do badania zachowania i interakcji między dwoma typami endosomów w zakończonych nerwach żywych kręgowców.  Ruch tych małych struktur jest scharakteryzowany w trzech wymiarach, co pozwala na potwierdzenie zdarzeń takich jak fuzja endosomów i egzocytoza.

Wizualizacja dynamiki endosomów w żywych zakończeniach nerwowych za pomocą czterowymiarowego obrazowania fluorescencyjnego

Opisujemy tutaj połączenie techniki tworzenia synaps immunologicznych z wykorzystaniem dwuwarstwowego lipidu na wspartym szkłem z techniką obrazowania w superrozdzielczości mikroskopii STED (Stimulated emission depletion). Celem tego protokołu jest dostarczenie użytkownikom instrukcji niezbędnych do pomyślnego przeprowadzenia tych dwóch technik.

Obrazowanie w superrozdzielczości synapsy immunologicznej komórek NK na płaskiej dwuwarstwie lipidowej na podłożu szklanym

Ten artykuł przedstawia protokół wykrywania jednego lub więcej białek plazmy i/lub błony wewnątrzkomórkowej za pomocą mikroskopii superrozdzielczej GSD (Ground State Depletion) w komórkach ssaków. W tym miejscu omawiamy korzyści i rozważania dotyczące stosowania takich podejść do wizualizacji i kwantyfikacji białek komórkowych.

Obrazowanie w superrozdzielczości zubożenia stanu podstawowego w komórkach ssaków

Ostatnio zmapowaliśmy trójwymiarowe (3D) przestrzenne lokalizacje tras transportowych dla różnych białek przemieszczających się wewnątrz rzęsek pierwotnych w żywych komórkach. W tym artykule szczegółowo opisano konfigurację eksperymentalną, proces pobierania próbek biologicznych i analizy danych dla podejścia do obrazowania fluorescencji 3D o wysokiej rozdzielczości, nowo zastosowanego w żywych rzęskach pierwotnych.

Zastosowanie szybkiej mikroskopii superrozdzielczej SPEED w żywej rzęsce pierwotnej

Mikroskopia superrozdzielcza może dostarczyć szczegółowych informacji na temat organizacji komponentów w kompleksie synaptonemalnym w mejozie. Tutaj demonstrujemy protokół rozwiązywania poszczególnych białek kompleksu synaptonemalnego Caenorhabditis elegans.

Mikroskopia superrozdzielcza kompleksu synaptonemalnego w obrębie linii zarodkowej Caenorhabditis elegans

Protokół ten określa procedurę wykonywania głębokiej, całkomórkowej mikroskopii lokalizacyjnej pojedyncząsteczkowej (SMLM) za pomocą obrotowego mikroskopu konfokalnego z optycznym przesunięciem fotonów, co umożliwia obrazowanie DNA-PAINT bez potrzeby stosowania niestandardowej optyki czy złożonego oświetlenia.

Obrazowanie całokomórkowe superrozdzielczości za pomocą DNA-PAINT na obracającym się dysku konfokalnym z optycznym przekształceniem fotonów

Protokół ten opisuje zaawansowane zastosowania obrazowania oraz zarządzanie współzasobami systemu mikroskopu konfokalnego z laserowym skanowaniem zintegrowanym z multipleksowanym detektorem matrycowym do obrazowania komórkowego i subkomórkowego o wysokiej rozdzielczości. Workflow umożliwia obrazowanie multimodalne od konfokalnej do superrozdzielczości (~120 nm) na jednej platformie, czyniąc wizualizację w skali nanoskalowej bardziej dostępną.

Obrazowanie superrozdzielcze i zarządzanie współdzielone: Protokół do mikroskopii konfokalnej z detekcją multipleksową

Poznaj metodę obrazowania żywych komórek w superrozdzielczości struktur subkomórkowych w tkance Drosophila. Technika umożliwia badanie dynamicznych procesów komórkowych przy zachowaniu warunków fizjologicznych.

Obrazowanie żywych komórek w superrozdzielczości struktur subkomórkowych

Przeglądaj więcej filmów