Obrazowanie żywych komórek w superrozdzielczości struktur subkomórkowych
January 13th, 2021
Prezentowany tutaj jest protokół do obrazowania żywych komórek w nienaruszonej tkance w superrozdzielczości. Ustandaryzowaliśmy warunki obrazowania bardzo wrażliwej populacji dorosłych komórek macierzystych w ich natywnym środowisku tkankowym. Technika ta polega na zrównoważeniu rozdzielczości czasowej i przestrzennej, aby umożliwić bezpośrednią obserwację zjawisk biologicznych w żywej tkance.
Nasz protokół wykorzystuje regularne sondy fluoroforowe i proste techniki przygotowania próbek, które utrzymują obrazowaną komórkę w stanie fizjologicznym w celu zbadania wysoce dynamicznego procesu komórkowego i szczegółowych struktur subkomórkowych. Technika ta pozwala nam badać procesy komórkowe w super rozdzielczości i w warunkach fizjologicznych przez dłuższy czas bez poświęcania ani specjalnej lub tymczasowej rozdzielczości. Zacznij od pocięcia membrany dializacyjnej o masie cząsteczkowej od 12 do 14 kilodaltonów na małe kawałki i namoczenia kawałków w 100 mikrolitrach pożywki z żywych komórek przez około pięć minut.
Podczas moczenia membran pokrój zewnętrzny pierścień 50-mililitrowej rurki na małe kawałki i wysterylizuj kawałki w 70% etanolu. W celu wycięcia i zamontowania jąder przenieś dziesięć dwu- do trzydniowych, znieczulonych samców much do naczynia preparacyjnego pod mikroskopem preparacyjnym i użyj cienkich kleszczy do usunięcia jąder. Po zebraniu wszystkich jąder umyj je dwa razy w pożywce z żywych komórek i za pomocą końcówki pipety rozprowadź od 100 do 150 mikrolitrów pożywki z żywych komórek do przygotowanego naczynia ze szklanym dnem.
Użyj cienkich kleszczy, aby przenieść jądra muchy na środek naczynia i usuń wszystko, z wyjątkiem około 10 mikrolitrów pożywki. Szybko umieść wstępnie zwilżoną membranę na jądrach i umieść na membranie dwa do trzech małych plastikowych ciężarków. Natychmiast dodaj od 100 do 150 mikrolitrów świeżej pożywki z żywych komórek i umieść pierścień z powrotem na podwyższonej stronie naczynia.
Umieść szkiełko nakrywkowe z powrotem na pierścieniu i zakręć kawałkiem bibułki w wodzie przed umieszczeniem papieru na szkiełku nakrywkowym. Następnie przykryj naczynie pokrywką i zabezpiecz naczynie na stoliku mikroskopu o super rozdzielczości. W przypadku obrazowania komórek macierzystych linii zarodkowej otwórz oprogramowanie do obrazowania i włącz światło przechodzące.
Użyj obiektywu 63X, aby skupić się na tkance jąder i włączyć lasery. Kliknij Na żywo", aby zlokalizować rozrodcze komórki macierzyste. Dostosuj ostrość i kliknij Rozmiar ramki"aby ustawić rozmiar klatki w zakresie od 512 na 512 do 1024 na 1024 pikseli i Uśrednianie"aby ustawić średnią klatki na jeden lub dwa.
Kliknij Master Gain"aby ustawić wzmocnienie mnożenia elektronów na mniej niż 800, i Lasery"aby ustawić moc lasera na 1% do 2%Powiększ obszar lub komórkę zainteresowania, aby skrócić czas akwizycji obrazu i zmniejszyć wybielanie zdjęć, a także potwierdź, że obraz został optymalnie skonfigurowany przed kliknięciem Rozpocznij eksperyment"aby rozpocząć przechwytywanie obrazu poklatkowego. Jeśli Airyscan Acquisition nie jest skonfigurowany optymalnie, kliknij Optymalny"w rozmiarach ramki, Z-Stack i Obszar skanowania"sekcje i zoptymalizuj przedział czasu, liczbę wycinków Z i czas trwania obrazowania poklatkowego, zgodnie z projektem eksperymentalnym i typem próbki. Po zobrazowaniu wybierz Przetwarzanie, Przetwarzanie wsadowe i Przetwarzanie Airyscan, a następnie wybierz obrazy do przetworzenia.
Następnie kliknij Uruchom proces"aby uzyskać obrazy w super rozdzielczości. Obrazowanie żywych komórek jąder drosophila eksprymujących alfa-tubulinę GFP we wczesnym stadium rozwoju komórek rozrodczych przy użyciu mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem umożliwia wizualizację asymetrycznej intensywności sygnałów GFP w dwóch centrosomach, jako jaśniejszy sygnał w centrosomie macierzystym i stosunkowo słabszy sygnał w centrosomach potomnych. Różnica w jasności jest prawdopodobnie odzwierciedlona przez asymetrię czasową zarodkowania mikrotubul, ale szczegółowej morfologii i ilości mikrotubul nie można rozwiązać za pomocą mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem.
W przeciwieństwie do tego, obrazowanie w super rozdzielczości żywych komórek umożliwia wizualizację i kwantyfikację morfologii i liczby mikrotubul. Ta ulepszona rozdzielczość ujawnia również wzorce asymetrycznego zarodkowania mikrotubul, wydłużenia i zwiększonej interakcji z błoną jądrową. Obrazowanie żywych komórek pozwala również na wizualizację asymetrycznego wgłębienia błony jądrowej, ale nie pojedynczych mikrotubul, które bezpośrednio wchodzą do jądra.
W przeciwieństwie do tego, ta technika super rozdzielczości żywych komórek pozwala na bezpośrednią obserwację tych zdarzeń poprzez jednoczesne obrazowanie zarówno mikrotubul, jak i blaszki jądrowej. Podczas metafazy oba siostrzane centromery można wykryć jako jeden sygnał za pomocą mikroskopii wirującego dysku, chociaż nie można zaobserwować centralnego przyczepienia mikrotubul. W przeciwieństwie do tego, obrazowanie na żywo w super rozdzielczości umożliwia wizualizację przyczepienia centromerów mikrotubul we wczesnej fazie profazy.
Pamiętaj, aby umieścić membranę na jądrach, aby upewnić się, że nie poruszają się ani nie unoszą podczas obrazowania oraz aby zoptymalizować ustawienia mikroskopu, aby uniknąć wybielania zdjęć i fototoksyczności. Istnieje wiele sposobów zastosowania tej metody, takich jak badanie dynamiki białek, stresu liniowego lub mechanizmów obronnych i procesów komórkowych.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół przedstawia metodę superrozdzielczego obrazowania komórek żywych w nienaruszonym tkance, mającą na celu badanie dynamicznych procesów komórkowych w populacji komórek macierzystych dorosłych w ich naturalnym środowisku. Równoważy ona rozdzielczość czasową i przestrzenną, aby skutecznie obserwować zjawiska biologiczne w żywym tkance.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Biologia komórki
- Mikroskopia
- Obrazowanie komórek żywych
Tło
- Znaczenie utrzymania warunków fizjologicznych w obrazowaniu
- Wyzwania związane z obserwacją dynamicznych procesów komórkowych
- Porównanie z tradycyjnymi technikami mikroskopowymi
Stosowane metody
- Superrozdzielcze obrazowanie komórek żywych
- Jako system biologiczny użyto jąder Drosophila
- Zastosowanie sond fluorescencyjnych i konfokalnej mikroskopii dyskowej
Główne wyniki
- Ulepszona wizualizacja dynamiki i morfologii mikrotubuli
- Ujawnienie asymetrycznej nukleacji mikrotubuli i interakcji z błoną jądra
- Możliwość obserwacji przyczepienia centromeru podczas metafazy i profazy
Wnioski
- To badanie wykazuje skuteczność superrozdzielczego obrazowania w obserwowaniu dynamiki komórkowej.
- Metoda w znacznym stopniu przyczynia się do zrozumienia procesów komórkowych w biologii rozwoju.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Super-resolution live-cell imaging in intact tissue enables high-fidelity observation of dynamic subcellular processes under physiological conditions, addressing a critical gap in target validation and mechanistic de-risking. By preserving spatial and temporal resolution without requiring specialized probes or high illumination, this method supports reliable phenotypic screening and assay development in disease-relevant systems. Its compatibility with endogenous low-intensity fluorophores expands applicability to early discovery workflows where target confidence and predictive value are paramount.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct visualization of target engagement and subcellular localization in native tissue context, reducing mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Supports hypothesis testing of protein dynamics and complex formation without fixation artifacts.
- Translational Value: Facilitates target confidence assessment in disease-relevant models like stem cell niches.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative readouts of microtubule morphology, nucleation patterns, and organelle interactions for assay standardization.
- Operational Value: Enables time-lapse imaging with low phototoxicity, supporting longitudinal screening campaigns.
- Translational Value: Generates reproducible, high-content data suitable for hit validation and lead optimization.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges discovery and preclinical stages by observing cellular processes in intact tissue under near-physiological conditions.
- Operational Value: Maintains tissue morphology and cellular function for extended imaging, supporting longitudinal studies.
- Translational Value: Enables biomarker-adjacent observations such as nuclear membrane remodeling and centrosome asymmetry.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing super-resolution readouts that inform target validation and lead identification decisions prior to preclinical investment.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven interrogation of cytoskeletal dynamics and nucleocytoplasmic interactions in live tissue.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible imaging outputs suitable for assay standardization and compound effect evaluation.
- Analytics: Generates super-resolution datasets quantifying microtubule numbers, elongation rates, and spatial organization for comparative analysis.
- Translational Research: Supports continuity from subcellular observation to tissue-level phenotypes in stem cell niches.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable across cell types and disease models without probe engineering.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by resolving subcellular mechanisms invisible to diffraction-limited microscopy.
- Operational Value: Delivers standardization through specimen immobilization, low-laser imaging, and batch processing workflows.
- Strategic Value: Reduces late-stage attrition by improving target validation fidelity in physiologically relevant contexts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement decisions through mechanistic de-risking of cytoskeletal and nucleoskeletal targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live tissue handling, super-resolution microscopy, and image processing pipelines.
- Depends on access to super-resolution systems with Airyscan or equivalent capabilities and environmental control chambers.
- Necessitates standardization of specimen preparation, mounting, and medium composition across users and sites.
- Involves adaptation considerations for varying tissue fragility, autofluorescence, and genetic accessibility beyond Drosophila testis.
- Limited by the need for genetic tagging of targets with compatible fluorophores such as EGFP or mCherry at endogenous loci.
