Charakterystyka cytometrii przepływowej rozwoju mysich komórek B

Dane wygenerowane przy użyciu tej techniki pogłębiają wiedzę na temat autoimmunologicznych modeli myszy podatnych na zakażenie, a także humanizowanych myszy, które można wykorzystać do ogólnej terapii przeciwciał lub przeciwciał na życie. Dostępność odczynników o coraz szerszym zakresie fluoroforów, pozwala na jednoczesną analizę wielu parametrów na poszczególnych komórkach oraz umożliwia ocenę niejednorodności limfocytów B. Protokół ten został opracowany w celu fenotypowania genetycznie modyfikowanych myszy.

w celu ustalenia, czy manipulacja genetyczna zmieni rozwój limfocytów B. Cześć, nazywam się Faith Harris. Dzisiaj zademonstruję procedurę.

Zacznij od porcjowania miliona komórek każdego typu od każdego zwierzęcia do 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U. Upewnij się, że dostępna jest wystarczająca ilość studzienek dla wszystkich próbek i kontroli, w tym pełnego barwienia, próbek fluorescencji minus jeden i próbek niebarwionych dla każdego fluoroforu. W przypadku panelu dojrzewania szpiku kostnego i panelu dojrzewania śledziony, podwielokrotność komórek do dwóch dołków, 1 milion komórek na studzienkę na każdą pełną próbkę barwienia.

W przypadku kontroli żywotności pojedynczej kompensacji koloru dodaj dwa miliony komórek każdego typu komórek do poszczególnych studzienek. Odwirować płytkę o sile 845 x g przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zdekantować supernatant, szybko odwracając i przesuwając talerz nad zlewem, uważając, aby nie zanieczyścić krzyżowo studzienek.

Umyj komórki dwukrotnie w 200 mikrolitrach DPBS. Odwirować i zdekantować supernatant po każdym przemyciu. Ponownie zawiesić komórki w 100 mikrolitrach barwnika żywotności rozcieńczonego w DPBS w stosunku jeden do 1000, unikając komórek używanych do kompensacji pojedynczego koloru.

Dla każdego zestawu barwie należy pozostawić kilka niebarwionych studzienek na całkowicie niezabarwioną próbkę i inne kontrole, których możesz potrzebować, a także dodatkową niebarwioną studzienkę do kontroli żywotności FMO. Dodaj PBS do tych studzienek. Ponownie zawiesić komórki kontroli żywotności pojedynczej kompensacji barwy w 200 mikrolitrach rozcieńczonego barwnika żywotności.

Przenieś 100 mikrolitrów tych komórek do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej i podgrzewaj ją przez pięć minut w temperaturze 65 stopni Celsjusza, a następnie przenieś podgrzane komórki z powrotem do oryginalnej studzienki z pozostałymi żywymi komórkami. Inkubować komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut, chroniąc je przed światłem. Po inkubacji odwirować komórki i zdekantować supernatant poprzez strzepnięcie lub odwrócenie płytki bez zanieczyszczenia krzyżowego pozostałych studzienek.

Umyć komórki przez ponowne zawieszenie w 200 mikrolitrach DPBS, a następnie odwirować i zdekantować supernatant jak poprzednio. Powtórz ponownie pranie DPBS. Dodaj mikrolitry bloku FC rozcieńczonego buforem barwiącym w stosunku od jednego do 50, aby uzyskać końcowe stężenie 10 mikrogramów na mililitr.

W przypadku komórek otrzewnej dodaj pięć mikrolitrów blokera monocytów, aby zmniejszyć niespecyficzne barwienie. Następnie inkubuj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut, chroniąc przed światłem. Przygotować pełne mieszaniny wzorcowe barwienia i FMO w buforze barwienia dla końcowej objętości 100 mikrolitrów na milion komórek, korzystając z tabel przeciwciał w manuskrypcie tekstowym.

Nie usuwając bloku FC, dodaj 100 mikrolitrów pełnych mieszanek barwiących i FMO do wybranych studzienek. Przygotuj pojedyncze kontrolki kompensacji barwy dla każdego przeciwciała i zestawu barwienia. Postępuj zgodnie ze wskazówkami producenta, jeśli używasz koralików kompensacyjnych.

Inkubować komórki i kulki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut, chroniąc przed światłem. Następnie odwirować i zdekantować supernatant, odwracając i przesuwając płytkę. Umyj komórki i kulki w 200 mikrolitrach buforu do barwienia trzykrotnie, za każdym razem odwirowując i dekantując supernatant

Ponownie zawiesić komórki i kulki w 200 mikrolitrach 2% paraformaldehydu w DPBS, aby utrwalić próbki do analizy. Inkubować komórkę i kulki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut, chroniąc przed światłem, a następnie odwirować i zdekantować supernatant poprzez odwrócenie lub strzepnięcie płytki. Ponownie zawiesić komórki i kulki w 200 mikrolitrach bufora do barwienia.

Umieść płytkę filtracyjną na czystej 96-dołkowej płytce dolnej w kształcie litery U i przenieś każdą próbkę do dołka na płycie filtracyjnej za pomocą pipety wielokrotnej. Odwirować płytkę filtracyjną i zdekantować supernatant. W przypadku paneli dojrzewania szpiku kostnego i śledziony należy ponownie zawiesić całkowicie wybarwione komórki w 100 mikrolitrach buforu do barwienia.

Połącz dwie studzienki dla każdego zwierzęcia w jedną studzienkę. Ponownie zawiesić pozostałe panele, FMO i kontrole w 200 mikrolitrach bufora do plam. Inkubuj stałe komórki i koraliki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, chroniąc przed światłem.

Rejestruj kontrole kompensacji dla każdego panelu barwienia przy użyciu przygotowanych pojedynczych kompensacji plam i ustaw bramki dodatnie i ujemne dla każdej próbki. Oblicz macierz wynagrodzeń za pomocą oprogramowania. Rozpocznij pobieranie pierwszej próbki, upewniając się, że bramki są odpowiednio ustawione.

Ustaw maszynę tak, aby działała i rejestrowała różne zdarzenia komórkowe dla każdej próbki, jak wspomniano w rękopisie tekstowym. Kontynuuj analizę danych za pomocą oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej, postępując zgodnie ze strategiami bramkowania opisanymi w rękopisie tekstowym. Analiza cytometryczna przepływowa w celu scharakteryzowania komórek B otrzewnej w otrzewnej pokazuje częstość żywotnych komórek otrzewnej, całkowitych komórek B, podzbiorów B-1 i B-2, a także komórek B-1a i B-1b u myszy.

Podczas analizy komórek B szpiku kostnego określono częstość żywotnych komórek, całkowitą liczbę komórek B, frakcję A, komórki pre-pro-B, frakcję B, frakcję C, frakcję C'frakcję D, niedojrzałą frakcję E, przejściową frakcję E i frakcję F komórek B u myszy. Analiza limfocytów B śledziony pokazuje częstość występowania żywotnych komórek śledziony, całkowitych komórek B, przejściowych komórek B, komórek T1, T2, T3, dojrzałych komórek B, komórek pęcherzykowych I, komórek pęcherzykowych II, komórek prekursorowych i dojrzałych komórek strefy brzeżnej oraz komórek B-1 u myszy. Częstość występowania immunoglobuliny kappa i immunoglobuliny lambda B u myszy określono za pomocą analizy cytometrycznej przepływowej śledziony.

Podczas wykonywania tego protokołu należy rozwiązać problem wycieku sygnału z jednego detektora do następnego za pomocą elementów sterujących kompensacją. Kontrole te mogą być barwione pojedynczo komórkami lub za pomocą dostępnych na rynku kulek kompensacyjnych. Dodatkowe testy mogą być stosowane w połączeniu z cytometrią przepływową, takie jak immunohistochemia w celu wizualizacji lokalizacji komórek w narządach limfatycznych, a także mikroskopia dwufotonowa do analizy odpowiedzi komórek B w rzeczywistej przestrzeni i czasie.

Analiza cytometrii przepływowej przedziałów limfocytów B pozwala na scharakteryzowanie fenotypów związanych z BCR i powiązanymi niedoborami, zaburzeniami cząsteczek sygnałowych BCR lub zakłóceniami cytokin modulujących przeżycie komórek B.