Dynamiczny pomiar i obrazowanie naczyń włosowatych, tętniczek i perycytów w sercu myszy

Metoda ta może być stosowana do badania mikrokrążenia wieńcowego w żywej mysiej tkance serca i składnikach drzewa naczyniowego poprzez monitorowanie ex vivo ciśnienia i przepływu perfuzji tętniczej. Metoda ta stanowi użyteczną platformę do badania funkcji mikrokrążenia perycytów i odczynników w sercu, dzięki czemu mamy tendencję do pomiaru średnicy naczynia i ciśnienia światła tętniczki. Aby przygotować kaniulę do eksperymentu, użyj ściągacza do mikropipet, aby wytworzyć dwie kaniule z długimi cienkimi końcówkami, z jednej czystej probówki ze szkła borokrzemianowego.

Użyj cienkich nożyczek i mikroskopu preparacyjnego, aby przyciąć końcówkę każdej kaniuli do końcowej średnicy końcówki od 100 do 150 mikrometrów i wypoleruj końcówki, aby lekko zaokrąglić ostre krawędzie. Użyj platynowego drutu umieszczonego z boku trzonu, około dwóch milimetrów od końcówki, aby zgiąć kaniulę wzdłuż trzonu pod kątem około 45 stopni i włóż otwarty koniec kaniuli do uchwytu kaniuli. Następnie dokręć złączkę i użyj pięciomililitrowej strzykawki, aby przepłukać kaniulę i rurkę roztworem Tyrode'a.

Zamontuj uchwyt kaniuli na mikromanipulacji komory miografu ciśnieniowego. Aby zebrać serce myszy do eksperymentu, najpierw wprowadź do niego parę, wstrzyknij 500 mikrolitrów heparyny znieczulonej ośmio- do 16-tygodniowej czarnej myszy C 57. Po 10 minutach umieść mysz na podgrzewanym łóżku w pozycji leżącej na plecach i ustabilizuj łapy taśmą do etykietowania.

Za pomocą kleszczy i nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie w skórze brzucha, nad przeponą i przetnij przeponę i mostek, aby umożliwić wycięcie serca z jamy piersiowej. Umieść serce w lodowatym roztworze Tyrode'a zawierającym 30 milimolowy BDM i w razie potrzeby usuń z niego wszelkie tkanki łączne. Następnie umieść serce w wstępnie schłodzonej komorze prosektoryjnej, wypełnionej świeżym roztworem Tyrode'a uzupełnionym 30-milimolowym BDM.

Aby przygotować tętnicę przegrodową do kaniulacji, włącz serwopompę i ustaw ciśnienie w sterowniku serwomechanizmu w trybie przepływu. W sercu na PDMS, uważając, aby uniknąć uszkodzenia środkowej części tkanki i umieścić tkankę pod mikroskopem preparacyjnym. Usuń jeden lub oba przedsionki i rozetnij prawą komorę.

Usuń prawą wolną ścianę komory i odsłoń tętnicę przegrodową. Użyj nylonowej nici o średnicy 30 mikrometrów, aby zawiązać luźny węzeł wokół tętnicy przegrody. Za pomocą cienkich nożyczek usuń wolną ścianę lewej komory i przenieś preparat mięśni brodawkowatych do komory doświadczalnej.

Za pomocą mikromanipulatora wprowadź kaniulę do tętnicy przegrody międzygrobowej i zabezpiecz kaniulę szwem. Następnie za pomocą szpilek przymocuj mięsień brodawkowaty do dna komory z końcówką kaniuli równolegle do ściany tętnicy, tak aby można było uzyskać wyraźny widok układu naczyniowego i użyj strzykawki, aby stopniowo przepłukać roztwór przez kaniulę. Aby ustabilizować preparat tkankowy, włącz pompę perystaltyczną i w sposób ciągły przełączaj preparat z wstępnie zagazowanym roztworem soli fizjologicznej przy natężeniu przepływu od trzech do czterech mililitrów na minutę, włącz regulator temperatury roztworu do przefuzji i dostosuj temperaturę superfuzatu kąpieli do 35 do 37 stopni Celsjusza.

Podłącz kaniulę do serwopompy i wyreguluj przepływ, aby ustawić ciśnienie na około 10 milimetrów słupa rtęci. Pozwól superfuzji działać przez około 10 minut, a następnie zwiększ przepływ roztworu luminalnego, aby ustawić ciśnienie w tętnicy na około 60 milimetrów słupa rtęci i pozwól próbce ustabilizować się przez 30 do 60 minut z monitorowaniem. Aby załadować próbkę aglutyniną z kiełków pszenicy, należy perfaktorować preparat pięcioma mililitrami roztworu Tyrode'a, uzupełnionym 100 mikrogramami sprzężonej aglutyniny z kiełków pszenicy Alexa Fluor-488

Po 30 minutach zmień przyrząd do utylizowania z powrotem na normalny roztwór Tyrode'a i włącz system mikroskopu konfokalnego. Użyj mikroskopu przy mniejszej mocy powiększenia, aby zlokalizować tętnicę przegrody w trybie światła przechodzącego i rozpocznij obrazowanie za pomocą tego konfokalnego dysku obrotowego. Wybierz 40-krotne powiększenie obiektywu i laser wzbudzający 488 nanometrów, a następnie dostosuj intensywność lasera i częstotliwość próbkowania.

Aby zdefiniować zakres obrazowania, ustaw górną i dolną pozycję obrazowania dla mikroskopu oraz ustaw rozmiar kroku i parametry obrazowania Z-stack. Następnie wybierz folder do przechowywania obrazu i kliknij uruchom, aby rozpocząć nagrywanie obrazów. Gdy fluorescencyjny marker naczyniowy jest perfundowany do światła naczyniowego, możliwe jest uwidocznienie całych drzew naczyniowych za pomocą szybkiej mikroskopii konfokalnej.

Dalsze powiększenie umożliwia szczegółowe zobrazowanie naczynia włosowatego. Gdy pinacidil i wrażliwy na ATP agonista kanału potasowego jest podawany ze światła, średnica tętnic zwiększa się. Gdy endotelina zwężająca naczynia krwionośne jest nakładana ze światła.

Zmniejsza się średnica tętnicy. Gdy ustawiony przepływ jest stały, ciśnienie świetlne wzrasta. Na tych obrazach tkanki brodawkowatej transgenicznej myszy transgenicznej z ekspresją NG two DS red, zarówno naczynia włosowate, jak i perycyty można uwidocznić w tkance mięśniowej brodawkowatej, w warunkach, które lepiej naśladują fizjologię żywych zwierząt.

Ważne jest, aby w żadnym momencie zabiegu w rurki nie było żadnych pęcherzyków powietrza. Łącząc tę metodę z technikami obrazowania optycznego, preparat może być stosowany do badania mikrokrążenia w sercu i komunikacji międzykomórkowej między różnymi typami komórek, przy użyciu transgenicznych myszy wykorzystujących technologię fluorescencji.