Name: Dynamiczny pomiar i obrazowanie naczyń włosowatych, tętniczek i perycytów w sercu myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Poznaj metodę pomiaru mikrokrążenia wieńcowego w sercu myszy ex vivo z monitorowaniem ciśnienia perfuzji i przepływu tętniczego. Technika umożliwia badanie funkcji pericytów oraz dynamiki naczyń włosowatych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez Centrum Inżynierii i Technologii Biomedycznej (BioMET); NIH (1U01HL116321) i (1R01HL142290) oraz American Heart Association 10SDG4030042 (GZ), 19POST34450156 (HCJ).

Cała opieka nad zwierzętami była zgodna z wytycznymi Uniwersytetu Maryland w Baltimore oraz zatwierdzonymi protokołami Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt.
1. Przygotowanie roztworów
UWAGA: Przygotuj rozwiązania z wyprzedzeniem. W doświadczeniach stosuje się dwa rodzaje roztworów podstawowych: (1) roztwory soli fizjologicznej (PSS) do superfuzatu kąpielowego oraz (2) roztwory Tyrode'a do perfuzatu światła. Ciągłe bulgotanie z CO2 jest potrzebne do utrzymania pH PSS. Roztwór Tyrode'a buforowany przez HEPES jest używany w świetle zamiast PSS, aby uniknąć przedostawania się pęcherzyków do naczyń, ponieważ pęcherzyki uszkadzają komórki śródbłonka7 i blokują przepływ.
<ol>
	<li>Roztwór PSS: Patrz wzór i skład roztworu PSS w Tabeli 1. Przygotować 10 l roztworu podstawowego PSS wolnego od Ca2+ i glukozy i przechowywać w temperaturze pokojowej. Na 1 godzinę przed zabiegiem należy wyjąć 1 l roztworu podstawowego i bąbelkować 5% CO2 (74% N2 i 21% O2 ), aby utrzymać pH roztworu na poziomie ~7,4. Dodać 1,8 g glukozy i 1,8 ml CaCl2 (1 M bulionu)8, 
	UWAGA: Dodaj Ca2+ tylko po bulgotaniu, gdy pH wynosi ~ 7,4, w przeciwnym razie Ca2+ zostanie wytrącony.</li>
	<li>Roztwór Tyrode'a: Patrz wzór i skład roztworu Tyrode'a w Tabeli 1. Przefiltrować roztwór (0,22 μm) i przechowywać w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości9.</li>
	<li>Roztwór Tyrode'a z BDM (monoksymem 2,3-butanodionu): Dodaj BDM jako odwracalny inhibitor miofilamentów, aby zapobiec skurczowi miocytów10. Odważyć 600 mg BDM i dodać do 200 ml roztworu Tyrode'a. Mieszaj roztwór z BDM, aż do całkowitego rozpuszczenia. Nie jest wymagana dalsza filtracja.</li>
	<li>Roztwór Tyrode zawierający BDM należy przechowywać w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komory
<ol>
	<li>Zarówno komorę preparacyjną, jak i komorę doświadczalną należy wcześniej pokryć polidimetylosiloksanem (PDMS) zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez producenta.</li>
	<li>Napełnij komorę sekcyjną roztworem Tyrode'a zawierającym BDM.</li>
	<li>Włącz chłodziarkę na 1 godzinę przed zabiegiem. Ustaw temperaturę na 4 °C.</li>
</ol>
3. Przygotowanie kaniuli
<ol>
	<li>Włącz ściągacz do mikropipet. Wybierz ustawienia zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Weź czystą rurkę ze szkła borokrzemianowego (zewnętrzna i wewnętrzna średnica użytych szklanych rurek wynosiła odpowiednio 1,2 mm i 0,69 mm).</li>
	<li>Włóż szklaną rurkę do rowkowanych zacisków ściągacza do pipet Sutter z platynowym żarnikiem grzewczym w kształcie litery U.</li>
	<li>Aktywuj ściągacz, aby wytworzyć dwie kaniule, każda z długą, cienką końcówką.</li>
	<li>Odetnij końcówkę każdej kaniuli za pomocą cienkich nożyczek pod mikroskopem preparacyjnym, aby uzyskać ostateczną średnicę końcówki około 100 do 150 μm.</li>
	<li>Wypoleruj końcówkę przeciętej kaniuli, aby lekko zaokrąglić ostre krawędzie.</li>
	<li>Zegnij kaniulę wzdłuż trzonu za pomocą drutu platynowego (podgrzewanego z precyzyjną kontrolą) umieszczonego z boku wału około 2 mm od końcówki. Kąt zgięcia w kaniuli powinien wynosić około 45°.</li>
	<li>Włóż otwarty koniec kaniuli do uchwytu komory miografu ciśnieniowego i dokręć złączkę. Podłączyć strzykawkę o pojemności 5 ml wypełnioną roztworem Tyrode do drugiej strony złączki. Podłącz kaniulę do mikromanipulatora zamontowanego na komorze (patrz Rysunek 1 i <silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Napełnij kaniulę roztworem Tyrode'a za pomocą strzykawki (5 ml), przepłukując ją, rurkę i łącznik pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Przed zabiegiem kaniulacji zmierz ciśnienie perfuzji wewnątrz kaniuli w danym zakresie przepływu (od 50 do 300 μl/min, <klasa silna = "xfig">Rysunek 3). Rób to tylko wtedy, gdy używana jest nowa kaniula. 
	UWAGA: Ciśnienie perfuzji wewnątrz kaniuli jest proporcjonalne do przepływu i jest dopasowane liniowo (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
</ol>
4. Ekstrakcja serca myszy
<ol>
	<li>Umieść mysz C57BL/6 (dowolnej płci, w wieku 8-16 tygodni) w pudełku anestezjologicznym, które jest podłączone do zbiorników z izofluranem i tlenem.</li>
	<li>Włącz butlę z tlenem i rozpocznij przepływ izofluranu. Odczekaj ~5 min, aż mysz zostanie w pełni znieczulona.</li>
	<li>Po ustaleniu znieczulenia wyjmij mysz z pudełka anestezjologicznego i wstrzyknij heparynę IP (do jamy otrzewnej, 360 jednostek, 0,5 ml / mysz), aby uniknąć tworzenia się skrzepów krwi w naczyniach krwionośnych. Następnie włóż mysz z powrotem do pudełka anestezjologicznego.</li>
	<li>Po 10 minutach od wstrzyknięcia heparyny należy przesunąć mysz do podgrzewanego łóżka w pozycji leżącej na plecach i ustabilizować jej łapki za pomocą taśmy do etykietowania. Trzymaj mysz w pełnym znieczuleniu izofluranem za pomocą stożka nosowego.</li>
	<li>Podnieś skórę brzucha myszy nad przeponę za pomocą kleszczy i użyj nożyczek chirurgicznych, aby przeciąć i odsłonić przeponę.</li>
	<li>Przetnij przeponę i mostek. Otwórz skrzynię.</li>
	<li>Wypreparuj serce z jamy klatki piersiowej, przecinając jak najbliżej grzbietowej ściany klatki piersiowej.</li>
	<li>Umieść serce w lodowatym roztworze Tyrode'a zawierającym 30 mM BDM.</li>
	<li>Oczyść serce, aby usunąć tkanki łączne, takie jak płuca.</li>
	<li>Przenieś serce do wstępnie schłodzonej komory preparacyjnej wypełnionej roztworem Tyrode'a zawierającym 30 mM BDM.</li>
</ol>
5. Przygotowanie i kaniulacja tętnicy przegrody międzygrodowej
<ol>
	<li>Włącz serwopompę. Ustaw serwopompę w tryb "przepływu". Pozwól mu pracować z dużą prędkością, aż rurka zostanie wypełniona roztworem Tyrode, który zostanie użyty do perfuzji światła naczyniowego. Upewnij się, że w rurkach nie ma pęcherzyków. Następnie zmniejsz prędkość.</li>
	<li>Przypnij serce do PDMS, unikając uszkodzenia środkowej części serca.</li>
	<li>Usuń zarówno prawy, jak i lewy przedsionek. Rozetnij prawą komorę i usuń prawą wolną ścianę komory za pomocą mikroskopu preparacyjnego.</li>
	<li>Odsłoń i zidentyfikuj tętnicę przegrodową. Umieść nylonową nić (o średnicy 30 μm) pod tętnicą przegrodową i zawiąż luźny węzeł do wykorzystania w przyszłości. 
	UWAGA: Tętnicę przegrodową można łatwo zidentyfikować za pomocą mikroskopu preparacyjnego. Tętnica przegrodowa jest w większości przypadków główną tętnicą na przegrodzie wychodzącą z prawej tętnicy wieńcowej.</li>
	<li>Usuń wolną ścianę lewej komory za pomocą cienkich nożyczek.</li>
	<li>Przenieść preparat mięśni brodawkowatych do komory doświadczalnej, w której umieszczono kaniulę. Komora jest wypełniona roztworem Tyrode'a zawierającym BDM. Dno tej komory pokryte jest cienką (~2 mm) warstwą PDMS.</li>
	<li>Dostosuj położenie kaniuli (za pomocą mikromanipulatora), aby umożliwić kaniulację tętnicy przegrodowej. Zaciśnij węzeł.</li>
	<li>Przymocuj mięsień brodawkowaty za pomocą małych szpilek do dna komory, tak aby obiektyw mikroskopu miał wyraźny widok na naczynia krwionośne. Zwróć uwagę na kąt i położenie kaniuli i upewnij się, że końcówka kaniuli jest równoległa do ściany tętnicy.</li>
	<li>Przetestuj kaniulację poprzez stopniowe wypychanie roztworu ze strzykawki przez kaniulę. Jeśli wszystkie pierwiastki funkcjonują prawidłowo, resztki krwi w mięśniu brodawkowatym opuszczą tkankę na początku tego procesu i później będzie widoczny tylko roztwór Tyrode'a.</li>
</ol>
6. Stabilizacja preparatu
<ol>
	<li>Włącz pompę perystaltyczną, która dostarczy roztwór do superfuzji. Następnie należy stale przelać preparat w kąpieli za pomocą wstępnie zagazowanego PSS z szybkością 3-4 ml/min.</li>
	<li>Włącz regulator temperatury roztworu do superfuzji. Ustawić temperaturę superfusatu kąpieli na ~35-37 °C.</li>
	<li>Podłącz kaniulę do serwopompy. Odczytaj ciśnienie wyświetlane na sterowniku serwomechanizmu ciśnienia.</li>
	<li>Monitoruj przepływ i ciśnienie. Przepływ (μl/min) i ciśnienie perfuzji tętniczej (mm Hg) są digitalizowane za pomocą digitizera i rejestrowane za pomocą odpowiedniego oprogramowania (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Dostosuj przepływ, aby ustawić ciśnienie ~10 mmHg i pozwól mu pracować przez ~10 minut.</li>
	<li>Zwiększ przepływ roztworu luminalnego, aby ciśnienie w tętnicy wynosiło ~60 mmHg. Uzyskaj końcowe ciśnienie perfuzji samej tętniczki, odejmując spadek ciśnienia kaniuli (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3). 
	UWAGA: Jeśli wybrany jest tryb "ciśnienia" na serwosterowniku ciśnienia, ciśnienie światła jest ustawiane na ~60 mmHg dla tych eksperymentów. Następnie monitoruj zmianę przepływu.</li>
	<li>Pozwól próbce ustabilizować się przez ~ 30-60 minut, monitorując poziom przepływu i/lub ciśnienia. Stopniowy wzrost ciśnienia tętniczego obserwuje się zwykle na początku perfuzji po kanelulacji. Nowy stan ustalony ustabilizuje się sam w ciągu około 30 minut (<silna klasa="xfig">Rysunek 4).</li>
	<li>Rozpocznij eksperyment po ustabilizowaniu się ciśnienia perfuzji (przy stałym przepływie).</li>
</ol>
7. Ładowanie preparatu fluorescencyjnie znakowaną aglutyniną z kiełków pszenicy (WGA)
<ol>
	<li>Przygotować roztwór Tyrode'a zawierający sprzężony z Alexa-Fluor-488 WGA, dodając 100 μg sprzężonego WGA do 5 ml roztworu Tyrode'a.</li>
	<li>Ostrożnie zmienić perfuzat z normalnego roztworu Tyrode'a na taki, który zawiera fluorescencyjnie znakowany WGA. Ważne jest, aby ostrożnie zmienić perfuzat, aby nie zostały wprowadzone pęcherzyki.</li>
	<li>Po ~30 minutach perfuzji WGA lub gdy roztwór WGA ma się skończyć, zmień perfuzat z powrotem na normalny roztwór Tyrode.</li>
</ol>
8. Obrazowanie konfokalne tętniczek i naczyń włosowatych
<ol>
	<li>Włącz system mikroskopu konfokalnego z dyskiem Nipkow.</li>
	<li>Użyj mikroskopu, aby zlokalizować tętnicę przegrody za pomocą obiektywu o małej mocy (4x) w trybie światła przechodzącego. 
	UWAGA: Tętnicę przegrodową można zlokalizować, postępując zgodnie z położeniem kaniuli.</li>
	<li>Rozpocznij obrazowanie konfokalne za pomocą konfokalnego dysku wirującego i wybierz laser wzbudzający 488 nm, 40-krotne powiększenie obiektywu i dostosuj intensywność lasera oraz częstotliwość próbkowania (10 - 500 ms na obraz).</li>
	<li>Ustaw górną i dolną pozycję obrazowania dla mikroskopu konfokalnego, aby zdefiniować zakres obrazowania i wprowadzić parametry obrazowania z-stack</li>.
	<li>Ustaw rozmiar kroku zgodnie z zaleceniami dla używanego systemu lub ustaw rozmiar kroku zgodnie z potrzebami.</li>
	<li>Wybierz ustawienie stosu z i/lub ustawienia szeregów czasowych.</li>
	<li>Wybierz lub ustaw nowy folder do przechowywania nowego obrazu.</li>
	<li>Kliknij "Uruchom", aby rozpocząć nagrywanie obrazowania do przyszłej analizy (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 5).</li>
</ol>
9. Przykładowy eksperyment z rozszerzaczem naczyń krwionośnych: rozszerzenie naczyń krwionośnych wywołane pinacidylem (Wideo 1).
<ol>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy pinacidylu (100 mM w DMSO) i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotuj 10 ml roztworu Tyrode'a. Dodać 10 μl roztworu podstawowego pinacidilu, aby uzyskać końcowe stężenie pinacidylu 100 μM.</li>
	<li>Wyobraź sobie mięsień brodawkowaty w małym powiększeniu (obiektyw 4x), aby uwzględnić tętnicę przegrodową i tętniczki rozgałęzione.</li>
	<li>Zmienić roztwór luminalny na roztwór zawierający pinacidil.</li>
</ol>
10. Przykładowe eksperymenty kontroli przepływu krwi: wzrost ciśnienia perfuzji tętniczej wywołany przez zwężający naczynia krwionośne przy stałym przepływie (Rysunek 6)
<ol>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy endoteliny-1 (ET-1) (10 μM) i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotuj 10 ml roztworu Tyrode'a. Dodać 10 μl roztworu podstawowego ET-1 (10 μM), aby uzyskać końcowe stężenie ET-1 10 nM.</li>
	<li>Zapisz ciśnienie światła przy stałym przepływie i zobrazuj mięsień brodawkowaty.</li>
	<li>Zamień roztwór luminalny na roztwór zawierający ET-1.</li>
</ol>
11. Przykładowe obrazy naczyń włosowatych z perycytami (Rysunek 7)
<ol>
	<li>Poświęć transgeniczną mysz NG2DsRedBAC, jak opisano w sekcji 4 niniejszego protokołu.</li>
	<li>Wyodrębnij serce, kanuluj tętnicę przegrodową i załaduj próbkę sprzężonym WGA Alexa-Fluor-488 zgodnie z protokołami 5-7.</li>
	<li>Zobrazuj mięsień brodawkowaty przy wzbudzeniu 488 nm i 560 nm oraz emisji 510-525 nm, 575-625 nm za pomocą konfokalu. Ciśnienie w tętniczce wyniesie około 40 mmHg.</li>
</ol>

<ol><li>Zhao, G., Joca, H. C., Nelson, M. T., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-+and+voltage-dependent+electro-metabolic+signaling+regulates+blood+flow+in+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">ATP- and voltage-dependent electro-metabolic signaling regulates blood flow in heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, 7461-7470 (2020).</li>
<li>Schouten, V. J., Allaart, C. P., Westerhof, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+perfusion+pressure+on+force+of+contraction+in+thin+papillary+muscles+and+trabeculae+from+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effect of perfusion pressure on force of contraction in thin papillary muscles and trabeculae from rat heart.</a> Journal of Physiology. 451, 585-604 (1992).</li>
<li>Tillmanns, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcirculation+in+the+ventricle+of+the+dog+and+turtle%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Microcirculation in the ventricle of the dog and turtle.</a> Circulation Research. 34, 561-569 (1974).</li>
<li>Martini, J., Honig, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+intercapillary+distance+in+beating+rat+heart+in+situ+under+various+conditions+of+O2+supply%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of intercapillary distance in beating rat heart in situ under various conditions of O2 supply.</a> Microvascular Research. 1, 244-256 (1969).</li>
<li>Nellis, S. H., Liedtke, A. J., Whitesell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+coronary+vessel+pressure+and+diameter+in+an+intact+beating+rabbit+heart+using+fixed-position+and+free-motion+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Small coronary vessel pressure and diameter in an intact beating rabbit heart using fixed-position and free-motion techniques.</a> Circulation Research. 49, 342-353 (1981).</li>
<li>Marcus, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+coronary+circulation+through+studies+at+the+microvascular+level%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Understanding the coronary circulation through studies at the microvascular level.</a> Circulation. 82, 1-7 (1990).</li>
<li>Ralevic, V., Kristek, F., Hudlicka, O., Burnstock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+protocol+for+removal+of+the+endothelium+from+the+perfused+rat+hind-limb+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">A new protocol for removal of the endothelium from the perfused rat hind-limb preparation.</a> Circulation Research. 64, 1190-1196 (1989).</li>
<li>Zhao, G., Adebiyi, A., Blaskova, E., Xi, Q., Jaggar, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate+receptors+mediate+UTP-induced+cation+currents%2C+Ca2%2B+signals%2C+and+vasoconstriction+in+cerebral+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Amercian+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate receptors mediate UTP-induced cation currents, Ca2+ signals, and vasoconstriction in cerebral arteries.</a> Amercian Journal of Physiology-Cell Physiology. 295, 1376-1384 (2008).</li>
<li>Zhao, G., Li, T., Brochet, D. X., Rosenberg, P. B., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STIM1+enhances+SR+Ca2%2B+content+through+binding+phospholamban+in+rat+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">STIM1 enhances SR Ca2+ content through binding phospholamban in rat ventricular myocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 4792-4801 (2015).</li>
<li>Stowe, D. F., Boban, M., Graf, B. M., Kampine, J. P., Bosnjak, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contraction+uncoupling+with+butanedione+monoxime+versus+low+calcium+or+high+potassium+solutions+on+flow+and+contractile+function+of+isolated+hearts+after+prolonged+hypothermic+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Contraction uncoupling with butanedione monoxime versus low calcium or high potassium solutions on flow and contractile function of isolated hearts after prolonged hypothermic perfusion.</a> Circulation. 89, 2412-2420 (1994).</li>
<li>Lawton, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Low-Cost+and+Open+Source+Pressure+Myograph+System+for+Vascular+Physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">a Low-Cost and Open Source Pressure Myograph System for Vascular Physiology.</a> Frontiers in Physiology. 10, 99(2019).</li>
<li>Kim, K. J., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+in+vitro+approach+to+study+neurovascular+coupling+mechanisms+in+the+brain+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation.</a> Journal of Physiology. 590, 1757-1770 (2012).</li>
</ol>

W niniejszej pracy przedstawiliśmy niezwykle prostą, a jednocześnie bardzo praktyczną metodę badania ex vivo mikrokrążenia wieńcowego w sercu w warunkach fizjologicznych. Metoda ta została zmodyfikowana na podstawie badań mechanicznych na szczurach2. Wyzwaniem była technologia obrazowania o dużej szybkości i wysokiej rozdzielczości optycznej. Dzięki temu mogliśmy skorzystać z zaawansowanych systemów obrazowania optycznego, które są obecnie dostępne na rynku. Dzięki starannemu rozwarstwieniu i umie...

Odpowiednia regulacja przepływu w naczyniu wieńcowym zapewnia wystarczające ukrwienie serca, aby zaspokoić jego zapotrzebowanie metaboliczne1. Jednak dopiero niedawno stało się jasne, w jaki sposób przepływ ciśnienia w naczyniach wieńcowych jest dynamicznie regulowany w sercu, pomimo szeroko zakrojonych badań przeprowadzonych in vivo i in vitro w ciągu ostatnich dziesięcioleci. Jednym z powodów jest trudność w ustaleniu fizjologicznego modelu roboczego dla takich badań ze względu na ciągłe bicie serca. Niezależnie od tego, opracowano różne metody obserwacji mikronaczyń wieńcowych w żywych tkankach lub zwierzętach, ale żadna z tych metod nie była w stanie osiągnąć stałego/stabilnego ogniskowania i pomiarów ciśnienia, przepływu i średnicy mikronaczyń w tym samym czasie2,3. Bezpośrednia wizualizacja mikronaczyń tętniczych naczyń wieńcowych w bijącym sercu została wprowadzona kilkadziesiąt lat temu4,3, ale pomiary średnicy w małych naczyniach były trudne, a specyficzne funkcje wielu wyspecjalizowanych typów komórek związanych z mikrokrążeniem były równie irytujące. Nawet metoda stroboskopowa i system pływających obiektywów nie były w stanie dostarczyć powyższych informacji jednocześnie5. Niemniej jednak przy użyciu wyżej wymienionych technologii uzyskano znaczną ilość cennych informacji, które pomogły nam lepiej zrozumieć regulację przepływu krwi w naczyniach wieńcowych6. Metoda, którą opisujemy w tym artykule, pomoże w szczegółowym zbadaniu i zrozumieniu, w jaki sposób składniki tętnic wieńcowych, tętniczek i mikrokrążenia różnie reagują na stymulacje i wymagania metaboliczne.
Model roboczy, który stworzyliśmy w celu prowadzenia tych badań, został zbudowany na podstawie poprzedniej pracy Westerhof et al.2. Po kaniulacji tętnicy przegrodowej serca myszy, fizjologiczny roztwór soli fizjologicznej został użyty do perfuzji tej tętnicy, aby utrzymać odżywienie miocytów i innych składników tkanki serca. Ciśnienie perfuzji tętniczej, przepływ i średnicę naczyń monitorowano, a także inne funkcje fizjologiczne za pomocą odpowiednich wskaźników fluorescencyjnych. Metoda ta pozwala po raz pierwszy uwidocznić łożysko mikronaczyniowe naczyń wieńcowych pod ciśnieniem fizjologicznym w żywej tkance oraz zbadać mechanizmy komórkowe leżące u podstaw regulacji mikrokrążenia.

<table><tbody><tr><td>1 M roztwór CaCl2</td><td>MilliporeSigma, Stany Zjednoczone</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>1 M roztwór MgCl2</td><td>MiliporeSigma, Stany Zjednoczone</td><td>Oprogramowanie M1028</td><td></td></tr><tr><td>AxoScope</td><td>Molecular Devices, San Jose, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agregat chłodniczy/inkubator wodny</td><td>FisherScientific, Stany Zjednoczone</td><td>Isotemp 3016S</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalne</td><td>instrumenty firmy Nikon, Stany Zjednoczone</td><td>A1R</td><td></td></tr><tr><td>Niestandardowe rurki szklane</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>9-000-3301</td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1322A</td><td>Molecular Devices, San Jose, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Olympus, Japonia</td><td>SZX12</td><td></td></tr><tr><td>Endothelin-1</td><td>MilliporeSigma, USA</td><td>E7764</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna sodowa Sól</td><td>Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór liniowy Grzałka</td><td>Warner Istruments, Hamden, CT, USA</td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>VETone, Idaho, Stany Zjednoczone</td><td>502017</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instruments, Novato, Kalifornia, USA</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na mikropipety/kaniulę</td><td>Warner Istruments, Hamden, CT, USA</td><td>64-0981</td><td></td></tr><tr><td>Mysz transgeniczna NG2DsRedBAC</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>#008241</td><td></td></tr><tr><td>Nylonowa nić do wiązania naczyń krwionośnych</td><td>Oprzyrządowanie systemów żywych, Burlington, Vt, USA</td><td>THR-G</td><td></td></tr><tr><td>PDMS (polidimetylosiloksan)</td><td>SYLGARD, Germantown, WI, USA</td><td>184 ZESTAW</td><td></td>SIL ELAST</tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Gilson, Middleton, WI, USA</td> Serwo ciśnieniowe <td>minipuls 3</td><td></td></tr><tr><td> Oprzyrządowanie kontrolera</td><td>systemów żywych, Burlington, Vt, USA</td><td>PS-200-S</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Precyzyjne narzędzia naukowe, Foster City, CA, USA</td><td>15000-10</td><td></td></tr><tr>Oprzyrządowanie żywych systemów<td>serwopompy</td><td>, Burlington, Vt, USA</td><td>Regulator temperatury PS-200-P</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Warner Instruments, Hamden, CT, USA</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>Aglutynina z kiełków pszenicy, Alexa Fluor 488 Sprzężony</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA USA</td><td>W11261</td><td></td></tr></tbody></table>

dynamiczny pomiar i obrazowanie naczyń włosowatych, tętniczek i perycytów w sercu myszy

Dynamic Measurement and Imaging of Capillaries, Arterioles, and Pericytes in Mouse Heart

Napięcie tętnic wieńcowych wraz z otwieraniem lub zamykaniem naczyń włosowatych w dużej mierze determinuje przepływ krwi do kardiomiocytów przy stałym ciśnieniu perfuzji. Trudno jest jednak monitorować dynamiczne zmiany tętniczek wieńcowych i naczyń włosowatych w całym sercu, przede wszystkim ze względu na jego ruch i nieustanne bicie. W tym artykule opisano metodę, która umożliwia monitorowanie szybkości perfuzji tętniczej, ciśnienia oraz zmian średnicy tętniczek i naczyń włosowatych w mięśniach brodawkowatych prawej komory myszy. Tętnica przegrody nosowej myszy jest kaniulowana i perfundowana przy stałym przepływie lub ciśnieniu, przy czym druga tętnica jest mierzona dynamicznie. Po perfuzji z lektyną znakowaną fluorescencyjnie (np. Alexa Fluor-488 lub -633 znakowaną aglutyniną z kiełków pszenicy, WGA), tętniczki i naczynia włosowate (i inne naczynia) w mięśniu brodawkowatym prawej komory i przegrodzie można łatwo zobrazować. Zmiany średnicy naczynia można następnie zmierzyć w obecności lub braku skurczów serca. Gdy genetycznie kodowane białka fluorescencyjne uległy ekspresji, można było monitorować określone cechy. Na przykład perycyty zwizualizowano w sercach myszy, które wykazywały ekspresję NG2-DsRed. Metoda ta stanowi użyteczną platformę do badania fizjologicznych funkcji perycytów naczyń włosowatych w sercu. Nadaje się również do badania wpływu odczynników na przepływ krwi w sercu poprzez jednoczesny pomiar średnicy naczyń krwionośnych / naczyń włosowatych i ciśnienia świetlnego w tętnicach. Preparat ten, w połączeniu z najnowocześniejszym systemem obrazowania optycznego, pozwala badać przepływ krwi i jej kontrolę na poziomie komórkowym i molekularnym w sercu w warunkach zbliżonych do fizjologicznych.

Kiedy do światła naczyń wprowadzany jest fluorescencyjny marker naczyniowy (w tym przypadku WGA sprzężony z Alexa Fluor-48), możliwe jest zwizualizowanie całych drzew naczyniowych, jak pokazano na Ryc. 5 (panel lewy), przy użyciu konfokalnego mikroskopu wysokiej rozdzielczości. Dalsze powiększenie umożliwia szczegółowe obrazowanie naczyń włosowatych (Ryc. 5, panel prawy). Ponieważ system ciśnieniowy pozwala na stałe monitorowanie ciśnienia w świetle naczynia, pr...

Prezentowany tutaj jest protokół do badania mikrokrążenia wieńcowego w żywej tkance serca mysiego poprzez monitorowanie ex vivo ciśnienia perfuzji tętniczej i przepływu, który utrzymuje ciśnienie, a także składników drzewa naczyniowego, w tym łożysk naczyń włosowatych i perycytów, gdy tętnica przegrody jest kaniulowana i poddawana ciśnieniu.

Dynamiczny pomiar i obrazowanie naczyń włosowatych, tętniczek i perycytów w sercu myszy

Coronary arterial tone along with the opening or closing of the capillaries largely determine the blood flow to cardiomyocytes at constant perfusion ...

Metoda ta może być stosowana do badania mikrokrążenia wieńcowego w żywej mysiej tkance serca i składnikach drzewa naczyniowego poprzez monitorowanie ex vivo ciśnienia i przepływu perfuzji tętniczej. Metoda ta stanowi użyteczną platformę do badania funkcji mikrokrążenia perycytów i odczynników w sercu, dzięki czemu mamy tendencję do pomiaru średnicy naczynia i ciśnienia światła tętniczki. Aby przygotować kaniulę do eksperymentu, użyj ściągacza do mikropipet, aby wytworzyć dwie kaniule z długimi cienkimi końcówkami, z jednej czystej probówki ze szkła borokrzemianowego.Użyj cienkich nożyczek i mikroskopu preparacyjnego, aby przyciąć końcówkę każdej kaniuli do końcowej średnicy końcówki od 100 do 150 mikrometrów i wypoleruj końcówki, aby lekko zaokrąglić ostre krawędzie. Użyj platynowego drutu umieszczonego z boku trzonu, około dwóch milimetrów od końcówki, aby zgiąć kaniulę wzdłuż trzonu pod kątem około 45 stopni i włóż otwarty koniec kaniuli do uchwytu kaniuli. Następnie dokręć złączkę i użyj pięciomililitrowej strzykawki, aby przepłukać kaniulę i rurkę roztworem Tyrode'a.Zamontuj uchwyt kaniuli na mikromanipulacji komory miografu ciśnieniowego. Aby zebrać serce myszy do eksperymentu, najpierw wprowadź do niego parę, wstrzyknij 500 mikrolitrów heparyny znieczulonej ośmio- do 16-tygodniowej czarnej myszy C 57. Po 10 minutach umieść mysz na podgrzewanym łóżku w pozycji leżącej na plecach i ustabilizuj łapy taśmą do etykietowania.Za pomocą kleszczy i nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie w skórze brzucha, nad przeponą i przetnij przeponę i mostek, aby umożliwić wycięcie serca z jamy piersiowej. Umieść serce w lodowatym roztworze Tyrode'a zawierającym 30 milimolowy BDM i w razie potrzeby usuń z niego wszelkie tkanki łączne. Następnie umieść serce w wstępnie schłodzonej komorze prosektoryjnej, wypełnionej świeżym roztworem Tyrode'a uzupełnionym 30-milimolowym BDM.Aby przygotować tętnicę przegrodową do kaniulacji, włącz serwopompę i ustaw ciśnienie w sterowniku serwomechanizmu w trybie przepływu. W sercu na PDMS, uważając, aby uniknąć uszkodzenia środkowej części tkanki i umieścić tkankę pod mikroskopem preparacyjnym. Usuń jeden lub oba przedsionki i rozetnij prawą komorę.Usuń prawą wolną ścianę komory i odsłoń tętnicę przegrodową. Użyj nylonowej nici o średnicy 30 mikrometrów, aby zawiązać luźny węzeł wokół tętnicy przegrody. Za pomocą cienkich nożyczek usuń wolną ścianę lewej komory i przenieś preparat mięśni brodawkowatych do komory doświadczalnej.Za pomocą mikromanipulatora wprowadź kaniulę do tętnicy przegrody międzygrobowej i zabezpiecz kaniulę szwem. Następnie za pomocą szpilek przymocuj mięsień brodawkowaty do dna komory z końcówką kaniuli równolegle do ściany tętnicy, tak aby można było uzyskać wyraźny widok układu naczyniowego i użyj strzykawki, aby stopniowo przepłukać roztwór przez kaniulę. Aby ustabilizować preparat tkankowy, włącz pompę perystaltyczną i w sposób ciągły przełączaj preparat z wstępnie zagazowanym roztworem soli fizjologicznej przy natężeniu przepływu od trzech do czterech mililitrów na minutę, włącz regulator temperatury roztworu do przefuzji i dostosuj temperaturę superfuzatu kąpieli do 35 do 37 stopni Celsjusza.Podłącz kaniulę do serwopompy i wyreguluj przepływ, aby ustawić ciśnienie na około 10 milimetrów słupa rtęci. Pozwól superfuzji działać przez około 10 minut, a następnie zwiększ przepływ roztworu luminalnego, aby ustawić ciśnienie w tętnicy na około 60 milimetrów słupa rtęci i pozwól próbce ustabilizować się przez 30 do 60 minut z monitorowaniem. Aby załadować próbkę aglutyniną z kiełków pszenicy, należy perfaktorować preparat pięcioma mililitrami roztworu Tyrode'a, uzupełnionym 100 mikrogramami sprzężonej aglutyniny z kiełków pszenicy Alexa Fluor-488.Po 30 minutach zmień przyrząd do utylizowania z powrotem na normalny roztwór Tyrode'a i włącz system mikroskopu konfokalnego. Użyj mikroskopu przy mniejszej mocy powiększenia, aby zlokalizować tętnicę przegrody w trybie światła przechodzącego i rozpocznij obrazowanie za pomocą tego konfokalnego dysku obrotowego. Wybierz 40-krotne powiększenie obiektywu i laser wzbudzający 488 nanometrów, a następnie dostosuj intensywność lasera i częstotliwość próbkowania.Aby zdefiniować zakres obrazowania, ustaw górną i dolną pozycję obrazowania dla mikroskopu oraz ustaw rozmiar kroku i parametry obrazowania Z-stack. Następnie wybierz folder do przechowywania obrazu i kliknij uruchom, aby rozpocząć nagrywanie obrazów. Gdy fluorescencyjny marker naczyniowy jest perfundowany do światła naczyniowego, możliwe jest uwidocznienie całych drzew naczyniowych za pomocą szybkiej mikroskopii konfokalnej.Dalsze powiększenie umożliwia szczegółowe zobrazowanie naczynia włosowatego. Gdy pinacidil i wrażliwy na ATP agonista kanału potasowego jest podawany ze światła, średnica tętnic zwiększa się. Gdy endotelina zwężająca naczynia krwionośne jest nakładana ze światła.Zmniejsza się średnica tętnicy. Gdy ustawiony przepływ jest stały, ciśnienie świetlne wzrasta. Na tych obrazach tkanki brodawkowatej transgenicznej myszy transgenicznej z ekspresją NG two DS red, zarówno naczynia włosowate, jak i perycyty można uwidocznić w tkance mięśniowej brodawkowatej, w warunkach, które lepiej naśladują fizjologię żywych zwierząt.Ważne jest, aby w żadnym momencie zabiegu w rurki nie było żadnych pęcherzyków powietrza. Łącząc tę metodę z technikami obrazowania optycznego, preparat może być stosowany do badania mikrokrążenia w sercu i komunikacji międzykomórkowej między różnymi typami komórek, przy użyciu transgenicznych myszy wykorzystujących technologię fluorescencji.

dynamic-measurement-imaging-capillaries-arterioles-pericytes-mouse

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Mikroskopia wewnątrzżyciowa do śledzenia czasowych i przestrzennych zdarzeń hemodynamicznych i zapalnych w mikrokrążeniu opony miękkiej.

Mikroskopia intravitalna mikrokrążenia mózgu myszy z wykorzystaniem zamkniętego okna czaszkowego

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje procedurę sekcji, konfigurację aparatury oraz warunki eksperymentalne podczas mapowania optycznego potencjału błonowego (Vm) i wewnątrzkomórkowych przejściowych zmian stężenia wapnia (CaT) w nienaruszonych, izolowanych sercach myszy perfundowanych metodą Langendorffa.

Mapowanie optyczne potencjałów czynnościowych i przejściowych zmian stężenia wapnia w sercu myszy

Glikokaliks śródbłonka/warstwa powierzchniowa śródbłonka jest idealnie badana za pomocą mikroskopii przyżyciowej.  Mikroskopia przyżyciowa jest technicznie trudna w przypadku poruszającego się narządu, takiego jak płuca.   Pokazujemy, w jaki sposób można wykorzystać jednoczesną mikroskopię jasnego pola i mikroskopię fluorescencyjną do oszacowania grubości warstwy powierzchniowej śródbłonka w swobodnie poruszającym się płucu myszy in vivo.

In vivo (in vivo) Pomiar warstwy powierzchniowej śródbłonka płucnego myszy

Mikroskopia przyżyciowa myszy M. cremaster microcirculation oferuje unikalny i dobrze ustandaryzowany model in vivo do analizy migracji komórek macierzystych szpiku kostnego obwodowego.

Mikroskopia przyżyteczna mikrokrążenia w mięśniu Cremaster myszy do analizy migracji obwodowych komórek macierzystych

Badanie echokardiograficzne jest często stosowane u myszy. W tym celu opracowano drogie urządzenia ultrasonograficzne o wysokiej rozdzielczości. Protokół ten opisuje niedrogą procedurę echokardiograficzną połączoną z histologicznymi analizami morfometrycznymi w celu określenia morfologii serca.

Echokardiograficzne i histologiczne badanie morfologii serca u myszy

To badanie wykorzystuje technikę mikroskopii fluorescencyjnej z dwustronnym oświetleniem (LSFM) w połączeniu z oczyszczaniem optycznym do badania mysiego serca.

Mikroskopia fluorescencyjna z arkuszem świetlnym do badania mysiego serca

To badanie opisuje kompleksowy protokół obrazowania metodą rezonansu magnetycznego układu sercowo-naczyniowego (CMR) w celu ilościowego określenia parametrów funkcjonalnych lewej komory serca myszy. Protokół opisuje pozyskiwanie, przetwarzanie końcowe i analizę obrazów CMR, a także ocenę różnych parametrów czynnościowych serca.

Kwantyfikacja funkcji lewej komory serca myszy, napięcia mięśnia sercowego i sił hemodynamicznych za pomocą rezonansu magnetycznego układu sercowo-naczyniowego

Ten protokół przedstawia kroki do pozyskiwania i analizy fluorescencyjnych obrazów wapnia z perycytów otaczających mózg oraz danych o przepływie krwi z pobliskich naczyń krwionośnych u znieczulonych myszy. Techniki te są przydatne do badań nad fizjologią komórek szkieletowych i mogą być dostosowane do badania stanów przejściowych wapnia w dowolnym typie komórki.

Obrazowanie wapnia i hemodynamiki perycytów mózgu u myszy transgenicznych in vivo

Przedstawiamy metodę mezoskopowej rekonstrukcji całego serca myszy poprzez połączenie nowych osiągnięć w transformacji tkanek i barwieniu z rozwojem osiowo skanowanego mikroskopu świetlnego.

Mezoskopowe obrazowanie optyczne całego serca myszy

Intensywne przygotowanie nienaruszonych "rurek" śródbłonka mózgu myszy z tętniczek miąższowych mózgu jest zilustrowane do badania regulacji przepływu krwi w mózgu. Ponadto pokazujemy eksperymentalne mocne strony tego modelu badania śródbłonka do obrazowania fluorescencyjnego i pomiaru elektrofizjologii kluczowych szlaków sygnalizacji komórkowej, w tym zmian wewnątrzkomórkowych [Ca2+] i potencjału błonowego.

Izolacja i analiza funkcjonalna śródbłonka tętniczego miąższu mózgu myszy

Ten protokół wprowadza szybką metodę ilościowego trójwymiarowego obrazowania naczyń krwionośnych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z użyciem arkusza świetlnego. Skuteczność metody wykazano przy użyciu systemu tętnic łukowatych gardła w modelu zarodka pisklęcia, z siłami hemodynamicznymi określonymi ilościowo za pomocą obliczeniowej dynamiki płynów.

Szybkie obrazowanie naczyń krwionośnych małych zwierząt w całej rozdzielczości do badań ilościowych

Poznaj metodę pomiaru mikrokrążenia wieńcowego w sercu myszy ex vivo z monitorowaniem ciśnienia perfuzji i przepływu tętniczego. Technika umożliwia badanie funkcji pericytów oraz dynamiki naczyń włosowatych.

Dynamiczny pomiar i obrazowanie naczyń włosowatych, tętniczek i perycytów w sercu myszy

Przeglądaj więcej filmów