Dynamiczny pomiar i obrazowanie naczyń włosowatych, tętniczek i perycytów w sercu myszy
July 29th, 2020
Prezentowany tutaj jest protokół do badania mikrokrążenia wieńcowego w żywej tkance serca mysiego poprzez monitorowanie ex vivo ciśnienia perfuzji tętniczej i przepływu, który utrzymuje ciśnienie, a także składników drzewa naczyniowego, w tym łożysk naczyń włosowatych i perycytów, gdy tętnica przegrody jest kaniulowana i poddawana ciśnieniu.
Metoda ta może być stosowana do badania mikrokrążenia wieńcowego w żywej mysiej tkance serca i składnikach drzewa naczyniowego poprzez monitorowanie ex vivo ciśnienia i przepływu perfuzji tętniczej. Metoda ta stanowi użyteczną platformę do badania funkcji mikrokrążenia perycytów i odczynników w sercu, dzięki czemu mamy tendencję do pomiaru średnicy naczynia i ciśnienia światła tętniczki. Aby przygotować kaniulę do eksperymentu, użyj ściągacza do mikropipet, aby wytworzyć dwie kaniule z długimi cienkimi końcówkami, z jednej czystej probówki ze szkła borokrzemianowego.
Użyj cienkich nożyczek i mikroskopu preparacyjnego, aby przyciąć końcówkę każdej kaniuli do końcowej średnicy końcówki od 100 do 150 mikrometrów i wypoleruj końcówki, aby lekko zaokrąglić ostre krawędzie. Użyj platynowego drutu umieszczonego z boku trzonu, około dwóch milimetrów od końcówki, aby zgiąć kaniulę wzdłuż trzonu pod kątem około 45 stopni i włóż otwarty koniec kaniuli do uchwytu kaniuli. Następnie dokręć złączkę i użyj pięciomililitrowej strzykawki, aby przepłukać kaniulę i rurkę roztworem Tyrode'a.
Zamontuj uchwyt kaniuli na mikromanipulacji komory miografu ciśnieniowego. Aby zebrać serce myszy do eksperymentu, najpierw wprowadź do niego parę, wstrzyknij 500 mikrolitrów heparyny znieczulonej ośmio- do 16-tygodniowej czarnej myszy C 57. Po 10 minutach umieść mysz na podgrzewanym łóżku w pozycji leżącej na plecach i ustabilizuj łapy taśmą do etykietowania.
Za pomocą kleszczy i nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie w skórze brzucha, nad przeponą i przetnij przeponę i mostek, aby umożliwić wycięcie serca z jamy piersiowej. Umieść serce w lodowatym roztworze Tyrode'a zawierającym 30 milimolowy BDM i w razie potrzeby usuń z niego wszelkie tkanki łączne. Następnie umieść serce w wstępnie schłodzonej komorze prosektoryjnej, wypełnionej świeżym roztworem Tyrode'a uzupełnionym 30-milimolowym BDM.
Aby przygotować tętnicę przegrodową do kaniulacji, włącz serwopompę i ustaw ciśnienie w sterowniku serwomechanizmu w trybie przepływu. W sercu na PDMS, uważając, aby uniknąć uszkodzenia środkowej części tkanki i umieścić tkankę pod mikroskopem preparacyjnym. Usuń jeden lub oba przedsionki i rozetnij prawą komorę.
Usuń prawą wolną ścianę komory i odsłoń tętnicę przegrodową. Użyj nylonowej nici o średnicy 30 mikrometrów, aby zawiązać luźny węzeł wokół tętnicy przegrody. Za pomocą cienkich nożyczek usuń wolną ścianę lewej komory i przenieś preparat mięśni brodawkowatych do komory doświadczalnej.
Za pomocą mikromanipulatora wprowadź kaniulę do tętnicy przegrody międzygrobowej i zabezpiecz kaniulę szwem. Następnie za pomocą szpilek przymocuj mięsień brodawkowaty do dna komory z końcówką kaniuli równolegle do ściany tętnicy, tak aby można było uzyskać wyraźny widok układu naczyniowego i użyj strzykawki, aby stopniowo przepłukać roztwór przez kaniulę. Aby ustabilizować preparat tkankowy, włącz pompę perystaltyczną i w sposób ciągły przełączaj preparat z wstępnie zagazowanym roztworem soli fizjologicznej przy natężeniu przepływu od trzech do czterech mililitrów na minutę, włącz regulator temperatury roztworu do przefuzji i dostosuj temperaturę superfuzatu kąpieli do 35 do 37 stopni Celsjusza.
Podłącz kaniulę do serwopompy i wyreguluj przepływ, aby ustawić ciśnienie na około 10 milimetrów słupa rtęci. Pozwól superfuzji działać przez około 10 minut, a następnie zwiększ przepływ roztworu luminalnego, aby ustawić ciśnienie w tętnicy na około 60 milimetrów słupa rtęci i pozwól próbce ustabilizować się przez 30 do 60 minut z monitorowaniem. Aby załadować próbkę aglutyniną z kiełków pszenicy, należy perfaktorować preparat pięcioma mililitrami roztworu Tyrode'a, uzupełnionym 100 mikrogramami sprzężonej aglutyniny z kiełków pszenicy Alexa Fluor-488
.Po 30 minutach zmień przyrząd do utylizowania z powrotem na normalny roztwór Tyrode'a i włącz system mikroskopu konfokalnego. Użyj mikroskopu przy mniejszej mocy powiększenia, aby zlokalizować tętnicę przegrody w trybie światła przechodzącego i rozpocznij obrazowanie za pomocą tego konfokalnego dysku obrotowego. Wybierz 40-krotne powiększenie obiektywu i laser wzbudzający 488 nanometrów, a następnie dostosuj intensywność lasera i częstotliwość próbkowania.
Aby zdefiniować zakres obrazowania, ustaw górną i dolną pozycję obrazowania dla mikroskopu oraz ustaw rozmiar kroku i parametry obrazowania Z-stack. Następnie wybierz folder do przechowywania obrazu i kliknij uruchom, aby rozpocząć nagrywanie obrazów. Gdy fluorescencyjny marker naczyniowy jest perfundowany do światła naczyniowego, możliwe jest uwidocznienie całych drzew naczyniowych za pomocą szybkiej mikroskopii konfokalnej.
Dalsze powiększenie umożliwia szczegółowe zobrazowanie naczynia włosowatego. Gdy pinacidil i wrażliwy na ATP agonista kanału potasowego jest podawany ze światła, średnica tętnic zwiększa się. Gdy endotelina zwężająca naczynia krwionośne jest nakładana ze światła.
Zmniejsza się średnica tętnicy. Gdy ustawiony przepływ jest stały, ciśnienie świetlne wzrasta. Na tych obrazach tkanki brodawkowatej transgenicznej myszy transgenicznej z ekspresją NG two DS red, zarówno naczynia włosowate, jak i perycyty można uwidocznić w tkance mięśniowej brodawkowatej, w warunkach, które lepiej naśladują fizjologię żywych zwierząt.
Ważne jest, aby w żadnym momencie zabiegu w rurki nie było żadnych pęcherzyków powietrza. Łącząc tę metodę z technikami obrazowania optycznego, preparat może być stosowany do badania mikrokrążenia w sercu i komunikacji międzykomórkowej między różnymi typami komórek, przy użyciu transgenicznych myszy wykorzystujących technologię fluorescencji.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę badania mikrokrążenia wieńcowego w żywym tkankach serc mysich poprzez ex vivo monitorowanie ciśnienia perfuzji tętnic i przepływu. Skupia się na składnikach drzewa naczyniowego, w tym łożyskach włosowatych i perycytach, podczas kanulacji i nadciśnienia tętnicy przegrodowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Fizjologia układu krążenia
- Mikrokrążenie
- Biologia naczyń
Tło
- Zrozumienie mikrokrążenia wieńcowego jest kluczowe dla zdrowia serca.
- Perycyte odgrywają znaczącą rolę w stabilności i funkcji naczyń.
- Modele ex vivo pozwalają na kontrolowane warunki eksperymentalne.
- Monitorowanie ciśnienia perfuzji tętnic jest niezbędne do oceny funkcji mikrokrążenia.
Cel badania
- Zbadanie dynamiki mikrokrążenia wieńcowego w sercach mysich.
- Analiza roli perycytów w funkcji naczyń.
- Pomiar średnicy naczyń i ciśnienia światła tętniczek.
Stosowane metody
- Ex vivo monitorowanie ciśnienia perfuzji tętnic i przepływu.
- Kanulacja tętnicy przegrodowej za pomocą niestandardowych mikropipet.
- Przygotowanie mikropipet o określonych wymiarach dla optymalnego wprowadzenia.
- Płukanie mikropipet roztworem Tyrode'a, aby zapewnić przepuszczalność.
Główne wyniki
- Metoda pozwala na udaną ocenę mikrokrążenia wieńcowego.
- Funkcję perycytów można ocenić w kontekście zdrowia naczyń.
- Ciśnienie perfuzji tętnic i przepływ można dokładnie monitorować.
- Pomiar średnicy naczyń dostarcza informacji na temat dynamiki mikrokrążenia.
Wnioski
- Ten protokół jest cennym narzędziem do badania mikrokrążenia wieńcowego.
- Zwiększa zrozumienie ról perycytów w biologii naczyń.
- Metoda może być dostosowana do różnych warunków eksperymentalnych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables direct measurement of coronary microcirculation dynamics in murine heart tissue, providing a physiologically relevant platform to evaluate vascular responses to pharmacological agents. By simultaneously monitoring arterial perfusion pressure, flow, and vascular diameter changes in arterioles and capillaries, it supports mechanistic de-risking of cardiovascular targets. The ability to visualize pericytes and assess their functional contribution adds translational value for target validation in heart failure and ischemic disease programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses on coronary tone regulation by measuring arteriolar and capillary diameter changes under controlled perfusion conditions.
- Operational Value: Enables functional validation of vascular targets such as pericytes and ion channels in a near-physiological, beating tissue preparation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated vascular networks for compound screening by enabling real-time imaging of lumen diameter and pressure responses.
- Operational Value: Supports assay standardization through reproducible cannulation and perfusion protocols, facilitating cross-laboratory consistency in microcirculation assessment.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links discovery-phase vascular phenotypes to preclinical outcomes by monitoring pericyte-mediated capillary regulation in disease-relevant genetic models.
- Operational Value: Provides quantitative, imaging-based endpoints for go/no-go decisions in cardiovascular lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target engagement to functional validation, particularly for cardiovascular programs focused on microvascular health and pericyte biology.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by linking agonist/antagonist exposure to real-time vascular diameter and pressure changes in arterioles and capillaries.
- Screening: Enables assay readiness through stable, long-term imaging of vascular responses under constant flow or pressure conditions.
- Analytics: Generates quantitative readouts of luminal pressure, flow rate, and vessel diameter that allow objective comparison of compound effects.
- Translational Research: Connects microcirculatory findings to preclinical continuity via pericyte visualization in NG2-DsRed transgenic models, supporting biomarker-aligned target validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing cardiovascular compounds across multiple projects by standardizing vascular preparation and imaging parameters.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in coronary microcirculation regulation.
- Operational Value: Promotes reproducibility through standardized cannulation, perfusion, and imaging workflows applicable across murine strains and disease models.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early identification of compounds with off-target vascular effects, reducing late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted advancement decisions by providing direct evidence of target engagement in physiologically relevant microvascular beds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery, vascular cannulation, and confocal microscopy for successful tissue preparation and imaging.
- Depends on specialized instrumentation including pressure myograph chambers, servo pumps, and high-speed confocal systems capable of Z-stack imaging.
- Necessitates cross-team standardization between surgical, perfusion, and imaging teams to maintain consistent arterial pressure and flow settings.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different mouse models, including transgenic lines expressing fluorescent reporters in pericytes or endothelial cells.
- Limited by the need for meticulous bubble-free tubing preparation and stable superfusion conditions to avoid artifacts in pressure and diameter measurements.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:41
Cannula Preparation
1:39
Mouse Heart Extraction
2:33
Septal Artery Preparation and Cannulation
3:47
Preparation Stabilization
4:38
Fluorescence-Tagged Wheat-Germ Agglutinin (WGA) Loading and Confocal Arteriole and Capillary Imaging
5:42
Results: Representative Capillary and Arteriole Imaging and Luminal Pressure and Atrial Diameter Assessment
6:42
Conclusion
