Name: Analiza danych SEC-SAXS za pomocą dekonwolucji i rozproszenia EFA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Poznaj analizę danych SEC-SAXS z dekonwolucją EFA dla makrocząsteczek biologicznych. Ta metoda pozwala uzyskać idealizowane krzywe rozpraszania i dokładniejsze dane strukturalne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy za wsparcie finansowe dla projektu z francuskiego grantu REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 oraz z grantów badawczych od Service de Santé des Armées i Délégation Générale pour l'Armement. Jesteśmy wdzięczni ESRF za czas poświęcony na wiązkę SAXS. W pracy wykorzystano platformy centrum Grenoble Instruct-ERIC (ISBG; UMS 3518 CNRS-CEA-UGA-EMBL) w ramach Grenoble Partnership for Structural Biology (PSB), wspierany przez FRISBI (ANR-10-INBS-05-02) i GRAL, finansowany w ramach University Grenoble Alpes graduate school (Ecoles Universitaires de Recherche) CBH-EUR-GS (ANR-17-EURE-0003). IBS potwierdza integrację z Interdyscyplinarnym Instytutem Badawczym w Grenoble (IRIG, CEA). Dziękujemy Wimowi P. Burmeisterowi i ksédéric Iseni za wsparcie finansowe i naukowe, a także dziękujemy dr Jesse Hopkinsowi z BioCAT w APS za jego pomoc i opracowanie BioXTAS RAW.

<ol><li>Pelikan, M., Hura, G., Hammel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+flexibility+within+proteins+as+identified+through+small+angle+X-ray+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22General+Physiology+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Structure and flexibility within proteins as identified through small angle X-ray scattering.</a> General Physiology and Biophysics. 28 (2), 174-189 (2009).</li>
<li>Brosey, C. A., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+SAXS+versatility%3A+solution+X-ray+scattering+for+macromolecular+architecture%2C+functional+landscapes%2C+and+integrative+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolving SAXS versatility: solution X-ray scattering for macromolecular architecture, functional landscapes, and integrative structural biology.</a> Current Opinion in Structural Biology. 58, 197-213 (2019).</li>
<li>Gräwert, M., Svergun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beginner%27s+guide+to+solution+small-angle+X-ray+scattering+%28SAXS%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemist%22%5BJournal%5D)">A beginner's guide to solution small-angle X-ray scattering (SAXS).</a> The Biochemist. 42 (1), 36-42 (2020).</li>
<li>Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+solution+scattering+%28SAXS%29+combined+with+crystallography+and+computation%3A+defining+accurate+macromolecular+structures%2C+conformations+and+assemblies+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+reviews+of+biophysics%22%5BJournal%5D)">X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution.</a> Quarterly reviews of biophysics. 40 (03), 191-285 (2007).</li>
<li>Meisburger, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+Movements+upon+Activation+of+Phenylalanine+Hydroxylase+Characterized+by+Crystallography+and+Chromatography-Coupled+Small-Angle+X-ray+Scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Domain Movements upon Activation of Phenylalanine Hydroxylase Characterized by Crystallography and Chromatography-Coupled Small-Angle X-ray Scattering.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (20), 6506-6516 (2016).</li>
<li>Brennich, M. E., Round, A. R., Hutin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Online+Size-exclusion+and+Ion-exchange+Chromatography+on+a+SAXS+Beamline%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e54861(2017).</li>
<li>Watanabe, Y., Inoko, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-exclusion+chromatography+combined+with+small-angle+X-ray+scattering+optics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Size-exclusion chromatography combined with small-angle X-ray scattering optics.</a> Journal of Chromatography A. 1216 (44), 7461-7465 (2009).</li>
<li>Graewert, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Pipeline+for+Purification%2C+Biophysical+and+X-Ray+Analysis+of+Biomacromolecular+Solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Automated Pipeline for Purification, Biophysical and X-Ray Analysis of Biomacromolecular Solutions.</a> Scientific reports. 5, (2015).</li>
<li>David, G., Pérez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+sampler+robot+and+high-performance+liquid+chromatography%3A+a+fully+automated+system+for+biological+small-angle+X-ray+scattering+experiments+at+the+Synchrotron+SOLEIL+SWING+beamline%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+crystallography%22%5BJournal%5D)">Combined sampler robot and high-performance liquid chromatography: a fully automated system for biological small-angle X-ray scattering experiments at the Synchrotron SOLEIL SWING beamline.</a> Journal of applied crystallography. 42 (5), 892-900 (2009).</li>
<li>Ryan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+SEC-SAXS+system+enabling+high+X-ray+dose+for+rapid+SAXS+assessment+with+correlated+UV+measurements+for+biomolecular+structure+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">An optimized SEC-SAXS system enabling high X-ray dose for rapid SAXS assessment with correlated UV measurements for biomolecular structure analysis.</a> Journal of Applied Crystallography. 51 (1), 97-111 (2018).</li>
<li>Gampp, H., Maeder, M., Meyer, C. J., Zuberbühler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculation+of+equilibrium+constants+from+multiwavelength+spectroscopic+data-III%3A+Model-free+analysis+of+spectrophotometric+and+ESR+titrations%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Calculation of equilibrium constants from multiwavelength spectroscopic data-III: Model-free analysis of spectrophotometric and ESR titrations.</a> Talanta. 32 (12), 1133-1139 (1985).</li>
<li>Maeder, M., Neuhold, Y. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMaeder%2C+M+%22Practical+Data+Analysis+in+Chemistry%22">Practical Data Analysis in Chemistry</a>. , Elsevier. Burlington. http://www.123library.org/book_details/?id=35069 (2007).</li>
<li>Tarbouriech, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vaccinia+virus+DNA+polymerase+structure+provides+insights+into+the+mode+of+processivity+factor+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The vaccinia virus DNA polymerase structure provides insights into the mode of processivity factor binding.</a> Nature Communications. 8 (1), (2017).</li>
<li>Brennich, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Online+data+analysis+at+the+ESRF+bioSAXS+beamline%2C+BM29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29.</a> Journal of Applied Crystallography. 49 (1), (2016).</li>
<li>Brookes, E., Rocco, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+UltraScan+SOlution+MOdeller+%28US-SOMO%29+hydrodynamic+and+small-angle+scattering+data+analysis+and+simulation+suite%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the UltraScan SOlution MOdeller (US-SOMO) hydrodynamic and small-angle scattering data analysis and simulation suite.</a> European Biophysics Journal. 47 (7), 855-864 (2018).</li>
<li>Malaby, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+analysis+of+size-exclusion+chromatography-small-angle+X-ray+scattering+and+reconstruction+of+protein+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Methods for analysis of size-exclusion chromatography-small-angle X-ray scattering and reconstruction of protein scattering.</a> Journal of Applied Crystallography. 48 (4), 1102-1113 (2015).</li>
<li>Hopkins, J. B., Gillilan, R. E., Skou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioXTAS+RAW%3A+improvements+to+a+free+open-source+program+for+small-angle+X-ray+scattering+data+reduction+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">BioXTAS RAW: improvements to a free open-source program for small-angle X-ray scattering data reduction and analysis.</a> Journal of Applied Crystallography. 50 (5), 1545-1553 (2017).</li>
<li>Maeder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+factor+analysis+for+the+resolution+of+overlapping+chromatographic+peaks%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Evolving factor analysis for the resolution of overlapping chromatographic peaks.</a> Analytical Chemistry. 59 (3), 527-530 (1987).</li>
<li>Durand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidase+activator+p67phox+behaves+in+solution+as+a+multidomain+protein+with+semi-flexible+linkers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidase activator p67phox behaves in solution as a multidomain protein with semi-flexible linkers.</a> Journal of Structural Biology. 169 (1), 45-53 (2010).</li>
<li>De Maria Antolinos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISPyB+for+BioSAXS%2C+the+gateway+to+user+autonomy+in+solution+scattering+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">ISPyB for BioSAXS, the gateway to user autonomy in solution scattering experiments.</a> Acta Crystallographica Section D. 71 (1), 76-85 (2015).</li>
<li>Brennich, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Online+data+analysis+at+the+ESRF+bioSAXS+beamline%2C+BM29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29.</a> Journal of Applied Crystallography. 49 (1), 203-212 (2016).</li>
<li>Kirby, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+radiation+dose+efficiency+in+solution+SAXS+using+a+sheath+flow+sample+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Improved radiation dose efficiency in solution SAXS using a sheath flow sample environment.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (12), 1254-1266 (2016).</li>
<li>Rambo, R. P., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+flexible+and+intrinsically+unstructured+biological+macromolecules+by+SAS+using+the+Porod-Debye+law%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Characterizing flexible and intrinsically unstructured biological macromolecules by SAS using the Porod-Debye law.</a> Biopolymers. 95 (8), 559-571 (2011).</li>
<li>Franke, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATSAS+2.8%3A+a+comprehensive+data+analysis+suite+for+small-angle+scattering+from+macromolecular+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">ATSAS 2.8: a comprehensive data analysis suite for small-angle scattering from macromolecular solutions.</a> Journal of Applied Crystallography. 50 (4), 1212-1225 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Pożądane jest posiadanie próbki monodyspersyjnej przed rozpoczęciem eksperymentu SAXS, ale w rzeczywistości wiele zbiorów danych nie spełnia tego wymagania i musi zostać ulepszone poprzez połączenie pomiaru z chromatografią liniową - w większości przypadków SEC. Jednak nawet brak czasu między oczyszczaniem a akwizycją danych monodyspersji próbki nie jest gwarantowana. Najczęściej dotyczy to eksperymentów, w których komponenty są zbyt zbliżone rozmiarem lub właściwościami fizycznymi, aby można je było rozdzielić, lub są podatne na szybką dynamikę. W tym miejscu dostarczyliśmy protokół łączący dekompozycję pojedynczej wartości z ewoluującą analizą czynnikową w celu usunięcia wpływuegzo-minusa związanego z DNA E9 z jego niezwiązanej formy, tworząc monodyspersyjny profil rozpraszania, który następnie byliśmy w stanie przeanalizować za pomocą pakietu SAXS Scatter IV.
SVD z EFA danych SEC-SAXS są bardzo skutecznymi metodami opracowanymi w celu dekonwolucji danych SAXS i poprawy analizy, ale mają ograniczenia. Wymagają one, aby szum lub dryft w linii podstawowej bufora SEC-SAXS był ograniczony do minimum. Może to wiązać się z dodatkowym wyrównaniem kolumn (lepiej użyć więcej niż 3 objętości kolumn, w zależności od bufora) przed załadowaniem próbki. Jednak najbardziej krytycznym krokiem jest wybór liczby wartości osobliwych i zakresu wykorzystywanych danych, ponieważ będzie to miało duży wpływ na dokładność dekonwolucji. Z tego powodu wyniki nie powinny być podejmowane samodzielnie, ale dalej analizowane przy użyciu technik takich jak analityczne ultrawirowanie (AUC) lub wielokątowe rozpraszanie światła laserowego (MALLS) do interpretacji biologicznej.
Scatter IV to nowy pakiet oprogramowania, bezpłatny do użytku badawczego i przemysłowego, z intuicyjnym interfejsem użytkownika, który pozwala nawet laikom analizować swoje dane. Scatter IV ma kilka nowych funkcji, które pomagają usprawnić analizę danych SEC-SAXS, takich jak mapa cieplna połączona z wykresem sygnału, umożliwiająca większą dokładność wyboru klatek. W pierwotnej analizie danych analiza piku Guiniera i wykres walidacji krzyżowej związany z analizą P(r) oferują zintegrowaną możliwość rozwiązywania problemów w oprogramowaniu.
Należy wspomnieć, że do pierwotnej analizy danych można wykorzystać wiele innych programów; Zawierają one te same podstawowe funkcje i są również regularnie aktualizowane, takie jak BioXTAS, RAW17 , ATSAS Package24 i US-SOMO15 , aby wymienić tylko kilka.
Jednak niezależnie od tego, który pakiet SAXS jest używany do analizy, główne ograniczenia są wspólne: przygotowanie próbki, przed pobraniem i analizą. W pokazanym przykładzie E9 exominus wyraźnie widać poprawę stosunku sygnału do szumu oraz zmniejszenie Rgd max związanego z próbką monodyspersyjną. To znacznie ułatwi dalsze przetwarzanie danych, takie jak dopasowywanie lub modelowanie ze znanymi strukturami o wysokiej rozdzielczości.

Makrocząsteczki biologiczne są zbyt małe, aby można je było zobaczyć nawet za pomocą najlepszych mikroskopów świetlnych. Obecne metody określania ich struktur zazwyczaj obejmują krystalizację białka lub pomiary na ogromnej liczbie identycznych cząsteczek w tym samym czasie. Podczas gdy krystalografia dostarcza informacji na poziomie atomowym, reprezentuje sztuczne środowisko próbki, biorąc pod uwagę, że większość makrocząsteczek nie jest prezentowana w komórce w postaci krystalicznej. W ciągu ostatnich kilku lat mikroskopia krioelektronowa dostarczyła podobnych struktur o wysokiej rozdzielczości dużych makrocząsteczek / kompleksów makromolekularnych, ale chociaż próbki są bliższe stanowi fizjologicznemu, nadal są zamrożone, a więc nieruchome i statyczne. Bio-małe kątowe rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego (BioSAXS) zapewnia pomiar strukturalny makrocząsteczki w warunkach istotnych dla biologii. Stan ten można zwizualizować jako kształt 3D o niskiej rozdzielczości określony w skali nanometrowej i obejmuje całą przestrzeń konformacyjną makrocząsteczki w roztworze. Eksperymenty BioSAXS skutecznie oceniają stan oligomeryczny, układy domenowe i złożone, a także elastyczność między domenami1,2,3. Metoda jest dokładna, w większości nieniszcząca i zwykle wymaga jedynie minimalnego przygotowania próbki i czasu. Jednakże, aby uzyskać najlepszą interpretację danych, próbki muszą być monodyspersyjne. Jest to trudne; Cząsteczki biologiczne są często podatne na zanieczyszczenia, słabe oczyszczanie i agregację, na przykład w wyniku zamrażania, rozmrażania4. Opracowanie chromatografii inline, po której następuje natychmiastowy pomiar SAXS, pomaga złagodzić te skutki. Chromatografia wykluczania wielkości rozdziela próbki według wielkości, wykluczając w ten sposób większość zanieczyszczeń i agregacji5,6,7,8,9,10. Jednak w niektórych przypadkach nawet SEC-SAXS nie wystarcza do wytworzenia próbki monodyspersyjnej, ponieważ mieszanina może składać się ze składników o zbyt zbliżonej wielkości lub ich właściwości fizyczne lub ich szybka dynamika prowadzą do nakładania się pików w śladzie SEC UV. W takich przypadkach programowy krok dekonwolucji uzyskanych danych SAXS może prowadzić do wyidealizowanej krzywej SAXS pojedynczego komponentu5,11,12. Jako przykład w sekcji 2 protokołu pokazujemy standardową analizę SEC-SAXS egzonukleazy polimerazy krowianki E9 DNA minus mutant (egzominus E9) w kompleksie z DNA. Krowianka jest organizmem modelowym rodziny Poxviridae, zawierającej kilka patogenów, na przykład ludzki wirus ospy prawdziwej. Wykazano, że polimeraza ściśle wiąże się z DNA w podejściach biochemicznych, a struktura kompleksu została niedawno rozwiązana za pomocą krystalografii rentgenowskiej13.
Większość obiektów synchrotronowych zapewni zautomatyzowany potok przetwarzania danych, który przeprowadzi normalizację i integrację danych, tworząc zestaw nieodejmowanych ramek. Ale podejście opisane w tym manuskrypcie może być również stosowane ze źródłem laboratoryjnym, pod warunkiem, że zostanie przeprowadzony SEC-SAXS. Ponadto może być dostępna dodatkowa automatyzacja, która odrzuci ramki uszkodzone przez promieniowanie i wykona odejmowanie bufora14. W sekcji 2 pokażemy, jak przeprowadzić pierwotną analizę danych na wstępnie przetworzonych danych i jak najlepiej wykorzystać dostępne dane.
W sekcji 3 pokazujemy, jak dekonwolucjonizować dane SEC-SAXS i efektywnie analizować krzywe. Chociaż istnieje kilka metod dekonwolucji, takich jak dekonwolucja piku Gaussa, zaimplementowana w US-SOMO15 i zoptymalizowana metoda maksymalnego prawdopodobieństwa Guiniera, zaimplementowana w oprogramowaniu DELA16, zazwyczaj wymagają one modelu dla kształtu piku12. Skończony rozmiar poszczególnych pików, które badamy, pozwala na wykorzystanie analizy czynników ewoluujących (EFA) jako ulepszonej formy dekompozycji wartości osobliwych (SVD) do dekonwolucji nakładających się pików, bez polegania na kształcie piku lub profilu rozpraszania5,11. Implementację specyficzną dla SAXS można znaleźć w BioXTAS RAW17. EFA został po raz pierwszy użyty na danych chromatograficznych, gdy dane z matrycy diod 2D pozwoliły na utworzenie matryc z absorbancji w stosunku do czasu retencji i danych o długości fali18. Tym, co wyróżnia EFA, jest to, że skupia się na ewoluującym charakterze wartości pojedynczych, na tym, jak zmieniają się one wraz z pojawianiem się nowych komponentów, z zastrzeżeniem, że w akwizycji istnieje nieodłączny porządek10. Na szczęście dane SEC-SAXS dostarczają wszystkie niezbędne uporządkowane dane akwizycji w zorganizowanych tablicach danych 2D, co dobrze nadaje się do techniki EFA.
W sekcji 4 pokażemy podstawy analizy SAXS niezależnej od modelu na podstawie odjętej krzywej SAXS z odjętym tłem bufora. Analiza niezależna od modelu określa promień bezwładności cząstki (Rg), objętość korelacji (Vc), objętość Poroda (Vp) i wykładnik Poroda-Debye'a (PE). Analiza zapewnia półilościową ocenę stanu termodynamicznego cząstki pod względem zwartości lub elastyczności za pomocą bezwymiarowego wykresu Kratky'ego2,4,19.
Na koniec, dane SAXS są mierzone w odwrotnych jednostkach przestrzeni i pokażemy, jak przekształcić dane SAXS w przestrzeń rzeczywistą, aby odzyskać funkcję rozkładu par odległości, P(r). Rozkład P(r) jest zbiorem wszystkich odległości znajdujących się w cząstce i obejmuje maksymalny wymiar cząstki, dmax. Ponieważ jest to pomiar termodynamiczny, rozkład P(r) reprezentuje przestrzeń fizyczną zajmowaną przez przestrzeń konformacyjną cząstek. Właściwa analiza zestawu danych SAXS może dostarczyć informacji o stanie roztworu, które uzupełniają informacje o wysokiej rozdzielczości z krystalografii i krio-EM.

<table><tbody><tr><td>Oprogramowanie sterujące linią badawczą BsXCuBE</td><td>ESRF</td><td>Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664</td><td>rozwój lokalny</td></tr><tr><td>BioXTAS Raw 1.2.3.</td><td>MacCHESS</td><td>http://bioxtas-raw.readthedocs.io/en/latest/index.html</td><td>Po raz pierwszy opracowany w 2008 roku przez Sorena Skou w ramach projektu BioXTAS (biological x-ray total analysis system). Od tego czasu został szeroko rozwinięty, a ostatnie prace zostały wykonane przez Jesse B. Hopkins</td></tr><tr><td>HPLC program LabSolutions</td><td>Shimadzu</td><td>n.a.ISPyB</td><td></td></tr>, <tr><td></td><td>ESRF</td><td>De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85.</td><td>Rozwój lokalny</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td><td>27808.297</td><td></td></tr><tr><td>Scatter</td><td>Diamond Light Source Ltd</td><td>http://www.bioisis.net/tutorial/9</td><td>Wspierany przez linię badawczą SIBYLS (ALS berkeley, Ca) i Bruker Cororation (Karlsruhe, Niemcy)</td></tr><tr><td>Kolumna Superdex 200 Increase 5/150 GL</td><td>Kolumna GE Healthcare</td><td>28990945</td><td>SEC-SAXS</td></tr> używana <tr><td>podstawa Tris</td><td>Euromedex</td><td>26-128-3094-B</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza danych sec-saxs za pomocą dekonwolucji i rozproszenia efa

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

BioSAXS to popularna technika używana w biologii molekularnej i strukturalnej do określania struktury roztworu, wielkości i kształtu cząstek, stosunku powierzchni do objętości oraz zmian konformacyjnych makrocząsteczek i kompleksów makromolekularnych. Wysokiej jakości zestaw danych SAXS do modelowania strukturalnego musi pochodzić z monodyspersyjnych, jednorodnych próbek, a często osiąga się to tylko poprzez połączenie chromatografii liniowej i natychmiastowego pomiaru SAXS. Najczęściej chromatografia wykluczająca wielkość jest stosowana do oddzielania próbek i wykluczania zanieczyszczeń i agregacji z cząstki będącej przedmiotem zainteresowania, co pozwala na wykonanie pomiarów SAXS na podstawie dobrze rozdzielonego piku chromatograficznego pojedynczego gatunku białka. Jednak w niektórych przypadkach nawet oczyszczanie w linii produkcyjnej nie gwarantuje próbek monodyspersyjnych, ponieważ wiele składników jest zbyt blisko siebie pod względem wielkości lub zmian kształtu wywołanych wiązaniem zmienia postrzegany czas elucji. W takich przypadkach możliwe jest zdekonwoluowanie danych SAXS mieszaniny w celu uzyskania wyidealizowanych krzywych SAXS poszczególnych składników. Tutaj pokazujemy, jak to się osiąga, a praktyczna analiza danych SEC-SAXS jest przeprowadzana na idealnych i trudnych próbkach. W szczególności pokazujemy analizę SEC-SAXS egzonukleazy polimerazy DNA krowianki E9 minus mutant.

Zaletą zastosowania dekonwolucji w porównaniu do klasycznego wyboru klatek13 jest usunięcie wzajemnego wpływu poszczególnych gatunków, co pozwala uzyskać monodyspersyjny sygnał rozpraszania. Często wiąże się to również z lepszym stosunkiem sygnału do szumu. Podczas analizy SEC-SAXS kompleksu E9 exominus związanego z DNA obserwuje się dwa piki (Rysunek 1). Pierwszy, duży pik (mniej więcej klatki 420‒475) odpowiada kompleksowi E9 exominus-DNA, a drugi (mniej więcej klatki 475‒540) stanowi stan niezwiązanego białka (patrz Dane uzupełniające: Rysunek 2). Choć klasyczne podejście polegające na wyborze klatek zapewnia stabilną wartość Rg dla kompleksu w pierwszym piku (patrz Dane uzupełniające: Rysunek 3), drugi pik jest wyraźnie zlewający się, a wykres Rg wskazuje, że drugi analizowany pik nie posiada stabilnej wartości Rg ze względu na zanieczyszczenie sygnałem z sąsiedniego piku. Można było wykorzystać jedynie 5 klatek wykazujących półstabilną wartość Rg, które po odjęciu dały Rg = 36,3 Å (Rysunek 2, kolor zielony). Po przeprowadzeniu dekonwolucji pików za pomocą EFA, odpowiadająca krzywa dla drugiego piku (Rysunek 2, kolor niebieski) została nałożona na oryginał i wykazała wyraźny spadek stosunku sygnału do szumu, a zarejestrowana wartość Rg była niższa i wynosiła 34,1 Å. Wykres Kratky'ego (Rysunek 3) pokazuje, że kompleks z dekonwolucyjnym pikiem (kolor niebieski) jest bardziej globularny. Potwierdza to krzywa P(r) (Rysunek 4), dla której dmax wynosi 108,5 Å w przypadku krzywej dekonwolucyjnej (kolor niebieski), podczas gdy w przypadku krzywej niedekonwolucyjnej jest ona bardziej wydłużona z dmax 120 Å (kolor zielony), co najprawdopodobniej wynika z heterogeniczności spowodowanej obecnością niezwiązanego E9 exominus.
<img alt="Analiza chromatograficzna, wykres sygnału w funkcji klatki; dopasowanie widmowe, badanie stabilności białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1: Wykres sygnału dla E9 exominus same oraz w kompleksie z DNA. 
Górny panel przedstawia wykres stosunku całki do tła dla każdej klatki pomiaru SEC-SAXS (jasnoniebieski). Czerwone punkty wskazują wartość Rg dla każdej klatki w obrębie piku. Dolny panel przedstawia odpowiadającą mu mapę ciepła ukazującą residua dla każdej klatki, pokolorowane zgodnie z analizą autokorelacji Durbina-Watsona; obszary o wysokim stopniu podobieństwa są zabarwione na kolor cyjanowy, natomiast klatki mniej podobne przyjmują barwy od ciemnoniebieskich, przez różowe, aż po czerwone, w zależności od stopnia różnicy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres małokątowego rozpraszania promieni rentgenowskich (SAXS) przedstawiający wyniki danych dla E9 exo minus oraz dekonwolucji EFA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Wykres zależności intensywności od wektora rozproszenia. 
Nałożenie odjętych danych SAXS z E9 exominus. Kolorem zielonym zaznaczono 5 uśrednionych klatek (klatki 517‒522), odjętych od obszaru półstabilnego Rg, a kolorem niebieskim reprezentatywną krzywą rozpraszania uzyskaną z dekonwolucji EFA piku SEC-SAXS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres intensywności rozpraszania, E9 exominus, dekonwolucja EFA, wynik analizy strukturalnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Bezwymiarowa krzywa Kratky'ego. 
Nałożenie dekonwolucyjnej (niebieska) i niedekonwolucyjnej (zielona) krzywej Kratky'ego wykazujące, że E9 exominus ma strukturę globularną. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rozkład wielkości cząstek, dekonwolucja E9 exominus vs EFA, analiza wykresu, skala Ångströma." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Krzywa P(r). 
Nałożenie krzywych dekonwolucyjnych (niebieska) i niedekonwolucyjnych (zielona) dla E9 exominus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Dane uzupełniające. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/Supplementary%20data.docx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik</a>

Pomiary makrocząsteczek biologicznych SEC-BioSAXS są standardowym podejściem do określania struktury roztworu makrocząsteczek i ich kompleksów. W tym miejscu analizujemy dane SEC-BioSAXS z dwóch typów powszechnie spotykanych śladów SEC - chromatogramów z pikami w pełni rozdzielczymi i częściowo rozdzielczymi. Demonstrujemy analizę i dekonwolucję za pomocą rozpraszania i BioXTAS RAW.

Analiza danych SEC-SAXS za pomocą dekonwolucji i rozproszenia EFA

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Biologiczne rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małymi kątami zapewnia pomiary strukturalne kompleksów makromolekułowych i makromolekularnych. Idealnie byłoby, gdyby próbka, która ma być mierzona, była monodyspersyjna. Chociaż w niektórych przypadkach chromatografia wykluczania wielkości SAXS nie jest wystarczająca do uzyskania monodyspersyjności, można przeprowadzić programową dekonwolucję danych SAXS w celu uzyskania wyidealizowanej krzywej SAXS.Zgodnie z tym protokołem, program dekonwolucyjny i przyjazny dla użytkownika program Scatter mogą być używane do analizy mutantów egzominusa polimerazy DNA wirusa krowianki. Aby odjąć tło od danych chromatografii wykluczania wielkości, otwórz program Scatter 4 oparty na Javie i otwórz kartę SEC. Przeciągnij i upuść zredukowane pliki danych do poniższego okna upuszczenia danych, a następnie kliknij przycisk katalogu wyjściowego i otwórz, aby ustawić katalog wyjściowy, w którym dane zostaną zapisane.Wprowadź nazwę próbki w polu Zapisz jako i kliknij przycisk śledzenia. Kliknij przycisk edycji szczegółów, aby edytować szczegóły eksperymentu i wypełnić odpowiednie pola. Aby ręcznie zaznaczyć ramki bufora, kliknij przycisk Ustaw.Kliknij lewym przyciskiem myszy i przeciągnij, aby ponownie wybrać bufor jako płaski na krzywej śladu przed pustą objętością kolumny chromatografii wykluczającej rozmiar wynoszącą około 100 klatek, a następnie kliknij ustaw bufor i aktualizację, aby ponownie obliczyć plik SEC. Kliknij lewym przyciskiem myszy i przeciągnij, aby wybrać obszar zainteresowania na wykresie sygnału, a następnie kliknij lewym przyciskiem myszy i przeciągnij krzyżyk nitkowy na wykresie mapy cieplnej, aby wybrać powiększenie i podzbiór klatek, które będą używane do scalania. Kolejnym kliknięciem lewym przyciskiem myszy zaznacz klatki na mapie ciepła odpowiadające obszarowi w prawym dolnym rogu krzyża nitkowego.Idealnie byłoby, gdyby ramka podkreślała obszar o przeważającym kolorze cyjanowym i stabilnym promieniu bezwładności. Jeśli wybrane ramki są zadowalające, kliknij przycisk Scal, aby scalić odjęte ramki, a następnie kliknij kartę analizy, aby wyświetlić dane. Aby zdekonwoluować dane, załaduj zestaw danych w programie do dekonwolucji.W panelu sterowania w obszarze pliki użyj symbolu folderu, aby zlokalizować dane i podświetlić wszystkie pliki DAT. Wykres o zintegrowanej intensywności w funkcji numeru klatki zostanie narysowany na wykresie serii. Na karcie serii kliknij, aby podświetlić krzywą i otworzyć wyskakujące okno analizy LC.Aby wybrać odpowiedni region buforowy, kliknij przycisk Dodaj region, aby wybrać obszar przed szczytem chromatogramu i jeden za przodem rozpuszczalnika, a następnie kliknij przycisk Ustaw bufor. Wyskakujące okienka będą wskazywać, że ramki nie zostały wybrane jako tło. Aby uruchomić EFA, kliknij prawym przyciskiem myszy podświetlony plik i wybierz z menu opcję EFA.W wyskakującym okienku należy obserwować dekompozycję pojedynczej wartości zestawu danych. W polu kontrolki zaznacz wartości w polu Użyj klatek, aby potwierdzić, że cały obszar piku do dekonwolucji jest pokryty na wykresie intensywności. Wykres wartości osobliwych pokaże intensywność wartości osobliwych powyżej linii bazowej.Jeśli lewy i prawy pojedynczy wektor nie pasują do siebie, zmień znaczącą liczbę wektora osobliwego na dwa i przesuwaj ramki, aż lewy i prawy wektor osobliwy będą podobne. EFA zostanie obliczony, generując wykresy w kierunku do przodu i do tyłu dla każdego wektora i wskazując, kiedy składniki rozpoczynają i wychodzą z profilu roztworu dla wybranych danych SAXS chromatografii wykluczającej rozmiar. RAW podejmie próbę zidentyfikowania zakresów.W razie potrzeby użyj strzałek, aby zmienić zakresy tak, aby każdy okrąg był początkiem punktu przegięcia, wznoszącego się lub opadającego do linii bazowej, a następnie kliknij przycisk Dalej. Aby zmniejszyć lub wyeliminować skoki, określ w przybliżeniu, która klatka odpowiada spajkowi, używając strzałek kontrolnych zakresu w celu dostosowania elementów sterujących zakresem komponentów. Po osiągnięciu minimalnej wartości chi-kwadrat kliknij przycisk wstecz, aby przeprowadzić sprawdzanie poprawności.Jeśli oryginalne wykresy obszarów proekologicznych nadal wyglądają na prawidłowe, kliknij przycisk Dalej i zapisz dane programu EFA, aby zapisać wykresy. Następnie kliknij przycisk Gotowe, aby zamknąć okno EFA. Następnie w oknie RAW otwórz profile w panelu kreślenia, aby wyświetlić krzywe.Na karcie profile panelu sterowania kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zapisać krzywe jako pliki DAT. W celu wyznaczenia SAXS otwórz kartę analizy punktowej i wybierz G, aby wybrać ręczne narzędzie do analizy Guiniera. Na wykresie dodaj lub usuń punkty w taki sposób, aby reszty nie miały funkcji uśmiechu lub marszczenia brwi.Wybrane dane w dopasowaniu Guiniera nie powinny przekraczać maksymalnej kolejki pomnożonej przez promień granicy bezwładności 1,3. Kliknij znormalizowane Kratky. Otrzymany wykres przedstawia ocenę stanu strukturalnego makrocząsteczki, kulistej, cylindrycznej, nieuporządkowanej, znormalizowanej pod względem masy i stężenia.Kliknij głośność korelacji. Całkowita intensywność rozproszenia i zintegrowany obszar całkowitej intensywności rozproszenia w funkcji wykresów Q pojawią się jako szybkie odniesienie do walidacji jakości krzywej rozpraszania. Aby rozpocząć analizę elastyczności, kliknij przycisk Elastyczność.Każdy panel w wyskakującym okienku pokaże wykres wykorzystujący zależność prawa potęgowego, która istnieje między kompaktowymi a wydłużonymi elastycznymi biopolimerami. Użyj suwaka u dołu pola, aby zmienić widok danych do momentu osiągnięcia plateau na jednym z wykresów. Natychmiast po przeprowadzeniu analizy elastyczności kliknij opcję Objętość.Zostanie wygenerowane wyskakujące okienko z trzema wykresami. Wykres Poroda-Debye'a śledzi miejsce, w którym suwak z wykresu elastyczności został pozostawiony, i pokazuje dane obszaru plateau. Aby obliczyć objętość cząstki, przesuwaj punkt początkowy i końcowy, aż niebieska linia na wykresie będzie pasować do obszaru plateau.Aby uzyskać bezstronny wynik, reszty w dopasowaniu prawa potęgowego wykładnika Poroda-Debye'a nie powinny wykazywać żadnego wzorca. Pod zakładką P z R można obserwować rzeczywisty rozkład przestrzeni i krzywą rozpraszania dla próbki. Idealnie byłoby, gdyby krzywa rozkładu była gładka, bez fal i po prostu delikatnie dotykała osi x.Kliknij prawym przyciskiem myszy nazwę próbki i kliknij znajdź DMAX, aby otworzyć nowe okno. Limity maksymalnego wymiaru są wstępnie ustawione z sugerowanym maksymalnym zakresem Q, maksymalnymi punktami danych, które mają być użyte do obliczeń, dolnymi i górnymi maksymalnymi limitami wymiarów oraz dolnym i górnym wynikiem alfa. Kliknij przycisk Start.Zostanie utworzony rozkład złożony wraz z sugerowanym wymiarem maksymalnym i poziomem alfa. Jeśli te dane są akceptowalne, zamknij okno, aby powrócić do zakładki P of R, gdzie wykres odwrotności przestrzeni zostanie teraz przycięty w celu dopasowania do sugerowanego maksymalnego zakresu Q. Wybierz więcej modelu i kliknij tło, aby ustawić poziom alfa i maksymalny wymiar na sugerowane wartości z wyskakującego okienka.Kliknij przycisk Doprecyzuj. Otworzy się wykres walidacji krzyżowej, pokazujący, czy jakiekolwiek punkty musiały zostać odrzucone, jak wskazano na czerwono. Jeśli jest tylko kilka odrzuconych punktów, a rozkład wygląda dobrze, oznacza to, że model jest dobry.Wydrukujesz raport na karcie analizy. Kliknij lewym przyciskiem myszy, aby podświetlić próbkę, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy nazwę próbki. Wybierz pozycję Utwórz raport z pojedynczego zestawu danych.Otworzy się pole tekstowe umożliwiające komentowanie i zostanie utworzony dokument PDF pokazujący wszystkie wygenerowane figury i wartości. W tej reprezentatywnej analizie egzonukleaza polimerazy DNA E9 minus mutant została powiązana z DNA i przeprowadzona przy użyciu chromatografii wykluczającej wielkość rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem. Zaobserwowano dwa szczyty.Pierwszy duży pik reprezentuje egzonukleazę polimerazy DNA E9 minus zmutowany kompleks DNA. A drugi wskazuje stan niepowiązany. Podczas gdy klasyczne podejście polegające na doborze klatek zapewnia stabilny promień bezwładności kompleksu w pierwszym piku, drugi pik jest wyraźnie połączony, a promień bezwładności w poprzek wykresu pokazuje, że drugi pik zainteresowania nie ma stabilnego promienia bezwładności z powodu zanieczyszczenia piku krzyżowego.W tej analizie można było użyć tylko pięciu ramek, które wykazały półstabilny promień bezwładności. Po odjęciu dały one promień bezwładności wynoszący 36,3 angstremów. Gdy piki zostały zdekonwolucyjne za pomocą EFA, odpowiednia krzywa dla drugiego piku została nałożona na pierwotną, pokazując wyraźny spadek sygnału do szumu i niższy promień bezwładności wynoszący 34,1 angstremów.Wykres Kratky'ego danych pokazuje, że kompleks z zawiłym szczytem jest bardziej kulisty, co potwierdza krzywa PR, która daje maksymalny wymiar 108,5 angstremów dla krzywej zdekonwolucyjnej. Niezdekonwolucyjne dane do tej analizy są bardziej wydłużone z maksymalnym wymiarem 120 angstremów, najprawdopodobniej ze względu na niejednorodność wynikającą z niezwiązanej polimerazy E9 minus mutanta egzonukleazy. Najbardziej krytycznymi krokami są wybór wartości osobliwych i zakresu używanych danych, ponieważ mają one ogromny wpływ na dokładność dekonwolucji.Wyniki nie powinny być zbierane samodzielnie, ale dalej oceniane przy użyciu dodatkowych technik, takich jak wirowanie analityczne lub wielokątowe rozpraszanie światła laserowego, aby umożliwić ich biologiczną interpretację. Wbudowany SAXS sprzężony z kolumnami w połączeniu z dekonwolucją i przyjaznym dla użytkownika interfejsem, takim jak program Scatter, to potężny pakiet dostarczający istotnych danych strukturalnych nawet z wewnętrznie trudnych systemów.

analysis-of-sec-saxs-data-via-efa-deconvolution-and-scatter

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Prezentacja procedury małokątnego i szerokokątnego rozpraszania rentgenowskiego (SWAXS) stała się kluczowa w badaniach nad biologicznymi makromolekułami. Dzięki zastosowaniu aparatury oraz procedur przygotowania i metod specyficznych kątów, dane eksperymentalne z SWAXS pozwalają na charakterystykę makromolekuł w skali atomowej i nanometrycznej.

Badania rozpraszania promieni rentgenowskich pod kątem małym i szerokim dla makrocząsteczek biologicznych w roztworze

Nasycone i odwrócone saturable rozpraszanie zostały odkryte w izolowanych cząstkach plazmonicznych i przyjęte jako nowatorska metoda kontrastu bez wybielania w mikroskopii superrozdzielczej. Tutaj szczegółowo wyjaśniono eksperymentalne procedury wykrywania i ekstrakcji rozpraszania nieliniowego, a także sposoby zwiększenia rozdzielczości za pomocą nasyconej mikroskopii wzbudzenia.

Pomiar nieliniowości rozpraszania od pojedynczej nanocząstki plazmonicznej

Określenie struktury roztworu białka za pomocą rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS) wymaga próbek monodyspersyjnych. W tym miejscu przedstawiamy dwie możliwości zapewnienia minimalnych opóźnień między przygotowaniem próbki a akwizycją danych: chromatografia wykluczania wielkości online (SEC) i chromatografia jonowymienna online (IEC).

Wykluczenie według wielkości i chromatografia jonowymienna online na linii badawczej SAXS

Ta metoda opisuje klonowanie, ekspresję i oczyszczanie rekombinowanego Nsa1 do określania strukturalnego za pomocą krystalografii rentgenowskiej i rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS), i ma zastosowanie do hybrydowej analizy strukturalnej innych białek zawierających zarówno uporządkowane, jak i nieuporządkowane domeny.

Połączenie krystalografii rentgenowskiej z rozpraszaniem promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem w celu modelowania nieustrukturyzowanych obszarów Nsa1 z S. cerevisiae

Ten protokół pokazuje, jak uzyskać model ab initio o niskiej rozdzielczości i szczegóły strukturalne białka błonowego rozpuszczonego przez detergent w roztworze przy użyciu rozpraszania neutronów pod małym kątem z dopasowaniem kontrastowym detergentu.

Detergent z dopasowaniem kontrastu w eksperymentach z rozpraszaniem neutronów pod małym kątem do analizy strukturalnej białek błonowych i modelowania ab initio

Tutaj prezentujemy, jak można wykorzystać rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS) do uzyskania informacji o obwiedniach o niskiej rozdzielczości reprezentujących struktury makromolekularne. W połączeniu z technikami strukturalnymi o wysokiej rozdzielczości, takimi jak krystalografia rentgenowska i magnetyczny rezonans jądrowy, SAXS może dostarczyć szczegółowych informacji na temat wielodomenowych białek i kompleksów makromolekularnych w roztworze.

Badania strukturalne makrocząsteczek w roztworze z wykorzystaniem rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem

Ten artykuł jest demonstracją i wskazówką do przeprowadzenia i analizy wewnętrznych (z laboratoryjnym przyrządem rentgenowskim) eksperymentów in situ GISAXS dotyczących suszenia farb na niefulerenowych organicznych fotowoltaikach z rolki na rolkę.

Częstość występowania in situ Rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem na powłoce organicznych ogniw słonecznych z rolki na rolkę z laboratoryjnym oprzyrządowaniem rentgenowskim

Ten artykuł opisuje protokoły przygotowania próbek, redukcji danych i analizy danych w badaniach neutronowego echa spinowego (NSE) błon lipidowych. Rozsądne znakowanie lipidów deuterem umożliwia dostęp do różnych dynamik błon w mezoskopowych skalach długości i czasu, w których zachodzą ważne procesy biologiczne.

Spektroskopia neutronowego echa spinowego jako unikalna sonda do badania dynamiki błony lipidowej i interakcji błona-białko

Protokół przedstawia kompletny przebieg eksperymentów z nanoindentacją miękkiego materiału, w tym hydrożeli i komórek. Po pierwsze, szczegółowo opisano etapy eksperymentalne mające na celu pozyskanie danych ze spektroskopii sił; następnie analiza takich danych jest szczegółowo opisana za pomocą nowo opracowanego oprogramowania Python o otwartym kodzie źródłowym, które można pobrać bezpłatnie z GitHub.

Proces eksperymentowania i analizy danych dla nanotwardości miękkiej materii

Zespołowa spektroskopia sił (EFS) to solidna technika mechanicznego rozkładania i wykrywania w czasie rzeczywistym zestawu struktur biomolekularnych w polach biofizycznych i biosensorycznych.

Spektroskopia sił zespołowych za pomocą sił ścinających

Niniejszy protokół opisuje procedurę przeprowadzenia chromatografii wykluczenia rozmiaru fluorescencyjnego (FSEC) białek błonowych w celu oceny ich jakości na potrzeby dalszej analizy funkcjonalnej i strukturalnej. Przedstawiono reprezentatywne wyniki FSEC zebrane dla kilku receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR) w warunkach rozpuszczalnych w detergentach i bezdetergentowych.

Szybka ocena jakości białka błonowego za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiaru fluorescencyjnego

Poznaj analizę danych SEC-SAXS z dekonwolucją EFA dla makrocząsteczek biologicznych. Ta metoda pozwala uzyskać idealizowane krzywe rozpraszania i dokładniejsze dane strukturalne.

Analiza danych SEC-SAXS za pomocą dekonwolucji i rozproszenia EFA

Przeglądaj więcej filmów