Analiza danych SEC-SAXS za pomocą dekonwolucji i rozproszenia EFA
28 stycznia 2021
Pomiary makrocząsteczek biologicznych SEC-BioSAXS są standardowym podejściem do określania struktury roztworu makrocząsteczek i ich kompleksów. W tym miejscu analizujemy dane SEC-BioSAXS z dwóch typów powszechnie spotykanych śladów SEC - chromatogramów z pikami w pełni rozdzielczymi i częściowo rozdzielczymi. Demonstrujemy analizę i dekonwolucję za pomocą rozpraszania i BioXTAS RAW.
Biologiczne rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małymi kątami zapewnia pomiary strukturalne kompleksów makromolekułowych i makromolekularnych. Idealnie byłoby, gdyby próbka, która ma być mierzona, była monodyspersyjna. Chociaż w niektórych przypadkach chromatografia wykluczania wielkości SAXS nie jest wystarczająca do uzyskania monodyspersyjności, można przeprowadzić programową dekonwolucję danych SAXS w celu uzyskania wyidealizowanej krzywej SAXS.
Zgodnie z tym protokołem, program dekonwolucyjny i przyjazny dla użytkownika program Scatter mogą być używane do analizy mutantów egzominusa polimerazy DNA wirusa krowianki. Aby odjąć tło od danych chromatografii wykluczania wielkości, otwórz program Scatter 4 oparty na Javie i otwórz kartę SEC. Przeciągnij i upuść zredukowane pliki danych do poniższego okna upuszczenia danych, a następnie kliknij przycisk katalogu wyjściowego i otwórz, aby ustawić katalog wyjściowy, w którym dane zostaną zapisane.
Wprowadź nazwę próbki w polu Zapisz jako i kliknij przycisk śledzenia. Kliknij przycisk edycji szczegółów, aby edytować szczegóły eksperymentu i wypełnić odpowiednie pola. Aby ręcznie zaznaczyć ramki bufora, kliknij przycisk Ustaw.
Kliknij lewym przyciskiem myszy i przeciągnij, aby ponownie wybrać bufor jako płaski na krzywej śladu przed pustą objętością kolumny chromatografii wykluczającej rozmiar wynoszącą około 100 klatek, a następnie kliknij ustaw bufor i aktualizację, aby ponownie obliczyć plik SEC. Kliknij lewym przyciskiem myszy i przeciągnij, aby wybrać obszar zainteresowania na wykresie sygnału, a następnie kliknij lewym przyciskiem myszy i przeciągnij krzyżyk nitkowy na wykresie mapy cieplnej, aby wybrać powiększenie i podzbiór klatek, które będą używane do scalania. Kolejnym kliknięciem lewym przyciskiem myszy zaznacz klatki na mapie ciepła odpowiadające obszarowi w prawym dolnym rogu krzyża nitkowego.
Idealnie byłoby, gdyby ramka podkreślała obszar o przeważającym kolorze cyjanowym i stabilnym promieniu bezwładności. Jeśli wybrane ramki są zadowalające, kliknij przycisk Scal, aby scalić odjęte ramki, a następnie kliknij kartę analizy, aby wyświetlić dane. Aby zdekonwoluować dane, załaduj zestaw danych w programie do dekonwolucji.
W panelu sterowania w obszarze pliki użyj symbolu folderu, aby zlokalizować dane i podświetlić wszystkie pliki DAT. Wykres o zintegrowanej intensywności w funkcji numeru klatki zostanie narysowany na wykresie serii. Na karcie serii kliknij, aby podświetlić krzywą i otworzyć wyskakujące okno analizy LC.
Aby wybrać odpowiedni region buforowy, kliknij przycisk Dodaj region, aby wybrać obszar przed szczytem chromatogramu i jeden za przodem rozpuszczalnika, a następnie kliknij przycisk Ustaw bufor. Wyskakujące okienka będą wskazywać, że ramki nie zostały wybrane jako tło. Aby uruchomić EFA, kliknij prawym przyciskiem myszy podświetlony plik i wybierz z menu opcję EFA.
W wyskakującym okienku należy obserwować dekompozycję pojedynczej wartości zestawu danych. W polu kontrolki zaznacz wartości w polu Użyj klatek, aby potwierdzić, że cały obszar piku do dekonwolucji jest pokryty na wykresie intensywności. Wykres wartości osobliwych pokaże intensywność wartości osobliwych powyżej linii bazowej.
Jeśli lewy i prawy pojedynczy wektor nie pasują do siebie, zmień znaczącą liczbę wektora osobliwego na dwa i przesuwaj ramki, aż lewy i prawy wektor osobliwy będą podobne. EFA zostanie obliczony, generując wykresy w kierunku do przodu i do tyłu dla każdego wektora i wskazując, kiedy składniki rozpoczynają i wychodzą z profilu roztworu dla wybranych danych SAXS chromatografii wykluczającej rozmiar. RAW podejmie próbę zidentyfikowania zakresów.
W razie potrzeby użyj strzałek, aby zmienić zakresy tak, aby każdy okrąg był początkiem punktu przegięcia, wznoszącego się lub opadającego do linii bazowej, a następnie kliknij przycisk Dalej. Aby zmniejszyć lub wyeliminować skoki, określ w przybliżeniu, która klatka odpowiada spajkowi, używając strzałek kontrolnych zakresu w celu dostosowania elementów sterujących zakresem komponentów. Po osiągnięciu minimalnej wartości chi-kwadrat kliknij przycisk wstecz, aby przeprowadzić sprawdzanie poprawności.
Jeśli oryginalne wykresy obszarów proekologicznych nadal wyglądają na prawidłowe, kliknij przycisk Dalej i zapisz dane programu EFA, aby zapisać wykresy. Następnie kliknij przycisk Gotowe, aby zamknąć okno EFA. Następnie w oknie RAW otwórz profile w panelu kreślenia, aby wyświetlić krzywe.
Na karcie profile panelu sterowania kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zapisać krzywe jako pliki DAT. W celu wyznaczenia SAXS otwórz kartę analizy punktowej i wybierz G, aby wybrać ręczne narzędzie do analizy Guiniera. Na wykresie dodaj lub usuń punkty w taki sposób, aby reszty nie miały funkcji uśmiechu lub marszczenia brwi.
Wybrane dane w dopasowaniu Guiniera nie powinny przekraczać maksymalnej kolejki pomnożonej przez promień granicy bezwładności 1,3. Kliknij znormalizowane Kratky. Otrzymany wykres przedstawia ocenę stanu strukturalnego makrocząsteczki, kulistej, cylindrycznej, nieuporządkowanej, znormalizowanej pod względem masy i stężenia.
Kliknij głośność korelacji. Całkowita intensywność rozproszenia i zintegrowany obszar całkowitej intensywności rozproszenia w funkcji wykresów Q pojawią się jako szybkie odniesienie do walidacji jakości krzywej rozpraszania. Aby rozpocząć analizę elastyczności, kliknij przycisk Elastyczność.
Każdy panel w wyskakującym okienku pokaże wykres wykorzystujący zależność prawa potęgowego, która istnieje między kompaktowymi a wydłużonymi elastycznymi biopolimerami. Użyj suwaka u dołu pola, aby zmienić widok danych do momentu osiągnięcia plateau na jednym z wykresów. Natychmiast po przeprowadzeniu analizy elastyczności kliknij opcję Objętość.
Zostanie wygenerowane wyskakujące okienko z trzema wykresami. Wykres Poroda-Debye'a śledzi miejsce, w którym suwak z wykresu elastyczności został pozostawiony, i pokazuje dane obszaru plateau. Aby obliczyć objętość cząstki, przesuwaj punkt początkowy i końcowy, aż niebieska linia na wykresie będzie pasować do obszaru plateau.
Aby uzyskać bezstronny wynik, reszty w dopasowaniu prawa potęgowego wykładnika Poroda-Debye'a nie powinny wykazywać żadnego wzorca. Pod zakładką P z R można obserwować rzeczywisty rozkład przestrzeni i krzywą rozpraszania dla próbki. Idealnie byłoby, gdyby krzywa rozkładu była gładka, bez fal i po prostu delikatnie dotykała osi x.
Kliknij prawym przyciskiem myszy nazwę próbki i kliknij znajdź DMAX, aby otworzyć nowe okno. Limity maksymalnego wymiaru są wstępnie ustawione z sugerowanym maksymalnym zakresem Q, maksymalnymi punktami danych, które mają być użyte do obliczeń, dolnymi i górnymi maksymalnymi limitami wymiarów oraz dolnym i górnym wynikiem alfa. Kliknij przycisk Start.
Zostanie utworzony rozkład złożony wraz z sugerowanym wymiarem maksymalnym i poziomem alfa. Jeśli te dane są akceptowalne, zamknij okno, aby powrócić do zakładki P of R, gdzie wykres odwrotności przestrzeni zostanie teraz przycięty w celu dopasowania do sugerowanego maksymalnego zakresu Q. Wybierz więcej modelu i kliknij tło, aby ustawić poziom alfa i maksymalny wymiar na sugerowane wartości z wyskakującego okienka.
Kliknij przycisk Doprecyzuj. Otworzy się wykres walidacji krzyżowej, pokazujący, czy jakiekolwiek punkty musiały zostać odrzucone, jak wskazano na czerwono. Jeśli jest tylko kilka odrzuconych punktów, a rozkład wygląda dobrze, oznacza to, że model jest dobry.
Wydrukujesz raport na karcie analizy. Kliknij lewym przyciskiem myszy, aby podświetlić próbkę, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy nazwę próbki. Wybierz pozycję Utwórz raport z pojedynczego zestawu danych.
Otworzy się pole tekstowe umożliwiające komentowanie i zostanie utworzony dokument PDF pokazujący wszystkie wygenerowane figury i wartości. W tej reprezentatywnej analizie egzonukleaza polimerazy DNA E9 minus mutant została powiązana z DNA i przeprowadzona przy użyciu chromatografii wykluczającej wielkość rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem. Zaobserwowano dwa szczyty.
Pierwszy duży pik reprezentuje egzonukleazę polimerazy DNA E9 minus zmutowany kompleks DNA. A drugi wskazuje stan niepowiązany. Podczas gdy klasyczne podejście polegające na doborze klatek zapewnia stabilny promień bezwładności kompleksu w pierwszym piku, drugi pik jest wyraźnie połączony, a promień bezwładności w poprzek wykresu pokazuje, że drugi pik zainteresowania nie ma stabilnego promienia bezwładności z powodu zanieczyszczenia piku krzyżowego.
W tej analizie można było użyć tylko pięciu ramek, które wykazały półstabilny promień bezwładności. Po odjęciu dały one promień bezwładności wynoszący 36,3 angstremów. Gdy piki zostały zdekonwolucyjne za pomocą EFA, odpowiednia krzywa dla drugiego piku została nałożona na pierwotną, pokazując wyraźny spadek sygnału do szumu i niższy promień bezwładności wynoszący 34,1 angstremów.
Wykres Kratky'ego danych pokazuje, że kompleks z zawiłym szczytem jest bardziej kulisty, co potwierdza krzywa PR, która daje maksymalny wymiar 108,5 angstremów dla krzywej zdekonwolucyjnej. Niezdekonwolucyjne dane do tej analizy są bardziej wydłużone z maksymalnym wymiarem 120 angstremów, najprawdopodobniej ze względu na niejednorodność wynikającą z niezwiązanej polimerazy E9 minus mutanta egzonukleazy. Najbardziej krytycznymi krokami są wybór wartości osobliwych i zakresu używanych danych, ponieważ mają one ogromny wpływ na dokładność dekonwolucji.
Wyniki nie powinny być zbierane samodzielnie, ale dalej oceniane przy użyciu dodatkowych technik, takich jak wirowanie analityczne lub wielokątowe rozpraszanie światła laserowego, aby umożliwić ich biologiczną interpretację. Wbudowany SAXS sprzężony z kolumnami w połączeniu z dekonwolucją i przyjaznym dla użytkownika interfejsem, takim jak program Scatter, to potężny pakiet dostarczający istotnych danych strukturalnych nawet z wewnętrznie trudnych systemów.
Przegląd
Niniejszy artykuł omawia pomiary SEC-BioSAXS, będące standardową metodą określania struktury w roztworze makrocząsteczek biologicznych oraz ich kompleksów. Analiza koncentruje się na śladach SEC z całkowicie i częściowo rozdzielonymi pikami, demonstrując dekonwolucję danych przy użyciu oprogramowania Scatter oraz BioXTAS RAW.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Makromolekuły biologiczne
- Biologia strukturalna
- Techniki rozpraszania promieni rentgenowskich
Wstęp
- Rozpraszanie promieni rentgenowskich pod małym kątem (SAXS) pozwala na uzyskanie informacji strukturalnych o makrocząsteczkach.
- Monodyspersyjność próbek jest idealna dla uzyskania dokładnych pomiarów.
- Chromatografia żelowa (SEC) nie zawsze pozwala na osiągnięcie monodyspersyjności.
- Dekonwolucja oparta na oprogramowaniu może zoptymalizować analizę danych SAXS.
Cel badania
- Analiza danych SEC-BioSAXS z różnych śladów SEC.
- Zaprezentowanie zastosowania oprogramowania do dekonwolucji danych.
- Przedstawienie protokołu analizy SAXS kompleksów makromolekularnych.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie oprogramowania Scatter oraz BioXTAS RAW do analizy danych.
- Techniki odejmowania tła dla danych SEC.
- Dekonwolucja danych SAXS przy użyciu EFA i innych narzędzi analitycznych.
- Analiza stanów strukturalnych i elastyczności makrocząsteczek.
Główne wyniki
- Skuteczna dekonwolucja danych SAXS prowadząca do idealnych krzywych SAXS.
- Identyfikacja stanów strukturalnych makrocząsteczek poprzez analizę.
- Walidacja jakości danych przy użyciu różnych ocen graficznych.
- Wgląd w elastyczność i wymiary analizowanych cząsteczek.
Wnioski
- SEC-BioSAXS jest cenną techniką badania struktur makromolekularnych.
- Narzędzia programistyczne usprawniają analizę i interpretację danych SAXS.
- Metody dekonwolucji mogą poprawić dokładność oceny strukturalnej.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Dekonwolucja danych SEC-SAXS umożliwia charakterystykę strukturalną heterogenicznych próbek makromolekularnych, których nie udaje się monodyspergować wyłącznie za pomocą chromatografii. Podejście to wspiera walidację celu poprzez rozdzielanie nakładających się form cząsteczek i dostarczanie ilościowych parametrów strukturalnych w celu minimalizacji ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkrywania leków. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w identyfikacji związków wiodących, dostarczając powtarzalnych danych w stanie roztworu dla złożonych biopreparatów oraz oddziaływań kwasów nukleinowych z białkami.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez izolowanie sygnatur strukturalnych poszczególnych składników w mieszaninach heterogenicznych.
- Wartość operacyjna: Pozwala na wyjaśnienie przebiegu procesów dzięki dekonwolucji krzywych SAXS, które umożliwiają rozróżnienie stanów związanych i niezwiązanych kompleksów makromolekularnych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfelu badawczym, dostarczając ilościowych parametrów, takich jak promień żyracji oraz maksymalny wymiar dla każdego rozdzielonego składnika.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów analizy poprzez generowanie zidealizowanych krzywych SAXS z pików rozdzielonych metodą SEC.
- Wartość operacyjna: Rozwiązuje kwestie standaryzacji i powtarzalności testów dzięki protokołom odejmowania tła i wyboru klatek, które minimalizują zanieczyszczenia krzyżowe między pikami.
- Skalowalność: Podkreśla gotowość do screeningu dzięki przyjaznym dla użytkownika interfejsom oprogramowania (Scatter, BioXTAS RAW), które umożliwiają spójne przetwarzanie danych w różnych projektach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Omówienie znaczenia w kontekście chorób poprzez analizę mutanta vaccinia E9 DNA polymerase exonuclease minus, będącego modelem do badań mechanistycznych enzymów przetwarzających kwasy nukleinowe.
- Zgodność przedkliniczna: Opis ciągłości od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez powiązanie stanów strukturalnych uzyskanych z SAXS z wynikami funkcjonalnymi przy użyciu technik komplementarnych, takich jak wirowanie analityczne.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Skupienie się na wartości predykcyjnego ograniczania ryzyka poprzez wykorzystanie analizy elastyczności i wykresów Kratky'ego do oceny nieuporządkowania strukturalnego i kierowania decyzjami o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go).
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesów odkrywania leków, od wczesnej fazy odkrywania (Early Discovery) po identyfikację wiodących związków (Lead Identification) i badania przedkliniczne, wspierając testowanie hipotez, przygotowanie testów oraz analitykę strukturalną.
- Biologia odkryć: Wyjaśnia, w jaki sposób metoda ta wspiera testowanie hipotez poprzez rozdzielanie nakładających się piku SEC-SAXS w celu wyjaśnienia oddziaływań makrocząsteczkowych i stanów konformacyjnych.
- Screening: Opisuje gotowość analizy poprzez powtarzalność dekonwolucji krzywych SAXS oraz parametry ilościowe, takie jak promień gyracji i wymiar maksymalny.
- Analityka: Wskazuje na pomiary i odczyty (dopasowanie Guiniera, wykres Kratky'ego, analiza Poroda-Debyego), które umożliwiają zespołom porównywanie warunków strukturalnych i ocenę jakości danych.
- Badania translacyjne: Łączy metodę z ciągłością przedkliniczną poprzez walidację wymiarów i elastyczności wyznaczonych z SAXS za pomocą technik ortogonalnych w celu interpretacji biologicznej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Przedstawia metodę jako możliwość wielokrotnego zastosowania dzięki ustandaryzowanym przepływom pracy w oprogramowaniu (Scatter, BioXTAS RAW), co zapewnia spójność międzyzespołową w zakresie dekonwolucji danych i raportowania.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna, walidacja celu, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej w próbkach heterogenicznych.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność analizy danych SAXS poprzez zdefiniowane protokoły odejmowania tła i EFA.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa oraz zredukowane ryzyko biologiczne w późnych etapach dzięki wczesnemu rozwiązaniu problemu heterogeniczności strukturalnej.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko oraz decyzje dotyczące dalszego rozwoju oparte na ilościowych parametrach strukturalnych z odseparowanych komponentów.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w interpretacji danych SAXS, integracji z chromatografią oraz dekonwolucji programowej (EFA, Guinier, Kratky).
- Wymaga aparatury do sprzężenia SEC-SAXS oraz infrastruktury obliczeniowej do obsługi programów Scatter i BioXTAS RAW w celu selekcji klatek, odejmowania tła oraz analizy wartości osobliwych.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie doboru buforu, zaznaczania klatek i dostosowywania zakresów, aby zapewnić spójne wyniki dekonwolucji.
- Uwzględnia kwestie adaptacji w różnych systemach modelowych, szczególnie w przypadku elastycznych biopolimerów lub kompleksów zmieniających kształt, co wpływa na profile elucji.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak konieczność walidacji ortogonalnej (np. wirówką analityczną, MALS), aby potwierdzić biologiczną istotność zdekonwolucjonowanych krzywych SAXS.
