Analiza danych SEC-SAXS za pomocą dekonwolucji i rozproszenia EFA
January 28th, 2021
Pomiary makrocząsteczek biologicznych SEC-BioSAXS są standardowym podejściem do określania struktury roztworu makrocząsteczek i ich kompleksów. W tym miejscu analizujemy dane SEC-BioSAXS z dwóch typów powszechnie spotykanych śladów SEC - chromatogramów z pikami w pełni rozdzielczymi i częściowo rozdzielczymi. Demonstrujemy analizę i dekonwolucję za pomocą rozpraszania i BioXTAS RAW.
Biologiczne rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małymi kątami zapewnia pomiary strukturalne kompleksów makromolekułowych i makromolekularnych. Idealnie byłoby, gdyby próbka, która ma być mierzona, była monodyspersyjna. Chociaż w niektórych przypadkach chromatografia wykluczania wielkości SAXS nie jest wystarczająca do uzyskania monodyspersyjności, można przeprowadzić programową dekonwolucję danych SAXS w celu uzyskania wyidealizowanej krzywej SAXS.
Zgodnie z tym protokołem, program dekonwolucyjny i przyjazny dla użytkownika program Scatter mogą być używane do analizy mutantów egzominusa polimerazy DNA wirusa krowianki. Aby odjąć tło od danych chromatografii wykluczania wielkości, otwórz program Scatter 4 oparty na Javie i otwórz kartę SEC. Przeciągnij i upuść zredukowane pliki danych do poniższego okna upuszczenia danych, a następnie kliknij przycisk katalogu wyjściowego i otwórz, aby ustawić katalog wyjściowy, w którym dane zostaną zapisane.
Wprowadź nazwę próbki w polu Zapisz jako i kliknij przycisk śledzenia. Kliknij przycisk edycji szczegółów, aby edytować szczegóły eksperymentu i wypełnić odpowiednie pola. Aby ręcznie zaznaczyć ramki bufora, kliknij przycisk Ustaw.
Kliknij lewym przyciskiem myszy i przeciągnij, aby ponownie wybrać bufor jako płaski na krzywej śladu przed pustą objętością kolumny chromatografii wykluczającej rozmiar wynoszącą około 100 klatek, a następnie kliknij ustaw bufor i aktualizację, aby ponownie obliczyć plik SEC. Kliknij lewym przyciskiem myszy i przeciągnij, aby wybrać obszar zainteresowania na wykresie sygnału, a następnie kliknij lewym przyciskiem myszy i przeciągnij krzyżyk nitkowy na wykresie mapy cieplnej, aby wybrać powiększenie i podzbiór klatek, które będą używane do scalania. Kolejnym kliknięciem lewym przyciskiem myszy zaznacz klatki na mapie ciepła odpowiadające obszarowi w prawym dolnym rogu krzyża nitkowego.
Idealnie byłoby, gdyby ramka podkreślała obszar o przeważającym kolorze cyjanowym i stabilnym promieniu bezwładności. Jeśli wybrane ramki są zadowalające, kliknij przycisk Scal, aby scalić odjęte ramki, a następnie kliknij kartę analizy, aby wyświetlić dane. Aby zdekonwoluować dane, załaduj zestaw danych w programie do dekonwolucji.
W panelu sterowania w obszarze pliki użyj symbolu folderu, aby zlokalizować dane i podświetlić wszystkie pliki DAT. Wykres o zintegrowanej intensywności w funkcji numeru klatki zostanie narysowany na wykresie serii. Na karcie serii kliknij, aby podświetlić krzywą i otworzyć wyskakujące okno analizy LC.
Aby wybrać odpowiedni region buforowy, kliknij przycisk Dodaj region, aby wybrać obszar przed szczytem chromatogramu i jeden za przodem rozpuszczalnika, a następnie kliknij przycisk Ustaw bufor. Wyskakujące okienka będą wskazywać, że ramki nie zostały wybrane jako tło. Aby uruchomić EFA, kliknij prawym przyciskiem myszy podświetlony plik i wybierz z menu opcję EFA.
W wyskakującym okienku należy obserwować dekompozycję pojedynczej wartości zestawu danych. W polu kontrolki zaznacz wartości w polu Użyj klatek, aby potwierdzić, że cały obszar piku do dekonwolucji jest pokryty na wykresie intensywności. Wykres wartości osobliwych pokaże intensywność wartości osobliwych powyżej linii bazowej.
Jeśli lewy i prawy pojedynczy wektor nie pasują do siebie, zmień znaczącą liczbę wektora osobliwego na dwa i przesuwaj ramki, aż lewy i prawy wektor osobliwy będą podobne. EFA zostanie obliczony, generując wykresy w kierunku do przodu i do tyłu dla każdego wektora i wskazując, kiedy składniki rozpoczynają i wychodzą z profilu roztworu dla wybranych danych SAXS chromatografii wykluczającej rozmiar. RAW podejmie próbę zidentyfikowania zakresów.
W razie potrzeby użyj strzałek, aby zmienić zakresy tak, aby każdy okrąg był początkiem punktu przegięcia, wznoszącego się lub opadającego do linii bazowej, a następnie kliknij przycisk Dalej. Aby zmniejszyć lub wyeliminować skoki, określ w przybliżeniu, która klatka odpowiada spajkowi, używając strzałek kontrolnych zakresu w celu dostosowania elementów sterujących zakresem komponentów. Po osiągnięciu minimalnej wartości chi-kwadrat kliknij przycisk wstecz, aby przeprowadzić sprawdzanie poprawności.
Jeśli oryginalne wykresy obszarów proekologicznych nadal wyglądają na prawidłowe, kliknij przycisk Dalej i zapisz dane programu EFA, aby zapisać wykresy. Następnie kliknij przycisk Gotowe, aby zamknąć okno EFA. Następnie w oknie RAW otwórz profile w panelu kreślenia, aby wyświetlić krzywe.
Na karcie profile panelu sterowania kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zapisać krzywe jako pliki DAT. W celu wyznaczenia SAXS otwórz kartę analizy punktowej i wybierz G, aby wybrać ręczne narzędzie do analizy Guiniera. Na wykresie dodaj lub usuń punkty w taki sposób, aby reszty nie miały funkcji uśmiechu lub marszczenia brwi.
Wybrane dane w dopasowaniu Guiniera nie powinny przekraczać maksymalnej kolejki pomnożonej przez promień granicy bezwładności 1,3. Kliknij znormalizowane Kratky. Otrzymany wykres przedstawia ocenę stanu strukturalnego makrocząsteczki, kulistej, cylindrycznej, nieuporządkowanej, znormalizowanej pod względem masy i stężenia.
Kliknij głośność korelacji. Całkowita intensywność rozproszenia i zintegrowany obszar całkowitej intensywności rozproszenia w funkcji wykresów Q pojawią się jako szybkie odniesienie do walidacji jakości krzywej rozpraszania. Aby rozpocząć analizę elastyczności, kliknij przycisk Elastyczność.
Każdy panel w wyskakującym okienku pokaże wykres wykorzystujący zależność prawa potęgowego, która istnieje między kompaktowymi a wydłużonymi elastycznymi biopolimerami. Użyj suwaka u dołu pola, aby zmienić widok danych do momentu osiągnięcia plateau na jednym z wykresów. Natychmiast po przeprowadzeniu analizy elastyczności kliknij opcję Objętość.
Zostanie wygenerowane wyskakujące okienko z trzema wykresami. Wykres Poroda-Debye'a śledzi miejsce, w którym suwak z wykresu elastyczności został pozostawiony, i pokazuje dane obszaru plateau. Aby obliczyć objętość cząstki, przesuwaj punkt początkowy i końcowy, aż niebieska linia na wykresie będzie pasować do obszaru plateau.
Aby uzyskać bezstronny wynik, reszty w dopasowaniu prawa potęgowego wykładnika Poroda-Debye'a nie powinny wykazywać żadnego wzorca. Pod zakładką P z R można obserwować rzeczywisty rozkład przestrzeni i krzywą rozpraszania dla próbki. Idealnie byłoby, gdyby krzywa rozkładu była gładka, bez fal i po prostu delikatnie dotykała osi x.
Kliknij prawym przyciskiem myszy nazwę próbki i kliknij znajdź DMAX, aby otworzyć nowe okno. Limity maksymalnego wymiaru są wstępnie ustawione z sugerowanym maksymalnym zakresem Q, maksymalnymi punktami danych, które mają być użyte do obliczeń, dolnymi i górnymi maksymalnymi limitami wymiarów oraz dolnym i górnym wynikiem alfa. Kliknij przycisk Start.
Zostanie utworzony rozkład złożony wraz z sugerowanym wymiarem maksymalnym i poziomem alfa. Jeśli te dane są akceptowalne, zamknij okno, aby powrócić do zakładki P of R, gdzie wykres odwrotności przestrzeni zostanie teraz przycięty w celu dopasowania do sugerowanego maksymalnego zakresu Q. Wybierz więcej modelu i kliknij tło, aby ustawić poziom alfa i maksymalny wymiar na sugerowane wartości z wyskakującego okienka.
Kliknij przycisk Doprecyzuj. Otworzy się wykres walidacji krzyżowej, pokazujący, czy jakiekolwiek punkty musiały zostać odrzucone, jak wskazano na czerwono. Jeśli jest tylko kilka odrzuconych punktów, a rozkład wygląda dobrze, oznacza to, że model jest dobry.
Wydrukujesz raport na karcie analizy. Kliknij lewym przyciskiem myszy, aby podświetlić próbkę, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy nazwę próbki. Wybierz pozycję Utwórz raport z pojedynczego zestawu danych.
Otworzy się pole tekstowe umożliwiające komentowanie i zostanie utworzony dokument PDF pokazujący wszystkie wygenerowane figury i wartości. W tej reprezentatywnej analizie egzonukleaza polimerazy DNA E9 minus mutant została powiązana z DNA i przeprowadzona przy użyciu chromatografii wykluczającej wielkość rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem. Zaobserwowano dwa szczyty.
Pierwszy duży pik reprezentuje egzonukleazę polimerazy DNA E9 minus zmutowany kompleks DNA. A drugi wskazuje stan niepowiązany. Podczas gdy klasyczne podejście polegające na doborze klatek zapewnia stabilny promień bezwładności kompleksu w pierwszym piku, drugi pik jest wyraźnie połączony, a promień bezwładności w poprzek wykresu pokazuje, że drugi pik zainteresowania nie ma stabilnego promienia bezwładności z powodu zanieczyszczenia piku krzyżowego.
W tej analizie można było użyć tylko pięciu ramek, które wykazały półstabilny promień bezwładności. Po odjęciu dały one promień bezwładności wynoszący 36,3 angstremów. Gdy piki zostały zdekonwolucyjne za pomocą EFA, odpowiednia krzywa dla drugiego piku została nałożona na pierwotną, pokazując wyraźny spadek sygnału do szumu i niższy promień bezwładności wynoszący 34,1 angstremów.
Wykres Kratky'ego danych pokazuje, że kompleks z zawiłym szczytem jest bardziej kulisty, co potwierdza krzywa PR, która daje maksymalny wymiar 108,5 angstremów dla krzywej zdekonwolucyjnej. Niezdekonwolucyjne dane do tej analizy są bardziej wydłużone z maksymalnym wymiarem 120 angstremów, najprawdopodobniej ze względu na niejednorodność wynikającą z niezwiązanej polimerazy E9 minus mutanta egzonukleazy. Najbardziej krytycznymi krokami są wybór wartości osobliwych i zakresu używanych danych, ponieważ mają one ogromny wpływ na dokładność dekonwolucji.
Wyniki nie powinny być zbierane samodzielnie, ale dalej oceniane przy użyciu dodatkowych technik, takich jak wirowanie analityczne lub wielokątowe rozpraszanie światła laserowego, aby umożliwić ich biologiczną interpretację. Wbudowany SAXS sprzężony z kolumnami w połączeniu z dekonwolucją i przyjaznym dla użytkownika interfejsem, takim jak program Scatter, to potężny pakiet dostarczający istotnych danych strukturalnych nawet z wewnętrznie trudnych systemów.
Przegląd
Ten artykuł omawia pomiary SEC-BioSAXS, standardową metodę określania struktury w roztworze makrocząsteczek biologicznych i ich kompleksów. Analiza koncentruje się na śladach SEC z całkowicie rozdzielonymi i częściowo rozdzielonymi szczytami, demonstrując dekonwolucję danych za pomocą oprogramowania Scatter i BioXTAS RAW.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Makrocząsteczki biologiczne
- Biologia strukturalna
- Techniki rozpraszania rentgenowskiego
Tło
- Rozpraszanie rentgenowskie pod małym kątem (SAXS) zapewnia informacje strukturalne na temat makrocząsteczek.
- Monodyspersja próbek jest idealna dla dokładnych pomiarów.
- Chromatografia eklucją rozmiaru (SEC) nie zawsze osiąga monodyspersję.
- Dekonwolucja oparta na oprogramowaniu może zoptymalizować analizę danych SAXS.
Cel badania
- Aby analizować dane SEC-BioSAXS z różnych śladów SEC.
- Aby zademonstrować użycie oprogramowania do dekonwolucji danych.
- Aby przedstawić protokół dla analizy SAXS kompleksów makrocząsteczek.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie oprogramowania Scatter i BioXTAS RAW do analizy danych.
- Techniki odejmowania tła dla danych SEC.
- Dekonwolucja danych SAXS za pomocą EFA i innych narzędzi analitycznych.
- Analiza stanów strukturalnych i elastyczności makrocząsteczek.
Główne wyniki
- Udana dekonwolucja danych SAXS prowadząca do idealizowanych krzywych SAXS.
- Identyfikacja stanów strukturalnych makrocząsteczek poprzez analizę.
- Walidacja jakości danych za pomocą różnych graficznych ocen.
- Wgląd w elastyczność i wymiary analizowanych cząstek.
Wnioski
- SEC-BioSAXS to wartościowa technika do badania struktur makrocząsteczek.
- Narzędzia oprogramowania zwiększają analizę i interpretację danych SAXS.
- Metody dekonwolucji mogą poprawić dokładność ocen strukturalnych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
SEC-SAXS data deconvolution enables structural characterization of heterogeneous macromolecular samples that resist monodispersity through chromatography alone. This approach supports target validation by resolving overlapping species and providing quantitative structural parameters for mechanistic de-risking in early discovery. The method enhances predictive confidence in lead identification by delivering reproducible, solution-state data for complex biologics and nucleic acid-protein interactions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating structural signatures of individual components in heterogeneous mixtures.
- Operational Value: Provides pathway clarification through deconvoluted SAXS curves that distinguish bound and unbound states of macromolecular complexes.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by delivering quantitative metrics such as radius of gyration and maximum dimension for each resolved component.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by generating idealized SAXS curves from SEC-separated peaks.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through background subtraction and frame selection protocols that minimize cross-peak contamination.
- Scalability: Highlights screening readiness via user-friendly software interfaces (Scatter, BioXTAS RAW) that enable consistent data processing across projects.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Discusses disease relevance through analysis of vaccinia E9 DNA polymerase exonuclease minus mutant, a model for mechanistic studies of nucleic acid-processing enzymes.
- Preclinical Alignment: Describes continuity from discovery through preclinical validation by linking SAXS-derived structural states to functional outcomes via complementary techniques like analytical centrifugation.
- Risk-Adjusted Advancement: Focuses on predictive de-risking value by using flexibility analysis and Kratky plots to assess structural disorder and guide go/no-go decisions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification and Preclinical work, supporting hypothesis testing, assay readiness, and structural analytics.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing by resolving overlapping SEC-SAXS peaks to clarify macromolecular interactions and conformational states.
- Screening: Describes assay readiness through reproducibility of deconvoluted SAXS curves and quantitative outputs like radius of gyration and maximum dimension.
- Analytics: Highlights measurements and readouts (Guinier fit, Kratky plot, Porod-Debye analysis) that enable teams to compare structural conditions and assess data quality.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by validating SAXS-derived dimensions and flexibility with orthogonal techniques for biological interpretation.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability via standardized software workflows (Scatter, BioXTAS RAW) that ensure cross-team consistency in data deconvolution and reporting.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in heterogeneous samples.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of SAXS data analysis through defined background subtraction and EFA protocols.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by resolving structural heterogeneity early.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative structural parameters from deconvoluted components.
Implementation Considerations
- Requires expertise in SAXS data interpretation, chromatography integration, and software-based deconvolution (EFA, Guinier, Kratky).
- Needs instrumentation for SEC-SAXS coupling and computational infrastructure to run Scatter and BioXTAS RAW for frame selection, background subtraction, and singular value analysis.
- Demands cross-team standardization in buffer selection, frame highlighting, and range adjustment to ensure consistent deconvolution outcomes.
- Involves adaptation considerations across model systems, particularly when dealing with flexible biopolymers or shape-shifting complexes that alter elution profiles.
- Includes practical limitations such as the need for orthogonal validation (e.g., analytical centrifugation, MALS) to confirm biological relevance of deconvoluted SAXS curves.
