Kwantyfikacja krążącego DNA specyficznego dla świni we krwi w modelu ksenotransplantacji

Ksenotransplantacja jest wykonalną metodą leczenia Jednak skuteczne monitorowanie odrzucenia immunologicznego ksenotransplantacji stanowi problem dla lekarzy i badaczy. Protokół ten jest prostą, wygodną, tanią i mniej inwazyjną metodą monitorowania odrzucenia immunologicznego ksenotransmutacji. Technika ta może być stosowana w dziedzinie ksenotransplantacji, w tym przeszczepu wysp trzustkowych od świni do człowieka, przeszczepu nerki, przeszczepu wątroby i przeszczepu serca.

Zacznij od przeniesienia 500 mikrolitrów próbek krwi do różnych mikroprobówek wirówkowych. Dodać 20 mikrolitrów proteazy K i 500 mikrolitrów buforu do lizy do probówek. Następnie dokładnie potrząśnij nimi do wymieszania.

Umieść probówki w łaźni wodnej o temperaturze 56 stopni Celsjusza na 10 minut, potrząsając nimi dwa do trzech razy podczas inkubacji, aż roztwór stanie się klarowny, odwiruj je krótko, aby usunąć kulki płynu z wewnętrznej ścianki pokryw probówek. Następnie dodaj 500 mikrolitrów bezwodnego alkoholu etylowego i dokładnie wstrząśnij. Przenieść mieszaninę do kolumny adsorpcyjnej.

Następnie odwirować kolumnę przez dwie minuty i wyrzucić odpady. Dodaj 800 mikrolitrów roztworu płuczącego do każdej kolumny adsorpcyjnej i odwiruj przez jedną minutę. Pozostaw kolumny w temperaturze pokojowej na kilka minut, aby wysuszyć pozostały roztwór do płukania.

Przenieść kolumny absorpcyjne do czystej rurki odśrodkowej. Dodaj 50 mikrolitrów buforu elucyjnego do środka warstw adsorpcyjnych i umieść je w temperaturze pokojowej na dwie do pięciu minut, a następnie odwiruj przez jedną minutę. Przygotuj główną mieszankę PCR zgodnie ze wskazówkami manuskryptu, a następnie dodaj 23 mikrolitry mieszanki do każdej 0,6 mililitra mikroprobówki wirówkowej.

Dodaj dwa mikrolitry genomowego DNA do każdej probówki i ostrożnie Cabot. Następnie krótko wymieszaj i odwiruj. Umieść probówki w cyklerze PCR i rozpocznij amplifikację.

Po zakończeniu reakcji wykonaj elektroforezę agarozową. Dodaj 1,2 grama agarozy do kolby zawierającej sto milimetrów TAE i gotuj przez pięć minut w kuchence mikrofalowej. Gdy agaroza ostygnie do około 70 stopni Celsjusza, dodaj pięć mikrolitrów barwnika kwasu nukleinowego do kolby, powoli, wlej go do płytki i pozostaw w temperaturze pokojowej, aż zestali się w żel.

Dodaj pięć mikrolitrów każdej próbki i drabinkę DNA 2-log lub marker DNA 1 do studzienek żelu agarozowego i poddaj elektroforezie na 120 milionach pierów, aż pasma zostaną oddzielone. Wizualizuj żel za pomocą aparatu do obrazowania ultrafioletowego. Po przeprowadzeniu transformacji zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym, zweryfikuj plazmidy przez trawienie enzymami podwójnej restrykcji za pomocą EcoR I i Bam HI. Oddziel strawione produkty za pomocą elektroforezy 1% agarozy i wystaw żel na działanie światła UV.

Rozcieńczyć skoncentrowany plazmid fragmentem DNA świni dwa razy od 10 do 11 kopii na mililitr dla wyjściowego roztworu wzorcowego, używając wody podwójnie destylowanej. Aby ustalić krzywą wzorcową, należy przygotować wzorcową mieszankę qPCR, zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym i dodać 40 mikrolitrów mieszanki do każdej probówki ośmioprobowego paska. Dodać 10 mikrolitrów standardowego DNA o różnych stężeniach, zakryć probówki, a następnie krótko wymieszać i odwirować.

Umieść probówki w maszynie qPCR i wykonaj amplifikację. Użyj probówek EDTA, aby pobrać próbki krwi o objętości około 400 mikrolitrów z modeli łat tętniczych świnia-małpa lub 100 mikrolitrów z modeli przeszczepu komórek świni na mysz. Następnie przenieś próbki do 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych.

Usunąć komórki krwi z próbek krwi przez odwirowanie w niskiej temperaturze i z dużą prędkością. Przenieś supernatant do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra i usuń resztki komórek przez odwirowanie w temperaturze 16 000 razy G przez 10 minut. Przenieś supernatant do nowej 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej i wyekstrahuj krążące DNA za pomocą komercyjnego surowicy podczas krążącego zestawu do ekstrakcji DNA.

Skondensuj objętość krążącego DNA do 40 mikrolitrów i przechowuj je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Wykonaj qPCR, aby określić ilościowo krążące DNA specyficzne dla świni. Zaprojektowano startery specyficzne dla świń i wykorzystano je do ilościowego określenia krążącego DNA specyficznego dla świni za pomocą qPCR, w modelach przeszczepu komórek świni na mysz i plastra tętnicy świnia-małpa, modele transplantacji.

Do wyizolowania amplifikowanych fragmentów DNA zastosowano elektroforezę agarozową. Za pomocą PCR zidentyfikowano startery specyficzne dla amplifikowanego genomowego DNA świni. Następnie potwierdzono specyficzność gatunkową tych starterów w kohorcie genomowego DNA małpy lub człowieka lub w kohorcie genomowego DNA myszy.

Na koniec wykorzystano dwa specyficzne dla gatunku startery do amplifikacji DNA świni w plamie tętnicy świnia-małpa i modelach przeszczepu komórek świnia-mysz. Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas korzystania z tego protokołu, jest to, że należy zapobiegać wszelkiego rodzaju zanieczyszczeniom. Technika ta toruje naukowcom drogę do zbadania nowych pytań dotyczących ksenotransplantacji, ponieważ jest to prosta, tania i nieinwazyjna metoda monitorowania odrzucenia immunologicznego ksenotransplantacji.