Name: Umożliwienie kompensacji w czasie rzeczywistym w szybkim utlenianiu fotochemicznym białek w celu określenia zmian topografii białek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Poznaj metodę FPOP do analizy struktury białek z kompensacją w czasie rzeczywistym. Technika umożliwia badanie konformacji białek i ich interakcji w różnych buforach, co wspiera rozwój leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy za finansowanie badań z grantu Narodowego Instytutu Ogólnych Nauk Medycznych R43GM125420-01 na wsparcie komercyjnego rozwoju stacjonarnego urządzenia FPOP oraz R01GM127267 na rozwój protokołów standaryzacji i dozymetrii dla wysokoenergetycznego FPOP.

Joshua S. Sharp ujawnia znaczne udziały finansowe w GenNext Technologies, Inc., małej firmie dążącej do komercjalizacji technologii analizy struktury białek wyższego rzędu, w tym śladu białka rodnika hydroksylowego.

Techniki strukturalne oparte na spektrometrii mas, w tym wymiana wodorowo-deuterowa, sieciowanie chemiczne, znakowanie kowalencyjne oraz natywna spektrometria mas w sprayu i ruchliwość jonów, szybko zyskują na popularności ze względu na ich elastyczność, czułość i zdolność do radzenia sobie ze złożonymi mieszaninami. FPOP ma kilka zalet, które zwiększyły jego popularność w dziedzinie technik strukturalnych opartych na spektrometrii mas. Podobnie jak większość strategii znakowania kowalencyjnego, zapewnia stabilny obraz c...

Szybkie fotochemiczne utlenianie białek (FPOP) to rozwijająca się technika służąca do określania zmian topograficznych białek poprzez ultraszybką modyfikację kowalencyjną powierzchni białka wystawionej na działanie rozpuszczalnika, a następnie detekcję za pomocą LC-MS1. FPOP generuje wysokie stężenie rodników hydroksylowych in situ poprzez błyskawiczną fotolizę nadtlenku wodoru laserem UV. Rodniki hydroksylowe te są bardzo reaktywne i krótkotrwałe, ulegając zużyciu w skali czasu rzędu mikrosekundy w warunkach FPOP2. Rodniki te dyfundują przez wodę i utleniają różne komponenty organiczne w roztworze z szybkościami kinetycznymi zazwyczaj od szybkich (~106 M-1 s-1) po kontrolowane dyfuzyjnie3. Gdy rodnik hydroksylowy napotka powierzchnię białka, utlenia on łańcuchy boczne aminokwasów na tej powierzchni, co skutkuje przesunięciem masy danego aminokwasu (najczęściej w postaci netto dodania jednego atomu tlenu)4. Szybkość reakcji utleniania w przypadku każdego aminokwasu zależy od dwóch czynników: immanentnej reaktywności tego aminokwasu (która zależy od łańcucha bocznego i kontekstu sekwencji)4,5 oraz dostępności tego łańcucha bocznego dla dyfundującego rodnika hydroksylowego, co ściśle koreluje ze średnią powierzchnią dostępną dla rozpuszczalnika6,7. W eksperymentach FPOP zaobserwowano znakowanie wszystkich standardowych aminokwasów z wyjątkiem glicyny przez te wysoce reaktywne rodniki hydroksylowe, choć z bardzo różną wydajnością; w praktyce Ser, Thr, Asn i Ala rzadko wykazują utlenienie w większości próbek, chyba że zastosowano wysokie dawki rodników i zidentyfikowano je za pomocą precyzyjnej i czułej ukierunkowanej fragmentacji ETD8,9. Po utlenianiu próbki są gasiły w celu usunięcia nadtlenku wodoru i utleniaczy wtórnych (nadtlenku, tlenu singletowego, hydroperoksydów peptydylowych itp.). Następnie zgasiłe próbki poddawane są trawieniu proteolitycznemu w celu wytworzenia mieszanin utlenionych peptydów, w których informacje strukturalne zostają zamrożone jako chemiczny „snapshot” w układach produktów utleniania poszczególnych peptydów (Ryc. 1). Chromatografia cieczowa sprzężona ze spektrometrią mas (LC-MS) jest wykorzystywana do pomiaru stopnia utlenienia aminokwasów w danym peptydzie proteolitycznym na podstawie względnych intensywności wersji utlenionej i nieutlenionej tego peptydu. Poprzez porównanie takiego odcisku utleniającego tego samego białka uzyskanego w różnych warunkach konformacyjnych (np. w obecności liganda w porównaniu do jego braku), różnice w stopniu utlenienia danego regionu białka mogą być bezpośrednio skorelowane z różnicami w powierzchni dostępnej dla rozpuszczalnika w tym regionie6,7. Zdolność do dostarczania informacji topograficznych białek sprawia, że FPOP jest atrakcyjną technologią do określania struktury wyższego rzędu białek, w tym w procesie odkrywania i rozwoju leków białkowych10,11.
<img alt="Proces utleniania białka, wyniki LC-MS/MS; struktura białka, miejsca utleniania; analiza widm mas." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61580/61580fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przegląd metody FPOP. Powierzchnia białka ulega modyfikacji kowalencyjnej przez wysoce reaktywne rodniki hydroksylowe. Rodniki hydroksylowe reagują z łańcuchami bocznymi aminokwasów białka z szybkością silnie zależną od dostępności rozpuszczalnika dla danego łańcucha bocznego. Zmiany topograficzne (na przykład wynikające z wiązania liganda, jak pokazano powyżej) chronią aminokwasy w obszarze oddziaływania przed reakcją z rodnikami hydroksylowymi, co prowadzi do spadku intensywności sygnału zmodyfikowanego peptydu w analizie LC-MS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61580/61580fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Różne składniki obecne w roztworze FPOP (np. ligandy, substancje pomocnicze, bufory) wykazują różną aktywność wymiatania w stosunku do rodników hydroksylowych generowanych podczas fotolizy laserowej nadtlenku wodoru3. Podobnie, niewielka zmiana stężenia nadtlenku, fluencji lasera i składu buforu może zmienić efektywną dawkę rodników, co sprawia, że reprodukcja danych FPOP jest trudna pomiędzy próbkami oraz różnymi laboratoriami. Dlatego ważne jest, aby móc porównać dawkę rodników hydroksylowych dostępnych do reakcji z białkiem w każdej próbce, wykorzystując jeden z kilku dostępnych dozymetrów rodników hydroksylowych12,13,14,15,16. Dozymetry rodników hydroksylowych działają poprzez konkurowanie z analitym (oraz ze wszystkimi wymiataczami w roztworze) o pulę rodników hydroksylowych; efektywną dawkę rodników hydroksylowych określa się poprzez pomiar stopnia utlenienia dozymetru. Należy zauważyć, że „efektywna dawka rodników hydroksylowych” jest funkcją zarówno początkowego stężenia generowanych rodników hydroksylowych, jak i okresu półtrwania rodnika. Te dwa parametry są od siebie częściowo zależne, co sprawia, że teoretyczne modelowanie kinetyczne jest nieco złożone (Rysunek 2). Dwie próbki mogą mieć skrajnie różne początkowe okresy półtrwania rodników, a mimo to zachować tę samą efektywną dawkę rodników poprzez zmianę początkowego stężenia tworzonych rodników hydroksylowych; w takim przypadku wygenerują one identyczne „odciski” (footprints)17. Adenina13 i Tris12 są wygodnymi dozymetrami rodników hydroksylowych, ponieważ ich stopień utlenienia można mierzyć w czasie rzeczywistym za pomocą spektroskopii UV, co pozwala badaczom na szybką identyfikację problemów z efektywną dawką rodników hydroksylowych i ich rozwiązywanie. Aby rozwiązać ten problem, istotne jest zastosowanie dozymetru przepływowego zintegrowanego z układem, umieszczonego bezpośrednio za miejscem napromieniowania, który może monitorować w czasie rzeczywistym zmiany sygnału absorbancji adeniny. Pomaga to w przeprowadzaniu eksperymentów FPOP w buforach lub dowolnych innych substancjach pomocniczych o znacznie różniącej się zdolności do wymiatania rodników hydroksylowych17. Taka kompensacja dawki rodników może być wykonywana w czasie rzeczywistym, co pozwala na uzyskanie statystycznie nieodróżnialnych wyników dla tego samego konformeru poprzez dostosowanie efektywnej dawki rodników.
W niniejszym protokole szczegółowo opisano procedury przeprowadzania typowego eksperymentu FPOP z kompensacją dawki rodników przy użyciu adeniny jako wewnętrznego optycznego dozymetru rodnikowego. Metoda ta umożliwia badaczom porównywanie footprintów w różnych warunkach FPOP o odmiennej zdolności do wychwytywania rodników poprzez przeprowadzanie kompensacji w czasie rzeczywistym.
<img alt="Wykres analizy kinetycznej reakcji OH-białko z utlenionym dozymetrem; wyniki czas-stężenie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61580/61580fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Symulacja kinetyczna kompensacji opartej na dozymetrii. Odpowiedź dozymetru adeniny 1 mM jest mierzona w analizowanym roztworze lizozymu 5 µM przy początkowym stężeniu rodników hydroksylowych 1 mM (▪OH t1/2=53 ns) i przyjęta jako docelowa odpowiedź dozymetru (kolor czarny). Po dodaniu 1 mM histydyny jako substancji pomocniczej pełniącej rolę wymiatywacza, odpowiedź dozymetru (kolor niebieski) maleje proporcjonalnie do stopnia utleniania białka (kolor cyjan). Czas połowicznego rozpadu rodnika hydroksylowego również ulega skróceniu (▪OH t1/2=39 ns). Gdy zwiększona zostanie ilość generowanych rodników hydroksylowych, aby uzyskać w próbce z 1 mM wymiatywacza histydyny wydajność utlenionego dozymetru równoważną tej osiągniętej przy 1 mM rodników hydroksylowych w absence wymiatywacza (kolor czerwony), stopień utleniania białka staje się analogicznie identyczny (kolor magenta), podczas gdy czas połowicznego rozpadu rodnika hydroksylowego ulega dalszemu skróceniu (▪OH t1/2=29 ns). Zaadaptowano za zgodą Sharp J.S., Am Pharmaceut Rev 22, 50-55, 2019. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61580/61580fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>Adenina</td><td>Acros Organics</td><td>147440250</td><td>Rozpuszczalny w wodzie do 3,5 mM</td></tr><tr><td>Apertura</td><td>Edmund Optics</td><td>39-905</td><td>1000 &mu; m Średnica apertury, pozłacana miedź</td></tr><tr><td>Uchwyt apertury</td><td>Edmund Optics</td><td>53-287</td><td>25,8 mm Średnica zewnętrzna, precyzyjny montaż otworkowy</td></tr><tr><td>Catalse</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C-40</td><td>Katalaza z wątroby bydlęcej, liofilizowany proszek, &ge; 10 000 jednostek/mg białka</td></tr><tr><td>Laser COMPex Pro</td><td>Koherent</td><td>1113836</td><td>COMPexPRO 102, F-Vversion, laser KrF, No XeCl</td></tr><tr><td>Dithiotheitol (DTT)</td><td>Promega</td><td>V3151</td><td>DTT, klasa molekularna (DL-Ditiothreitol)</td></tr><tr><td>Kolektor frakcji</td><td>GenNext Technologies, Inc.</td><td>Nie dotyczy</td><td>Automatyczny kolektor frakcji</td></tr><tr><td>Stopiona krzemionka capillay</td><td>Molex</td><td>1068150023</td><td>Polymicro Elastyczna rurka kapilarna z topionej krzemionki, średnica wewnętrzna 100 i mikro; m, Średnica zewnętrzna 375 &mikro; m, TSP100375</td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Acros Organics</td><td>119951000</td><td>L(+)-Glutamina, 99%</td></tr><tr><td>Uchwyt do soczewek</td><td>Edmund Optics</td><td>03-668</td><td>53 mm Średnica zewnętrzna, trzyśrubowy regulowany pierścień</td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-100</td><td>, 30% (certyfikowany ACS), Fisher Chemical</td></tr><tr><td>LC-MS/MS system</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFADBMBCX</td><td>Dionex Ultimate 3000 sprzężony ze spektrometrem masowym Orbitap Fusion Tribrid</td></tr><tr><td>Mas spec grade Acetonitryl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-1</td><td>Acetonitryl, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical</td></tr><tr><td>Mass spec grade kwas mrówkowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>A117-50</td><td>Kwas mrówkowy, 99,0+%, Optima&trade; LC / MS Grade, Fisher Chemical</td></tr><tr><td>Mass spec grade water</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6-4</td><td>Water, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical</td></tr><tr><td>MES buffer</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0164</td><td>MES sól hemisodowa</td></tr><tr><td>Amid metioniny</td><td>Bachem</td><td>4000594.0005</td><td>H-met-NH2. Zacisk HCl</td></tr><tr><td>Micro V</td><td>Thor Labs</td><td>VK250</td><td>Micro V-clamp z ostrzami ze stali nierdzewnej</td></tr><tr><td>Zmotoryzowany stolik</td><td>Edmund Optics</td><td>68-638</td><td>50mm Travel Zmotoryzowany system sceniczny z ręcznym sterowaniem</td></tr><tr><td>Kolumna Nano C18</td><td>Thermo Scientific</td><td>164534</td><td>Uznanie PepMap 100 C18 HPLC</td></tr><tr><td>Ławka optyczna</td><td>Edmund Optics</td><td>56-935</td><td>18" x 18" płytka stykowa</td></tr><tr><td>Pionierski system modułów FPOP</td><td>GenNext Technologies, Inc.</td><td>N/A</td><td>Inline FPOP Radical Dozymetry System</td></tr><tr><td>Uchwyt na słupek</td><td>Edmund Optics</td><td>58-979</td><td>3" Długość, &frac14;-20 Gwint, Post Holder</td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP331-500</td><td>Fosforan sodu dwuzasadowy siedmiowodny (kryształy bezbarwne do białych), Fisher BioReagents</td></tr><tr><td>Jednozasadowy fosforan sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP330-500</td><td>Fosforan sodu jednowodny jednowodny (kryształy od bezbarwnego do białego), Fisher BioReagents</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>Hamilton</td><td>81065</td><td>100 &micro; L, Model 1710 RN SYR, Mały wyjmowany NDL, 22s ga, 2 cale, typ punktowy 3</td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>KD Scientific</td><td>788101</td><td>Legato&nbsp; 101 pompa strzykawkowa</td></tr><tr><td>Pułapka C18 kolumna</td><td>Thermo Scientific</td><td>160454</td><td>Thermo Scientific&nbsp; Uznanie PepMap 100 C18 Kolumny HPLC</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252859</td><td>Tris(hydroksymetylo)aminometan</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td>Stopień sekwencjonowania Zmodyfikowana trypsyna</td></tr><tr><td>UV soczewka wypukła</td><td>Edmund Optics</td><td>84-285</td><td>Średnica 30 mm x 120 mm FL Niepowlekana, UV soczewka płasko-wypukła</td></tr></tbody></table>

umożliwienie kompensacji w czasie rzeczywistym w szybkim utlenianiu fotochemicznym białek w celu określenia zmian topografii białek

Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes

Szybkie fotochemiczne utlenianie białek (FPOP) to technika biologii strukturalnej oparta na spektrometrii mas, która bada powierzchnię białek dostępną dla rozpuszczalników. Technika ta opiera się na reakcji łańcuchów bocznych aminokwasów z rodnikami hydroksylowymi swobodnie dyfundującymi w roztworze. FPOP generuje te rodniki in situ poprzez laserową fotolizę nadtlenku wodoru, tworząc wybuch rodników hydroksylowych, który jest wyczerpywany w ciągu mikrosekundy. Kiedy te rodniki hydroksylowe reagują z łańcuchem bocznym aminokwasu dostępnym dla rozpuszczalnika, produkty reakcji wykazują przesunięcie masy, które można zmierzyć i określić ilościowo za pomocą spektrometrii mas. Ponieważ szybkość reakcji aminokwasu zależy częściowo od przeciętnej powierzchni tego aminokwasu dostępnej dla rozpuszczalnika, zmierzone zmiany stopnia utlenienia danego regionu białka mogą być bezpośrednio skorelowane ze zmianami w dostępności rozpuszczalnika w tym regionie między różnymi konformacjami (np. ligandem związanym kontra bezligandowym, monomer a agregat itp.) FPOP został zastosowany w wielu problemach biologii, w tym w interakcjach białko-białko, zmianach konformacyjnych białek i wiązaniu białka-ligand. Ponieważ dostępne stężenie rodników hydroksylowych zmienia się w zależności od wielu warunków eksperymentalnych w eksperymencie FPOP, ważne jest monitorowanie efektywnej dawki rodnika, na którą narażony jest analit białkowy. Monitorowanie to jest skutecznie realizowane dzięki zastosowaniu wbudowanego dozymetru do pomiaru sygnału z reakcji FPOP, z fluencją lasera dostosowaną w czasie rzeczywistym w celu osiągnięcia pożądanej ilości utlenienia. Dzięki tej kompensacji zmiany w topografii białek odzwierciedlające zmiany konformacyjne, powierzchnie wiążące ligand i/lub interfejsy interakcji białko-białko można określić w próbkach heterogenicznych przy użyciu stosunkowo niewielkich ilości próbek.

Porównanie profilu peptydowego łańcucha ciężkiego biosymilara adalimumabu w buforze fosforanowym oraz po ogrzaniu w temperaturze 55 °C przez 1 h wykazuje interesujące wyniki. Do identyfikacji peptydów, które uległy istotnym zmianom w tych dwóch warunkach, zastosowano test t Studenta (p ≤ 0.05). Peptydy 20-38, 99-125, 215-222, 223-252, 260-278, 376-413 oraz 414-420 wykazują istotną ochronę przed rozpuszczalnikiem podczas ogrzewania białka w celu utworzenia agregatów (Rycina 5)<sup class="xref...

Szybkie fotochemiczne utlenianie białek to nowa technika strukturalnej charakterystyki białek. Różne dodatki rozpuszczalnikowe i ligandy mają różne właściwości wymiatania rodników hydroksylowych. Aby porównać strukturę białka w różnych warunkach, wymagana jest kompensacja w czasie rzeczywistym rodników hydroksylowych powstających w reakcji w celu normalizacji warunków reakcji.

Umożliwienie kompensacji w czasie rzeczywistym w szybkim utlenianiu fotochemicznym białek w celu określenia zmian topografii białek

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a mass spectrometry-based structural biology technique that probes the solvent-accessible surface area ...

Metoda ta ułatwia pomiar potwierdzenia białek i interakcji białkowych. Wymagania dotyczące składu buforu, czystości próbki i stężenia białka są elastyczne, co pozwala na rozwiązanie trudnych problemów strukturalnych. Technika ta pozwala na kompresję próbek w wielu różnych systemach buforowych.Korzystając z naszej metody dozymetrycznej, naukowcy mogą monitorować, jak dobrze działają ich reakcje etykietowania w czasie rzeczywistym. Jednym z zastosowań tej technologii jest opracowywanie leków, ponieważ pozwala ona naukowcom testować bardzo różne formuły leków i ich wpływ na strukturę białek. Przygotowanie ławki optycznej FPOP.Najpierw włącz laser i ustaw laser na zewnętrzny spust, stała energia i brak wymiany gazu. Gdy laser się rozgrzeje, ustaw energię lasera na impuls na od 80 do 120 miligramów na impuls i użyj palnika butanowego, aby delikatnie spalić poliimidowe kodowanie kapilary w miejscu, w którym dozymetr inline odczyta sygnał absorpcyjny przy 265 nanometrach po ekspozycji na laser. Użyj niestrzępiącej się chusteczki i metanolu, aby delikatnie wytrzeć zanieczyszczenia z kapilary i umieść oczyszczoną kapilarnę na ścieżce wiązki lasera i w dozymetrze na linii.Naciśnij dźwignię na górze wbudowanego dozymetru, aby otworzyć zawias i wyjąć uchwyty magnetyczne. Umieść kapilarę w rowku maszynowym dozymetru liniowego za pomocą uchwytów magnetycznych, aby utrzymać kapilarę na miejscu i zamknij zawias dozymetru nad kapilarą, naciskając zawias, aż dźwignia zablokuje się na swoim miejscu. Kliknij przycisk uruchamiania lampy błyskowej w oprogramowaniu dozymetrycznym, aby rozpocząć wyzwalanie lasera excimerowego i ustaw ustawioną częstotliwość powtarzania w zakresie od 10 do 20 Hz w oprogramowaniu dozymetrycznym, gdy wyzwalanie lasera przesuwa zmotoryzowany stolik przez jego zakres ruchu, upewniając się, że wiązka pozostaje wyśrodkowana na aperturze i że sylwetka kapilary może być obserwowana przez cały czas.Następnie przepłucz kapilarę wodą z prędkością 20 mikrolitrów na minutę przez co najmniej jedną minutę i kliknij start data plus auto zero w oprogramowaniu dozymetru, aby wyzerować dozymetr do wody przed rozpoczęciem zbierania danych. Aby przeprowadzić eksperyment FPOP, dodaj dwa mikrolitry nadtlenku wodoru do 18 mikrolitrów roztworu FPOP i użyj pipety, aby delikatnie wymieszać roztwór, szybko zbierz roztwór na dno probówki przez odwirowanie i natychmiast użyj gazoszczelnej strzykawki, aby załadować roztwór do pompy strzykawkowej. Kliknij przycisk uruchom pompę i uruchom dane w oprogramowaniu dozymetru, aby uruchomić przepływ w pompie strzykawkowej przy odpowiednim natężeniu przepływu i użyj wbudowanego dozymetru do monitorowania odczytu adeniny w czasie rzeczywistym, aż sygnał absorpcyjny o długości 265 nanometrów ustabilizuje się, zbierając próbkę do pojemnika na odpady.Aby rozpocząć wyzwalanie lasera z zadaną częstotliwością powtarzania energii końcowej, kliknij przycisk uruchamiania lampy błyskowej w oprogramowaniu dozymetru i użyj wbudowanego dozymetru do monitorowania odczytu adeniny w czasie rzeczywistym. Różnica w absorbancji przy 265 nanometrach przy wyłączonym laserze i włączonym laserze będzie równa absorbentom delta przy odczycie 265 nanometrów. Aby upewnić się, że porównywalne rodniki hydroksylowe są dostępne do reakcji z białkami w różnych próbkach.Porównaj absorbenty delta przy odczycie 265 nanometrów uzyskanym za pomocą dozymetru liniowego z pożądanymi absorbentami delta przy odczycie 265 nanometrów uzyskanym z poprzednich eksperymentów lub kontroli. Jeśli odczyt jest na pożądanym poziomie, natychmiast po laserze lub napromieniowaniu należy pobrać próbkę do buforu hartującego. Aby skompensować skuteczną dawkę rodnika, aby wyrównać odczyty absorbancji, zmień stężenie nadtlenku wodoru, zmień energię lasera na impuls lub zmień płaszczyznę ogniskową soczewki skupiającej, aby zwiększyć fluencję lasera.Aby dokonać zmiany w odczycie absorbentów delta o więcej niż 10 mili, należy ponownie przygotować próbkę z mniejszą lub większą ilością nadtlenku wodoru i ponownie uruchomić próbkę, jak pokazano. Aby dokonać niewielkiej zmiany w odczycie absorbancji w czasie rzeczywistym, użyj 50-milimetrowego zmotoryzowanego stolika, aby wyregulować położenie soczewki skupiającej, aby dostosować płaszczyznę ogniskową padającej wiązki. Aby zmierzyć efektywną ilość rodnika hydroksylowego obecnego w próbce po napromieniowaniu laserowym, monitoruj absorbenty delta adeniny o długości 265 nanometrów w czasie rzeczywistym za pomocą wbudowanego detektora kapilarnego UV, wykorzystując zmotoryzowany stolik do regulacji położenia soczewki, aż absorbenty delta przy odczycie 265 nanometrów będą równe pożądanemu odczytowi.Porównanie śladu peptydowego silnego łańcucha biopodobnego adilumumabu w buforze fosforanowym i po ogrzewaniu w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez godzinę pokazuje, że wskazane regiony peptydowe wykazują znaczną ochronę przed rozpuszczalnikami, gdy białko jest podgrzewane do postaci agregatów. Użycie dozymetru inline w czasie rzeczywistym do monitorowania różnicy w absorbentach adeniny przed i po laserze lub promieniowaniu wskazuje, że w buforze MES obserwuje się porównywalną zmianę poziomu absorbentów adeniny w porównaniu z buforem fosforanowym. Podczas gdy średnie utlenianie peptydów jest niższe w obecności buforu MES w porównaniu z buforem fosforanowym.Jednakże, ponieważ fluencja lasera jest zwiększana w celu uzyskania równej odpowiedzi dozymetrii adeniny, średnie wartości utleniania peptydów są prawie takie same po buforze FPOP i MES oraz buforze fosforanowym. Ponieważ na odczyt dozymetrii ma wpływ fluencja lasera, stężenie nadtlenku, a także wymiatacz rodników. Należy zwrócić uwagę, aby odpowiedź dozymetryczna między badaniem próby była zbliżona do siebie.Mutageneza ukierunkowana na witrynę jest często używana do sondowania witryn chronionych w FPOP. To pozwala badaczom określić, czy zmiany są spowodowane przez Alistaira. Technika ta ułatwia porównywanie białek w różnych lub preparatach, umożliwiając naukowcom określenie wpływu różnych dodatków na potwierdzenie białka.

enabling-real-time-compensation-fast-photochemical-oxidations

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film opisuje czasowo-rozdzielczy transfer energii rezonansu Förstera lub test TR-FRET w celu określenia endogennej fosforylacji białek za pomocą fluoroforów donorowych i akceptorowych oznaczonych na przeciwciałach specyficznych dla badanego białka. Technika ta ma na celu pomiar fosforylacji badanych białek w lizatach komórkowych.

Czasowo-rozdzielczy transfer energii rezonansu Forstera do monitorowania fosforylacji białek w komórkach

Ten film demonstruje technikę spektroskopii fluktuacji fluorescencji (FFS) do badania homooligomeryzacji białek. Białka znakowane fluorescencyjnie w próbce są dimeryzowane przy użyciu środka podczas badania oligomeryzacji białek za pomocą FFS. Za pomocą mikroskopu konfokalnego, gdy białka wchodzą i wychodzą z małej objętości obserwacyjnej, przeprowadza się analizę wahań jasności cząsteczek fluorescencyjnych w celu określenia stanu oligomerycznego białek.

Spektroskopia fluktuacji fluorescencji w celu zbadania homooligomeryzacji białek

Kluczowe etapy funkcjonowania białka, w szczególności zmiany konformacyjne szkieletu i reakcje transferu protonów, często odbywają się w skali od mikrosekund do milisekund. Te dynamiczne procesy można badać za pomocą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera ze skanowaniem czasowo-rozdzielczym, w szczególności w przypadku białek, których funkcja jest wyzwalana przez światło.

Transfer protonów i dynamika konformacji białek w białkach światłoczułych za pomocą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera ze skanowaniem czasowym i transformacją Fouriera

Tutaj prezentujemy protokół do uzyskiwania trójkolorowych danych smFRET i ich analizy za pomocą 3D zespołowego modelu Ukrytego Markowa. Dzięki takiemu podejściu naukowcy mogą wyodrębnić informacje kinetyczne ze złożonych systemów białkowych, w tym kooperatywność lub skorelowane interakcje.

Wykorzystanie trójkolorowego jednocząsteczkowego FRET do badania korelacji oddziaływań białek

Ten protokół opisuje bezkalibracyjne podejście do ilościowego określania homo-oligomeryzacji białek in vitro na podstawie spektroskopii fluktuacji fluorescencji przy użyciu komercyjnej mikroskopii skaningowej światła. Wyświetlane są prawidłowe ustawienia akwizycji i metody analizy.

Kwantyfikacja homooligomeryzacji białek in vitro bez kalibracji przy użyciu komercyjnego oprzyrządowania i bezpłatnego oprogramowania do analizy jasności typu open source

Ten protokół opisuje podejście oparte na spektroskopii fluktuacji fluorescencji, mające na celu badanie interakcji między białkami pośredniczącymi w interakcjach komórka-komórka, tj. białkami zlokalizowanymi w połączeniach komórkowych, bezpośrednio w żywych komórkach. Zapewniamy szczegółowe wytyczne dotyczące kalibracji, akwizycji i analizy przyrządów, w tym korekty możliwych źródeł artefaktów.

Test spektroskopii fluktuacji fluorescencji interakcji białko-białko na styku komórka-komórka

Tutaj charakteryzujemy strukturę białek i miejsca interakcji w żywych komórkach za pomocą techniki śladu białkowego, zwanej szybkim fotochemicznym utlenianiem białek w komórce (IC-FPOP).

Charakterystyka białek komórkowych za pomocą szybkiego fotochemicznego utleniania białek w komórce

Ten protokół przedstawia metodę wykorzystania wbudowanej dozymetrii rodnikowej i plazmowego źródła światła do przeprowadzenia błyskawicznego śladu białkowego utleniania. Metoda ta zastępuje niebezpieczny laser UV w celu uproszczenia i poprawy odtwarzalności szybkich badań utleniania fotochemicznego białek.

Bezlaserowe śladowanie białek rodników hydroksylowych w celu przeprowadzenia analizy strukturalnej białek wyższego rzędu

Nowa platforma statyczna służy do charakteryzowania struktury białek i miejsc interakcji w natywnym środowisku komórkowym, wykorzystując technikę śladu białkowego zwaną szybkim fotochemicznym utlenianiem białek w komórce (IC-FPOP).

Inkubator platformowy z ruchomym stolikiem XY: nowa platforma do wdrażania szybkiego utleniania fotochemicznego białek w komórkach

Utlenianie tiolu białka ma znaczące implikacje w normalnych warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych. Opisujemy szczegóły ilościowej metody proteomiki redoks, która wykorzystuje wychwytywanie wspomagane żywicą, znakowanie izobaryczne i spektrometrię mas, umożliwiając specyficzną dla miejsca identyfikację i kwantyfikację odwracalnie utlenionych reszt cysteiny białek.

Wychwytywanie wspomagane żywicą w połączeniu z izobarycznym tandemowym etykietowaniem masy w celu multipleksowanej kwantyfikacji utleniania tiolu białek

Ten artykuł przedstawia metodę analizy czasoprzestrzennej mobilnych, jednocząsteczkowych sond opartych na transferze energii rezonansu Förstera (smFRET) przy użyciu szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej. Nowo opracowany zestaw narzędzi programowych umożliwia wyznaczanie śladów czasowych smFRET poruszających się sond, w tym prawidłowej wydajności FRET i pozycji molekularnych, jako funkcji czasu.

Zautomatyzowana dwuwymiarowa analiza czasoprzestrzenna mobilnych jednocząsteczkowych sond FRET

Poznaj metodę FPOP do analizy struktury białek z kompensacją w czasie rzeczywistym. Technika umożliwia badanie konformacji białek i ich interakcji w różnych buforach, co wspiera rozwój leków.

Umożliwienie kompensacji w czasie rzeczywistym w szybkim utlenianiu fotochemicznym białek w celu określenia zmian topografii białek (Wideo) | JoVE Journal

Umożliwienie kompensacji w czasie rzeczywistym w szybkim utlenianiu fotochemicznym białek w celu określenia zmian topografii białek

Przeglądaj więcej filmów