Umożliwienie kompensacji w czasie rzeczywistym w szybkim utlenianiu fotochemicznym białek w celu określenia zmian topografii białek
1 września 2020
Szybkie fotochemiczne utlenianie białek to nowa technika strukturalnej charakterystyki białek. Różne dodatki rozpuszczalnikowe i ligandy mają różne właściwości wymiatania rodników hydroksylowych. Aby porównać strukturę białka w różnych warunkach, wymagana jest kompensacja w czasie rzeczywistym rodników hydroksylowych powstających w reakcji w celu normalizacji warunków reakcji.
Metoda ta ułatwia pomiar potwierdzenia białek i interakcji białkowych. Wymagania dotyczące składu buforu, czystości próbki i stężenia białka są elastyczne, co pozwala na rozwiązanie trudnych problemów strukturalnych. Technika ta pozwala na kompresję próbek w wielu różnych systemach buforowych.
Korzystając z naszej metody dozymetrycznej, naukowcy mogą monitorować, jak dobrze działają ich reakcje etykietowania w czasie rzeczywistym. Jednym z zastosowań tej technologii jest opracowywanie leków, ponieważ pozwala ona naukowcom testować bardzo różne formuły leków i ich wpływ na strukturę białek. Przygotowanie ławki optycznej FPOP.
Najpierw włącz laser i ustaw laser na zewnętrzny spust, stała energia i brak wymiany gazu. Gdy laser się rozgrzeje, ustaw energię lasera na impuls na od 80 do 120 miligramów na impuls i użyj palnika butanowego, aby delikatnie spalić poliimidowe kodowanie kapilary w miejscu, w którym dozymetr inline odczyta sygnał absorpcyjny przy 265 nanometrach po ekspozycji na laser. Użyj niestrzępiącej się chusteczki i metanolu, aby delikatnie wytrzeć zanieczyszczenia z kapilary i umieść oczyszczoną kapilarnę na ścieżce wiązki lasera i w dozymetrze na linii.
Naciśnij dźwignię na górze wbudowanego dozymetru, aby otworzyć zawias i wyjąć uchwyty magnetyczne. Umieść kapilarę w rowku maszynowym dozymetru liniowego za pomocą uchwytów magnetycznych, aby utrzymać kapilarę na miejscu i zamknij zawias dozymetru nad kapilarą, naciskając zawias, aż dźwignia zablokuje się na swoim miejscu. Kliknij przycisk uruchamiania lampy błyskowej w oprogramowaniu dozymetrycznym, aby rozpocząć wyzwalanie lasera excimerowego i ustaw ustawioną częstotliwość powtarzania w zakresie od 10 do 20 Hz w oprogramowaniu dozymetrycznym, gdy wyzwalanie lasera przesuwa zmotoryzowany stolik przez jego zakres ruchu, upewniając się, że wiązka pozostaje wyśrodkowana na aperturze i że sylwetka kapilary może być obserwowana przez cały czas.
Następnie przepłucz kapilarę wodą z prędkością 20 mikrolitrów na minutę przez co najmniej jedną minutę i kliknij start data plus auto zero w oprogramowaniu dozymetru, aby wyzerować dozymetr do wody przed rozpoczęciem zbierania danych. Aby przeprowadzić eksperyment FPOP, dodaj dwa mikrolitry nadtlenku wodoru do 18 mikrolitrów roztworu FPOP i użyj pipety, aby delikatnie wymieszać roztwór, szybko zbierz roztwór na dno probówki przez odwirowanie i natychmiast użyj gazoszczelnej strzykawki, aby załadować roztwór do pompy strzykawkowej. Kliknij przycisk uruchom pompę i uruchom dane w oprogramowaniu dozymetru, aby uruchomić przepływ w pompie strzykawkowej przy odpowiednim natężeniu przepływu i użyj wbudowanego dozymetru do monitorowania odczytu adeniny w czasie rzeczywistym, aż sygnał absorpcyjny o długości 265 nanometrów ustabilizuje się, zbierając próbkę do pojemnika na odpady.
Aby rozpocząć wyzwalanie lasera z zadaną częstotliwością powtarzania energii końcowej, kliknij przycisk uruchamiania lampy błyskowej w oprogramowaniu dozymetru i użyj wbudowanego dozymetru do monitorowania odczytu adeniny w czasie rzeczywistym. Różnica w absorbancji przy 265 nanometrach przy wyłączonym laserze i włączonym laserze będzie równa absorbentom delta przy odczycie 265 nanometrów. Aby upewnić się, że porównywalne rodniki hydroksylowe są dostępne do reakcji z białkami w różnych próbkach.
Porównaj absorbenty delta przy odczycie 265 nanometrów uzyskanym za pomocą dozymetru liniowego z pożądanymi absorbentami delta przy odczycie 265 nanometrów uzyskanym z poprzednich eksperymentów lub kontroli. Jeśli odczyt jest na pożądanym poziomie, natychmiast po laserze lub napromieniowaniu należy pobrać próbkę do buforu hartującego. Aby skompensować skuteczną dawkę rodnika, aby wyrównać odczyty absorbancji, zmień stężenie nadtlenku wodoru, zmień energię lasera na impuls lub zmień płaszczyznę ogniskową soczewki skupiającej, aby zwiększyć fluencję lasera.
Aby dokonać zmiany w odczycie absorbentów delta o więcej niż 10 mili, należy ponownie przygotować próbkę z mniejszą lub większą ilością nadtlenku wodoru i ponownie uruchomić próbkę, jak pokazano. Aby dokonać niewielkiej zmiany w odczycie absorbancji w czasie rzeczywistym, użyj 50-milimetrowego zmotoryzowanego stolika, aby wyregulować położenie soczewki skupiającej, aby dostosować płaszczyznę ogniskową padającej wiązki. Aby zmierzyć efektywną ilość rodnika hydroksylowego obecnego w próbce po napromieniowaniu laserowym, monitoruj absorbenty delta adeniny o długości 265 nanometrów w czasie rzeczywistym za pomocą wbudowanego detektora kapilarnego UV, wykorzystując zmotoryzowany stolik do regulacji położenia soczewki, aż absorbenty delta przy odczycie 265 nanometrów będą równe pożądanemu odczytowi.
Porównanie śladu peptydowego silnego łańcucha biopodobnego adilumumabu w buforze fosforanowym i po ogrzewaniu w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez godzinę pokazuje, że wskazane regiony peptydowe wykazują znaczną ochronę przed rozpuszczalnikami, gdy białko jest podgrzewane do postaci agregatów. Użycie dozymetru inline w czasie rzeczywistym do monitorowania różnicy w absorbentach adeniny przed i po laserze lub promieniowaniu wskazuje, że w buforze MES obserwuje się porównywalną zmianę poziomu absorbentów adeniny w porównaniu z buforem fosforanowym. Podczas gdy średnie utlenianie peptydów jest niższe w obecności buforu MES w porównaniu z buforem fosforanowym.
Jednakże, ponieważ fluencja lasera jest zwiększana w celu uzyskania równej odpowiedzi dozymetrii adeniny, średnie wartości utleniania peptydów są prawie takie same po buforze FPOP i MES oraz buforze fosforanowym. Ponieważ na odczyt dozymetrii ma wpływ fluencja lasera, stężenie nadtlenku, a także wymiatacz rodników. Należy zwrócić uwagę, aby odpowiedź dozymetryczna między badaniem próby była zbliżona do siebie.
Mutageneza ukierunkowana na witrynę jest często używana do sondowania witryn chronionych w FPOP. To pozwala badaczom określić, czy zmiany są spowodowane przez Alistaira. Technika ta ułatwia porównywanie białek w różnych lub preparatach, umożliwiając naukowcom określenie wpływu różnych dodatków na potwierdzenie białka.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Szybkie fotochemiczne utlenianie białek (FPOP) to nowatorska technika służąca do charakteryzacji struktur białkowych. Metoda ta umożliwia monitorowanie generowania rodników hydroksylowych w czasie rzeczywistym, co pozwala badaczom oceniać oddziaływania i konformacje białek w różnych warunkach.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Charakterystyka białek
- Biologia strukturalna
- Opracowywanie leków
Wstęp
- Metoda FPOP wykorzystuje rodniki hydroksylowe do utleniania białek.
- Różne dodatki rozpuszczalnikowe wpływają na właściwości wymiatania rodników.
- Kompensacja rodników w czasie rzeczywistym jest kluczowa dla uzyskania powtarzalnych wyników.
- Metoda jest dostosowywalna do różnych układów buforowych i warunków próbek.
Cel badania
- W celu ułatwienia pomiaru konformacji białek.
- W celu badania oddziaływań białkowych w czasie rzeczywistym.
- W celu oceny wpływu różnych formulacji leków na strukturę białek.
Zastosowane metody
- Konfiguracja ławy optycznej FPOP.
- Skład elastycznego buforu i wymagania dotyczące czystości próbek.
- Dozymetria w czasie rzeczywistym do monitorowania reakcji znakowania.
- Zastosowanie w badaniach nad formulacją leków.
Główne wyniki
- Pomyślny pomiar oddziaływań białkowych w zmiennych warunkach.
- Wykazana elastyczność systemów buforowych w przypadku trudnych problemów strukturalnych.
- Monitorowanie w czasie rzeczywistym poprawiło niezawodność reakcji znakowania.
- Podkreślono potencjalne zastosowania w opracowywaniu leków.
Wnioski
- FPOP jest potężnym narzędziem do analizy strukturalnej białek.
- Adaptacyjność tej metody sprawia, że jest ona odpowiednia dla różnorodnych zastosowań badawczych.
- Monitorowanie w czasie rzeczywistym zwiększa dokładność wyników eksperymentalnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Szybka fotochemiczna utleniająca białka (FPOP) umożliwia kompensację w czasie rzeczywistym zmienności dawki rodników hydroksylowych, zapewniając spójne odczyty utleniania w heterogenicznych próbkach. Możliwość ta wspiera niezawodną detekcję zmian konformacyjnych, interfejsów wiązania ligandów oraz oddziaływań białko-białko we wczesnych etapach walidacji celu. Dostarczając ilościowe pomiary oparte na dostępności rozpuszczalnika, FPOP zwiększa pewność prognostyczną w przepływach pracy biologii strukturalnej istotnych dla badań i rozwoju w sektorze biofarmaceutycznym.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pomiar zmian w dostępności rozpuszczalnika w celu weryfikacji hipotez terapeutycznych i wyjaśnienia stanów konformacyjnych białek.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celu poprzez korelację wzorców utleniania z przesunięciami strukturalnymi specyficznymi dla agregatów lub ligandów.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów (triage portfolio) poprzez dostarczanie powtarzalnych, ilościowych danych o śladach strukturalnych (footprinting), co zmniejsza ryzyko związane z założeniami mechanistycznymi dotyczącymi oddziaływania z celem.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych badań przesiewowych poprzez dostarczanie spójnych, kontrolowanych dozymetrycznie wyników utleniania.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność testu dzięki monitorowaniu sygnału adeniny w czasie rzeczywistym przy 265 nm, co ogranicza zmienność wynikającą z fluencji lasera lub efektów buforowych.
- Wartość skalowalności: Umożliwia ponowne wykorzystanie platformy w różnych systemach buforowych (np. fosforanowym, MES) poprzez regulację energii lasera lub stężenia nadtlenku w celu utrzymania równoważnej dawki rodnikowej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość translacyjna: Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną, umożliwiając bezpośrednie porównanie topografii białek w różnych formulacjach, buforach lub warunkach stresowych (np. agregacji indukowanej ciepłem).
- Podejmowanie decyzji z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera kryteria go/no-go poprzez kwantyfikację wzorców ochrony w peptydach (np. ciężki łańcuch biosymilara adalimumabu) w zmiennych warunkach środowiskowych.
- Mechanistyczna redukcja ryzyka: Izoluje rzeczywiste zmiany konformacyjne od artefaktów spowodowanych przez absorbenty rodników lub skład buforu poprzez normalizację dawki.
Integracja potoków i przepływów pracy
FPOP wpisuje się w kontinuum procesu badawczego, od weryfikacji hipotez po identyfikację wiodących związków, szczególnie przy ocenie wpływu formulacji leków lub dodatków na strukturę białek w warunkach zbliżonych do fizjologicznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez mapowanie zmian dostępności rozpuszczalnika w odpowiedzi na wiązanie ligandów, oligomeryzację lub stres środowiskowy.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowe do analizy, powtarzalne profile utleniania, gdy dozymetria w czasie rzeczywistym stabilizuje sygnał zmiany absorbancji pomiędzy uruchomieniami.
- Analityka: Zapewnia ilościowe pomiary zmiennych zależnych (zmiana absorbancji przy 265 nm), które umożliwiają porównanie ekspozycji na rodniki hydroksylowe i stopnia utlenienia między próbkami.
- Badania translacyjne: Łączą się z ciągłością przedkliniczną, umożliwiając bezpośrednie porównanie topografii białek w różnych buforach, co naśladuje zmiany w formulacji napotykane podczas opracowywania leków.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Funkcjonuje jako wielokrotnego użytku platforma sterowana dozymetrycznie, a nie jako jednorazowy protokół, możliwa do dostosowania do wielu celów i systemów buforowych poprzez regulację fluencji lasera lub stężenia nadtlenku.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez ograniczenie niejednoznaczności mechanistycznej dzięki bezpośredniej, mierzalnej korelacji między utlenianiem a dostępnością rozpuszczalnika.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację dzięki dozymetrii w czasie rzeczywistym (inline), która kompensuje fluktuacje lasera, rozkład nadtlenków oraz efekty wymiatania przez bufor.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wiarygodne podejmowanie decyzji go/no-go we wczesnej fazie odkrywania, co zmniejsza ryzyko niepowodzeń na późnych etapach z powodu niepotwierdzonego zaangażowania celu.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko, dostarczając spójnych danych strukturalnych dla heterogenicznych zestawów próbek, co ułatwia obiektywne porównywanie formulacji leków lub mutantów.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie fotochemicznych systemów laserowych oraz dozymetrii UV-Vis w celu dokładnej interpretacji sygnału.
- Zależy od zastosowania przepływowego detektora kapilarnego UV oraz integracji z zautomatyzowanym stolikiem do regulacji płaszczyzny ogniskowej i stabilizacji sygnału w czasie rzeczywistym.
- Wymaga standaryzacji punktów odniesienia dozymetrii (delta absorbancji przy 265 nm) pomiędzy zespołami w celu zapewnienia porównywalności wyników między ośrodkami lub eksperymentami.
- Uwzględnia kwestie adaptacyjne przy zmianie systemów buforowych ze względu na zmienną zdolność do wychwytywania rodników (np. MES w porównaniu z buforem fosforanowym), co wymaga dostosowania fluencji lasera lub stężenia nadtlenku.
- Ograniczenie praktyczne: skuteczna kompensacja opiera się na stabilnej detekcji sygnału adeniny; dryft sygnału lub zanieczyszczenie kapilary mogą wymagać ponownej kalibracji lub konserwacji.
Najczęściej zadawane pytania (FAQ) dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:47
Fast Photochemical Oxidations of Proteins (FPOP) Optical Bench Preparation
2:43
FPOP Experiment
3:58
Compensation Performance
5:45
Results: Representative Adalimumab FPOP and Compensated Myoglobin FPOP in MES Buffer
6:51
Conclusion
