Name: Nanodruty krzemowe i stymulacja optyczna do badań wewnątrz- i międzykomórkowego sprzężenia elektrycznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Poznaj metodę stymulacji optycznej z użyciem nanodrutów krzemowych do badań wewnątrzkomórkowego sprzężenia elektrycznego. Technika umożliwia precyzyjną modulację komórek serca i mózgu z wysoką rozdzielczością przestrzenną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez Biuro Badań Naukowych Sił Powietrznych (AFOSR FA9550-18-1-0503).

Aby zapewnić zgodność ze standardami etycznymi, wszystkie procedury na zwierzętach związane z izolacją kardiomiocytów z serc gryzoni zostały najpierw zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu w Chicago (IACUC). Ponadto wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone w pełnej zgodności z wytycznymi IACUC Uniwersytetu w Chicago.
1. Przygotowanie hybryd komórkowo-SiNW
<ol>
	<li>Wyizoluj pierwotne kardiomiocyty (CM) za pomocą komercyjnego zestawu zgodnie z wytycznymi producenta.</li>
	<li>Przygotuj kompletny DMEM do pierwotnej izolacji komórek uzupełniony 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą, 1% penicyliną-streptomycyną i 1% L-glutaminą.</li>
	<li>Aby wyizolować miofibroblasty (MFs) z zawiesiny MFs-CMs, należy wstępnie poszczepić wyizolowane komórki na szalce do hodowli tkankowej (komórki wyizolowane z 2 serc z kroku 1.1. na 100 mm szalka) przez 1 godzinę. Ponieważ CM potrzebują do przylegania powierzchni poddanej fibronektynie lub kolagenowi, tylko MF przyczepią się do powierzchni kultury tkankowej.</li>
	<li>Odessać wzbogaconą zawiesinę komórek CMs. Te CM mogą być używane do eksperymentów ze sprzężeniem heterokomórkowym, jak opisano w sekcji 3. Opłucz MF za pomocą DMEM, aby usunąć wszelkie pozostałe CM z naczynia MFs.</li>
	<li>Dodaj świeżą pożywkę hodowlaną do MF i pozwól im się rozmnażać, aż osiągną ~80% zlewania się (2-4 dni). Zmieniaj podłoże co drugi dzień.</li>
	<li>Gdy komórki są gotowe (80% zlewania się), przygotuj SiNW do poniższego kroku hybrydyzacji (krok 1.7). 
	UWAGA: Można do tego celu użyć wielu rodzajów SiNW. W tym eksperymencie użyto SiNW, które zostały wyhodowane przez chemiczne osadzanie z fazy gazowej (CVD) z konfiguracją złącza p-i-n rdzeń-powłoka, jak opisano wcześniej16. Podczas wzrostu CVD SiNW są hodowane na podłożu z płytki krzemowej i ostatecznie są utrzymywane jako chipy krzemowe pokryte SiNW.</li>
	<li>Wytnij wiór o wymiarach 3 mm x 3 mm z wafla z SiNW wyhodowanymi w CVD za pomocą rysika diamentowego. Używaj ostrych kleszczy do obchodzenia się z waflem i zminimalizuj powierzchnię, której dotykają kleszcze, ponieważ może to spowodować pęknięcie SiNW.</li>
	<li>Wysterylizuj chip, płucząc go 70% etanolem i pozostawiając etanol do wyschnięcia przez 30 minut w świetle UV w okapie z przepływem laminarnym bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Przenieś chip do sterylnej probówki mikrowirówkowej i przepłucz nadmiar etanolu za pomocą kompletnej pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Dodać 1 ml pożywki hodowlanej i sonikować chip w kąpieli sonikacyjnej przez 1-10 min. Podłoże powinno stać się mętne, gdy SiNW są uwalniane do nośnika. 
	UWAGA: Czas i moc sonikacji powinny być zoptymalizowane dla różnych sonikatorów lub różnych komórek, ponieważ krótszy czas trwania i niższe moce dadzą dłuższe SiNW.</li>
	<li>Dodać zawiesinę SiNW do 5 ml pożywki hodowlanej i wysiać ją na 100-milimetrowe naczynie do hodowli tkankowej z MF. Pozwól SiNW na internalizację przez 4 godziny i spłucz nadmiar SiNW 5x pożywką. Pozwól częściowo zinternalizowanym SiNW na zakończenie internalizacji, pozwalając im siedzieć przez kolejne 1 godzinę przed użyciem. 
	UWAGA: Różne typy komórek mogą wymagać różnych stężeń SiNW i/lub czasów internalizacji.</li>
	<li>Przygotować roztwór do powlekania kolagenu, rozcieńczając podstawowy roztwór kolagenu (3 mg/ml) sterylnym 20 mM kwasem octowym w stosunku 1:50. Dodać 0,5 ml roztworu powlekającego do naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm i pozostawić na 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Usunąć roztwór i spłukać naczynie sterylnym PBS.</li>
	<li>Zebrać hybrydy komórkowo-SiNW, traktując je 3 ml trypsyny przez 2 minuty w temperaturze 37 °C. Dodać 10 ml pożywki hodowlanej i energicznie przepłukać hybrydy pipetowaniem. Delikatnie odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut, aby uniknąć uszkodzenia komórek przez zinternalizowane SiNW. Usuń nadmiar pożywki, zawieś komórki za pomocą 1 ml pożywki i umieść je na naczyniu ze szkła nasączonego kolagenem. 
	UWAGA: Hybrydy mogą być wysiewane samodzielnie, w celu zbadania sprzężenia wewnątrzkomórkowego lub międzykomórkowego lub z CM, w celu zbadania sprzężenia heterokomórkowego in vitro.</li>
	<li>Przeprowadzić końcową weryfikację internalizacji SiNW poprzez znakowanie cytozolu (kalceina-AM, 4 μM) i błony komórkowej (marker błonowy, 2 μM) przez 30 minut w temperaturze 37 °C i obrazowanie komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej. Ponieważ SiNW są wysoce odblaskowe, do ich wizualizacji można użyć światła odbitego zamiast fluorescencji.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek do badań wewnątrz- i międzykomórkowych
<ol>
	<li>Przygotować roztwór do powlekania kolagenem jak w ppkt 1.12</li>
	<li>Do wewnątrzkomórkowej stymulacji elektrycznej hybrydy hodowlane o niskiej gęstości wysiewu. Użyj standardowego hemocytometru, aby policzyć komórki z sekcji 1.11. i wysiewać 50 000 komórek na szklanym naczyniu o dnie o średnicy 35 mm w pożywkach hodowlanych. Do badań międzykomórkowych należy stosować komórki o większej gęstości (500 000 komórek na miskę). W celu sprzężenia międzykomórkowego między CM i MF należy wspólnie hodować hybrydy ze świeżo wyizolowanymi CM. </li>
	<li>Pozwól komórkom przyczepić się przez noc przed wykonaniem eksperymentów ze stymulacją optyczną. W przypadku badań międzykomórkowych należy odczekać 48 godzin w temperaturze 37 °C, aby komórki uzyskały ekspresję połączeń szczelinowych międzykomórkowych przed przeprowadzeniem eksperymentu.</li>
	<li>Przygotować wrażliwy na wapń roztwór podstawowy barwnika (może być przechowywany w temperaturze -20 °C), dodając 50 μl DMSO do 50 μg Fluo-4 AM. Przygotować roztwór barwiący, rozcieńczając 1 μl barwnika w 1 ml DMEM.</li>
	<li>Odessać pożywkę hodowlaną z komórek i dodać 1 ml roztworu barwiącego. Pozostawić barwnik do internalizacji w komórkach przez 20-30 minut w temperaturze 37 °C. Odessać barwnik i dwukrotnie spłukać sterylnym PBS.</li>
	<li>Na koniec dodać 1 ml wstępnie podgrzanego podłoża DMEM wolnego od czerwieni fenolowej i pozostawić wewnątrzkomórkowy Fluo-4 do deestryfikacji przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przenieś komórki do mikroskopu w celu obrazowania i stymulacji.</li>
</ol>
3. Obrazowanie optyczne i stymulacja
<ol>
	<li>Podgrzej wstępnie nawilżony mikroinkubator do temperatury 37 °C i mieszaniny powietrza bąbelkowego i CO2 (95:5).</li>
	<li>Użyj mikroskopu ze skolimowaną linią laserową sprzężoną ze ścieżką światła do obrazowania wapnia i stymulacji optycznej. 
	UWAGA: Skaningowy mikroskop konfokalny jest najprostszą opcją ze względu na jego możliwości stymulacji punktowej. Jednak procedurę tę można wykonać przy użyciu dowolnego standardowego mikroskopu fluorescencyjnego, sprzęgając skolimowaną wiązkę laserową z nieskończoną przestrzenią ścieżki światła za pomocą rozdzielacza wiązki. Każdy obiektyw mikroskopowy jest zaprojektowany w taki sposób, że skolimowany laser, przez który przechodzi, będzie skupiony na plamce lasera o ograniczonej dyfrakcji w płaszczyźnie ogniskowej. Długość fali lasera powinna być zbliżona do światła wzbudzenia, więc zostanie odbita przez zwierciadło dichroiczne i przepuszczona przez filtr wzbudzenia.</li>
	<li>Wizualizuj SiNW i określ miejsce stymulacji za pomocą mikroskopii jasnego pola, światła przechodzącego lub światła odbitego. Następnie należy przekonfigurować ścieżkę światła do trybu fluorescencji, zachowując punkt stymulacji w predefiniowanym miejscu SiNW.</li>
	<li>Zweryfikuj optymalną moc stymulacji i długość impulsu dla każdego rozmiaru SiNW i typu komórki, aby zminimalizować uszkodzenia fototermiczne stymulowanych komórek. W przypadku typowego protokołu stymulacji należy wykonać 2-10-sekundowy podstawowy zapis wewnątrzkomórkowej aktywności wapnia. Następnie należy zastosować pojedynczy impuls laserowy o mocy 1-10 mW i czasie trwania 1-10 ms (co odpowiada 30-300 kW/mm2) w celu stymulacji SiNW i zarejestrować powstałą falę wapniową przez kolejne 2-10 s. 
	UWAGA: Niezbędna jest optymalizacja mocy optycznej i długości impulsu dla każdego rozmiaru SiNW i ogniw. Jest to konieczne, aby zminimalizować uszkodzenia fototermiczne stymulowanych komórek.</li>
	<li>W razie potrzeby prześlij nagrane filmy ze stymulacji optycznej do dalszej analizy.</li>
</ol>
4. Przetwarzanie wideo
<ol>
	<li>Wizualizacja zmian we fluorescencji Fluo-4 za pomocą makro "dF over F" class17 dostępnego dla ImageJ18, który oblicza zmianę liczby fluorescencji dla każdego piksela i normalizuje się przez średnią wartość spoczynkowej linii bazowej. Przekonwertuj dane wyjściowe (format zmiennoprzecinkowy) na 8 bitów w celu dalszego przetwarzania.</li>
	<li>Kontynuuj przetwarzanie filmu dF/F za pomocą selektywnego filtra mediany "Usuń wartości odstające" dostępnego w ImageJ. Zdefiniuj parametry, aby usunąć piksele, których wartość jest większa niż 10 powyżej wartości mediany w promieniu 2 pikseli, i zastąp tę wartość piksela medianą.</li>
	<li>Oblicz przepływ optyczny w każdej klatce za pomocą algorytmu Lucasa-Kanade'a, zaimplementowanego w zestawie narzędzi Matlab Computer Vision. Wynikiem tej funkcji było pole wektorowe zawierające składowe x i y przepływu optycznego w każdym punkcie każdego obrazu (kod jest dostępny w pliku uzupełniającym 1). 
	UWAGA: Średni przepływ optyczny w komórce, <ν>, odpowiada rozwojowi strumienia wapnia w komórce. Różnica przepływu optycznego, Δ<ν> zapewnia punkt czasowy, w którym aktywowano sygnalizację wapniową, identyfikując miejsce, w którym sygnał został zmaksymalizowany. Dodatkowo wielkość Δ<ν> w maksimum jest skorelowana z szybkością, z jaką front falowania wapnia przechodzi przez komórkę.</li>
	<li>Oblicz prędkość międzykomórkową przekaźnictwa wapnia zgodnie z następującym równaniem. 
	vCa2+ = rij / ( tmax,j − tmax,i ), 
	gdzie tmax,j i tmax,i są czasami aktywacji odpowiednio dla komórek j i i, a rij jest odległością między centroidami komórek.</li>
</ol>

<ol><li>Blackiston, D. J., McLaughlin, K. A., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioelectric+controls+of+cell+proliferation%3A+ion+channels%2C+membrane+voltage+and+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">Bioelectric controls of cell proliferation: ion channels, membrane voltage and the cell cycle.</a> Cell cycle. 8 (21), 3527-3536 (2009).</li>
<li>Dantzer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroimmune+interactions%3A+from+the+brain+to+the+immune+system+and+vice+versa%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Neuroimmune interactions: from the brain to the immune system and vice versa.</a> Physiological Reviews. 98 (1), 477-504 (2017).</li>
<li>Wohleb, E. S., Franklin, T., Iwata, M., Duman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+neuroimmune+systems+in+the+neurobiology+of+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Integrating neuroimmune systems in the neurobiology of depression.</a> Nature Reviews Neuroscience. 17 (8), 497(2016).</li>
<li>Veiga-Fernandes, H., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroimmune+regulation+during+intestinal+development+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neuroimmune regulation during intestinal development and homeostasis.</a> Nature Immunology. 18 (2), 116(2017).</li>
<li>Sundelacruz, S., Levin, M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+membrane+potential+in+the+regulation+of+cell+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Role of membrane potential in the regulation of cell proliferation and differentiation.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 5 (3), 231-246 (2009).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+Physiology%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annual Reviews Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).</li>
<li>Jayant, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+intracellular+voltage+recordings+from+dendritic+spines+using+quantum-dot-coated+nanopipettes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Targeted intracellular voltage recordings from dendritic spines using quantum-dot-coated nanopipettes.</a> Nature Nanotechnology. 12 (4), 335-342 (2017).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annual Review of Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).</li>
<li>Xie, C., Lin, Z., Hanson, L., Cui, Y., Cui, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+recording+of+action+potentials+by+nanopillar+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Intracellular recording of action potentials by nanopillar electroporation.</a> Nature Nanotechnology. 7 (3), 185-190 (2012).</li>
<li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertical+nanowire+electrode+arrays+as+a+scalable+platform+for+intracellular+interfacing+to+neuronal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Vertical nanowire electrode arrays as a scalable platform for intracellular interfacing to neuronal circuits.</a> Nature Nanotechnology. 7 (3), 180-184 (2012).</li>
<li>Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+application+of+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The development and application of optogenetics.</a> Annual Review of Neuroscience. 34, 389-412 (2011).</li>
<li>Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+all-optical+manipulation+and+recording+of+neural+circuit+activity+with+cellular+resolution+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo.</a> Nature Methods. 12 (2), 140-146 (2015).</li>
<li>Rotenberg, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicon+Nanowires+for+Intracellular+Optical+Interrogation+with+Sub-Cellular+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Silicon Nanowires for Intracellular Optical Interrogation with Sub-Cellular Resolution.</a> Nano Letters. 20 (2), 1226-1232 (2020).</li>
<li>Rotenberg, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Living+myofibroblast-silicon+composites+for+probing+electrical+coupling+in+cardiac+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Living myofibroblast-silicon composites for probing electrical coupling in cardiac systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22531-22539 (2019).</li>
<li>Zimmerman, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+uptake+and+dynamics+of+unlabeled+freestanding+silicon+nanowires%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Cellular uptake and dynamics of unlabeled freestanding silicon nanowires.</a> Science Advances. 2 (12), 1601039(2016).</li>
<li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nongenetic+optical+neuromodulation+with+silicon-based+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Nongenetic optical neuromodulation with silicon-based materials.</a> Nature protocols. 14 (5), 1339(2019).</li>
<li>Ackman, J. dFoFmovie-CatFullAutoSave.java. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://gist.github.com/ackman678/11155761">https://gist.github.com/ackman678/11155761</a> (2020).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 5229(2017).</li>
<li>Lee, J. -H., Zhang, A., You, S. S., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+internalization+of+cell+penetrating+peptide-modified+nanowires+into+primary+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Spontaneous internalization of cell penetrating peptide-modified nanowires into primary neurons.</a> Nano Letters. 16 (2), 1509-1513 (2016).</li>
<li>Lozano, O., Torres-Quintanilla, A., García-Rivas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomedicine+for+the+cardiac+myocyte%3A+where+are+we%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Nanomedicine for the cardiac myocyte: where are we.</a> Journal of Controlled Release. 271, 149-165 (2018).</li>
<li>Lozano, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoencapsulated+quercetin+improves+cardioprotection+during+hypoxia-reoxygenation+injury+through+preservation+of+mitochondrial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Oxidative+Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">Nanoencapsulated quercetin improves cardioprotection during hypoxia-reoxygenation injury through preservation of mitochondrial function.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 7683091(2019).</li>
<li>Gaudesius, G., Miragoli, M., Thomas, S. P., Rohr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+cardiac+electrical+activity+over+extended+distances+by+fibroblasts+of+cardiac+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Researach%22%5BJournal%5D)">Coupling of cardiac electrical activity over extended distances by fibroblasts of cardiac origin.</a> Circulation Researach. 93 (5), 421-428 (2003).</li>
<li>Klesen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+fibroblasts+%3A+Active+players+in+%28atrial%29+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Herzschrittmacherther+Elektrophysiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac fibroblasts : Active players in (atrial) electrophysiology.</a> Herzschrittmacherther Elektrophysiology. 29 (1), 62-69 (2018).</li>
<li>He, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-distance+intercellular+connectivity+between+cardiomyocytes+and+cardiofibroblasts+mediated+by+membrane+nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Long-distance intercellular connectivity between cardiomyocytes and cardiofibroblasts mediated by membrane nanotubes.</a> Cardiovascular Research. 92 (1), 39-47 (2011).</li>
<li>Carvalho-de-Souza, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosensitivity+of+neurons+enabled+by+cell-targeted+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Photosensitivity of neurons enabled by cell-targeted gold nanoparticles.</a> Neuron. 86 (1), 207-217 (2015).</li>
<li>Wang, S. -H., Lee, C. -W., Chiou, A., Wei, P. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-dependent+endocytosis+of+gold+nanoparticles+studied+by+three-dimensional+mapping+of+plasmonic+scattering+images%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Size-dependent endocytosis of gold nanoparticles studied by three-dimensional mapping of plasmonic scattering images.</a> Journal of Nanobiotechnology. 8 (1), 33(2010).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Pokazaliśmy tutaj prosty sposób na wykonanie wewnątrzkomórkowej stymulacji elektrycznej komórek. W tej demonstracji użyliśmy MF, które zostały wstępnie zhybrydyzowane z SiNW, a następnie współhodowane z CM. Ogólnie rzecz biorąc, większość proliferujących komórek ma tendencję do internalizacji SiNW, co pozwala na zastosowanie tej metodologii z wieloma innymi typami komórek. Co więcej, chociaż wykazaliśmy wewnątrzkomórkową stymulację komórek, te same zasady można zastosować do zewnątrzkomórkowej stymulacji komórek. Można t...

Wszystkie organizmy biologiczne używają elektryczności w postaci jonów do regulowania zachowania komórek. Błony komórkowe zawierają różne rodzaje specyficznych kanałów jonowych umożliwiających pasywny i aktywny transport jonów. Jony te regulują funkcje komórek pobudliwych, takie jak aktywność neuronów oraz kurczliwość mięśni szkieletowych i sercowych. Jednak bioelektryczność odgrywa również ważną rolę w komórkach niepobudliwych, regulując wiele funkcji komórkowych, takich jak proliferacja komórek1, neuroimmunity2,3,4, oraz różnicowanie komórek macierzystych5.
W ostatnich dziesięcioleciach dziedzina bioelektryczności cieszy się coraz większym zainteresowaniem, co przyczyniło się do rozwoju licznych technologii dla interfejsów bioelektronicznych. Pipety z mikroelektrodami są złotym standardem wewnątrzkomórkowego zapisu i stymulacji6. W tej metodologii szklana pipeta jest ciągnięta w określonych warunkach, aby utworzyć ostrą krawędź o wielkości porów kilku mikronów. Pipeta ta jest wypełniona buforem, a pipeta umożliwia bezpośredni kontakt buforu z objętością wewnątrzkomórkową. Skutkuje to interfejsem bioelektrycznym, który zapewnia niezwykle wysoki stosunek sygnału do szumu, precyzyjną kontrolę nad aktywnością elektryczną komórek i niezwykle wysoką rozdzielczość czasową. Chociaż metodologia ta jest niezwykle potężnym narzędziem, które zostało niedawno zmniejszone do konfiguracji nanopipet7, wiąże się z kilkoma istotnymi ograniczeniami technicznymi. Efekt rozcieńczenia cytozolu8, jak również drgania mechaniczne, ograniczają jego użyteczność do krótkotrwałych przesłuchań i wymagają drogiego specjalistycznego sprzętu i wysokiego poziomu umiejętności technicznych. Co więcej, jego masywność ogranicza liczbę komórek, które mogą być rejestrowane lub stymulowane jednocześnie, a ze względu na jego inwazyjność nie można go rekonfigurować w trakcie eksperymentu. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowano układy mikroelektrod, ale rozmiar elektrod ogranicza rozdzielczość przestrzenną, a także dostęp wewnątrzkomórkowy. Matryce nanoelektrod umożliwiają wewnątrzkomórkowy zapis i stymulację, ale wymagają elektroporacji ściernej, aby uzyskać dostęp do cytozolu9,10. Ponadto wszystkie te metodologie są związane z substratem, a zatem ograniczają się do hodowli komórkowych in vitro lub do zewnętrznych komórek powierzchownych, bez dostępu do komórek znajdujących się wewnątrz trójwymiarowej (3D) tkanki.
Optogenetics11 jest powszechnie używany do rozwiązywania tych ograniczeń 3D i in vivo. Jednak metody optogenetyczne opierają się na zaburzeniach kanałów jonowych błony plazmatycznej aktywowanych światłem, które są rozprowadzane na błonie plazmatycznej, ograniczając rozdzielczość przestrzenną 3D12 i możliwości wewnątrzkomórkowe.
Niedawno pokazaliśmy, że nanodruty krzemowe (SiNW) mogą być używane do przeprowadzania wewnątrzkomórkowych badań bioelektrycznych z submikronową rozdzielczością przestrzenną z różnymi niepobudliwymi komórkami, a mianowicie miofibroblastami serca i oligodendrocytami13. Co więcej, użyliśmy tych SiNW do przeprowadzenia specyficznego dla komórek ex-vivo przesłuchania w tkance serca 3D, aby zbadać, w jaki sposób komórki serca łączą się elektrycznie in vivo14. Dużą zaletą tej metodologii jest jej prostota; Nie wymaga żadnych modyfikacji genetycznych ani nieporęcznego oprzyrządowania. Wiele komórek spontanicznie internalizuje światłoczułe SiNW bez potrzeby sonikacji czy elektroporacji15. Ponadto spontanicznie uciekną z enkapsulacji endosomalnej i utworzą bezproblemową integrację z cytozolem i organellami wewnątrzkomórkowymi13,15. Te kompozyty komórka-SiNW, zwane hybrydami komórka-krzem, posiadają dynamiczną, miękką i wszechstronną naturę oryginalnego ogniwa, a także możliwości optoelektryczne SiNW. Po hybrydyzacji hybryda komórka-SiNW może być zbierana przy użyciu standardowych technik hodowli tkankowych i wykorzystywana do różnych zastosowań, takich jak wewnątrzkomórkowa stymulacja bioelektryczna; badanie międzykomórkowego sprzężenia bioelektrycznego in vitro; oraz do przesłuchań in vivo specyficznych dla komórek. Ponieważ skuteczna stymulacja wymaga kolokalizacji o wysokich gęstościach mocy optycznej i SiNW, można osiągnąć wysoką rozdzielczość przestrzenną zarówno w 2D, jak i 3D. W tym protokole szczegółowo opisujemy metodologię, a także sposób, w jaki można analizować wyniki. Nacisk kładziony jest na badania wewnątrz- i międzykomórkowe in vitro, ale implementacja tej metodologii in vivo może być bezpośrednio wykorzystana w wielu innych scenariuszach biologicznych.

<table><tbody><tr><td>35 mm Naczynia ze szklanym dnem</td><td>Cellvis</td><td>D35-10-0-N</td><td></td></tr><tr><td>3i Marianas Spinning Disk Confocal</td><td>3i</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcein-AM</td><td>Invitrogen</td><td>C1430</td><td></td></tr><tr><td>CellMask Pomarańczowa Barwnik z membraną plazmatyczną</td><td>Invitrogen</td><td>C10045</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen I, ogon szczura</td><td>Gibco</td><td>A1048301</td><td></td></tr><tr><td>Deluxe Diamentowe pisak do rysowania</td><td>Ted Pella</td><td>54468</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, wysoka glukoza, pirogronian, bez glutaminy</td><td>Gibco</td><td>10313039</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, bezwodny</td><td>Invitrogen</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Standardowe naczynia do hodowli tkankowych Falcon</td><td></td><td>08-772E</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca, certyfikowana, inaktywowana termicznie,</td> <td>Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin Białko ludzkie, osocze</td><td>Gibco</td><td>33016015</td><td></td></tr><tr><td>Zaawansowana myjka ultradźwiękowa z serii Fisherbrand 112xx</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB11201</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4, AM, przepuszczalna komórka</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM Media</td><td>Gibco</td><td>A1896701</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>OKO pełna komora kontroli środowiska (stała temperatura, wilgotność i CO2)</td><td>OKO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Zestaw do izolacji kardiomiocytów pierwotnych</td><td>Thermo Scientific</td><td>88281</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowa</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

nanodruty krzemowe i stymulacja optyczna do badań wewnątrz- i międzykomórkowego sprzężenia elektrycznego

Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling

Miofibroblasty mogą spontanicznie internalizować nanodruty krzemowe (SiNW), co czyni je atrakcyjnym celem dla zastosowań bioelektronicznych. Te hybrydy komórkowo-krzemowe oferują bezołowiowe możliwości modulacji optycznej przy minimalnych zakłóceniach normalnego zachowania komórek. Zdolności optyczne uzyskuje się dzięki właściwościom fototermicznym i fotoelektrycznym SiNW. Hybrydy te można zbierać przy użyciu standardowych technik hodowli tkankowych, a następnie stosować do różnych scenariuszy biologicznych. Pokazujemy tutaj, w jaki sposób te hybrydy można wykorzystać do badania sprzężenia elektrycznego komórek serca i porównania, w jaki sposób miofibroblasty łączą się ze sobą lub z kardiomiocytami. Proces ten można przeprowadzić bez specjalnego sprzętu poza mikroskopem fluorescencyjnym ze sprzężoną linią laserową. Pokazano również użycie niestandardowej procedury MATLAB, która umożliwia ilościowe określenie propagacji wapnia w różnych komórkach w kulturze i między nimi. Wykazano, że miofibroblasty mają wolniejszą odpowiedź elektryczną niż kardiomiocyty. Co więcej, propagacja międzykomórkowa miofibroblastów wykazuje nieco wolniejsze, choć porównywalne prędkości do ich prędkości wewnątrzkomórkowych, co sugeruje pasywną propagację przez połączenia szczelinowe lub nanorurki. Technika ta jest wysoce elastyczna i może być łatwo stosowana w innych dziedzinach komórkowych, zarówno w badaniach in vitro, jak i in vivo lub ex vivo.

Zdolność tej metodologii do zapewnienia bezpośredniego dostępu do cytozolu wewnątrzkomórkowego zależy od spontanicznej internalizacji SiNW do wnętrza komórek. Chociaż SiNW ulegają spontanicznej internalizacji w wielu typach komórek15, niektóre komórki, takie jak kardiomiocyty i neurony, wymagają odpowiedniego przygotowania SiNW, aby umożliwić ich internalizację19. W niniejszym protokole opisujemy proces internalizacji p-i-n SiNW o średnicy 200-300 nm i długości ~1-3 µm do k...

Ten protokół opisuje użycie nanoprzewodów krzemowych do wewnątrzkomórkowej optycznej biomodulacji komórki w prosty i łatwy do wykonania sposób. Technika ta jest wysoce elastyczna i może być stosowana zarówno do zastosowań in vitro, jak i in vivo.

Nanodruty krzemowe i stymulacja optyczna do badań wewnątrz- i międzykomórkowego sprzężenia elektrycznego

Myofibroblasts can spontaneously internalize silicon nanowires (SiNWs), making them an attractive target for bioelectronic applications. These ...

Technika ta umożliwia wewnątrzkomórkowe badanie bioelektryczne z niezwykle wysoką rozdzielczością przestrzenną i swoistością komórkową przy użyciu tylko standardowej mikroskopii optycznej. Metoda ta ułatwia stymulację i badanie elektryczne komórek i określonych miejsc w komórkach i może być wykonywana zarówno in vitro, jak i w preparatach tkankowych 3D ex vivo. Technika ta umożliwia bioelektroniczne badanie wielu obszarów komórkowych, takich jak komórki serca lub mózgu, a także komunikację elektryczną między wszystkimi naszymi niepobudliwymi komórkami.Aby wyizolować miofibroblasty z zawiesiny kardiomiocytów miofibroblastów, należy wstępnie poszczepić izolowane komórki na 100-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowej przez jedną godzinę, ponieważ kardiomiocyty potrzebują do przylegania powierzchni z włóknami i poddanej obróbce. Pod koniec inkubacji zebrać wzbogacony kardiomiocyt zawierający supernatant do dalszej kohodowli. Przepłucz miofibroblasty DMEM, aby wyeliminować wszelkie pozostałe kardiomiocyty i nakarm komórki świeżą pożywką hodowlaną przed dodatkowymi dwoma do czterech dni inkubacji.Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, użyj rysika diamentowego, aby wyciąć wiór o wymiarach trzy na trzy milimetry z płytki za pomocą nanodrutów krzemowych wyhodowanych w wyniku chemicznego osadzania z fazy gazowej. I użyj ostrych kleszczy, aby spłukać frytki w 70% etanolu. Po wypłukaniu suszyć frytki na powietrzu przez 30 minut w świetle ultrafioletowym w okapie z przepływem laminarnym zapewniającym bezpieczeństwo biologiczne, przed przeniesieniem wiórów do sterylnej probówki z mikrowirówką.Użyj pełnego płukania pożywki do hodowli komórkowych, aby usunąć pozostały etanol, przed sonikacją wiórów w jednym mililitrze świeżej pożywki hodowlanej w kąpieli sonizacyjnej przez jedną do 10 minut. Supernatant powinien zmętnieć, gdy nanodruty zostaną uwolnione. Wymieszaj zawiesinę nanodrutów krzemowych z pięcioma mililitrami świeżej pożywki hodowlanej i umieść roztwór nanodrutu na szalce z miofibroblastami.Po czterech godzinach w inkubatorze do hodowli komórkowych przepłucz naczynie pięć razy świeżą pożywką hodowlaną, aby usunąć wszelkie niezinternalizowane nanodruty i kontynuuj inkubację komórek przez kolejną godzinę, aby umożliwić całkowite włączenie częściowo zinternalizowanych nanoprzewodów. Następnie dodaj 500 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu powłoki kolagenowej do naczynia o szklanym dnie o grubości 35 milimetrów. Po godzinnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza opłucz naczynie sterylnym PBS i zbierz hybrydy miofibroblastów z nanodrutu krzemowego z trzema mililitrami trypsyny przez dwie minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Gdy komórki się odłączą, zatrzymać reakcję za pomocą 10 mililitrów pożywki hodowlanej, energicznie spłukać pipetowaniem i nie odwirowywać powyżej 200 G, aby uniknąć uszkodzenia komórek. Następnie ponownie zawiesić granulki komórek hybrydowych w jednym mililitrze świeżej pożywki i zasiać komórki na szklanym naczyniu pokrytym kolagenem. Aby zweryfikować internalizację nanodrutu, oznacz komórki fluorescencyjnym cytozolem i barwnikami błonowymi, zgodnie ze standardowymi protokołami, a następnie użyj mikroskopu konfokalnego do zobrazowania komórek.Ponieważ nanodruty krzemowe są wysoce odblaskowe, do ich wizualizacji można użyć światła odbitego zamiast fluorescencji. Aby skonfigurować hybrydową hodowlę kardiomiocytów z nanodrutów krzemowych miofibroblastów, należy zasiać odpowiednią liczbę każdego typu komórek na szklanym naczyniu pokrytym kolagenem. I hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 48 godzin, aby umożliwić komórkom tworzenie międzykomórkowych połączeń szczelinowych.W dniu eksperymentu zastąpić supernatant hodowli jednym mililitrem pożywki hodowlanej uzupełnionej świeżo przygotowanym barwnikiem wrażliwym na wapń, na 20 do 30 minut inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji umyć płytkę dwa razy sterylnym PBS, a następnie potraktować komórki jednym mililitrem wstępnie podgrzanego DMEM wolnego od czerwieni fenolowej. Następnie pozwól wewnątrzkomórkowemu barwnikowi wapnia przejść deestryfikację przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, przed uzyskaniem obrazów wyjściowych.Przed obrazowaniem optycznym i stymulacją podgrzej wilgotny mikroinkubator pod mikroskopem ze skolimowaną linią laserową sprzężoną ze ścieżką światła, do obrazowania wapnia i stymulacji optycznej do 37 stopni Celsjusza i 5% mieszanki dwutlenku węgla z epoki bąbelkowej. Gdy mikroskop jest gotowy, umieść kokulturę hybrydowych kardiomiocytów miofibroblastów w mikroinkubatorze i zwizualizuj nanodruty za pomocą mikroskopii jasnego pola, aby zlokalizować odpowiednie miejsce stymulacji. Po zidentyfikowaniu miejsca należy ponownie skonfigurować ścieżkę światła do trybu fluorescencji, utrzymując punkt stymulacji w predefiniowanym miejscu nanodrutu i zwalidować optymalną moc stymulacji i długość impulsu dla każdego rozmiaru nanodrutu krzemowego i typu komórki.Uzyskaj od dwóch do dziesięciu sekund zapisu wyjściowej wewnątrzkomórkowej aktywności wapnia, a następnie stymuluj nanodrut pojedynczym impulsem laserowym o mocy od jednego do 10 melowatów i czasie trwania od jednego do 10 milisekund, rejestrując powstałą falę wapnia przez kolejne dwie do 10 sekund. Na zakończenie eksperymentu przenieś nagrane filmy ze stymulacji optycznej do odpowiedniego programu w celu dodatkowej analizy. Korzystając ze standardowej optyki z kontrastem fazowym, komórki konfluencji można łatwo zobaczyć za pomocą mikroskopii świetlnej.Nanodruty krzemowe są jednak ledwo widoczne, co uniemożliwia określenie ich położenia tą metodą. Nadmierne nakładanie obrazów jasnego i ciemnego pola pozwala jednak na wizualizację układu jądrowego Perry'ego odbijających światło nanodrutów krzemowych. Mikroskopia konfokalna może być wykorzystana do wizualizacji cytozolu i błon plazmatycznych barwionych markerami fluorescencyjnymi, dzięki czemu wewnątrzkomórkowa lokalizacja nanodrutów krzemowych jest bardziej widoczna.Za pomocą standardowej mikroskopii można uzyskać obraz jasnego pola, aby zidentyfikować lokalizację nanodrutu krzemowego, który ma być stymulowany. Następnie można uzyskać krótki film wyjściowy przedstawiający spontanicznie bijące kardiomiocyty i spoczynkowe miofibroblasty. Po stymulacji można zarejestrować rozmnażanie wapnia w kokulturze.Czas, w którym różne komórki ulegają wzbudzeniu, można określić na podstawie punktu, w którym zmiana średniego przepływu optycznego osiąga maksimum. Przepływ optyczny można następnie obliczyć, aby pomóc w identyfikacji czasu aktywacji w każdym regionie komórki. Prędkości wewnątrzkomórkowe można określić dla każdej komórki za pomocą wykresów Khaimah, przy czym nachylenie linii reprezentuje odwrotność prędkości propagacji wewnątrzkomórkowej.Na przykład w tym miejscu można zaobserwować podsumowanie różnych prędkości między- i wewnątrzkomórkowych mierzonych dla interakcji komórkowych w obrębie jednej kokultury. Metoda ta może być wykorzystana do badań in vivo poprzez wstrzyknięcie hybryd krzemu komórkowego bezpośrednio do tkanki i użycie preparatów 3D ex vivo do zbadania firmy elektrycznej in vivo.

silicon-nanowires-optical-stimulation-for-investigations-intra

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Niniejszy protokół ilustruje, w jaki sposób barwniki napięciowo-wrażliwe umożliwiają optyczną rejestrację aktywności elektrycznej z nienaruszonych sieci neuronalnych, takich jak sploty jelitowego układu nerwowego świnki morskiej, z regulowaną rozdzielczością obejmującą zakres od pojedynczych komórek po obwody wieloganglionarne.

Optyczny zapis aktywności elektrycznej w sieciach jelitowych świnki morskiej z użyciem barwników napięcioczułych

Neurony powstałe w wieku dorosłym wykazujące ekspresję ChR2 mogą być manipulowane w preparatach elektrofizjologicznych w plastrach tkankowych w celu zbadania ich wkładu w funkcjonowanie węchowych obwodów neuronalnych.

Wykorzystanie przystępnych cenowo mat LED do fotostymulacji neuronów

Opisujemy metody wielkoskalowej rejestracji wielu pojedynczych jednostek oraz lokalnych potencjałów polowych u gryzoni podczas zachowań, z wykorzystaniem sond krzemowych. Procesy wykonania napędu, mocowania sondy do napędu oraz implantacji sondy zostały przedstawione w wystarczających szczegółach, aby umożliwić łatwą replikację.

Wielkoskalowa rejestracja neuronów za pomocą ruchomych sond krzemowych u gryzoni podczas zachowań

Ten film demonstruje użycie mikroprzepływowego chipa pokrytego macierzą zewnątrzkomórkową do różnicowania nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych lub NPC za pomocą stymulacji elektrycznej. Po wysianiu i przyleganiu do pokrytego obszaru NPC rosną, a zastosowanie prądu stałego wyzwala ich różnicowanie w neurony, astrocyty i oligodendrocyty.

Różnicowanie nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych wywołane stymulacją elektryczną

Stymulacja nerwów w podczerwieni została zaproponowana jako alternatywa dla stymulacji elektrycznej w wielu typach nerwów, w tym związanych z układem słuchowym. Protokół ten opisuje metodę patch clamp do badania mechanizmu stymulacji nerwów w podczerwieni w kulturze pierwotnych neuronów słuchowych.

Klamra krosowa całej komórki do badania mechanizmów stymulacji neuronalnej w podczerwieni

Ten protokół opisuje, jak wykorzystać przejściowe ogrzewanie związane z optyczną absorpcją nanoprętów złota do stymulowania różnicowania i wewnątrzkomórkowej aktywności wapnia w komórkach neuronalnych. Wyniki te potencjalnie otwierają nowe zastosowania w protezach neuronalnych i podstawowych badaniach w neurobiologii.

Stymulacja optyczna komórek neuronalnych wspomagana złotem nanoprętami

Opisano metodę stymulacji aktywności elektrycznej kultur komórkowych in vitro za pomocą światła widzialnego, opartą na użyciu organicznych polimerów półprzewodnikowych.

Optyczna kontrola aktywności elektrycznej żywych komórek za pomocą sprzężonych polimerów

Kultury neuronów są dobrym modelem do badania nowych technik stymulacji mózgu poprzez ich wpływ na pojedyncze neurony lub populację neuronów. Przedstawiono różne metody stymulacji wzorcowych kultur neuronalnych za pomocą pola elektrycznego wytwarzanego bezpośrednio przez elektrody kąpielowe lub indukowanego przez zmienne w czasie pole magnetyczne.

Zewnętrzne wzbudzenie neuronów za pomocą pól elektrycznych i magnetycznych w kulturach jedno- i dwuwymiarowych

Tutaj prezentujemy metodę wytwarzania systemu optycznego ze światłowodami do dostarczania światła i matrycą elektrod do rejestracji neuronowej. Eksperymenty in vivo na transgenicznych myszach z ekspresją rodopsyny-2 pokazują wykonalność systemu do jednoczesnej stymulacji optogenetycznej i zapisu elektrofizjologicznego.

Matryca optrodowa do jednoczesnej modulacji optogenetycznej i elektrycznego zapisu neuronowego

Użycie światła do kontrolowania komórek i tkanek serca umożliwia bezkontaktową stymulację, zachowując w ten sposób naturalny stan i funkcję komórek, co czyni ją wartościowym podejściem zarówno do badań podstawowych, jak i zastosowań terapeutycznych.

Mikrofizjologiczny system serca do badania propagacjiCa2+ za pomocą niegenetycznej stymulacji optycznej

Protokół ten przedstawia zaawansowane metody wytwarzania materiałów i ex vivo badania serca szczurów do optycznego i elektrycznego dwukierunkowego biointerfejsu, umożliwiając precyzyjną stymulację serca, rejestrację i modelowanie zawału na potrzeby badań bioelektronicznych.

Dwukierunkowe interfejsy elektryczne i optoelektroniczne w zdrowych i niedokrwionych sercach szczurów ex vivo

Poznaj metodę stymulacji optycznej z użyciem nanodrutów krzemowych do badań wewnątrzkomórkowego sprzężenia elektrycznego. Technika umożliwia precyzyjną modulację komórek serca i mózgu z wysoką rozdzielczością przestrzenną.

Nanodruty krzemowe i stymulacja optyczna do badań wewnątrz- i międzykomórkowego sprzężenia elektrycznego

Przeglądaj więcej filmów