Name: Przygotowanie, podawanie i ocena specyficznego tkankowo wychwytu komórkowego in vivo liposomów znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-30T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Poznaj metodę syntezy liposomów znakowanych fluorescencyjnie i oceny ich wychwytu komórkowego in vivo za pomocą cytometrii przepływowej. Technika ta umożliwia precyzyjną analizę lokalizacji nanonośników w tkankach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Michaelowi Soldze i reszcie personelu Flow Cytometry Core za zapewnienie szkoleń i usług w zakresie cytometrii przepływowej. Autorzy pragną również podziękować Shiva Sai Krishna Dasa, Dustinowi K. Bauknightowi, Melissie A. Marshall, Jamesowi C. Garmeyowi, Chantel McSkimming, Aditi Upadhye i Prasadowi Srikakulapu za ich pomoc w przygotowaniu liposomów (SSKD, DKB), pobieraniu tkanek (MAM, JCG) oraz barwieniu cytometrią przepływową i pozyskiwaniu próbek (AU, PS, CM). Prace te były wspierane przez granty AstraZeneca, R01HL 136098, R01HL 141123 i R01HL 148109, AHA 16PRE30770007 oraz T32 HL007284.

<ol><li>Allen, T. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+drug+delivery+systems%3A+from+concept+to+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Liposomal drug delivery systems: from concept to clinical applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (1), 36-48 (2013).</li>
<li>Sercombe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+Challenges+of+Liposome+Assisted+Drug+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 286(2015).</li>
<li>Osinski, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+liposomal+delivery+of+PPAR%CE%B1%2F%CE%B3+dual+agonist+tesaglitazar+in+a+model+of+obesity+enriches+macrophage+targeting+and+limits+liver+and+kidney+drug+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">In vivo liposomal delivery of PPARα/γ dual agonist tesaglitazar in a model of obesity enriches macrophage targeting and limits liver and kidney drug effects.</a> Theranostics. 10 (2), (2020).</li>
<li>Bauknight, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+thorough+tissue+and+cellular+level+characterization+of+targeted+drugs+in+the+evaluation+of+pharmacodynamic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Importance of thorough tissue and cellular level characterization of targeted drugs in the evaluation of pharmacodynamic effects.</a> PLoS ONE. 14 (11), (2019).</li>
<li>Rosales, C., Uribe-Querol, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+A+Fundamental+Process+in+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: A Fundamental Process in Immunity.</a> BioMed Research International. , (2017).</li>
<li>He, H., Ghosh, S., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomedicines+for+dysfunctional+macrophage-associated+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Nanomedicines for dysfunctional macrophage-associated diseases.</a> Journal of Controlled Release. 247, 106-126 (2017).</li>
<li>Song, G., Petschauer, J. S., Madden, A. J., Zamboni, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+and+the+mononuclear+phagocyte+system%3A+pharmacokinetics+and+applications+for+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Rheumatology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles and the mononuclear phagocyte system: pharmacokinetics and applications for inflammatory diseases.</a> Current Rheumatology Reviews. 10 (1), 22-34 (2014).</li>
<li>Litzinger, D. C., Buiting, A. M. J., van Rooijen, N., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+liposome+size+on+the+circulation+time+and+intraorgan+distribution+of+amphipathic+poly%28ethylene+glycol%29-containing+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22BBA+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Effect of liposome size on the circulation time and intraorgan distribution of amphipathic poly(ethylene glycol)-containing liposomes.</a> BBA - Biomembranes. , (1994).</li>
<li>Su, C., Liu, Y., He, Y., Gu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+methods+for+investigating+in+vivo+fate+of+nanoliposomes%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Analytical methods for investigating in vivo fate of nanoliposomes: A review.</a> Journal of Pharmaceutical Analysis. , (2018).</li>
<li>Vasquez, K. O., Casavant, C., Peterson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+whole+body+biodistribution+of+fluorescent-labeled+agents+by+non-invasive+tomographic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative whole body biodistribution of fluorescent-labeled agents by non-invasive tomographic imaging.</a> PLoS One. 6 (6), 20594(2011).</li>
<li>Larmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fluorescence-mediated+tomography+for+quantification+of+urokinase+receptor-dependent+leukocyte+trafficking+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">In vivo fluorescence-mediated tomography for quantification of urokinase receptor-dependent leukocyte trafficking in inflammation.</a> Anesthesiology. 113 (3), 610-618 (2010).</li>
<li>Feng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clodronate+liposomes+improve+metabolic+profile+and+reduce+visceral+adipose+macrophage+content+in+diet-induced+obese+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Clodronate liposomes improve metabolic profile and reduce visceral adipose macrophage content in diet-induced obese mice.</a> PLoS One. 6 (9), 1-11 (2011).</li>
<li>Bu, L., Gao, M., Qu, S., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraperitoneal+injection+of+clodronate+liposomes+eliminates+visceral+adipose+macrophages+and+blocks+high-fat+diet-induced+weight+gain+and+development+of+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22The+AAPS+Journal%22%5BJournal%5D)">Intraperitoneal injection of clodronate liposomes eliminates visceral adipose macrophages and blocks high-fat diet-induced weight gain and development of insulin resistance.</a> The AAPS Journal. 15 (4), 1001-1011 (2013).</li>
<li>Toita, R., Kawano, T., Murata, M., Kang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-obesity+and+anti-inflammatory+effects+of+macrophage-targeted+interleukin-10-conjugated+liposomes+in+obese+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Anti-obesity and anti-inflammatory effects of macrophage-targeted interleukin-10-conjugated liposomes in obese mice.</a> Biomaterials. 110, 81-88 (2016).</li>
<li>Sakurai, Y., Kajimoto, K., Hatakeyama, H., Harashima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+an+active+and+passive+targeting+to+tumor+and+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Advances in an active and passive targeting to tumor and adipose tissues.</a> Expert Opin Drug Deliv. 12 (1), 41-52 (2015).</li>
<li>Nakhlband, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combating+atherosclerosis+with+targeted+nanomedicines%3A+Recent+advances+and+future+prospective%5BTitle%5D)+AND+%22BioImpacts%22%5BJournal%5D)">Combating atherosclerosis with targeted nanomedicines: Recent advances and future prospective.</a> BioImpacts. , (2018).</li>
<li>Sibuyi, N. R. S., Meyer, M., Onani, M. O., Skepu, A., Madiehe, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+targeted+nanotherapeutic+approach+for+obesity+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Vascular targeted nanotherapeutic approach for obesity treatment.</a> International Journal of Nanomedicine. , (2018).</li>
<li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+carbocyanine+dyes+allow+living+neurons+of+identified+origin+to+be+studied+in+long-term+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures.</a> Journal of Cell Biology. , (1986).</li>
<li>Warren, J. S. A., Feustel, P. J., Lamar, J. M. Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWarren%2C+JSA+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22">Journal of visualized experiments : JoVE</a>. , (2019).</li>
<li>Dasa, S. S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plectin-targeted+liposomes+enhance+the+therapeutic+efficacy+of+a+PARP+inhibitor+in+the+treatment+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Plectin-targeted liposomes enhance the therapeutic efficacy of a PARP inhibitor in the treatment of ovarian cancer.</a> Theranostics. , (2018).</li>
<li>Morrison, B. E., Park, S. J., Mooney, J. M., Mehrad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine-mediated+recruitment+of+NK+cells+is+a+critical+host+defense+mechanism+in+invasive+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Chemokine-mediated recruitment of NK cells is a critical host defense mechanism in invasive aspergillosis.</a> Journal of Clinical Investigation. , (2003).</li>
<li>Finlon, J. M., Burchill, M. A., Jirón Tamburini, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digestion+of+the+murine+liver+for+a+flow+cytometric+analysis+of+lymphatic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Digestion of the murine liver for a flow cytometric analysis of lymphatic endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , e58621(2019).</li>
<li>Upadhye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversification+and+CXCR4-Dependent+Establishment+of+the+Bone+Marrow+B-1a+Cell+Pool+Governs+Atheroprotective+IgM+Production+Linked+to+Human+Coronary+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Diversification and CXCR4-Dependent Establishment of the Bone Marrow B-1a Cell Pool Governs Atheroprotective IgM Production Linked to Human Coronary Atherosclerosis.</a> Circulation research. , (2019).</li>
<li>O'Brien, C. A., Harris, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICOS-deficient+and+ICOS+YF+mutant+mice+fail+to+control+Toxoplasma+gondii+infection+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">ICOS-deficient and ICOS YF mutant mice fail to control Toxoplasma gondii infection of the brain.</a> PLoS ONE. , (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tutaj opisujemy trzyczęściowy protokół (i) przygotowania liposomów, które są znakowane fluorescencyjnym barwnikiem lipidowym i ładowane związkiem przeciwcukrzycowym, tesaglitazarem, (ii) podawania liposomów myszy poprzez wstrzyknięcie retroorbitalne oraz (iii) zbierania, przetwarzania i barwienia tkanek w celu wykrycia wychwytu liposomów na poziomie komórkowym za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół ten obejmuje przygotowanie liposomów o wielkości około 150 μm i ocenę wychwytu w tkance tłuszczowej, krwi i śledzionie. Preparat liposomowy jest skalowalny, wykonywany głównie w temperaturze pokojowej i wykorzystuje odparowanie w odwrotnej fazie, aby zmaksymalizować ładowanie leku i usuwanie rozpuszczalników organicznych. Korzystając z tego protokołu, można osiągnąć stężenie tesaglitazaru do 2 mg/ml w oczyszczonej próbce liposomowej. Przygotowane liposomy mogą być przechowywane w buforze HEPES w temperaturze 4 °C przez ponad rok. Z naszego doświadczenia wynika, że wykazały one minimalną zmienność średniej wielkości cząstek. Poniżej 10% utraty zawartości leku wykazano spektrofotometrycznie, po ultrafiltracji oddzielenia liposomów od zewnętrznego leku za pomocą filtra odśrodkowego o sile 10 kDa.
Podczas przygotowywania liposomów należy wziąć pod uwagę kilka krytycznych kroków i czynników. Po pierwsze, kolejność kroków protokołu jest ważna i należy jej przestrzegać. Po drugie, pH roztworu użytego do napełnienia tesaglitazaru musi być utrzymywane na poziomie 7,4 w celu maksymalizacji rozpuszczalności i skutecznego obciążenia. Po trzecie, prawidłowy montaż sprzętu i filtrów zapewnia, że wyjście z każdego kroku ma odpowiednią wielkość i czystość. Na przykład, jeśli filtry 100 i 200 nm nie zostaną prawidłowo zmontowane, może dojść do powstania bardziej niejednorodnej i niewłaściwie dobranej partii liposomów. Po czwarte, konieczne jest całkowite usunięcie octanu Ca przed załadowaniem leku, aby zmaksymalizować transfer tesaglitazaru do liposomów. Aby przetestować całkowite usunięcie octanu Ca, użyj sedymentacji z dużą prędkością w celu usunięcia liposomów, a następnie zmierz poziom octanu Ca w roztworze nieliposomalnym. Po piąte, ważne jest, aby zważyć i zapisać masę wszystkich materiałów dodanych do preparatu liposomowego na każdym etapie. Gwarantuje to, że można obliczyć odpowiednie stężenia i utrzymać potrzebne proporcje materiałów. Wreszcie, jeśli technika nie jest prawidłowo wykonana, może wystąpić niepożądany poziom niejednorodności. Ważne jest, aby dokładnie sprawdzić ten parametr za pomocą DLS i innych podejść, takich jak mikroskopia elektronowa. Aby poprawić jednorodność, rozważ dostosowanie wybranego rozmiaru filtra lub ułożenie dwóch filtrów w stos.
Ponadto bardzo ważne jest, aby kontrole i panel przeciwciał do cytometrii przepływowej zostały zaplanowane i zoptymalizowane przed pełnym przeprowadzeniem tego protokołu (Tabela 1, Tabela 3). Przeciwciała powinny być testowane, aby upewnić się, że do barwienia stosowane są odpowiednie stężenia i że nakładanie się fluoroforów jest minimalne. Wzbudzenie i emisja barwnika użytego podczas przygotowania liposomów musi być również uwzględniona w planowaniu panelu. W naszych wynikach wykorzystaliśmy DiD, który ma podobne wzbudzenie i emisję do fluoroforów, takich jak Allophycocyjanin (APC) i AlexaFluor 647. W związku z tym nie wybraliśmy przeciwciał sprzężonych z tymi fluoroforami w naszym panelu przeciwciał. Ponadto w protokole tym nie uwzględniono kontroli izotypów. Dzieje się tak, ponieważ przeciwciała wybrane do tego protokołu są dobrze zwalidowanymi, dostępnymi na rynku przeciwciałami. Jeśli jednak jest zainteresowany użyciem przeciwciała, które nie zostało wcześniej zoptymalizowane, należy rozważyć przetestowanie przeciwciała przeciwko kontroli izotypu na tkankach będących przedmiotem zainteresowania przed przeprowadzeniem pełnego eksperymentu.
Chociaż protokół ten pokazuje, jak ekstrahować i przetwarzać krew, śledzionę, tkankę tłuszczową pachwinową i tkankę tłuszczową najądrza z myszy po leczeniu, to ogólne podejście można zastosować do innych tkanek. W zależności od tkanki będącej przedmiotem zainteresowania, może być konieczna zmiana protokołów przetwarzania i trawienia, jak jest to opublikowane dla następujących tkanek: płuca21, wątroba22, jama otrzewnej3, szpik kostny 3,23, mózg24.
Ważnym ograniczeniem tej metody, które należy wziąć pod uwagę, jest to, że absorpcję można ocenić tylko w jednym punkcie czasowym na zwierzę. W związku z tym korzystne może być połączenie tego protokołu z innymi nieinwazyjnymi technikami obrazowania lub odpowiednie zaplanowanie w celu zapewnienia wystarczających zasobów do przeprowadzenia oceny. Czas wychwytu komórkowego i przewrót komórkowy są ważnymi czynnikami, które należy wziąć pod uwagę: liposomy będą krążyć w całym organizmie w ciągu pierwszych 24 godzin i w zależności od długości życia komórek, które pobierają liposomy lub jak reagują na wychwyt, może dojść do śmierci komórki lub dalszej fagocytozy. Nasze poprzednie badanie wykazało zmiany w charakterystyce populacji DiD+ w różnych punktach czasowych3. Z tego powodu ważna jest ocena wychwytu we wcześniejszych punktach czasowych lub punktach czasowych najbardziej istotnych dla biologii mechanizmu będącego przedmiotem zainteresowania. Ponadto, podczas gdy za pomocą tego protokołu można przeprowadzić kwantyfikację wychwytu komórek w całej tkance, cytometria przepływowa nie może ujawnić lokalizacji tkanki. Połączenie tego podejścia z metodami histologicznymi może pomóc w rozwiązaniu tego problemu.
Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten uzupełnia istniejącą metodologię, taką jak histologia i obrazowanie fluorescencyjne całego ciała. Dzięki ciągłemu postępowi w narzędziach i metodach cytometrii przepływowej możliwe stanie się opracowywanie większych paneli do coraz bardziej specyficznych populacji komórek. Sugerujemy, aby protokół ten był stosowany jako dodatek do wyżej wymienionych metod, ponieważ poprawi to ocenę wychwytu komórkowego, a także zapewni możliwość walidacji wyników obserwowanych za pomocą cytometrii przepływowej. Na przykład, jeśli okaże się, że większość cząstek w tkance tłuszczowej została wchłonięta przez makrofagi za pomocą cytometrii przepływowej. Immunofluorescencję dodatkowej porcji tej samej tkanki tłuszczowej można zapisać, utrwalić, przeciąć i wybarwić pod kątem markerów makrofagów, aby sprawdzić, czy typ komórki rzeczywiście pobiera liposomy. Podejście to powinno zwiększyć rygor przeprowadzanych testów biodystrybucji nanocząstek: walidacji celowania specyficznego dla komórki, ilościowego określania wychwytu komórkowego, identyfikacji wychwytu poza celem i, miejmy nadzieję, dostarczenia informacji do generowania mechanistycznych hipotez dla obserwowanych wyników terapeutycznych. Protokół ten może być również dostosowany do przyszłych badań z wykorzystaniem różnych liposomów, badania wychwytu w innych tkankach i testowania nowych związków w warunkach otyłości i dysmetabolizmu lub jakiejkolwiek innej choroby, w której dostarczanie nanocząstek jest wykonalną opcją terapeutyczną.

Wraz ze wzrostem zainteresowania rozwojem terapii wykorzystujących nanocząsteczki dostarczania leków, metody przygotowania i oceny rozkładu i absorpcji cząstek muszą nadal się rozwijać, rozszerzać i być dostępne dla społeczności naukowej1,2. Protokół ten został opracowany w celu oceny dokładnych typów komórek, które przyjmowały liposomy in vivo po leczeniu liposomami znakowanymi DiD załadowanymi tesaglitazarem, agonistą receptora aktywowanego przez proliferatory peroksysomów (PPAR)-α/γ sup class<="xref">3,4. W tych badaniach byliśmy w stanie ocenić, na które typy komórek bezpośrednio wpłynęło leczenie liposomalnym tesaglitazarem, skuteczność celowania w ugrupowania oraz wygenerować hipotezy wyjaśniające zaobserwowane przez nas wyniki leczenia. Co więcej, ustalone funkcje biologiczne w różnych typach komórek sugerują, że komórki fagocytarne, takie jak makrofagi, komórki dendrytyczne i komórki Kupffera specyficzne dla wątroby, zajmują większość liposomów5,6,7. Korzystając z tego protokołu, wykazaliśmy, że nieklasyczne fagocyty mogą również przyjmować liposomy3,4.
Ten protokół przedstawia zoptymalizowaną metodę solubilizacji tesaglitazaru, przygotowania liposomów przez odparowanie w odwrotnej fazie i użycia octanu wapnia jako atraktantu do zdalnego ładowania leków. Przedstawione metody są dostępne dla wielu laboratoriów i brakuje w nich trudnych do zdobycia materiałów i etapów wymagających wysokich temperatur. Protokół wytwarza liposomy o rozmiarach, które są optymalne dla zwiększonego krążenia in vivo8. Ponadto, jak podsumowali Su i wsp., do tej pory metody oceny dystrybucji liposomów in vivo i wychwytu tkankowego zostały dogłębnie zbadane i przetestowane9. Pozytonowa tomografia emisyjna (PET), obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI) i fluorescencyjna tomografia molekularna (FMT) są stosowane do ilościowego określania biodystrybucji i wychwytu specyficznego dla tkanki9,10,11. Chociaż metody te zostały zoptymalizowane w celu maksymalizacji wykrywania in vivo, nadal brakuje im możliwości ilościowego określenia wychwytu liposomów in vivo w rozdzielczości komórkowej. Przedstawiony tutaj protokół ma na celu zaspokojenie tej potrzeby poprzez zastosowanie cytometrii przepływowej. Wreszcie, w przypadku tego protokołu, wychwyt komórkowy został zawężony do kilku tkanek, w tym tkanki tłuszczowej. Istnieje coraz więcej literatury badającej potencjał wykorzystania nanocząsteczek do dostarczania terapii w warunkach otyłości, dysmetabolizmu i stanów zapalnych12,13,14,15,16,17. W związku z tym uznaliśmy, że ważne jest, aby podzielić się protokołem ze skutecznymi metodami przetwarzania i analizy tkanki tłuszczowej – jednej z tkanek, która odgrywa ważną rolę w tych patologiach.

<table><tbody><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 10 ml</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>igła o rozmiarze 25, sterylna do wstrzykiwań zaoczodołowych</td><td>Igła BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>27 G, sterylna do wstrzykiwań zaoczodołowych</td><td>BD</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>Anty-mysz B220 BV421</td><td>Biolegend</td><td>103251</td><td>Klon RA3-6B2</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie CD115 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-1152-82</td><td>Klon AFS98</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie CD11b PerCP Cy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>550993</td><td>Klon M1/70</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie CD11c APC ef780</td><td>eBioscience</td><td>47-0114-82</td><td>Klon N418</td></tr><tr><td>Anty-mysz CD19 PE CF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562291</td><td>Klon 1D3</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie CD3 FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>553061</td><td>Klon 145-2C11</td></tr><tr><td>Anty-mysz CD31 BV605</td><td>Biolegend</td><td>102427</td><td>Klon 390</td></tr><tr><td>Anty-mysz CD45 PerCP</td><td>BD Biosciences</td><td>557235</td><td>Klon 30-F11</td></tr><tr><td>Anty-mysz F4/80 PE Cy7</td><td>Biolegend</td><td>123114</td><td>Klon BM8</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Gemini Bio-products</td><td>700-107P</td><td></td></tr><tr><td>Odsalanie kolumny</td> <td>wirowejThermoFisher</td><td>89889, 89890</td><td>Kolumna wirowa Zeba</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Dynamiczne rozpraszanie światła,</td><td>system wymiarowania cząstek</td> Nicomp 370, Inc <td></td><td></td></tr><tr><td>FIX & Zestaw do przepuszczalności komórek PERM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>GAS004</td><td></td></tr><tr><td>Gąbki z gazy</td><td>Dermacea</td><td>441211</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>3393-1MU</td><td></td></tr><tr><td>Wytłaczarka do liposomów</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z373400</td><td>LiposoFast</td></tr><tr><td>Live/Dead Aqua</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>Nanosight</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td>NS300</td><td></td></tr><tr><td>Smar okulistyczny</td><td>Optixcare</td><td></td><td>20g/70 oz Sterylny</td></tr><tr><td>paraformaldehyd, 16% w/v aq. soln., bez metanolu</td><td>Alfa Aesar</td><td>433689L</td><td></td></tr><tr><td>Fiolka polietylenowa do mielenia</td><td>Wheaton</td><td>986701</td><td></td></tr><tr><td>Parownik obrotowy</td><td>Buchi</td><td>Re111</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Misonix</td><td>XL2020</td><td></td></tr><tr><td>T/Pump Pompa do terapii cieplnej i podkładka</td><td>Gaymer Industries</td><td>TP-500</td><td></td></tr><tr><td>Tesaglitazar</td><td>Tocris</td><td>3965</td><td></td></tr><tr><td>Membrany poliwęglanowe trawione Thomas</td><td>Scientific</td><td>1141Z**</td><td>Whatman, Nuclepore Membrany hydrofilowe z poliwęglanu</td></tr><tr><td>System ZetaSizer/DLS-ELS</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie, podawanie i ocena specyficznego tkankowo wychwytu komórkowego in vivo liposomów znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

Rośnie zainteresowanie wykorzystaniem liposomów do dostarczania związków in vivo, szczególnie w przypadku ukierunkowanych metod leczenia. W zależności od preparatu liposomowego, liposomy mogą być preferencyjnie pobierane przez różne typy komórek w organizmie. Może to mieć wpływ na skuteczność cząsteczki terapeutycznej, ponieważ postęp różnych chorób jest specyficzny dla typu tkanki i komórki. W tym protokole przedstawiamy jedną metodę syntezy i fluorescencyjnego znakowania liposomów przy użyciu DSPC, cholesterolu i PEG-2000 DSPE oraz barwnika lipidowego DiD jako znacznika fluorescencyjnego. Protokół ten przedstawia również podejście do dostarczania liposomów in vivo i oceny specyficznego dla komórek wychwytu liposomów za pomocą cytometrii przepływowej. Podejście to można wykorzystać do określenia typów komórek, które pobierają liposomy oraz ilościowego określenia rozkładu i proporcji wychwytu liposomów w różnych typach komórek i tkankach. Chociaż nie wspomniano o tym w tym protokole, dodatkowe testy, takie jak immunofluorescencja i obrazowanie fluorescencji pojedynczych komórek na cytometrze, wzmocnią wszelkie dokonane odkrycia lub wnioski, ponieważ umożliwiają ocenę barwienia wewnątrzkomórkowego. Protokoły mogą również wymagać dostosowania w zależności od tkanki (tkanek) będących przedmiotem zainteresowania.

Produkcja liposomów
Wyniki opublikowane w niniejszym opracowaniu są zbliżone do wyników uzyskanych w naszych poprzednich pracach3,4,20. Stosując przedstawiony tutaj protokół, spodziewamy się otrzymania liposomów o wielkości około 150‒160 nm. Analiza DLS wykazuje średnicę liposomów wynoszącą średnio 163,2 nm oraz potencjał zeta na poziomie -19,2 mV (Rycyna 1A). Obrazowanie metodą kriomikroskopii elektronowej (cryo-EM) ukazuje koliste liposomy (Rycina 1B), a wykres DLS wskazuje na stosunkowo małe odchylenie standardowe od średniej średnicy (Rycina 1C).
Pozytywne wiązanie liposomów wymaga kontroli traktowanej PBS
Wcześniejsze badania przeprowadzone przez naszą grupę z wykorzystaniem tego protokołu badały, które subpopulacje komórek w SVF tkanki tłuszczowej, śledzionie i krwi wiążą się z liposomami po jednym tygodniu podawania in vivo3,4. W przypadku myszy traktowanej PBS, komórki jamy otrzewnej i śledziony barwiono tym samym panelem przeciwciał, który zastosowano w próbkach od myszy traktowanych liposomami. Tkanki pobrano po jednym tygodniu zabiegów (Rysunek 2A). Próbki od myszy traktowanej PBS służyły jako kontrola DiD FMO, na podstawie której utworzono bramki dla sygnału DiD-dodatniego (Rysunek 2B,C). Bramkę dodatnią można utworzyć w oparciu o sygnał DiD-dodatni, jednak należy również wykorzystać próbki pozbawione sygnału DiD, aby zweryfikować, że bramka dodatnia nie obejmuje żadnych próbek DiD-ujemnych.
Miareczkowania są niezbędne do optymalizacji sygnałów fluorescencyjnych
Przed przeprowadzeniem pełnego eksperymentu należy zoptymalizować różne warunki, w tym stężenie przeciwciał sprzężonych z fluoresceincją stosowanych podczas barwienia komórek oraz stężenie barwnika lipidowego używanego podczas przygotowania liposomów. Cytometry przepływowe mają górną granicę detekcji intensywności fluorescencji, zatem zbyt duża ilość barwnika włączonego do liposomów doprowadzi do niekwantyfikowalnych poziomów sygnału DiD w próbkach analizowanych za pomocą cytometru. Ponadto nadmiar DiD w liposomach może prowadzić do wysokiego poziomu nieswoistego transferu barwnika, co mogłoby zafałszować wyniki poboru komórkowego. Rysunek 3 przedstawia wyniki eksperymentu, w którym miareczkowano stężenia barwnika lipidowego w celu zidentyfikowania stężenia dającego optymalny sygnał w zakresie detekcji użytego cytometru przepływowego. Badanie przeprowadzono na tkankach istotnych dla końcowego eksperymentu: krwi (Rysunek 3A), SVF z tkanki tłuszczowej pachwinowej (Rysunek 3B) oraz SVF z tkanki tłuszczowej nadjądrzowej (Rysunek 3C). Stężenia wybrane do testów wynosiły 10 mg DiD (wysokie, czerwony), 1 mg DiD (średnie, niebieski) lub 0,1 mg DiD (niskie, szary) na 1 mL liposomów. Najwyższe stężenie zastosowane w liposomach było zbyt wysokie i przekroczyło zakres kwantyfikowalny cytometru we wszystkich trzech tkankach (Rysunek 3A‒C, czerwony). Najniższe stężenie DiD wykazało pewien sygnał (Rysunek 3A‒C, szary), jednak nie zaobserwowano wyraźnej populacji wykraczającej poza komórki traktowane PBS (Rysunek 3A‒C, czarny). Po kwantyfikacji średnia arytmetyczna MFI dla DiD dla każdej tkanki i stężenia wykazała wyraźną różnicę między kontrolami PBS a średnim stężeniem DiD (Rysunek 3D). Zatem, zgodnie z protokołem, do przygotowania liposomów wybraliśmy stężenie średnie (Rysunek 3, niebieski).
Zastosowanie panelu wielu przeciwciał umożliwia identyfikację pobierania liposomów przez różne subpopulacje komórek
Korzystając z panelu opisanego w Tabeli 3, komórki barwiono przeciwciałami przeciwko markerom makrofagów, limfocytów B, limfocytów T, komórek dendrytycznych, monocytów oraz komórek śródbłonka (Rycina 4). Dla każdego typu tkanki wymagane są nieco inne strategie bramkowania, jednak w każdej z nich można zidentyfikować większość tych samych typów komórek. Wyjątki stanowią komórki śródbłonka, które zazwyczaj nie występują we krwi, oraz monocyty, których częstość występowania we krwi jest zazwyczaj wyższa niż w innych tkankach. Po zidentyfikowaniu populacji można określić całkowitą liczebność każdej populacji komórek oraz częstość, z jaką są one DiD+. Można przeprowadzić dalsze obliczenia w celu charakterystyki populacji DiD+: jaki procent komórek DiD+ stanowią makrofagi, komórki śródbłonka itd. Należy pamiętać, że są to przykładowe strategie bramkowania, a nie jedyny sposób analizy próbek. Analiza będzie zależeć od wybranego panelu oraz dostępnych cytometrów przepływowych.
<img alt="Charakterystyka nanocząsteczek; dane dotyczące wielkości i potencjału zeta; obraz TEM; analiza histogramu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Przykładowe charakterystyki przygotowanych liposomów. 
(A) Wielkość i potencjał zeta zmierzono zgodnie z powyższym opisem i przedstawiono w formie tabeli. Każdy parametr podano jako średnią ± odchylenie standardowe. (B) Do obrazowania przygotowanych liposomów wykorzystano kriomikroskopię elektronową (Cryo-EM). Biały pasek skali ma długość 50 nm. (C) Metodą DLS wygenerowano histogram średnic liposomów w tej preparacji. Rycina została opracowana na podstawie pracy Osinski et al.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Eksperyment z iniekcjami PBS/liposomów; wyniki cytometrii przepływowej; pobieranie tkanek; analiza myszy DiD+." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Reprezentatywne barwienie DiD u myszy traktowanych PBS lub liposomami. 
(A) Schemat eksperymentalny dla traktowania PBS i liposomami. PBS lub liposomy wstrzykiwano trzykrotnie w ciągu jednego tygodnia. Tkanki pobrano w 8. dniu traktowania. (B, C) Reprezentatywne wykresy z cytometrii przepływowej wykazują dodatnie barwienie DiD u myszy traktowanych liposomami (C), ale nie u myszy traktowanych PBS (B). FSC, rozproszenie przednie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy cytometrii przepływowej pokazujące pobieranie liposomów DiD w krwi i tkance tłuszczowej przy różnych stężeniach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Miareczkowanie DiD w liposomach. 
Liposomy przygotowano z trzema różnymi stężeniami DiD i wstrzyknięto myszom. Kolor szary oznacza niskie stężenie wynoszące 0.1 mg DiD na 1 mL liposomów, niebieski oznacza stężenie średnie wynoszące 1 mg DiD/mL liposomów, a czerwony oznacza stężenie wysokie wynoszące 10 mg DiD/mL liposomów. Myszy traktowanej PBS użyto jako kontroli negatywnej (kolor czarny). Krew (A, koło), tkankę tłuszczową pachwinową (B, trójkąt) oraz tkankę tłuszczową nadjądrzową (C, kwadrat) pobrano 24 h po wstrzyknięciu i przetworzono w celu wyizolowania zawiesiny pojedynczych komórek. Próbki te analizowano za pomocą cytometru przepływowego do poziomu wykrywalnego DiD. Przedstawiono histogramy specyficzne dla tkanek z nałożonymi wynikami każdej grupy badawczej, aby zademonstrować intensywność fluorescencji w zależności od stężenia (A‒C). Obliczono również średnią arytmetyczną DiD dla każdej tkanki i stężenia, a następnie przedstawiono ją na wykresie (D). SSC = side scatter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Strategia bramkowania w cytometrii przepływowej; obejmująca SVF tkanki tłuszczowej, śledzionę i krew; diagramy pokazują komórki CD45+, CD31+." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig04v4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Reprezentatywna analiza cytometrii przepływowej subpopulacji komórek w SVF tkanki tłuszczowej, krwi i śledzionie. 
(A‒C) Schemat reprezentatywny strategii bramkowania w celu identyfikacji subpopulacji komórek oraz komórek DiD+ w SVF tkanki tłuszczowej (A), śledzionie (B) i krwi (C). Skróty: FSC = forward scatter (rozproszenie przednie); LD = live/dead (żywe/martwe); L-DCs = limfoidalne komórki dendrytyczne; M-DCs = mieloidalne komórki dendrytyczne; SSC = side scatter (rozproszenie boczne). Rycina została zaadaptowana z pracy Osinski et al.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Kontrola</td>
			<td>Cel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">Myszy traktowane PBS lub solą fizjologiczną</td>
			<td>Wykorzystaj komórki z tej myszy do następujących kontroli cytometrii przepływowej:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1. Niezbarwione komórki</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Barwienie pojedyncze na żywe/martwe komórki</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Komórki barwione pełnym panelem, ale pozbawione fluorescencji liposomów, w celu określenia dodatniego sygnału liposomów podczas analizy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Te myszy zostaną również wykorzystane do określenia, czy liposomy wykazują jakiekolwiek działanie in vivo, ponieważ w eksperymencie zostanie zastosowana grupa kontrolna bez liposomów.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liposomy nieobciążone</td>
			<td>Jeśli wprowadzają Państwo związek do liposomów, część partii liposomów powinna zostać zsyntetyzowana bez tego związku. Pozwala to na uwzględnienie wszelkich efektów in vivo wywołanych przez same liposomy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sama metoda DiD</td>
			<td>Ponieważ DiD może być również pobierany przez błony komórkowe, przydzielenie części myszy do grupy otrzymującej wolny barwnik w ilości równej tej zawartej w liposomach pomoże uwzględnić jakiekolwiek tło wynikające z barwienia błon.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kontrole Fluorescence-minus-one (FMO)</td>
			<td>Są to komórki barwione wszystkimi przeciwciałami z panelu z wyjątkiem jednego. Podobnie jak w przypadku próbki nr 3 w powyższym polu, ułatwia to określenie prawdziwego sygnału dodatniego dla danego przeciwciała podczas analizy.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Kontrole do zastosowania w tym protokole.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Roztwór</td>
			<td>Składniki</td>
			<td>Przybliżona objętość potrzebna na partię/mysz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Przygotowanie liposomów</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octan wapnia</td>
			<td>1 M octan wapnia w H2O</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor HEPES</td>
			<td>10 mM HEPES w H2O, pH 7.4</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tesaglitazar w HEPES</td>
			<td>w 10 mM HEPES</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Pobieranie tkanek, przetwarzanie i barwienie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór buforowy fosforanowy (PBS)</td>
			<td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 w destylowanej H2O</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-Heparyna</td>
			<td>0.1 mM heparyny w PBS</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor HEPES</td>
			<td>20 mM HEPES w PBS</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor do trawienia</td>
			<td>2 mg/mL kolagenazy typu I w buforze HEPES</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor do lizy AKC</td>
			<td>0.158 M NH3Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA w ddH2O, pH 7.2</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor FACS</td>
			<td>1% BSA, 0.05% NaN3 w PBS</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blokada Fc (rozcieńczona)</td>
			<td>Fc Block w stosunku 1:50 w buforze FACS</td>
			<td>250 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor do fiksacji</td>
			<td>2% paraformaldehydu w PBS</td>
			<td>200 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Roztwory do przygotowania.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr>
			<td>A</td>
			<td>B</td>
			<td>C</td>
			<td>D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Barwienie zewnątrzkomórkowe (2x mieszanina przeciwciał)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antygen</td>
			<td>Fluorofor</td>
			<td>Objętość przeciwciał na test 100 µL</td>
			<td>Całkowita wymagana objętość:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45</td>
			<td>PerCP</td>
			<td>0.5 µL</td>
			<td>Kolumna C x 1.2 x całkowita liczba próbek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b</td>
			<td>PerCP Cy5.5</td>
			<td>0.25 µL</td>
			<td>(0.5 µL/test) x (1.2) x (liczba próbek)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F4/80</td>
			<td>PE Cy7</td>
			<td>0.25 µL</td>
			<td>(0.25 µL/test) x (1.2) x (liczba próbek)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19</td>
			<td>PE-CF594</td>
			<td>1 µL</td>
			<td>(0.25 µL/test) x (1.2) x (liczba próbek)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>FITC</td>
			<td>1 µL</td>
			<td>(1.0 µL/test) x (1.2) x (liczba próbek)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>BV605</td>
			<td>0.25 µL</td>
			<td>itp…</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c</td>
			<td>APC ef780</td>
			<td>1 µL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD115</td>
			<td>PE</td>
			<td>1.5 µL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Aby przygotować mieszaninę przeciwciał, należy połączyć przeciwciała obliczone w kolumnie D z buforem do FACS lub buforem Brilliant Violet Staining Buffer* do uzyskania objętości końcowej (50 µL x 1.2 x całkowita liczba próbek)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Barwienie Live/Dead (1x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead</td>
			<td>Fluorofor</td>
			<td>Objętość barwnika L/D na test 200 uL</td>
			<td>Całkowita wymagana objętość:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead</td>
			<td>Aqua</td>
			<td>0.67 µL</td>
			<td>Kolumna C x 1.2 x całkowita liczba próbek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Barwienie wewnątrzkomórkowe (1x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antygen</td>
			<td>Fluorofor</td>
			<td>Objętość przeciwciał na test 50 µL</td>
			<td>Całkowita wymagana objętość:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>αSMA</td>
			<td>FITC</td>
			<td>0.125</td>
			<td>Kolumna C x 1.2 x całkowita liczba próbek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">*Bufor Brilliant Violet Staining Buffer powinien być stosowany, jeśli w panelu używa się więcej niż jednego przeciwciała koniugowanego z fluoroforem z serii Brilliant Violet.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Przykładowy panel przeciwciał i obliczenia mieszanin barwiących do wykorzystania w cytometrii przepływowej.

Celem tego protokołu jest synteza liposomów znakowanych fluorescencyjnie i wykorzystanie cytometrii przepływowej do identyfikacji lokalizacji liposomów in vivo na poziomie komórkowym.

Przygotowanie, podawanie i ocena specyficznego tkankowo wychwytu komórkowego in vivo liposomów znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...

Nasz protokół łączy dostępną metodę przygotowania liposomów zawierających tesaglitazar z dokładnym podejściem do oceny wychwytu liposomów na poziomie komórkowym. Technika ta zapewnia bezstronną metodę oceny wychwytu liposomów znakowanych fluorescencyjnie, które są przygotowywane przy użyciu niskich temperatur i łatwego do zdobycia sprzętu. Aby przygotować znakowane fluorescencyjnie liposomy wypełnione octanem wapnia i tesaglitazarem, najpierw użyj półcalowej sondy do emulgowania roztworu eteru chloroformu lipidów przez sonikację przez 30 sekund w temperaturze pokojowej, 20 kilohercach i 50% mocy.Natychmiast przenieś homogenizowany roztwór emulsji wodno-olejowej do parownika obrotowego ze specjalnym adapterem, manometrem nanometrowym i zaworem regulatora ciśnienia i podłącz parownik do przewodu próżniowego. Aby usunąć rozpuszczalniki organiczne, ustaw prędkość obrotową na 100 obrotów na minutę, a próżnię na 0,5 atmosfery. Po utworzeniu i zniknięciu żelu zwiększ próżnię do 0,9 atmosfery i przefiltruj wodną dyspersję liposomów tam iz powrotem przez 200-nanometrowy filtr poliwęglanowy w wytłaczarce liposomowej wyposażonej w dwie gazoszczelne strzykawki wielokrotnie.Po zweryfikowaniu rozkładu wielkości za pomocą dynamicznego rozpraszania światła, użyj dwumililitrowej kolumny wirowej, aby usunąć wszelkie nieuwięzione tesaglitazar z liposomów i użyj spektrofotometru, aby określić uwięzione stężenie leku. Następnie dodaj nie więcej niż 500 mikrolitrów próbki liposomu do suchego złoża żelowego kolumny. Aby podać liposomy przez wstrzyknięcie zaoczodołowe, delikatnie dociśnij skórę powyżej i poniżej odsłoniętego oka, aby unieść oko powyżej płaszczyzny twarzy.Następnie ostrożnie włóż końcówkę igły w przednim kąciku oka, upewniając się, że igła znajduje się poniżej kuli bez dotykania jej, i powoli wstrzyknij liposomy do przestrzeni zadoczodołowej. W celu pobrania próbki krwi, w odpowiednim doświadczalnym punkcie końcowym ostrożnie wykonać nacięcie w skórze na krawędzi ogonowego końca klatki piersiowej myszy i przeciąć jednocentymetrową linię prostą w górę w kierunku głowy zwierzęcia, aż do odsłonięcia mięśni piersiowych. W początkowym miejscu nacięcia wykonaj dwa małe nacięcia prostopadłe do linii w kierunku głowy i ostrożnie odetnij mięsień piersiowy po jednej stronie klatki piersiowej w odsłoniętym obszarze, aby umożliwić lepszy dostęp i wizualizację miejsca wkłucia igły.Włóż igłę między trzecie i czwarte żebro, trzymając ją jak najbliżej linii środkowej klatki piersiowej, a następnie delikatnie pociągnij strzykawkę, aby rozpocząć pobieranie krwi. Po zebraniu jak największej objętości należy przenieść krew do mikroprobówki wirówkowej zawierającej 10 mikrolitrów 0,5 molowego EDTA na lodzie. Aby wydobyć pachwinową poduszkę tkankową z każdej strony myszy, użyj jednego zestawu kleszczy, aby przytrzymać błonę otrzewną po prawej stronie, a drugiego zestawu kleszczy, aby przytrzymać krawędź skóry powyżej błony otrzewnej po drugiej.Delikatnie odciągnij skórę od membrany, aby oddzielić warstwy od siebie. Przypnij zewnętrzną krawędź skóry, aby uzyskać lepszy dostęp do magazynu tłuszczu i zlokalizuj magazyn pachwinowej tkanki tłuszczowej wzdłuż skóry. I zlokalizuj pachwinowy węzeł chłonny w środku magazynu tłuszczu za pomocą kleszczy i nożyczek, aby w razie potrzeby usunąć węzeł chłonny.Po usunięciu węzła chłonnego za pomocą kleszczy ostrożnie chwyć koniec magazynu tłuszczu znajdujący się najbliżej unieruchomionego punktu i zacznij wykonywać małe nacięcia na błonie łącznej między tkanką tłuszczową a skórą. Oderwij tkankę tłuszczową od skóry, wykonując nacięcia dla lepszego dostępu do błony, a następnie umieść magazyn w polietylenowej fiolce zawierającej bufor HEPES na lodzie. Aby usunąć magazyny tłuszczowe najądrza z ogonowego końca jamy otrzewnej, użyj kleszczy, aby delikatnie pociągnąć pierwszy magazyn tłuszczowy najądrza od grzbietowego końca myszy i zlokalizuj najądrza i nasieniowody przyczepione do tego magazynu.Następnie ostrożnie przeciąć między magazynem tkanki tłuszczowej a najądrzem i nasieniowodami, aby oddzielić tkankę tłuszczową od innych tkanek i umieścić depo w fiolce polietylenowej z buforem HEPES na lodzie. Po pobraniu wszystkich tkanek użyj jednej lub dwóch par nożyczek, aby zmielić próbki tkanki tłuszczowej na 0,5 milimetrowe fragmenty tkanki. Następnie dodaj 1,5 mililitra dwóch miligramów na mililitr buforu kolagenazy do fiolek z kawałkami tkanki tłuszczowej i umieść fiolki w inkubatorze wstrząsającym w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 150 obrotach na minutę przez 30 do 45 minut.Po 30 minutach użyj pipety o pojemności jednego mililitra, aby kilkakrotnie roztarć próbki. Jeśli kawałki tkanki są nadal zbyt duże, aby można je było łatwo pipetować, należy umieścić próbki z powrotem w inkubatorze na dodatkowe 15 minut. Gdy próbki zostaną w pełni strawione, należy rozcierać fragmenty kolejne 10 razy, aby zapewnić utworzenie zawiesiny pojedynczej komórki i przecedzić każdą próbkę przez indywidualne filtry 70 mikrometrów do jednej 50-mililitrowej probówki na próbkę.Przepłucz każdy plik pięcioma mililitrami buforu FACS, aby zebrać wszelkie pozostałe komórki i przefiltrować każde popłuczynie do odpowiedniej fiolki z próbką komórek na lodzie. Gdy wszystkie próbki zostaną przefiltrowane, zebrać komórki przez odwirowanie i odessać supernatant adipocytów z próbek. Następnie ostrożnie odessać supernatanty, pozostawiając nienaruszone granulki frakcji zrębu naczyniowej i ponownie zawiesić granulki w jednym mililitrze buforu FACS na probówkę.Następnie przenieś zawiesiny do nowych probówek o pojemności 1,5 lub 1,7 mililitra na lodzie do czasu analizy cytometrii przepływowej według standardowych protokołów. Dynamiczne rozpraszanie światła ujawnia średnią średnicę liposomu wynoszącą 163,2 nanometra i potencjał zeta wynoszący minus 19,2 miliwolta. Obrazowanie za pomocą kriogenicznej mikroskopii elektronowej ujawnia koliste liposomy ze stosunkowo małym odchyleniem standardowym uzyskanym od średniej średnicy mierzonej przez dynamiczne rozpraszanie światła.Analiza cytometryczna przepływowa próbek od myszy traktowanych PBS może być stosowana jako fluorescencja DiD minus jedna kontrola, za pomocą której można utworzyć bramki DiD dodatnie. Jak pokazano w tej reprezentatywnej analizie, stężenie obciążenia liposomem DiD wynoszące 10 miligramów na mililitr jest zbyt wysokie, przekraczając wymierny zakres cytometru we wszystkich trzech badanych tkankach. Stężenie 0,1 miligrama na mililitr pokazuje pewien sygnał, ale nie obserwuje się wyraźnej populacji poza komórkami traktowanymi PBS.W związku z tym stężenie jednego miligrama na mililitr, które wykazuje wyraźne odróżnienie od kontroli PBS, a jednocześnie jest możliwe do odczytania przez analizator, jest zalecane do stosowania w preparacie liposomowym. Dla każdego typu tkanki wymagane są nieco inne strategie bramkowania, ale większość tych samych typów komórek można zidentyfikować w każdym z nich. Po zidentyfikowaniu określonych populacji będących przedmiotem zainteresowania można określić ilościowo całkowitą wielkość każdej populacji komórek i częstotliwość, z jaką są one DiD dodatnie.Przygotowanie odczynników i sprzętu oraz przewidywanie wyników dla każdego kroku ma kluczowe znaczenie. Nieoczekiwane wyniki na wczesnym etapie mogą zrujnować przyszłe wyniki. Metody histologiczne mogą być stosowane do oceny lokalizacji liposomów w całej tkance, podczas gdy obrazowa cytometria przepływowa może być stosowana do weryfikacji internalizacji liposomów w przeliczeniu na komórkę.

preparation-administration-assessment-vivo-tissue-specific-cellular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Nanocząstki wirusowe pochodzenia roślinnego (VNPs) stanowią obiecujące platformy do zastosowań w biomedycynie. W niniejszym materiale opisujemy procedury propagacji, oczyszczania, charakteryzacji oraz biokoniugacji roślinnych VNP. Na koniec przedstawiamy zastosowanie VNP w celowanym dostarczaniu do guzów oraz obrazowaniu z wykorzystaniem modelu ksenoprzeszczepu u myszy i obrazowania fluorescencyjnego.

Nanocząsteczki wirusowe do obrazowania guzów in vivo

Ten film omawia test wycieku fluorescencji w celu zbadania interakcji peptydów penetrujących komórki z błonami komórkowymi za pomocą mimiki błony komórkowej - dużych pęcherzyków jednopłytkowych lub LUV, otoczonych barwnikiem fluorescencyjnym i gaszącym.

Test nieszczelności fluorescencji w celu zbadania interakcji peptydu przenikającego przez komórkę z błoną

Przestrzenny rozkład i czasowa dynamika białek błony komórkowej i lipidów to gorący temat w biologii. W tym przypadku problem ten został rozwiązany za pomocą czasoprzestrzennej analizy fluktuacji obrazu, która zapewnia koncepcyjnie te same fizyczne wielkości śledzenia pojedynczych cząstek, ale wykorzystuje małe znaczniki molekularne i standardowe konfiguracje mikroskopowe.

Od szybkiego obrazowania fluorescencyjnego do prawa dyfuzji molekularnej na żywych błonach komórkowych w komercyjnym mikroskopie

Użycie fluoroforów do obrazowania in vivo może być znacznie ograniczone przez opsonizację, szybki klirens, niską czułość wykrywania i cytotoksyczne działanie na gospodarza. Enkapsulacja fluoroforów w liposomach poprzez hydratację i ekstruzję filmu prowadzi do wygaszania i ochrony fluorescencji, co umożliwia obrazowanie in vivo o wysokiej czułości wykrywania.

Wygaszanie fluorescencji fluoroforu bliskiej podczerwieni w obudowie liposomalnej jako narzędzie do obrazowania optycznego in vivo

Heterogeniczne nagromadzenie liposomów wewnątrz guza zostało powiązane z nieprawidłowym mikrośrodowiskiem guza. W niniejszej pracy przedstawiono metody pomiaru mikrokrążenia guza za pomocą obrazowania perfuzyjnego i podwyższonego ciśnienia płynu śródmiąższowego (IFP) przy użyciu systemu robotycznego sterowanego obrazem. Pomiary są porównywane z wewnątrznowotworową akumulacją liposomów, oznaczoną za pomocą wolumetrycznego obrazowania mikro-CT.

Pomiary przestrzenne perfuzji, ciśnienia płynu śródmiąższowego i akumulacji liposomów w guzach litych

Obrazowanie ex vivo całego narządu to szybka metoda określania względnych stężeń związków znakowanych fluorescencyjnie w obrębie i pomiędzy tkankami lub grupami leczenia. I odwrotnie, ilościowa histologia fluorescencji, choć bardziej pracochłonna, pozwala na ilościowe określenie bezwzględnych poziomów tkanek znakowanych cząsteczek.

Zastosowanie obrazowania ex vivo całego narządu i ilościowej histologii tkanek w celu określenia biodystrybucji cząsteczek znakowanych fluorescencyjnie

Słabe zrozumienie skuteczności nanoleków in vivo utrudnia ich kliniczne tłumaczenie. Opisano tutaj procedury oceny zachowania in vivo nanoleków przeciwnowotworowych na poziomie ogólnoustrojowym, tkankowym, jednokomórkowym i subkomórkowym u myszy immunokompetentnych z nowotworem. Podejście to może pomóc naukowcom w zidentyfikowaniu obiecujących nanoleków przeciwnowotworowych do zastosowania klinicznego.

Kompleksowa procedura oceny skuteczności in vivo nanoleków przeciwnowotworowych

Obrazowanie żywych komórek to potężne narzędzie do wizualizacji dynamicznych procesów. Badanie nieruchomych komórek dostarcza jedynie statycznych obrazów, co może prowadzić do błędnej interpretacji i zamieszania co do procesu. W pracy przedstawiono metodę badania wychwytu, uwalniania leków i lokalizacji wewnątrzkomórkowej nanocząstek liposomalnych w żywych komórkach.

Wykorzystanie obrazowania żywych komórek in vitro do badania chemioterapeutyków dostarczanych przez nanocząstki na bazie lipidów

Ten protokół opisuje wytwarzanie liposomów oraz sposób, w jaki można je unieruchomić na powierzchni i zobrazować indywidualnie w masowy równoległy sposób za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Pozwala to na ilościowe określenie wielkości i niejednorodności składu między pojedynczymi liposomami populacji.

Ilościowy test pojedynczego liposomu oparty na mikroskopii fluorescencyjnej do wykrywania niejednorodności składu między poszczególnymi liposomami

Opisujemy protokoły oceny stopnia transdukcji przez peptydy penetrujące komórki, wykorzystując systemy obrazowania ex vivo, a następnie zatapianie parafiny, cięcie i konfokalną mikroskopię fluorescencyjną na przykładzie peptydu celującego w serce. W naszym protokole pojedyncze zwierzę może być wykorzystane do uzyskania obu rodzajów oceny obrazowej tych samych narządów, zmniejszając w ten sposób liczbę zwierząt potrzebnych do badań o połowę.

Obrazowanie in vivo skuteczności transdukcji peptydu ukierunkowanego na serce

Przedstawiamy protokół użycia światłowodowej konfokalnej laserowej mikroendoskopii (CLM) do nieinwazyjnego badania czasoprzestrzennego rozkładu liposomów w oku po wstrzyknięciu podspojówkowym.

Przestrzenno-czasowe obrazowanie in vivo ocznych systemów dostarczania leków za pomocą światłowodowej konfokalnej laserowej mikroendoskopii

Poznaj metodę syntezy liposomów znakowanych fluorescencyjnie i oceny ich wychwytu komórkowego in vivo za pomocą cytometrii przepływowej. Technika ta umożliwia precyzyjną analizę lokalizacji nanonośników w tkankach.

Przygotowanie, podawanie i ocena specyficznego tkankowo wychwytu komórkowego in vivo liposomów znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie, podawanie i ocena specyficznego tkankowo wychwytu komórkowego in vivo liposomów znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym

Przeglądaj więcej filmów