Przygotowanie, podawanie i ocena specyficznego tkankowo wychwytu komórkowego in vivo liposomów znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym

Nasz protokół łączy dostępną metodę przygotowania liposomów zawierających tesaglitazar z dokładnym podejściem do oceny wychwytu liposomów na poziomie komórkowym. Technika ta zapewnia bezstronną metodę oceny wychwytu liposomów znakowanych fluorescencyjnie, które są przygotowywane przy użyciu niskich temperatur i łatwego do zdobycia sprzętu. Aby przygotować znakowane fluorescencyjnie liposomy wypełnione octanem wapnia i tesaglitazarem, najpierw użyj półcalowej sondy do emulgowania roztworu eteru chloroformu lipidów przez sonikację przez 30 sekund w temperaturze pokojowej, 20 kilohercach i 50% mocy.

Natychmiast przenieś homogenizowany roztwór emulsji wodno-olejowej do parownika obrotowego ze specjalnym adapterem, manometrem nanometrowym i zaworem regulatora ciśnienia i podłącz parownik do przewodu próżniowego. Aby usunąć rozpuszczalniki organiczne, ustaw prędkość obrotową na 100 obrotów na minutę, a próżnię na 0,5 atmosfery. Po utworzeniu i zniknięciu żelu zwiększ próżnię do 0,9 atmosfery i przefiltruj wodną dyspersję liposomów tam iz powrotem przez 200-nanometrowy filtr poliwęglanowy w wytłaczarce liposomowej wyposażonej w dwie gazoszczelne strzykawki wielokrotnie.

Po zweryfikowaniu rozkładu wielkości za pomocą dynamicznego rozpraszania światła, użyj dwumililitrowej kolumny wirowej, aby usunąć wszelkie nieuwięzione tesaglitazar z liposomów i użyj spektrofotometru, aby określić uwięzione stężenie leku. Następnie dodaj nie więcej niż 500 mikrolitrów próbki liposomu do suchego złoża żelowego kolumny. Aby podać liposomy przez wstrzyknięcie zaoczodołowe, delikatnie dociśnij skórę powyżej i poniżej odsłoniętego oka, aby unieść oko powyżej płaszczyzny twarzy.

Następnie ostrożnie włóż końcówkę igły w przednim kąciku oka, upewniając się, że igła znajduje się poniżej kuli bez dotykania jej, i powoli wstrzyknij liposomy do przestrzeni zadoczodołowej. W celu pobrania próbki krwi, w odpowiednim doświadczalnym punkcie końcowym ostrożnie wykonać nacięcie w skórze na krawędzi ogonowego końca klatki piersiowej myszy i przeciąć jednocentymetrową linię prostą w górę w kierunku głowy zwierzęcia, aż do odsłonięcia mięśni piersiowych. W początkowym miejscu nacięcia wykonaj dwa małe nacięcia prostopadłe do linii w kierunku głowy i ostrożnie odetnij mięsień piersiowy po jednej stronie klatki piersiowej w odsłoniętym obszarze, aby umożliwić lepszy dostęp i wizualizację miejsca wkłucia igły.

Włóż igłę między trzecie i czwarte żebro, trzymając ją jak najbliżej linii środkowej klatki piersiowej, a następnie delikatnie pociągnij strzykawkę, aby rozpocząć pobieranie krwi. Po zebraniu jak największej objętości należy przenieść krew do mikroprobówki wirówkowej zawierającej 10 mikrolitrów 0,5 molowego EDTA na lodzie. Aby wydobyć pachwinową poduszkę tkankową z każdej strony myszy, użyj jednego zestawu kleszczy, aby przytrzymać błonę otrzewną po prawej stronie, a drugiego zestawu kleszczy, aby przytrzymać krawędź skóry powyżej błony otrzewnej po drugiej.

Delikatnie odciągnij skórę od membrany, aby oddzielić warstwy od siebie. Przypnij zewnętrzną krawędź skóry, aby uzyskać lepszy dostęp do magazynu tłuszczu i zlokalizuj magazyn pachwinowej tkanki tłuszczowej wzdłuż skóry. I zlokalizuj pachwinowy węzeł chłonny w środku magazynu tłuszczu za pomocą kleszczy i nożyczek, aby w razie potrzeby usunąć węzeł chłonny.

Po usunięciu węzła chłonnego za pomocą kleszczy ostrożnie chwyć koniec magazynu tłuszczu znajdujący się najbliżej unieruchomionego punktu i zacznij wykonywać małe nacięcia na błonie łącznej między tkanką tłuszczową a skórą. Oderwij tkankę tłuszczową od skóry, wykonując nacięcia dla lepszego dostępu do błony, a następnie umieść magazyn w polietylenowej fiolce zawierającej bufor HEPES na lodzie. Aby usunąć magazyny tłuszczowe najądrza z ogonowego końca jamy otrzewnej, użyj kleszczy, aby delikatnie pociągnąć pierwszy magazyn tłuszczowy najądrza od grzbietowego końca myszy i zlokalizuj najądrza i nasieniowody przyczepione do tego magazynu.

Następnie ostrożnie przeciąć między magazynem tkanki tłuszczowej a najądrzem i nasieniowodami, aby oddzielić tkankę tłuszczową od innych tkanek i umieścić depo w fiolce polietylenowej z buforem HEPES na lodzie. Po pobraniu wszystkich tkanek użyj jednej lub dwóch par nożyczek, aby zmielić próbki tkanki tłuszczowej na 0,5 milimetrowe fragmenty tkanki. Następnie dodaj 1,5 mililitra dwóch miligramów na mililitr buforu kolagenazy do fiolek z kawałkami tkanki tłuszczowej i umieść fiolki w inkubatorze wstrząsającym w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 150 obrotach na minutę przez 30 do 45 minut.

Po 30 minutach użyj pipety o pojemności jednego mililitra, aby kilkakrotnie roztarć próbki. Jeśli kawałki tkanki są nadal zbyt duże, aby można je było łatwo pipetować, należy umieścić próbki z powrotem w inkubatorze na dodatkowe 15 minut. Gdy próbki zostaną w pełni strawione, należy rozcierać fragmenty kolejne 10 razy, aby zapewnić utworzenie zawiesiny pojedynczej komórki i przecedzić każdą próbkę przez indywidualne filtry 70 mikrometrów do jednej 50-mililitrowej probówki na próbkę.

Przepłucz każdy plik pięcioma mililitrami buforu FACS, aby zebrać wszelkie pozostałe komórki i przefiltrować każde popłuczynie do odpowiedniej fiolki z próbką komórek na lodzie. Gdy wszystkie próbki zostaną przefiltrowane, zebrać komórki przez odwirowanie i odessać supernatant adipocytów z próbek. Następnie ostrożnie odessać supernatanty, pozostawiając nienaruszone granulki frakcji zrębu naczyniowej i ponownie zawiesić granulki w jednym mililitrze buforu FACS na probówkę.

Następnie przenieś zawiesiny do nowych probówek o pojemności 1,5 lub 1,7 mililitra na lodzie do czasu analizy cytometrii przepływowej według standardowych protokołów. Dynamiczne rozpraszanie światła ujawnia średnią średnicę liposomu wynoszącą 163,2 nanometra i potencjał zeta wynoszący minus 19,2 miliwolta. Obrazowanie za pomocą kriogenicznej mikroskopii elektronowej ujawnia koliste liposomy ze stosunkowo małym odchyleniem standardowym uzyskanym od średniej średnicy mierzonej przez dynamiczne rozpraszanie światła.

Analiza cytometryczna przepływowa próbek od myszy traktowanych PBS może być stosowana jako fluorescencja DiD minus jedna kontrola, za pomocą której można utworzyć bramki DiD dodatnie. Jak pokazano w tej reprezentatywnej analizie, stężenie obciążenia liposomem DiD wynoszące 10 miligramów na mililitr jest zbyt wysokie, przekraczając wymierny zakres cytometru we wszystkich trzech badanych tkankach. Stężenie 0,1 miligrama na mililitr pokazuje pewien sygnał, ale nie obserwuje się wyraźnej populacji poza komórkami traktowanymi PBS.

W związku z tym stężenie jednego miligrama na mililitr, które wykazuje wyraźne odróżnienie od kontroli PBS, a jednocześnie jest możliwe do odczytania przez analizator, jest zalecane do stosowania w preparacie liposomowym. Dla każdego typu tkanki wymagane są nieco inne strategie bramkowania, ale większość tych samych typów komórek można zidentyfikować w każdym z nich. Po zidentyfikowaniu określonych populacji będących przedmiotem zainteresowania można określić ilościowo całkowitą wielkość każdej populacji komórek i częstotliwość, z jaką są one DiD dodatnie.

Przygotowanie odczynników i sprzętu oraz przewidywanie wyników dla każdego kroku ma kluczowe znaczenie. Nieoczekiwane wyniki na wczesnym etapie mogą zrujnować przyszłe wyniki. Metody histologiczne mogą być stosowane do oceny lokalizacji liposomów w całej tkance, podczas gdy obrazowa cytometria przepływowa może być stosowana do weryfikacji internalizacji liposomów w przeliczeniu na komórkę.