Name: Przygotowanie zarodków Drosophila i mikroiniekcja do mikroskopii żywych komórek wykonana przy użyciu automatycznego analizatora o wysokiej zawartości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Poznaj metodę mikroiniekcji i obrazowania zarodków Drosophila przy użyciu analizatora o wysokiej zawartości. Technika umożliwia jednoczesne pozyskiwanie wielu zarodków do ilościowej analizy rozwoju.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

UD, WFM i BR są wspierane przez Center for Cellular Construction, Centrum Nauki i Technologii Narodowej Fundacji Nauki (NSF), na podstawie umowy o grant DBI-1548297. BR jest również wspierany przez nagrodę NSF CAREER, 1553695.

<ol><li>Zanella, F., Lorens, J., Link, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+screening%3A+seeing+is+believing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">High content screening: seeing is believing.</a> Trends in Biotechnology. 28 (5), 237-245 (2010).</li>
<li>Jennings, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila-a+versatile+model+in+biology+%26+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Today%22%5BJournal%5D)">Drosophila-a versatile model in biology & medicine.</a> Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).</li>
<li>Soares, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2D+and+3D-organized+cardiac+cells+shows+differences+in+cellular+morphology%2C+adhesion+junctions%2C+presence+of+myofibrils+and+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression.</a> PLoS One. 7 (5), 38147(2010).</li>
<li>Bickle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beautiful+cell%3A+high-content+screening+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The beautiful cell: high-content screening in drug discovery.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 398 (1), 219-226 (2010).</li>
<li>Boutros, M., Heigwer, F., Laufer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopy+based+high+content+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Microscopy based high content screening.</a> Cell. 163 (6), 1314-1325 (2015).</li>
<li>Mandal, A., Pinter, K., Drerup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+Neuronal+Mitochondria+in-vivo+Using+Fluorescent+Reporters+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Analyzing Neuronal Mitochondria in-vivo Using Fluorescent Reporters in Zebrafish.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6 (144), 00144(2018).</li>
<li>Bellen, H., Tong, C., Tsuda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((100+years+of+Drosophila+research+and+its+impact+on+vertebrate+neuroscience%3A+a+history+lesson+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).</li>
<li>Letsou, A., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+flies-big+discoveries%3A+nearly+a+century+of+Drosophila+genetics+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%3A+An+Official+Publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Small flies-big discoveries: nearly a century of Drosophila genetics and development.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 232 (3), 526-528 (2005).</li>
<li>Sullivan, W., Theurkauf, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytoskeleton+and+morphogenesis+of+the+early+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The cytoskeleton and morphogenesis of the early Drosophila embryo.</a> Current Opinion in Cell Biology. 7 (1), 18-22 (1995).</li>
<li>Schejter, E., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+elements+of+the+cytoskeleton+in+the+early+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional elements of the cytoskeleton in the early Drosophila embryo.</a> Annual Review of Cell Biology. 9 (1), 67-99 (1993).</li>
<li>Kellogg, D., Mitchison, T., Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior+of+microtubules+and+actin+filaments+in+living+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Behavior of microtubules and actin filaments in living Drosophila embryos.</a> Development. 103 (4), 675-686 (1988).</li>
<li>Mavrakis, M., Rikhy, R., Lilly, M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+techniques+for+studying+Drosophila+embryo+development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging techniques for studying Drosophila embryo development.</a> Current Protocols in Cell Biology. 39 (1), 4-18 (2008).</li>
<li>Tram, U., Riggs, B., Koyama, C., Debec, A., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+study+of+centrosomes+in+Drosophila+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods for the study of centrosomes in Drosophila during embryogenesis.</a> Methods in Cell Biology. 67, 113-123 (2001).</li>
<li>Voeltz, G., Prinz, W., Shibata, Y., Rist, J., Rapoport, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+class+of+membrane+proteins+shaping+the+tubular+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum.</a> Cell. 124 (3), 573-586 (2006).</li>
<li>Diaz, U., Bergman, Z., Johnson, B., Edington, A., de Cruz, M., Marshall, W., Riggs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules+are+necessary+for+proper+Reticulon+localization+during+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Microtubules are necessary for proper Reticulon localization during mitosis.</a> PLoS One. 14 (12), 0226327(2019).</li>
<li>Shibata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reticulon+and+DP1%2FYop1p+proteins+form+immobile+oligomers+in+the+tubular+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The reticulon and DP1/Yop1p proteins form immobile oligomers in the tubular endoplasmic reticulum.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (27), 18892-18904 (2008).</li>
<li>Bergman, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+reorganization+of+the+endoplasmic+reticulum+during+mitosis+relies+on+mitotic+kinase+cyclin+A+in+the+early+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Spatial reorganization of the endoplasmic reticulum during mitosis relies on mitotic kinase cyclin A in the early Drosophila embryo.</a> PloS One. 10 (2), 0117859(2015).</li>
<li>Lu, L., Ladinsky, M., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisternal+organization+of+the+endoplasmic+reticulum+during+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Cisternal organization of the endoplasmic reticulum during mitosis.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (15), 3471-3480 (2009).</li>
<li>Puhka, M., Vihinen, H., Joensuu, M., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+remains+continuous+and+undergoes+sheet-to-tubule+transformation+during+cell+division+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum remains continuous and undergoes sheet-to-tubule transformation during cell division in mammalian cells.</a> The Journal of Cell Biology. 179 (5), 895-909 (2007).</li>
<li>Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCampos-Ortega%2C+J+%22The+embryonic+development+of+Drosophila+melanogaster%22">The embryonic development of Drosophila melanogaster</a>. , Springer Science & Business Media. eBook ISBN 978-3-662-22489-2 (2013).</li>
<li>Sulivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSulivan%2C+W+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN 978-087969827-0 (2000).</li>
<li>Bainbridge, S., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> Development. 66, 57-80 (1981).</li>
<li>Bate, M., et al. Mitosis and Morphogenesis in the Drosophila Embryo. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBate%2C+M+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. , Cold Spring Harbor Press. Chapter 3. ISBN 978-087969899-7 (1993).</li>
<li>Uyen, T., Blake, R., Carol, K., Alain, D., William, S. Methods for the study of centrosomes in Drosophila during embryogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aUyen%2C+T+%22Methods+in+Cell+Biology%22">Methods in Cell Biology</a>. 67, Academic Press. 113-123 (2001).</li>
<li>Voeltz, G., Prinz, W., Shibata, Y., Rist, J., Rapoport, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+class+of+membrane+proteins+shaping+the+tubular+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum.</a> Cell. 124 (3), 573-586 (2006).</li>
<li>Zurek, N., Sparks, L., Voeltz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reticulon+short+hairpin+transmembrane+domains+are+used+to+shape+ER+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Reticulon short hairpin transmembrane domains are used to shape ER tubules.</a> Traffic. 12 (1), 28-41 (2011).</li>
<li>Kumar, D., Golchoubian, B., Belevich, I., Jokitalo, E., Schlaitz, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REEP3+and+REEP4+determine+the+tubular+morphology+of+the+endoplasmic+reticulum+during+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">REEP3 and REEP4 determine the tubular morphology of the endoplasmic reticulum during mitosis.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (12), 1377-1389 (2019).</li>
<li>Park, S., Zhu, P., Parker, R., Blackstone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hereditary+spastic+paraplegia+proteins+REEP1%2C+spastin%2C+and+atlastin-1+coordinate+microtubule+interactions+with+the+tubular+ER+network%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Hereditary spastic paraplegia proteins REEP1, spastin, and atlastin-1 coordinate microtubule interactions with the tubular ER network.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1097-1110 (2010).</li>
<li>Loncar, D., Singer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+membrane+formation+during+the+cellularization+of+the+syncytial+blastoderm+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 92 (6), 2199-2203 (1995).</li>
<li>Mazumdar, A., Mazumdar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+one+becomes+many%3A+Blastoderm+cellularization+in+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessay%22%5BJournal%5D)">How one becomes many: Blastoderm cellularization in melanogaster.</a> Bioessay. 24, 1012-1022 (2002).</li>
<li>Yuan, K., O'Farrell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TALE-light+imaging+reveals+maternally+guided%2C+H3K9me2%2F3-independent+emergence+of+functional+heterochromatin+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">TALE-light imaging reveals maternally guided, H3K9me2/3-independent emergence of functional heterochromatin in Drosophila embryos.</a> Genes & Development. 30 (5), 579-593 (2016).</li>
<li>Walther, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin+formation+in+Drosophila+requires+genome-wide+histone+deacetylation+in+cleavage+chromatin+before+mid-blastula+transition+in+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin formation in Drosophila requires genome-wide histone deacetylation in cleavage chromatin before mid-blastula transition in early embryogenesis.</a> Chromosoma. 129 (1), 83-98 (2020).</li>
<li>McCleland, M., Shermoen, A., O'Farrell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+times+the+cell+cycle+and+contributes+to+the+mid-blastula+transition+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA replication times the cell cycle and contributes to the mid-blastula transition in Drosophila embryos.</a> Journal of Cell Biology. 187 (1), 7-14 (2009).</li>
<li>Tram, U., Riggs, B., Sullivan, W. Cleavage and Gastrulation in Drosophila Embryos. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTram%2C+U+%22Encyclopedia+of+Life+Sciences%22">Encyclopedia of Life Sciences</a>. , (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany tutaj protokół jest bardzo wszechstronny i łatwy do dostosowania do badania zdarzeń biologicznych na różnych etapach rozwoju embrionalnego Drosophila. Protokół ten doskonale nadaje się do badania procesów biologicznych, które zachodzą w długich okresach czasu. Na przykład badania nad cellularyzacją29,30 lub tworzeniem domen heterochromatyny u Drosophila 31,32 mogą skorzystać z wykorzystania metod opisanych w tym protokole, ponieważ procesy te zachodzą przez dłuższy czas. Ponadto wielkość próby można zwiększyć poprzez zmniejszenie powiększenia w celu zbadania pytań, które wymagają mniejszej rozdzielczości optycznej, takich jak czas między podziałami syncytialnymi33 lub czas trwania gastrulacji34. Podobnie, obiektyw 20x pozwala na zobrazowanie dwóch zarodków w jednej płaszczyźnie obrazowania. Metody zawarte w tym protokole stanowią dynamiczną platformę do zadawania pytań biologicznych przy użyciu rozwoju embrionalnego jako systemu modelowego do analizy ilościowej.
W tym protokole są 3 krytyczne kroki. Po dechorionacji w 50% wybielaczu konieczne jest energiczne przepłukanie i wysuszenie zarodków 5 razy (2.3.4). Ten krok usuwa wszelkie resztki małych kawałków kosmówki. Resztki kosmówki będą zasłaniać pole widzenia podczas obrazowania zarodka. Podczas umieszczania zarodków na szklanym szkiełku nakrywkowym (3.5) ważne jest, aby dociskać zarodki do kleju z równomiernym naciskiem. Spowoduje to umieszczenie zarodków na tej samej płaszczyźnie z. Podczas rozcinania igły do mikroiniekcji ważne jest, aby natychmiast wycofać tłok w celu wyregulowania natężenia przepływu igły, w przeciwnym razie pacjent straci cały wstrzykiwany płyn.
Nasze badanie było ograniczone przez dwa czynniki. Pierwszym czynnikiem był brak zautomatyzowanego procesu segmentacji. Zaprojektowaliśmy jednak skrypt do ręcznej segmentacji przy użyciu MATLAB; Dzięki genetycznie kodowanemu markerowi wrzeciona proces ten można zautomatyzować. W przyszłości chcielibyśmy produkować CNN-RFP21, Rtln1-GFP i CNN-RFP; Linie transgeniczne ReepB-GFP umożliwiające automatyczną segmentację wrzeciona. Aby uzyskać więcej informacji na temat naszego skryptu MATLAB i potoku analizy, zapoznaj się z materiałami uzupełniającymi Diaz et al.15. Po drugie, byliśmy również ograniczeni przez nasz interwał akwizycji wynoszący 35 sekund, który pozwolił nam obrazować tylko 6 zarodków jednocześnie. Dłuższy odstęp między akwizycjami pozwoliłby nam na obrazowanie większej liczby zarodków jednocześnie. Chociaż wydajność dostarczania leków można zwiększyć, zastępując mikroiniekcję etapem przenikania, stwierdziliśmy, że jest to niepotrzebne, ponieważ wielkość naszej próby była już ograniczona przez interwał akwizycji.
Chociaż protokół ten został wykorzystany do zobrazowania rozwoju embrionalnego Drosophila , ogólne podejście można dostosować do badania rozwoju embrionalnego w innych wielokomórkowych systemach modelowych, takich jak C. elegans, jeżowce i Xenopus. Zarodki są niezwykle przydatne do analizy ilościowej, ponieważ można je łatwo zsynchronizować poprzez pobranie lub zapłodnienie. Ponadto zarodki nie poruszają się ani nie odpływają poza pole widzenia, co umożliwia wykorzystanie prostego oprogramowania do akwizycji wielopunktowej do tworzenia wielu filmów poklatkowych do analizy ilościowej. Chociaż w naszym badaniu użyliśmy analizatora o wysokiej zawartości, każdy system odwróconego mikroskopu zdolny do akwizycji wielopunktowej można sparować z metodami, o których mowa w niniejszym dokumencie.
Podobne wyniki można uzyskać przy użyciu odwróconego mikroskopu konfokalnego z możliwością akwizycji wielopunktowej; Jednak zalety analizatora o wysokiej zawartości pojawiają się, gdy zwiększa się wielkość próby w celu zbadania pytań, które wymagają mniejszej rozdzielczości w czasie. Oczywistą zaletą korzystania z analizatora o wysokiej zawartości jest możliwość jednoczesnego obrazowania 4 oddzielnych slajdów w porównaniu z 1 slajdem w tradycyjnych systemach. Dzięki pełnemu zestawowi 4 szkiełek i 40 zarodków na każdym szkiełku, 160 zarodków można obrazować w ciągu kilku godzin, o ile odstęp między klatkami wynosi co najmniej 15 minut. Kolejną ważną zaletą korzystania z analizatora o wysokiej zawartości jest to, że próbki są całkowicie odizolowane od wszelkich zewnętrznych źródeł światła, co jest niezbędne do pomiarów opartych na intensywności fluorescencji. Wreszcie, analizator o wysokiej zawartości zastosowany w naszym badaniu ma 5,5-megapikselową kamerę CMOS, która zapewnia duże pole widzenia 221,87 μm przy 60-krotnym powiększeniu. To większe pole widzenia umożliwiło nam zobrazowanie połowy zarodka w każdym punkcie akwizycji.

W ciągu ostatnich 30 lat, postęp w technologiach obrazowania i sondach molekularnych do obrazowania żywych komórek poszerzył nasze zrozumienie złożoności i wewnętrznego funkcjonowania komórki. Postępowi technologicznemu towarzyszy większe uzależnienie od modeli hodowli komórkowych ex vivo w celu pozyskiwania danych obrazowych o wysokiej przepustowości. Modele hodowli komórkowych zapewniają szereg korzyści, w tym kontrolę mikrośrodowiska za pomocą systemów mikroprzepływowych oraz możliwość jednoczesnego obrazowania wielu komórek, co umożliwia stosowanie podejść ilościowych niezbędnych do wysokoprzepustowych badań przesiewowych1,2. Istnieją jednak również istotne wady związane z modelami hodowli komórkowych w kontekście badań morfologicznych, takie jak dwuwymiarowe powierzchnie szklane lub plastikowe powodujące zakłócający wpływ na morfologię komórki i jej regulację3,4,5. Efekty te mogą dostarczyć fałszywych lub wprowadzających w błąd danych w odniesieniu do badania procesów biologicznych regulujących morfologię komórkową.
Chociaż alternatywą było badanie morfologii komórek w kontekście nienaruszonego organizmu6, niewiele odpowiednich nienaruszonych organizmów umożliwia wysokoprzepustowe ilościowe obrazowanie żywych komórek ze względu na trudności w utrzymaniu całych organizmów przy życiu poprzez obrazowanie zewnętrzne oraz wyzwania związane z obrazowaniem wewnątrz dużego organizmu wielokomórkowego. W rezultacie, badania biologiczne komórek w nienaruszonych organizmach na ogół koncentrowały się na obserwacji pojedynczego organizmu w czasie, co znacznie ogranicza wielkość próby. Ponadto to ograniczenie "jedno zwierzę na raz" sprawia, że obrazowanie na żywo w formie ekranu jest trudne i kosztowne, a także ogranicza możliwość zastosowania ilościowych narzędzi analitycznych, ponieważ liczba próbek jest na ogół zbyt mała. W związku z tym pojawia się zapotrzebowanie na wielokomórkowy organizm modelowy, który może być wykorzystany do podejść ilościowych opartych na wysokiej zawartości.
Ten protokół dostosowuje zarodek Drosophila do obrazowania na płytkach o wysokiej zawartości, aby wygenerować eksperymentalne rozmiary próbek wystarczająco duże do analizy ilościowej. Drosophila melanogaster jest powszechnie znana jako pierwszy organizm modelowy. Badania z wykorzystaniem Drosophila doprowadziły do przełomowych odkryć w biologii komórkowej i molekularnej, w tym w przekazywaniu informacji genetycznej, identyfikacji szlaków sygnalizacji komórkowej i genetycznych wymaganiach rozwoju embrionalnego7,8,9. Ponadto zarodek Drosophila został wykorzystany do zbadania in vivo dynamiki mikrotubul podczas podziału komórkowego10,11,12. Zastosowanie mikroiniekcji do dostarczania małych cząsteczek i sond molekularnych zapewnia kontrolę czasową, która sprawia, że rozwój embrionalny Drosophila jest szczególnie skuteczny w badaniu procesów komórkowych in vivo13,14. Jednak generowanie znacznej liczby powtórzeń eksperymentalnych przy użyciu tradycyjnego podejścia do obrazowania jest niezwykle pracochłonne i ma ograniczone zastosowanie w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych i analizach ilościowych. Nasze podejście wykorzystuje analizator o wysokiej zawartości, zwykle zarezerwowany do analizy pojedynczych komórek i dostosowuje analizę obrazowania in vivo w syncytium wczesnego Drosophila embryo.
Ten protokół został użyty do pobrania, etapowania i mikroiniekcji zarodków Drosophila w celu zbadania mechanizmów, które napędzają zmiany morfologiczne w retikulum endoplazmatycznym (ER) podczas mitozy15. Chociaż wiele badań nakreśliło dynamiczną naturę ER podczas cyklu komórkowego16,17,18,19, trudno było porównać wpływ wielu zaburzeń w czasie na morfologię ER. Aby zidentyfikować komponenty, które napędzają zmiany w morfologii ER podczas podziału komórki, metody wymienione w tym protokole wykorzystano do zbadania roli mikrotubul i innych czynników cytoszkieletu w mitotycznej reorganizacji ER przy użyciu korowego podziału syncytialnego we wczesnym zarodku Drosophila. Podsumowując, dostępność zaburzeń genetycznych w społeczności Drosophila, możliwość mikroiniekcji leków i sond molekularnych w precyzyjnych momentach rozwoju oraz niedrogie koszty pracy z Drosophila sprawiają, że podejście to jest wysoce podatne na wysokoprzepustowe badania przesiewowe oparte na obrazach. Opisane tutaj metody mają zastosowanie do badania szerokiej gamy procesów komórkowych i rozwojowych in vivo przy użyciu klasy Drosophila embryo<sup="xref">20. W szczególności protokół ten jest dobrze przystosowany do badania zdarzeń biologicznych, które zachodzą w dłuższym okresie i w promieniu 100 mikronów od kory zarodka Drosophila.

<table><tbody><tr><td>10 x 35 mm Micro Dish</td><td>VWR</td><td>Cat #: 10799-192</td><td>N/A</td></tr><tr><td>100% koncentrat soku winogronowego</td><td>Welch's, 100% koncentrat soku winogronowego</td><td>Nie dotyczy</td><td>Kup w sklepie spożywczym</td></tr><tr><td>Kolby Erlenmeyera 250 ml, wąskie usta</td><td>VWR</td><td>Nr kat. #: 10536-914</td> Nie <td>dotyczy</td></tr><tr><td>3-calowe niemetalowe sito nr 140</td><td>Gilson Company</td><td>SV-165 #140</td><td>Nie dotyczy</td></tr><tr><td>4 slajdów Obrazowanie Taca</td><td>Grace Biolabs</td><td>SKU: 400104</td><td>N/A</td></tr><tr><td>ACROS Organics , n-Heptane, 99+%, do spektroskopii</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat #: AC411255000</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Acros Organics, Etanol, 99.5%, Odczynnik ACS, bezwzględny, 200 proof</td><td>Fisher Scientific Cat</td><td># : AC615095000</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Acros Organics, 4-hydroksybenzoesan metylu, 99% . (metyloparaben )</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat#: AC126961000</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe, prostokątne, 25 x 75mm, #1 Szkło float</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat #: 50-143-782</td> Nie <td>dotyczy</td></tr><tr><td>Materiał silikonowy Culture Well - grubość 1,6 mm</td><td>Grace Biolabs</td><td>SKU: 664273</td><td>Nie dotyczy</td></tr><tr><td>DWK Life Sciences Wheaton 20 ml Fiolki scyntylacyjne z płynem PET</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat #: 03-341-71A Nie</td><td>dotyczy</td></tr><tr><td>Klatka do pobierania zarodków-Mini</td><td>Genesee Scientific</td><td>Cat #: 59-105</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet Eppendorf Microloader</td><td>Fisher</td><td>Scientific Kod produktu: 10289651</td><td>Nie dotyczy</td></tr><tr><td>Wirówka stożkowa Falcon 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat #: 05-527-90</td> Nie <td>dotyczy</td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat #: 14-432-22</td><td>Nie dotyczy</td></tr><tr><td>Fleischmann's, Aktywne suche drożdże</td><td>Fleischmann's</td><td>N/A</td><td>Zakup w sklepie spożywczym</td></tr><tr><td>Talerze winogronowe</td><td>ODNIESIENIE DO PRZYGOTOWANIA RECEPTURY</td><td>NIE</td><td>DOTYCZY NIE DOTYCZY</td></tr><tr><td>Olej Halocarbon 27 Genesee</td><td>Scientific</td><td>Cat #: 59-133</td><td>Nie dotyczy</td></tr><tr><td>Olej Halocarbon 700</td><td>Genesee Scientific</td><td>Cat #: 59-131</td><td>Nie dotyczy</td></tr><tr><td>Klej heptanowy</td><td>ODNOSI SIĘ DO PRZYGOTOWANIA RECEPTURY</td><td>NIE</td><td>DOTYCZY NIE DOTYCZY</td></tr><tr><td>Przemysłowe żyletki (chirurgiczna stal węglowa) Jednosieczne nr 9</td><td>VWR</td> Nr kat. <td>#: 55411-050</td><td>Nie</td></tr> dotyczy <tr><td>Parafilm M Laboratoryjna folia uszczelniająca, rolka 4 cale x 250 stóp</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat #: 50-998-944</td> N<td>/A</td></tr><tr><td>Taśma dwustronna szkocka z dyspenserem, wąska szerokość, zaprojektowana do klejenia, 1/2" x 7 jardów, 3 w opakowaniu Caddy</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat #: NC0879005</td><td>Nie dotyczy</td></tr><tr><td>Kulki żelu krzemionkowego, środek osuszający ~ 2 - 5 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>SKU: 1077351000</td> Nie <td>dotyczy</td></tr><tr><td>łyżki/szpatułki ze stali nierdzewnej</td><td>VWR</td><td>Nr kat. #: 470149-044</td><td>Nie dotyczy</td></tr><tr><td>WA Hammond Drierite Wskazujące absorbenty</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat #: 23-116582</td> Nie <td>dotyczy</td></tr><tr><td>Pasta drożdżowa</td><td>REFFER TO PRZYGOTOWANIE RECEPTURY</td><td>NIE</td><td>DOTYCZY NIE DOTYCZY NIE DOTYCZY</td></tr> <tr><td>NIE DOTYCZY NIE DOTYCZY EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-12 Wirówka, Wirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td>N/A</td><td>Potrzebny będzie dostęp do stożkowych wkładów wirówkowych o pojemności 15 ml.</td></tr><tr><td>Autoklaw</td><td>NIE DOTYCZY</td><td></td><td>NIE DOTYCZY Każdy autoklaw poradzi sobie dobrze.</td></tr><tr><td>Mikrowtryskiwacz Drummond Nanoject II.</td><td>Drummond Scientific</td><td>N/A</td><td>Jest to system wtryskowy na bazie oleju mineralnego.</td></tr><tr><td>Analizator komórek GE Healthcare IN 6000.</td><td>GE healthcare</td><td>N/A</td><td>Można zastąpić go szybkim mikroskopem konfokalnym zdolnym do akwizycji wielopunktowej.</td></tr><tr><td>Lodówka (4C&deg;)</td><td>N/A</td><td>N/D</td><td>Pożywka przeciw muchom i pasta drożdżowa muszą być przechowywane w temperaturze (4C&deg;).</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy Zies Stemi 508 z podstawą transillumination 300 i górnym oświetleniem na gęsiej szyi.</td><td>Zeiss Microscopy</td><td>N/A</td><td>Niezbędna jest podstawa transillumination i oświetlenie na gęsiej szyi.</td></tr></tbody></table>

przygotowanie zarodków drosophila i mikroiniekcja do mikroskopii żywych komórek wykonana przy użyciu automatycznego analizatora o wysokiej zawartości

Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer

Nowoczesne podejścia do ilościowego obrazowania żywych komórek stały się podstawowym narzędziem do badania biologii komórki, umożliwiając wykorzystanie statystyk i modelowania komputerowego do klasyfikowania i porównywania procesów biologicznych. Chociaż systemy modelowania kultur komórkowych doskonale nadają się do obrazowania o wysokiej zawartości, wysokoprzepustowe badania morfologii komórek sugerują, że hodowle ex vivo są ograniczone w rekapitulacji złożoności morfologicznej komórek w organizmach żywych. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na skalowalny system modelowy o wysokiej przepustowości do obrazowania żywych komórek w nienaruszonym organizmie. Opisano tutaj protokół korzystania z analizatora obrazu o wysokiej zawartości w celu jednoczesnego pozyskiwania wielu filmów poklatkowych przedstawiających rozwój embrionalny Drosophila melanogaster w stadium blastodermy syncytialnej. Blastoderma syncytialna tradycyjnie służyła jako doskonały model in vivo do obrazowania zdarzeń biologicznych; Jednak uzyskanie znacznej liczby powtórzeń eksperymentalnych dla podejść ilościowych i wysokoprzepustowych było pracochłonne i ograniczone przez obrazowanie pojedynczego zarodka na powtórzenie eksperymentalne. Przedstawiono tutaj metodę adaptacji metod obrazowania i mikroiniekcji do systemu obrazowania o wysokiej zawartości lub dowolnego mikroskopu odwróconego zdolnego do automatycznej akwizycji wielopunktowej. Takie podejście umożliwia jednoczesne pozyskanie 6-12 zarodków, w zależności od pożądanych czynników akwizycji, w ramach jednej sesji obrazowania.

Podejście przedstawione w niniejszym protokole zostało wykorzystane do zbadania roli mikrotubul w reorganizacji siateczki śródplazmatycznej (ER) podczas mitozy w zarodku Drosophila15. Podczas mitozy struktura ER ulega gwałtownej reorganizacji, jednak siły napędzające te zmiany nie są dobrze poznane. Niedawno wykazano, że rodzina białek kształtujących ER promuje tworzenie się cewek ER25,26,27,28, które charakteryzują się bliskim sąsiedztwem mikrotubul28. Aby zbadać wpływ mikrotubul na morfologię ER, metody opisane w protokole posłużyły do wygenerowania danych pozwalających na ilościowe porównanie efektów kilku kuracji lekami wprowadzonymi drogą mikroiniekcji na reorganizację ER podczas mitozy. Stwierdzono, że kolchicyna, która zapobiega polimeryzacji nowych mikrotubul, drastycznie ogranicza reorganizację ER podczas mitozy, co przedstawiono na Rysunku 5 i Rysunku 6. Ponadto opisane tutaj podejście umożliwiło uzyskanie danych z obrazowania poklatkowego dla 32 zarodków. Pomiary średniej i maksymalnej intensywności wykonano dla 12 80 obszarów zainteresowania (ROI) przy użyciu specjalnego skryptu MATLAB, który wygenerował również statystyki opisowe i wnioskowanie statystyczne niezbędne do porównania efektów poszczególnych leków. Dzięki dostępności sond molekularnych i łatwości przeprowadzania mikroiniekcji, opisane tutaj metody można łatwo dostosować do badania różnych procesów biologicznych poprzez ilościowe oznaczanie intensywności fluorescencji.
<img alt="Proces mikroskopii fluorescencyjnej, Rtn1-GFP, ReepB-GFP, analiza intensywności, eksperyment obrazowania komórkowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61589/61589fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Reprezentatywne obrazy wzbogacenia Rtnl1-GFP i ReepB-GFP w biegunach wrzeciona podczas mitozy. (A) pole widzenia 60x dla ReepB-GFP podczas mitozy w 10. cyklu komórkowym. Niebieski kwadrat reprezentuje pole widzenia wykorzystane w panelach B-E. Panel A został przetworzony za pomocą binarnego filtra progowego. Filtr ten nie został zastosowany w panelach B-E, ponieważ wyklucza on dane z pikseli znajdujących się poniżej ustawionego progu. (B,D) ReepB-GFP w grupie kontrolnej oraz w grupie z kolchicyną. (C,E) Rtnl1-GFP w grupie kontrolnej oraz po zastosowaniu kolchicyny. Rycina ta została zmodyfikowana na podstawie pracy Diaz i wsp.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61589/61589fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Intensywność fluorescencji Rtn1-GFP vs. ReepB-GFP; wykres liniowy; traktowanie 10 µM DMSO, 5 µM kolchicyną." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61589/61589fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Ilościowe oznaczenie wzbogacenia Rtnl1-GFP i ReepB-GFP w biegunach wrzeciona podczas mitozy. W przypadku 32 embrionów w następujących warunkach przeanalizowano po 20 ROI wrzecion i 20 ROI cytoplazmy w obrębie 10 klatek. (A) wstrzyknięcia kontrolne 10% DMSO dla Rtnl1-GFP. Zarodki kontrolne wykazały 0,1-krotny wzrost wzbogacenia (p&lt;0,01 dla wszystkich próbek w T210) w porównaniu z próbkami niepoddanymi iniekcji (p &lt; 0,01 dla wszystkich próbek przy T210). (B) embriony ReepB-GFP wstrzyknięte z 10% DMSO w celu posłużenia jako grupa kontrolna. Embriony kontrolne wykazały 0,1-krotny wzrost wzbogacenia (p&lt;0,01 dla wszystkich próbek w T210) w porównaniu z próbkami niepoddanymi wtryskowi (Rysunek 1E; p &lt; 0,01 dla wszystkich próbek w T210). (C) zarodki Rtnl1-GFP wstrzyknięte z 5 μM Kolchicyna. W tym przypadku zmierzono spadek wzbogacenia Rtnl1-GFP w wrzecionach (p &lt; 0,01 dla wszystkich próbek w T210) w porównaniu z kontrolami (A) (p &lt; 0,01 dla wszystkich próbek przy T210). (D) embriony ReepB-GFP po wstrzyknięciu 5 μM Kolchicyna. Odnotowaliśmy zmniejszenie wzbogacenia ReepB-GFP w wrzecionach (p&lt;0,01 dla wszystkich próbek w T210) w porównaniu z grupami kontrolnymi (B) (p&lt;0,01 dla wszystkich próbek w T210). Rycina ta została zmodyfikowana na podstawie pracy Diaz i wsp.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61589/61589fig6large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić tę figurę w większym rozmiarze, kliknij tutaj.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1. Pasta drożdżowa21</td>
			<td>2. Płytki z winogron21</td>
			<td>3. Klej heptanowy24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.1 Do probówki stożkowej o pojemności 50 ml dodać 7 gramów aktywnych suchych drożdży. Dodać 9 mililitrów wody dejonizowanej i wymieszać metalną szpatułką do uzyskania jednorodnej konsystencji.</td>
			<td>2.1 Przygotowanie roztworu a: Do kolby o pojemności 250 ml należy dodać 6 g agaru do 140 ml wody dejonizowanej (DI), a następnie poddać autoklawowaniu.</td>
			<td>3.1 Wypełnić szklaną fiolkę scyntylacyjną 50 calami taśmy dwustronnej.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.1 Do probówki stożkowej o pojemności 50 ml należy dodać 7 g aktywnych suchych drożdży. Dodać 9 ml wody dejonizowanej (DI) i wymieszać metalną szpatułką do uzyskania jednorodnej konsystencji.</td>
			<td>2.2 Przygotowanie roztworu b: Wymieszać 0,1 g metyloparabenu w 2 ml etanolu, a następnie dodać ten roztwór do 60 ml koncentratu soku z grejpfruta.</td>
			<td>3.2 Dodać 20 ml heptanu i zamknąć szklaną fiolkę scyntylacyjną za pomocą parafilmu. Inkubować w rotatorze przez noc w temperaturze pokojowej.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.3 Bezpośrednio po autoklawowaniu roztworu a, dodać roztwór b i wlać mieszaninę do szalek Petriego o średnicy 10 x 35 mm. (pozwala to na przygotowanie 35 płytek z winogronem)</td>
			<td>3.3 Usunąć resztki plastikowej taśmy, przenosząc klej do dwóch probówek stożkowych o pojemności 15 ml i wirując przy 300 obr./min przez 15 minut.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.4 Pozostaw płytki z agarosem z winogronami w temperaturze pokojowej na całą noc z otwartymi pokrywkami, aby stężały. Przykryj płytki pokrywkami i przechowuj w temperaturze 4°C.° po ich zastygnięciu.</td>
			<td>3.4 Przenieść nadsącz z kleju do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml w celu przechowywania.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Składy pożywek i roztworów.

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji i jednoczesnego obrazowania wielu zarodków Drosophila podczas rozwoju embrionalnego za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości na płytce.

Przygotowanie zarodków Drosophila i mikroiniekcja do mikroskopii żywych komórek wykonana przy użyciu automatycznego analizatora o wysokiej zawartości

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and ...

Protokół ten umożliwia jednoczesne pozyskanie wielu zarodków w ramach jednej sesji obrazowania. Podczas gdy przygotowanie próbek jest przystosowane do akwizycji wielopunktowej przy użyciu analizatora o wysokiej zawartości, próbki przygotowane przy użyciu tego protokołu można obrazować na dowolnym mikroskopie odwróconym zdolnym do akwizycji wielopunktowej. Na początek ułóż dwa rzędy po 15 do 20 zarodków na czystej części wielkiego talerza za pomocą narzędzia do zbierania jajek.Ustaw zarodki po ich stronie brzusznej w tej samej orientacji w stosunku do przedniego i tylnego końca. Przyklej przekładkę do szkiełka nakrywkowego i rozprowadź 10 mikrolitrów kleju heptanowego po odsłoniętej wstawce szkła nakrywkowego. Gdy klej wyschnie, użyj żyletki, aby wyciąć prostokąt wokół dwóch rzędów zarodków.Wytnij drugi prostokąt obok pierwszego i usuń drugi prostokąt za pomocą szpatułki ze stali nierdzewnej o prostej krawędzi. Ostrożnie wsuń prostą krawędź szpatułki pod pierwszy prostokąt i usuń ją. Następnie umieść wycięcie z zarodkami na zewnętrznej stronie 3,5 centymetrowej naczynia.Pod mikroskopem stereoskopowym opuść przygotowane szkiełko nakrywkowe na zarodki i delikatnie dociśnij dwa rzędy zarodków do kleju. Jeśli nie wykonujesz mikroiniekcji, wypełnij silikonową przekładkę do połowy drogi do góry olejem halowęglowym jeden do jednego od 700 do oleju halowęglowego 27. Wyłóż dolne krawędzie czterosuwakowego adaptera płytowego taśmą dwustronną.Zapobiegnie to przesuwaniu się szkiełka podczas obrazowania. Upewnij się, że nie umieszczasz taśmy na drodze soczewki obiektywu. Zamontuj szkiełko nakrywkowe na czterosuwakowym adapterze płyty.W przypadku mikroiniekcji zarodków należy umieścić szkiełko nakrywkowe z zarodkami na szkiełku, aby zapobiec zabrudzeniu dolnej części szkiełka nakrywkowego podczas wysuszania i mikroiniekcji. Osuszaj zarodki przez pięć do 10 minut, a następnie natychmiast przykryj je olejem halowęglowym jeden do jednego od 700 do oleju halowęglowego 27, wypełniając silikonową przekładkę do połowy do góry. Załadować dwie lub trzy igły do mikroiniekcji około dwoma mikrolitrami środka do wstrzykiwań za pomocą przedłużonej końcówki ładującej.Zamontuj igłę na mikrowtryskiwaczu i wciśnij tłok do połowy końcówki, zwiększając ciśnienie powietrza wewnątrz szklanej kapilary. Opuść szklaną igłę na szklane szkiełko i odetnij końcówkę igły nową brzytwą numer dziewięć, tnąc pod kątem 45 stopni, aby uzyskać ostrą, otwartą końcówkę. Wstrzykiwacz powinien spływać na dno końcówki, nie wypływając z igły.Ostrożnie dodaj 20 mikrolitrów oleju halowęglowego na końcówkę igły i ponownie ją przetnij, otwórz pod kątem 45 stopni. Wstrzykiwacz powinien zacząć szybko płynąć, więc pamiętaj o regulacji ciśnienia poprzez cofnięcie tłoka. Użyj mikromanipulatora, aby ustawić igłę w środku pola widzenia.Następnie podnieś igłę i wyjmij spod niej szkiełko szkiełkowe. Umieść zarodki na stoliku mikroskopu stereoskopowego, pod igłą do mikroiniekcji i skup się na nich w 50-krotnym powiększeniu. Opuścić igłę, aż znajdzie się w tej samej płaszczyźnie ostrości co zarodki.Przesuwając szkiełko jedną ręką i obsługując mikrowstrzykiwacz drugą wstrzyknąć jeden rząd zarodków. Podnieś igłę i obróć szkiełko o 180 stopni, aby wystawić drugi rząd zarodków na działanie igły do mikroiniekcji. Opuścić igłę i wstrzyknąć drugi rząd zarodków.Protokół ten wykorzystano do zbadania roli mikrotubul w reorganizacji retikulum endoplazmatycznego podczas mitozy w zarodku Drosophila. Ilościowo porównano wpływ kilku terapii mikroiniekcyjnych leków na reorganizację ER. Stwierdzono, że kolchicyna, która zapobiega polimeryzacji nowych mikrotubul, drastycznie zmniejsza lokalizację ER do biegunów wrzeciona podczas mitozy.Dane z obrazowania poklatkowego uzyskano dla 32 zarodków. Pomiary średniej i maksymalnej intensywności zostały przeanalizowane z 12 800 obszarów zainteresowania przy użyciu niestandardowego skryptu MATLAB. Próbując tego protokołu po raz pierwszy, pamiętaj, aby nie zajmować zbyt dużo czasu na żadnym kroku, w przeciwnym razie ryzykujesz, że przegapisz etap rozwoju, który chcesz zobrazować.Przećwicz ten protokół krok po kroku przed przystąpieniem do jakichkolwiek eksperymentów. Nasza metoda przygotowania próbek umożliwia jednoczesne pozyskanie wielu zarodków podczas jednego eksperymentu, generując w ten sposób wystarczającą liczbę powtórzeń eksperymentalnych do analizy ilościowej. Protokół ten może pomóc w przejściu embriologii rozwojowej z eksperymentów obrazowania jakościowego na ilościowe.Możliwość obrazowania wielu zarodków w ramach jednej sesji obrazowania eliminuje również szum eksperymentalny między powtórzeniami.

drosophila-embryo-preparation-microinjection-for-live-cell-microscopy

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Przedstawiono prostą, niedrogą i skuteczną metodę przygotowania embrionów Drosophila do analizy za pomocą obrazowania na żywo. Nasz protokół zapewnia wilgotność i wymianę gazową oraz nie powoduje kompresji embrionu Drosophila. Metoda ta jest odpowiednia do obrazowania na żywo embrionów Drosophila w oparciu o GFP z wykorzystaniem stereomikroskopu lub pionowego mikroskopu złożonego.

Przygotowanie zarodków Drosophila do obrazowania na żywo z wykorzystaniem protokołu wiszącej kropli

Niniejszy protokół opisuje zastosowanie mikroiniekcji i obrazowania o wysokiej rozdzielczości w zarodku syncytialnym Drosophila melanogaster w celu badania mitozy.

Techniki mikroiniekcji do badania mitozy w embrionie syncytialnym Drosophila melanogaster

Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster

Komora jajowa Drosophila stanowi doskonały model do badania mechanizmów lokalizacji mRNA. Aby uchwycić dynamiczne zdarzenia leżące u podstaw procesów lokalizacji, wymagane jest szybkie obrazowanie tkanek żywych w wysokiej rozdzielczości. W niniejszym materiale przedstawiamy protokół preparatyki i obrazowania żywych próbek przy minimalnej ingerencji w ich strukturę.

Przygotowanie pojedynczych komór jajeczkowych Drosophila do obrazowania na żywo

Kinetochor jest miejscem, w którym SAC inicjuje swój sygnał monitorujący segregację mitotyczną siostrzanych chromatyd. Opisano metodę wizualizacji rekrutacji i wymiany jednego z białek kinetochoru oraz jej koordynacji z ruchem chromosomów w embrionach Drosophila przy użyciu laserowego skanującego systemu konfokalnego Leica.

Badanie punktu kontrolnego mitozy poprzez obrazowanie dynamicznego zachowania białek kinetochorowych i ruchu chromosomów w żywych zarodkach syncytialnych Drosophila

Ten film opisuje, jak wykonywać mikrozastrzyki, które dostarczają odczynniki do żywych zarodków Drosophila. Naukowcy mogą wykorzystać tę metodę do wprowadzenia związków egzogennych, takich jak kwasy nukleinowe i białka, we wczesnych stadiach rozwoju zarodka. Przedstawiony protokół pokazuje, jak skonfigurować i wykonać procedurę wstrzykiwania dowolnego rozpuszczalnego odczynnika - w tym przypadku białka fluorescencyjnego do eksperymentów z obrazowaniem na żywo.

Mikroiniekcja żywych zarodków Drosophila: wczesne dostarczenie odczynników do rozwijającego się zarodka

Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych jest najcenniejszym narzędziem w biologii rozwoju. Głównym problemem w badaniach porównawczych jest wariancja otoczenia. Nasz protokół opisuje eksperymentalne ramy do jednoczesnego obrazowania na żywo wielu próbek i dlatego aktywnie rozwiązuje ten problem.

Jednoczesne obrazowanie na żywo wielu zarodków owadów w mikroskopach fluorescencyjnych z arkuszami świetlnymi w komorze na próbki

We wczesnym zarodku Drosophila wiele organelli jest ruchliwych. Zasadniczo można je obrazować na żywo za pomocą specjalnych sond fluorescencyjnych, ale skorupka jaja uniemożliwia bezpośrednie zastosowanie do zarodka. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wprowadzić takie sondy za pomocą mikroiniekcji, a następnie analizować ruch organelli masowych za pomocą prędkości obrazu cząstek.

Wizualizacja zależnego od cytoszkieletu transportu organelli zawierających lipidy w zarodkach Drosophila

Kurczliwość aktomyozyny odgrywa ważną rolę w morfogenezie komórek i tkanek. Jednak trudno jest dokładnie manipulować kurczliwością aktomiozyny in vivo. Protokół ten opisuje system optogenetyczny, który szybko hamuje kurczliwość aktomiozyny za pośrednictwem Rho1 w zarodkach Drosophila, ujawniając natychmiastową utratę napięcia nabłonka po inaktywacji aktomiozyny in vivo.

Optogenetyczne hamowanie kurczliwości aktomyozyny za pośrednictwem Rho1 w połączeniu z pomiarem napięcia nabłonka w zarodkach Drosophila

Ten protokół opisuje spersonalizowane znakowanie fluorescencyjne oparte na przeciwciałach i wstrzykiwanie do wczesnych zarodków Drosophila, aby umożliwić obrazowanie na żywo białek o niskiej obfitości lub modyfikacji potranslacyjnych, które są trudne do wykrycia przy użyciu tradycyjnych metod GFP/mCherry-tag.

Wizualizacja białek o niskiej liczebności i modyfikacji potranslacyjnych w żywych zarodkach Drosophila poprzez wstrzyknięcie przeciwciał fluorescencyjnych

Poznaj metodę mikroiniekcji i obrazowania zarodków Drosophila przy użyciu analizatora o wysokiej zawartości. Technika umożliwia jednoczesne pozyskiwanie wielu zarodków do ilościowej analizy rozwoju.

Przygotowanie zarodków Drosophila i mikroiniekcja do mikroskopii żywych komórek wykonana przy użyciu automatycznego analizatora o wysokiej zawartości (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie zarodków Drosophila i mikroiniekcja do mikroskopii żywych komórek wykonana przy użyciu automatycznego analizatora o wysokiej zawartości

Przeglądaj więcej filmów