Przygotowanie zarodków Drosophila i mikroiniekcja do mikroskopii żywych komórek wykonana przy użyciu automatycznego analizatora o wysokiej zawartości
19 stycznia 2021
Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji i jednoczesnego obrazowania wielu zarodków Drosophila podczas rozwoju embrionalnego za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości na płytce.
Protokół ten umożliwia jednoczesne pozyskanie wielu zarodków w ramach jednej sesji obrazowania. Podczas gdy przygotowanie próbek jest przystosowane do akwizycji wielopunktowej przy użyciu analizatora o wysokiej zawartości, próbki przygotowane przy użyciu tego protokołu można obrazować na dowolnym mikroskopie odwróconym zdolnym do akwizycji wielopunktowej. Na początek ułóż dwa rzędy po 15 do 20 zarodków na czystej części wielkiego talerza za pomocą narzędzia do zbierania jajek.
Ustaw zarodki po ich stronie brzusznej w tej samej orientacji w stosunku do przedniego i tylnego końca. Przyklej przekładkę do szkiełka nakrywkowego i rozprowadź 10 mikrolitrów kleju heptanowego po odsłoniętej wstawce szkła nakrywkowego. Gdy klej wyschnie, użyj żyletki, aby wyciąć prostokąt wokół dwóch rzędów zarodków.
Wytnij drugi prostokąt obok pierwszego i usuń drugi prostokąt za pomocą szpatułki ze stali nierdzewnej o prostej krawędzi. Ostrożnie wsuń prostą krawędź szpatułki pod pierwszy prostokąt i usuń ją. Następnie umieść wycięcie z zarodkami na zewnętrznej stronie 3,5 centymetrowej naczynia.
Pod mikroskopem stereoskopowym opuść przygotowane szkiełko nakrywkowe na zarodki i delikatnie dociśnij dwa rzędy zarodków do kleju. Jeśli nie wykonujesz mikroiniekcji, wypełnij silikonową przekładkę do połowy drogi do góry olejem halowęglowym jeden do jednego od 700 do oleju halowęglowego 27. Wyłóż dolne krawędzie czterosuwakowego adaptera płytowego taśmą dwustronną.
Zapobiegnie to przesuwaniu się szkiełka podczas obrazowania. Upewnij się, że nie umieszczasz taśmy na drodze soczewki obiektywu. Zamontuj szkiełko nakrywkowe na czterosuwakowym adapterze płyty.
W przypadku mikroiniekcji zarodków należy umieścić szkiełko nakrywkowe z zarodkami na szkiełku, aby zapobiec zabrudzeniu dolnej części szkiełka nakrywkowego podczas wysuszania i mikroiniekcji. Osuszaj zarodki przez pięć do 10 minut, a następnie natychmiast przykryj je olejem halowęglowym jeden do jednego od 700 do oleju halowęglowego 27, wypełniając silikonową przekładkę do połowy do góry. Załadować dwie lub trzy igły do mikroiniekcji około dwoma mikrolitrami środka do wstrzykiwań za pomocą przedłużonej końcówki ładującej.
Zamontuj igłę na mikrowtryskiwaczu i wciśnij tłok do połowy końcówki, zwiększając ciśnienie powietrza wewnątrz szklanej kapilary. Opuść szklaną igłę na szklane szkiełko i odetnij końcówkę igły nową brzytwą numer dziewięć, tnąc pod kątem 45 stopni, aby uzyskać ostrą, otwartą końcówkę. Wstrzykiwacz powinien spływać na dno końcówki, nie wypływając z igły.
Ostrożnie dodaj 20 mikrolitrów oleju halowęglowego na końcówkę igły i ponownie ją przetnij, otwórz pod kątem 45 stopni. Wstrzykiwacz powinien zacząć szybko płynąć, więc pamiętaj o regulacji ciśnienia poprzez cofnięcie tłoka. Użyj mikromanipulatora, aby ustawić igłę w środku pola widzenia.
Następnie podnieś igłę i wyjmij spod niej szkiełko szkiełkowe. Umieść zarodki na stoliku mikroskopu stereoskopowego, pod igłą do mikroiniekcji i skup się na nich w 50-krotnym powiększeniu. Opuścić igłę, aż znajdzie się w tej samej płaszczyźnie ostrości co zarodki.
Przesuwając szkiełko jedną ręką i obsługując mikrowstrzykiwacz drugą wstrzyknąć jeden rząd zarodków. Podnieś igłę i obróć szkiełko o 180 stopni, aby wystawić drugi rząd zarodków na działanie igły do mikroiniekcji. Opuścić igłę i wstrzyknąć drugi rząd zarodków.
Protokół ten wykorzystano do zbadania roli mikrotubul w reorganizacji retikulum endoplazmatycznego podczas mitozy w zarodku Drosophila. Ilościowo porównano wpływ kilku terapii mikroiniekcyjnych leków na reorganizację ER. Stwierdzono, że kolchicyna, która zapobiega polimeryzacji nowych mikrotubul, drastycznie zmniejsza lokalizację ER do biegunów wrzeciona podczas mitozy.
Dane z obrazowania poklatkowego uzyskano dla 32 zarodków. Pomiary średniej i maksymalnej intensywności zostały przeanalizowane z 12 800 obszarów zainteresowania przy użyciu niestandardowego skryptu MATLAB. Próbując tego protokołu po raz pierwszy, pamiętaj, aby nie zajmować zbyt dużo czasu na żadnym kroku, w przeciwnym razie ryzykujesz, że przegapisz etap rozwoju, który chcesz zobrazować.
Przećwicz ten protokół krok po kroku przed przystąpieniem do jakichkolwiek eksperymentów. Nasza metoda przygotowania próbek umożliwia jednoczesne pozyskanie wielu zarodków podczas jednego eksperymentu, generując w ten sposób wystarczającą liczbę powtórzeń eksperymentalnych do analizy ilościowej. Protokół ten może pomóc w przejściu embriologii rozwojowej z eksperymentów obrazowania jakościowego na ilościowe.
Możliwość obrazowania wielu zarodków w ramach jednej sesji obrazowania eliminuje również szum eksperymentalny między powtórzeniami.
Przegląd
Niniejszy protokół umożliwia mikroiniekcję i jednoczesne obrazowanie wielu embrionów Drosophila podczas rozwoju zarodkowego z wykorzystaniem analizatora wysokoprzepustowego (high content imager). Metoda ta ułatwia analizę ilościową, pozwalając na pozyskanie obrazów wielu embrionów w ramach jednej sesji obrazowania.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia rozwoju
- Embriologia
- Techniki obrazowania
Wstęp
- Mikroiniekcja jest kluczową techniką w badaniach nad rozwojem zarodkowym.
- Symultaniczne obrazowanie wielu zarodków zwiększa liczbę powtórzeń eksperymentalnych.
- Analiza ilościowa jest niezbędna do zrozumienia procesów rozwojowych.
- Obrazowanie wysokotreściowe (high-content imaging) pozwala na szczegółową obserwację dynamiki komórkowej.
Cel badania
- Opracowanie protokołu efektywnej mikroiniekcji i obrazowania zarodków Drosophila.
- Ułatwienie ilościowej analizy rozwoju zarodkowego.
- Zbadanie roli mikrotubul w reorganizacji retikulum endoplazmatycznego podczas mitozy.
Zastosowane metody
- Przygotowanie zarodków na szkiełku nakrywce do obrazowania.
- Mikroiniekcja zarodków określonymi substancjami.
- Obrazowanie time-lapse w celu uchwycenia zmian rozwojowych.
- Analiza pomiarów intensywności przy użyciu skryptów MATLAB.
Główne wyniki
- Obróbka kolchicyną znacząco ograniczyła lokalizację ER w obrębie bieguna wrzeciona.
- Dane z obrazowania time-lapse zebrano dla 32 embrionów.
- Przeprowadzono porównania ilościowe dla wielu różnych terapii lekowych.
- Metodyka umożliwia przeprowadzenie solidnych powtórzeń doświadczalnych.
Wnioski
- Niniejszy protokół zwiększa możliwość przeprowadzania ilościowych eksperymentów obrazowania.
- Ułatwia przejście z analizy jakościowej do ilościowej w biologii rozwoju.
- Redukuje szum eksperymentalny poprzez jednoczesne obrazowanie wielu embrionów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wysokoprzepustowe obrazowanie na żywo embrionów Drosophila umożliwia ilościową analizę procesów komórkowych w nienaruszonym organizmie z odpowiednią mocą statystyczną, rozwiązując ograniczenia workflowów ex vivo oraz tych opartych na pojedynczych próbkach. Niniejszy protokół wspiera skalowalną i powtarzalną akwizycję wielu powtórzeń doświadczalnych, co redukuje szum eksperymentalny i zwiększa pewność prognostyczną w badaniach mechanistycznych oraz we wczesnych etapach odkrywania. Podejście to jest bezpośrednio przydatne dla zespołów biofarmaceutycznych poszukujących niezawodnych, wysokoprzepustowych platform obrazowania in vivo do walidacji celów terapeutycznych i badania szlaków sygnałowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia ilościową analizę mechanizmów komórkowych w fizjologicznie istotnym, nienaruszonym systemie.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez umożliwienie manipulacji i obserwacji wielu zarodków jednocześnie.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego dzięki bezpośredniej wizualizacji efektów perturbacji lekowych lub genetycznych.
- Zwiększa pewność prognostyczną poprzez generowanie statystycznie istotnych zbiorów danych z równoległych powtórzeń.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Przygotowuje walidowane, powtarzalne próbki biologiczne do procesów obrazowania wysokotreściowego (high content imaging).
- Standaryzuje orientację i przygotowanie próbek, co wspiera powtarzalność i skalowalność analiz.
- Umożliwia uzyskanie ilościowych, multiparametrycznych odczytów odpowiednich do przesiewania związków chemicznych lub genetycznego.
- Redukuje zmienność między powtórzeniami poprzez obrazowanie wielu embrionów w jednej sesji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia istotny w kontekście choroby model in vivo do oceny odpowiedzi komórkowych na perturbacje.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrywania po walidację przedkliniczną dzięki wsparciu dla ilościowego obrazowania na poziomie organizmu.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o solidne, powtarzalne dane.
- Wspiera identyfikację biomarkerów translacyjnych dzięki wynikom wysokotreściowego obrazowania time-lapse.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół wpisuje się w kontinuum odkryć – od wczesnych badań mechanistycznych po walidację modeli przedklinicznych – wypełniając lukę pomiędzy hodowlami komórkowymi a analizą całego organizmu.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez umożliwienie bezpośredniej obserwacji zdarzeń komórkowych in vivo.
- Screening: Dostarcza gotowe do analizy, powtarzalne próbki do wysokoprzepustowego obrazowania i analizy ilościowej.
- Analityka: Zapewnia ilościowe pomiary intensywności oraz dane z obrazowania poklatkowego, co pozwala na rzetelne porównanie statystyczne warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Odpowiada wymaganiom modeli przedklinicznych, umożliwiając obrazowanie i manipulacje na poziomie całego organizmu.
- Zastosowania w przedsiębiorstwach: Oferuje skalowalny i adaptowalny schemat postępowania dla różnorodnych zastosowań mechanistycznych i screeningowych w zespołach badawczo-rozwojowych (R&D).
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje i skaluje przygotowanie próbek oraz obrazowanie, poprawiając powtarzalność i przepustowość.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie lepszych decyzji go/no-go oraz zwiększa efektywność kapitałową poprzez generowanie solidnych, ilościowych zbiorów danych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów badawczych w oparciu o wysokoprzepustowe dane in vivo.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w obchodzeniu się z embrionami, mikroiniekcji oraz obsłudze aparatury do obrazowania wysokotreściowego.
- Niezbędny jest dostęp do mikroskopów odwróconych z automatycznym systemem akwizycji wielopunktowej oraz kompatybilnego oprogramowania analitycznego.
- Wymagana jest standaryzacja przygotowania próbek i protokołów obrazowania między zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Metoda jest adaptowalna do innych systemów modelowych o podobnych etapach rozwoju i wymaganiach dotyczących obrazowania.
- Kluczowe znaczenie mają czas i sposób obchodzenia się z próbkami dla zachowania wierności etapu rozwojowego oraz jakości danych.
