Name: Fotoimmunoterapia w bliskiej podczerwieni w mysich modelach rozsiewu opłucnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 39 s
Description: Poznaj metodę oceny skuteczności fotoimmunoterapii w bliskiej podczerwieni w mysim modelu rozsiewu opłucnej przy użyciu bioluminescencyjnego obrazowania nowotworów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Brak

Wszystkie eksperymenty in vivo zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zasobów zwierząt laboratoryjnych Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Nagoya (zatwierdzenie #2017-29438, #2018-30096, #2019-31234, #2020-20104). Sześciotygodniowe homozygotyczne atymiczne nagie myszy zostały zakupione i utrzymywane w Centrum Zwierząt Uniwersytetu Nagoya. Podczas wykonywania zabiegu u myszy znieczulono je izofluranem (wprowadzenie: 4-5%, utrzymanie 2-3%); Łapa została przyciśnięta pęsetą, aby potwierdzić głębokość znieczulenia.
1. Koniugacja IR700 z mAb
<ol>
	<li>Inkubować mAb (1 mg, 6,8 nmol) z estrem IR700 NHS (66,8 mg, 34,2 nmol, 5 mmol/L w DMSO) w 0,1 mol/L Na2HPO4 (pH 8,6) w temperaturze 15-25 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Oczyścić mieszaninę za pomocą kolumny (np. Sephadex). Przygotować i umyć kolumnę PBS. Następnie nałóż mieszaninę na kolumnę i zbierz kroplę, która zawiera oczyszczone przeciwciało sprzężone z IR700. To przeciwciało sprzężone z IR700 jest określane jako koniugat fotouczulacza przeciwciała (APC).</li>
	<li>Zmierz stężenie białka i IR700 w APC.
	<ol>
		<li>Przygotuj krzywe kalibracyjne dla białka i IR700 za pomocą spektrofotometru.</li>
		<li>Zmieszać standardowe stężenia albuminy z zestawem do oznaczania białek zgodnie z protokołem zestawu (patrz Tabela materiałów, Barwienie białek Coomassie Brilliant Blue (CBB)). Zmierzyć absorbancję albuminy przy długości fali 595 nm i wykreślić krzywą kalibracyjną (wzór na przybliżenie liniowe) dla białka, stosując następujące równanie: y = ax + b (x: stężenie, y: absorbancja).</li>
		<li>Uzyskać krzywe kalibracyjne dla IR700 z absorpcją przy 690 nm, stosując tę samą procedurę. Standardowe stężenie IR700 jest zalecane na poziomie 0,1-5 μM (0,1954-9,77 μg/ml).</li>
		<li>Zmierzyć stężenie białka i stężenie IR700 w APC za pomocą krzywej kalibracyjnej [x = (y-b)/a (x: stężenie, y: absorbancja)].</li>
		<li>Określić liczbę barwników IR700 związanych na mAb z wynikami stężenia molowego. 
		UWAGA: Ważne jest, aby określić optymalną liczbę koniugacji cząsteczek IR700 na cząsteczkę mAb. Ogólnie rzecz biorąc, około trzech cząsteczek IR700 związanych na jednej cząsteczce mAb byłoby skuteczne zarówno in vitro, jak i in vivo. Wiele IR700 związanych na przeciwciało (np. sześć) ułatwia uwięzienie w wątrobie podczas eksperymentów in vivo. Stosunek przeciwciał związanych z IR700 mieścił się w zakresie 1:2-1:4. W razie potrzeby zmniejszono udział IR700</li>.
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonać elektroforezę w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE) jako potwierdzenie powstania APC. Zobrazuj żel przy długości fali 700 nm za pomocą obrazownika fluorescencyjnego i wybarwić białko w żelu za pomocą zestawu do barwienia białek zgodnie z protokołem zestawu (patrz Tabela materiałów, Barwienie białek CBB).</li>
</ol>
2. Generowanie modelu rozsiewu opłucnej
<ol>
	<li>Przygotować komórki docelowe wykazujące ekspresję lucyferazy i zawiesić 1,0 × 106 komórek docelowych w 100 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) 
	UWAGA: Komórki raka klatki piersiowej, takie jak rak płuc i MPM, są odpowiednie jako komórki docelowe. Komórki wykazujące ekspresję lucyferazy przygotowano poprzez transfekcję genu lucyferazy, a wysoką ekspresję lucyferazy potwierdzono po > 10 pasażach komórkowych. Komórki hodowano w pożywce uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą oraz penicyliną (100 j.m./ml) i streptomycyną (100 mg/ml). Liczbę komórek dostosowano w zależności od tempa wzrostu guza i czasu trwania leczenia (1,0. × 10 5-6,0 × 106 komórek/masę ciała).</li>
	<li>Przygotuj 8-12-tygodniowe samice homozygotycznych atymicznych nagich myszy o preferowanej masie ciała 19-21 g.</li>
	<li>Znieczulić myszy podczas zabiegu izofluranem (wprowadzenie: 4-5%, utrzymanie 2-3%); dociśnij ogon pęsetą, aby potwierdzić, że nie ma reakcji.</li>
	<li>Zrób korek z pianki polistyrenowej i przymocuj korek do igły 30 G tak, aby końcówka pozostała na 5 mm, aby zapobiec uszkodzeniu płuc. Zegnij końcówkę igły czystymi kleszczami lub przyciskając ją do twardego przedmiotu oczyszczonego 70% EtOH, aby uniknąć odmy opłucnowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). 
	UWAGA: Uważaj, aby się nie przekłuć. Użyj kleszczy, aby zgiąć igłę. Nie trzymać korka podczas mocowania go do igły. Bezpieczniej jest zatkać korek przed wlaniem komórek do strzykawki.</li>
	<li>Napełnić strzykawkę (1 ml) komórkami docelowymi i przymocować igłę 30 G z korkiem.</li>
	<li>Przed zabiegiem należy zdezynfekować klatkę piersiową zwierzęcia 70% EtOH.</li>
	<li>Wbij igłę w klatkę piersiową myszy przez przestrzeń międzyżebrową. Ze względu na opór stawiany w tym czasie przy uderzaniu o żebra, końcówka igły poruszała się w górę i w dół. Po przejściu przez przestrzeń międzyżebrową dociśnij strzykawkę do myszy i wstrzyknij 100 μl komórek docelowych (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2). 
	UWAGA: Mysz oddycha głęboko, gdy igła prawidłowo wejdzie do jamy klatki piersiowej. Dzięki zgięciu końcówki igły można uniknąć odmy opłucnowej i niewłaściwego wstrzykiwania komórek do płuc. 
	UWAGA: Zaleca się nakłucie prawej ściany klatki piersiowej, aby uniknąć ryzyka nakłucia ściany serca.</li>
	<li>Obróć mysz 2-3 razy, aby rozprowadzić komórki w całej jamie klatki piersiowej.</li>
	<li>Umieść mysz z powrotem w czystej i ciepłej klatce i monitoruj do czasu chodzenia. Po zabiegu mysz wybudzi się ze znieczulenia i będzie zachowywać się normalnie.</li>
</ol>
3. Pomiar bioluminescencji
UWAGA: Oprogramowanie używane do pozyskiwania danych jest wymienione w Tabeli Materiałów.
<ol>
	<li>Aby potwierdzić wygenerowanie modelu rozsiewu opłucnej, należy oceniać obrazy bioluminescencji codziennie po wstrzyknięciu komórek do jamy klatki piersiowej.</li>
	<li>Znieczulić myszy (krok 2.3) i wstrzyknąć dootrzewnowo D-lucyferynę (15 mg / ml, 200 μl).</li>
	<li>Upewnij się, że mysz oddycha normalnie przed i po obrazowaniu. W razie potrzeby użyj grzejnika, aby zapobiec hipotermii podczas znieczulenia. </li>
	<li>Dziesięć minut po wstrzyknięciu należy przełączyć mysz w sprzęt do obrazowania bioluminescencyjnego (BLI). Aby uzyskać obraz , otwórz Panel sterowania pobierania oprogramowania. Wybierz Luminescencyjne, Zdjęcie i Nakładka (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
	<li>Ustaw czas ekspozycji jako Auto. Ustaw opcję Pojemnikowanie jako małe.</li>
	<li>Ustaw przysłonę na 1 dla oprawy luminescencyjnej i 8 dla fotografii; wartość f/stop kontroluje ilość światła odbieranego przez detektor urządzenia sprzężonego z ładunkiem.</li>
	<li>Ustaw pole widzenia na C.</li>
	<li>Gdy próbka myszy będzie gotowa do obrazowania, kliknij przycisk Acquire for imaging acquisition. Myszy z wystarczającą aktywnością lucyferazy wybrano do dalszych badań. 
	UWAGA: Odpowiedni model rozsiewu opłucnej wykazuje silną luminescencję w rozproszonym miejscu w klatce piersiowej, gdy patrzy się na niego od strony brzusznej. Jeśli obrazy BLI nie są rozproszone w klatce piersiowej, a jedynie w miejscu wstrzyknięcia, guz może być przeszczepiony podskórnie.</li>
	<li>Po wyświetleniu obrazu ustaw format wyświetlania na Blastk. Otwórz panel Paleta narzędzi (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A).</li>
	<li>Wybierz Narzędzia ROI. Zalecamy użycie okręgu do określenia zakresu obszaru bioluminescencyjnego na obrazach.</li>
	<li>Kliknij opcję Zmierz zwrot z inwestycji, aby zmierzyć intensywność bioluminescencji powierzchni (<silna klasa="xfig">Rysunek 4B).</li>
	<li>Użyj opcji Konfiguruj pomiar w lewym rogu panelu pomiaru zwrotu z inwestycji, aby wybrać potrzebne wartości/informacje. Wyeksportuj tę tabelę danych jako plik .csv (Rysunek 4C).</li>
	<li>Użyj wartości całkowitego strumienia (p/s) jako kwantyfikacji intensywności bioluminescencji w pliku .csv.</li>
</ol>
4. Tomografia obrazowania dyfuzyjnej luminescencji (DLIT)
UWAGA: Oprogramowanie używane do pozyskiwania danych jest wymienione w Tabeli Materiałów.
<ol>
	<li>Włącz przycisk X-ray Armed (Uzbrojony aparat rentgenowski).</li>
	<li>Znieczulić myszy (krok 2.3), a następnie wstrzyknąć D-lucyferynę (15 mg / ml, 200 μl) dootrzewnowo myszom. Aby nagrywać DLIT w sposób ciągły od 3,2 do 3,7, pomiń ten krok.</li>
	<li>Dziesięć minut po wstrzyknięciu należy umieścić mysz w urządzeniu BLI.</li>
	<li>Otwórz Panel sterowania pobierania oprogramowania. Wybierz Luminescencyjne, Zdjęcie, CT, Standardowa mysz jednoosobowa i Nakładka. Pozostałe ustawienia były takie same jak w 3.4-3.6 (<silna klasa="xfig">Rysunek 5A).</li>
	<li>Wybierz Kreatora obrazowania w Panelu sterowania Pobieranie.</li>
	<li>Wybierz Bioluminescencję, a następnie DLIT (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 5B).</li>
	<li>Wybierz Firefly jako długość fali do pomiaru (Rysunek 5C).</li>
	<li>Ustaw obrazowany obiekt jako mysz, parametry ekspozycji jako ustawienia automatyczne, pole widzenia jako C-13,4 cm, a wysokość obiektu jako 1,5 cm (<silna klasa="xfig">Rysunek 5D).</li>
	<li>Push Promienie rentgenowskie będą wytwarzane po zasileniu. Nabyć.</li>
	<li>Otwórz dane sekwencyjnego obrazu CT.</li>
	<li>Otwórz topografię powierzchni na palecie narzędzi. Wybierz Pokaż (<silna klasa="xfig">Rysunek 6A).</li>
	<li>Dostosuj próg, ponieważ fioletowy wyświetlacz pokazuje tylko powierzchnię ciała (<silna klasa="xfig">Rysunek 6B). Następnie wybierz mysz Temat nago i kliknij przycisk Generuj powierzchnię. Upewnij się, że kontur myszy jest dokładnie narysowany (<silna klasa="xfig">Rysunek 6C).</li>
	<li>Otwórz paletę narzędzi, zakładkę Właściwości rekonstrukcji DLIT 3D. Wybierz Właściwości tkanki jako Tkankę myszy i Widmo źródłowe jako Świetlik (<silna klasa="xfig">Rysunek 6D). Następnie otwórz kartę Analizuj i potwierdź dane dla każdego wybranego danych o długości fali. Na koniec kliknij przycisk Reconstruct (<silna klasa="xfig">Rysunek 6E).</li>
	<li>Potwierdź obecność BLI w jamie klatki piersiowej na skonfigurowanym obrazie DLIT.</li>
</ol>
5. NIR-PIT dla modelu rozsiewu in vivo w opłucnej
<ol>
	<li>Zmierz dawkę światła lasera o długości fali 690 nm (NIR) za pomocą miernika mocy i dostosuj moc wyjściową do 100 mW / cm2. 
	UWAGA: Światło lasera jest spójne z precyzyjnym rozmiarem cewki; W ten sposób energia świetlna prawie się nie zmienia niezależnie od odległości w promieniu 50 cm. W przypadku wystąpienia wielu zdarzeń niepożądanych, takich jak oparzenia, należy zmniejszyć moc wyjściową w zakresie 40 mW/cm2.</li>
	<li>Oczyść ogon 70% EtOH i wstrzyknąć dożylnie APC (100 μg) przez żyłę ogonową 24 godziny przed napromienianiem NIR. Uciskać miejsce wstrzyknięcia, aby zatamować krwawienie. 
	UWAGA: Dostosuj objętość APC do 50-200 μl do wstrzykiwań.</li>
	<li>Znieczul myszy (krok 2.3) i połóż je na plecach. Aby uniknąć napromieniowania NIR do miejsca niedocelowego, osłoń inne miejsca folią aluminiową (<silna klasa = "xfig">Rysunek 7A). Naświetlić światłem NIR laserem o sile 100 J/cm2; jeśli guz jest rozprzestrzeniony z powrotem do brzucha, dawkę promieniowania światłem NIR można podzielić w wielu kierunkach (<silna klasa="xfig">Rysunek 7B). 
	UWAGA: Dawkę należy dostosować do 30-150 J/cm2 w zależności od wyników badań in vitro i zdarzeń niepożądanych, takich jak oparzenia.</li>
	<li>Po zakończeniu naświetlania NIR i wybudzeniu myszy należy umieścić ją z powrotem w klatce.</li>
	<li>Obserwuj BLI i mierz zwrot z inwestycji w czasie (każdego dnia) (patrz 3.2-3.12).</li>
	<li>W przypadku obrazowania ex vivo należy poddać myszy eutanazji dwutlenkiem węgla 24 godziny po wstrzyknięciu APC, bezpośrednio przed napromieniowaniem NIR.
	<ol>
		<li>Aby obserwować wnętrze klatki piersiowej myszy, usuń klatkę piersiową i przetnij żebra i mostek. Uchwyć obraz fluorescencyjny (700 nm) wraz z kontrolą bez podawania APC. Następnie nałóż D-lucyferynę (150 μg/ml) na odsłoniętą klatkę piersiową i pobrano BLI (patrz 3.2-3.7).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Xu, X., Lu, H., Lee, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+Infrared+Light+Triggered+Photo%2FImmuno-Therapy+Toward+Cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Near Infrared Light Triggered Photo/Immuno-Therapy Toward Cancers.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, (2020).</li>
<li>Mitsunaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell-selective+in+vivo+near+infrared+photoimmunotherapy+targeting+specific+membrane+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cancer cell-selective in vivo near infrared photoimmunotherapy targeting specific membrane molecules.</a> Nature Medicine. 17, 1685-1691 (2011).</li>
<li>Kobayashi, H., Choyke, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-Infrared+Photoimmunotherapy+of+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Near-Infrared Photoimmunotherapy of Cancer.</a> Accounts of Chemical Research. 52, 2332-2339 (2019).</li>
<li>Oseroff, A. R., Ohuoha, D., Hasan, T., Bommer, J. C., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-targeted+photolysis%3A+Selective+photodestruction+of+human+T-cell+leukemia+cells+using+monoclonal+antibody-chlorin+e6+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Antibody-targeted photolysis: Selective photodestruction of human T-cell leukemia cells using monoclonal antibody-chlorin e6 conjugates.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 8744-8748 (1986).</li>
<li>Mew, D., Wat, C. K., Towers, G. H., Levy, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoimmunotherapy%3A+treatment+of+animal+tumors+with+tumor-specific+monoclonal+antibody-hematoporphyrin+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Photoimmunotherapy: treatment of animal tumors with tumor-specific monoclonal antibody-hematoporphyrin conjugates.</a> Journal of Immunology. 130, 1473-1477 (1983).</li>
<li>Vrouenraets, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+meta-tetrahydroxyphenylchlorin-monoclonal+antibody+conjugates+for+photoimmunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Development of meta-tetrahydroxyphenylchlorin-monoclonal antibody conjugates for photoimmunotherapy.</a> Cancer Research. 59, 1505-1513 (1999).</li>
<li>Goff, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoimmunotherapy+and+biodistribution+with+an+OC125-chlorin+immunoconjugate+in+an+in+vivo+murine+ovarian+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Photoimmunotherapy and biodistribution with an OC125-chlorin immunoconjugate in an in vivo murine ovarian cancer model.</a> British Journal of Cancer. 70, 474-480 (1994).</li>
<li>Sato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoinduced+Ligand+Release+from+a+Silicon+Phthalocyanine+Dye+Conjugated+with+Monoclonal+Antibodies%3A+A+Mechanism+of+Cancer+Cell+Cytotoxicity+after+Near-Infrared+Photoimmunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Central+Science%22%5BJournal%5D)">Photoinduced Ligand Release from a Silicon Phthalocyanine Dye Conjugated with Monoclonal Antibodies: A Mechanism of Cancer Cell Cytotoxicity after Near-Infrared Photoimmunotherapy.</a> ACS Central Science. 4, 1559-1569 (2018).</li>
<li>Sato, K., Nagaya, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+infrared+photoimmunotherapy+in+the+treatment+of+pleural+disseminated+NSCLC%3A+Preclinical+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Near infrared photoimmunotherapy in the treatment of pleural disseminated NSCLC: Preclinical experience.</a> Theranostics. 5, 698-709 (2015).</li>
<li>Nishinaga, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Phototherapy+for+Malignant+Pleural+Mesothelioma%3A+Near-Infrared+Photoimmunotherapy+Targeting+Podoplanin%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Targeted Phototherapy for Malignant Pleural Mesothelioma: Near-Infrared Photoimmunotherapy Targeting Podoplanin.</a> Cells. 9, 1019(2020).</li>
<li>Sato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+infrared+photoimmunotherapy+prevents+lung+cancer+metastases+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Near infrared photoimmunotherapy prevents lung cancer metastases in a murine model.</a> Oncotarget. 6, 19747-19758 (2015).</li>
<li>Sato, K., Nagaya, T., Mitsunaga, M., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+infrared+photoimmunotherapy+for+lung+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Near infrared photoimmunotherapy for lung metastases.</a> Cancer Letters. 365, 112-121 (2015).</li>
<li>Isobe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+infrared+photoimmunotherapy+targeting+DLL3+for+small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Near infrared photoimmunotherapy targeting DLL3 for small cell lung cancer.</a> EBioMedicine. 52, 102632(2020).</li>
<li>Nakamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+infrared+photoimmunotherapy+in+a+transgenic+mouse+model+of+spontaneous+epidermal+growth+factor+receptor+%28EGFR%29-expressing+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Near infrared photoimmunotherapy in a transgenic mouse model of spontaneous epidermal growth factor receptor (EGFR)-expressing lung cancer.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 16, 408-414 (2017).</li>
<li>Nagaya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+infrared+photoimmunotherapy+with+avelumab%2C+an+anti-programmed+death-ligand+1+%28PD-L1%29+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Near infrared photoimmunotherapy with avelumab, an anti-programmed death-ligand 1 (PD-L1) antibody.</a> Oncotarget. 8, 8807-8817 (2017).</li>
<li>Sato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+selective+depletion+of+tumor-associated+regulatory+T+cells+with+near-infrared+photoimmunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Spatially selective depletion of tumor-associated regulatory T cells with near-infrared photoimmunotherapy.</a> Science Translational Medicine. 8, (2016).</li>
<li>Sato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+effectiveness+of+light+emitting+diodes+%28LEDs%29+and+lasers+in+near+infrared+photoimmunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Comparative effectiveness of light emitting diodes (LEDs) and lasers in near infrared photoimmunotherapy.</a> Oncotarget. 7, 14324-14335 (2016).</li>
<li>Sato, K., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoimmunotherapy+of+Gastric+Cancer+Peritoneal+Carcinomatosis+in+a+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Photoimmunotherapy of Gastric Cancer Peritoneal Carcinomatosis in a Mouse Model.</a> PLoS One. 9, 113276(2014).</li>
<li>McLemore, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+intrapulmonary%2C+percutaneous+intrathoracic%2C+and+subcutaneous+models+for+the+propagation+of+human+pulmonary+and+nonpulmonary+cancer+cell+lines+in+athymic+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of intrapulmonary, percutaneous intrathoracic, and subcutaneous models for the propagation of human pulmonary and nonpulmonary cancer cell lines in athymic nude mice.</a> Cancer Research. 48, 2880-2886 (1988).</li>
<li>Manzotti, C., Audisio, R. A., Pratesi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+orthotopic+implantation+for+human+tumors+as+model+systems%3A+relevance+to+metastasis+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Importance of orthotopic implantation for human tumors as model systems: relevance to metastasis and invasion.</a> Clinical & Experimental Metastasis. 11, 5-14 (1993).</li>
<li>Lwin, T. M., Hoffman, R. M., Bouvet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+patient-derived+orthotopic+mouse+models+and+genetic+reporters+for+developing+fluorescence-guided+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Advantages of patient-derived orthotopic mouse models and genetic reporters for developing fluorescence-guided surgery.</a> Journal of Surgical Oncology. 118, 253-264 (2018).</li>
<li>Sordat, B. C. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSordat%2C+BCM+%22From+Ectopic+to+Orthotopic+Tumor+Grafting+Sites%3A+Evidence+for+a+Critical+Role+of+the+Host+Tissue+Microenvironment+for+the+Actual+Expression+of+the+Malignant+Phenotype%22">From Ectopic to Orthotopic Tumor Grafting Sites: Evidence for a Critical Role of the Host Tissue Microenvironment for the Actual Expression of the Malignant Phenotype</a>. , Humana Press. Cham. 43-53 (2017).</li>
<li>Sato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoimmunotherapy%3A+comparative+effectiveness+of+two+monoclonal+antibodies+targeting+the+epidermal+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Photoimmunotherapy: comparative effectiveness of two monoclonal antibodies targeting the epidermal growth factor receptor.</a> Molecular Oncology. 8, 620-632 (2014).</li>
<li>Nakajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+conjugate+and+light+dose+on+photo-immunotherapy+induced+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">The effects of conjugate and light dose on photo-immunotherapy induced cytotoxicity.</a> BMC Cancer. 14, 389(2014).</li>
<li>Nagaya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+infrared+photoimmunotherapy+of+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Near infrared photoimmunotherapy of B-cell lymphoma.</a> Molecular Oncology. 10, 1404-1414 (2016).</li>
<li>Sato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+infrared+photoimmunotherapy+in+the+treatment+of+disseminated+peritoneal+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Near infrared photoimmunotherapy in the treatment of disseminated peritoneal ovarian cancer.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 14, 141-150 (2015).</li>
<li>Colin, D. J., Bejuy, O., Germain, S., Triponez, F., Serre-Beinier, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+and+monitoring+by+pet%2Fct+of+an+orthotopic+model+of+human+pleural+mesothelioma+in+athymic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Implantation and monitoring by pet/ct of an orthotopic model of human pleural mesothelioma in athymic mice.</a> Journal of Visualized Experiments. 2019, (2019).</li>
<li>Opitz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+recurrence+model+of+malignant+pleural+mesothelioma+for+investigation+of+intrapleural+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cardio-Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Local recurrence model of malignant pleural mesothelioma for investigation of intrapleural treatment.</a> European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 31, 772-778 (2007).</li>
<li>Bunn, P. A., Kelly, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+chemotherapeutic+agents+prolong+survival+and+improve+quality+of+life+in+non-small+cell+lung+cancer%3A+a+review+of+the+literature+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">New chemotherapeutic agents prolong survival and improve quality of life in non-small cell lung cancer: a review of the literature and future directions.</a> Clinical Cancer Research. 4, 1087-1100 (1998).</li>
<li>Astoul, P., Wang, X., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-like+nude-mouse+and+scid-mouse+models+of+human+lung+and+pleural+cancer+%28review%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Patient-like nude-mouse and scid-mouse models of human lung and pleural cancer (review).</a> International Journal of Oncology. 3, 713-718 (1993).</li>
<li>Yamaguchi, H., Pantarat, N., Suzuki, T., Evdokiou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+photoimmunotherapy+using+a+small+protein+mimetic+for+HER2-overexpressing+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Near-infrared photoimmunotherapy using a small protein mimetic for HER2-overexpressing breast cancer.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20, (2019).</li>
<li>Jing, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+selective+elimination+of+glioblastoma+stem+cells+with+theranostic+Near-Infrared-Labeled+CD133-Specific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Imaging and selective elimination of glioblastoma stem cells with theranostic Near-Infrared-Labeled CD133-Specific antibodies.</a> Theranostics. 6, 862-874 (2016).</li>
<li>Burley, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+photoimmunotherapy+targeting+EGFR-Shedding+new+light+on+glioblastoma+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Near-infrared photoimmunotherapy targeting EGFR-Shedding new light on glioblastoma treatment.</a> International Journal of Cancer. 142, 2363-2374 (2018).</li>
<li>Nagaya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+infrared+photoimmunotherapy+using+a+fiber+optic+diffuser+for+treating+peritoneal+gastric+cancer+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22Gastric+Cancer%22%5BJournal%5D)">Near infrared photoimmunotherapy using a fiber optic diffuser for treating peritoneal gastric cancer dissemination.</a> Gastric Cancer. 22, 463-472 (2019).</li>
<li>Nagaya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoscopic+near+infrared+photoimmunotherapy+using+a+fiber+optic+diffuser+for+peritoneal+dissemination+of+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Endoscopic near infrared photoimmunotherapy using a fiber optic diffuser for peritoneal dissemination of gastric cancer.</a> Cancer Science. 109, 1902-1908 (2018).</li>
<li>Harada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+photoimmunotherapy+with+galactosyl+serum+albumin+in+a+model+of+diffuse+peritoneal+disseminated+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Near-infrared photoimmunotherapy with galactosyl serum albumin in a model of diffuse peritoneal disseminated ovarian cancer.</a> Oncotarget. 7, 79408-79416 (2016).</li>
<li>Journals, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JNCI+Journal+of+the+National+Cancer+Institute+Way+to+Better+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">JNCI Journal of the National Cancer Institute Way to Better DNA.</a> Annals of Internal Medicine. 37, 1-9 (2008).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W niniejszej pracy zademonstrowaliśmy metodę pomiaru efektu terapeutycznego NIR-PIT na model rozsiewu opłucnowego MPM. Wysoce selektywne zabijanie komórek przeprowadzono za pomocą NIR-PIT; W ten sposób normalna tkanka prawie nie została uszkodzona 23,24,25. W przypadku tego typu selektywnego zabijania komórek wykazano, że NIR-PIT jest bezpieczny w rozpowszechnionych modelach</su...

Rak pozostaje jedną z głównych przyczyn śmiertelności, pomimo dziesięcioleci badań. Jednym z powodów jest to, że radioterapia i chemioterapia są technikami wysoce inwazyjnymi, co może ograniczać ich korzyści terapeutyczne. Coraz więcej uwagi poświęca się terapiom ukierunkowanym na komórki lub molekulary, które są mniej inwazyjnymi technikami. Fotoimmunoterapia to metoda leczenia, która synergistycznie wzmacnia efekt terapeutyczny poprzez połączenie immunoterapii i fototerapii. Immunoterapia wzmacnia odporność guza poprzez zwiększenie immunogenności mikrośrodowiska guza i zmniejszenie supresji immunoregulacyjnej, co prowadzi do zniszczenia guzów w organizmie. Fototerapia niszczy guzy pierwotne za pomocą kombinacji fotouczulaczy i promieni świetlnych, a antygeny specyficzne dla nowotworu uwalniane z komórek nowotworowych wzmacniają odporność nowotworu. Guzy można leczyć selektywnie za pomocą fotouczulaczy, ponieważ są one specyficzne i selektywne dla komórek docelowych. Modalność fototerapii obejmuje terapię fotodynamiczną (PDT), terapię fototermiczną (PTT) i terapie oparte na fotochemii1.
Fotoimmunoterapia w bliskiej podczerwieni (NIR-PIT) to niedawno opracowana metoda fototerapii przeciwnowotworowej, która łączy terapię fotochemiczną i immunoterapię1,2. NIR-PIT to terapia ukierunkowana molekularnie, która jest ukierunkowana na określone cząsteczki powierzchni komórki poprzez sprzężenie barwnika ftalocyjaniny krzemu w bliskiej podczerwieni, IRdye 700DX (IR700), z przeciwciałem monoklonalnym (mAb). Błona komórkowa komórki docelowej ulega zniszczeniu po napromieniowaniu światłem NIR (690 nm)3.
Koncepcja stosowania terapii światłem celowanym poprzez połączenie konwencjonalnych fotosensybilizatorów i przeciwciał lub ukierunkowanego PDT ma ponad trzy dekady4,5. Wcześniejsze badania próbowały celować w konwencjonalne środki PDT poprzez koniugację ich z przeciwciałami. Sukces był jednak ograniczony, ponieważ koniugaty te zostały uwięzione w wątrobie ze względu na hydrofobowość fotosensybilizatorów6,7. Co więcej, mechanizm NIR-PIT jest zupełnie inny niż w przypadku konwencjonalnego PDT. Konwencjonalne fotouczulacze generują stres oksydacyjny, który wynika z konwersji energii, która pochłania energię świetlną, przemieszcza się do stanu wzbudzonego, przechodzi w stan podstawowy i powoduje apoptozę. Jednak NIR-PIT powoduje szybką nekrozę poprzez bezpośrednie niszczenie błony komórkowej poprzez agregację fotouczulaczy na błonie w wyniku reakcji fotochemicznej8. NIR-PIT jest pod wieloma względami lepszy od konwencjonalnego ukierunkowanego PDT. Konwencjonalne fotouczulacze mają niskie współczynniki ekstynkcji, co wymaga przyłączenia dużej liczby fotouczulaczy do pojedynczej cząsteczki przeciwciała, co potencjalnie zmniejsza powinowactwo wiązania. Większość konwencjonalnych fotouczulaczy jest hydrofobowa, co utrudnia wiązanie fotouczulaczy z przeciwciałami bez uszczerbku dla ich immunoreaktywności lub akumulacji celu in vivo. Konwencjonalne fotouczulacze zazwyczaj pochłaniają światło w zakresie widzialnym, zmniejszając penetrację tkanek.
Zgłoszono kilka badań nad NIR-PIT ukierunkowanych na nowotwory wewnątrzklatki piersiowej, takie jak rak płuc i złośliwy międzybłoniak opłucnej (MPM)9,10,11,12,13,14,15,16, 17. Jednak tylko kilka doniesień opisało skuteczność NIR-PIT w modelach MPM z rozsianą opłucną lub raku płuc9,10,11,12. Podskórne modele ksenoprzeszczepów guzów są uważane za standardowe modele guzów i są obecnie szeroko stosowane do oceny przeciwnowotworowych efektów nowych terapii18. Jednak podskórne mikrośrodowisko guza nie jest permisywne dla rozwoju odpowiedniej struktury tkankowej lub stanu, który prawidłowo podsumowuje prawdziwy złośliwy fenotyp19,20,21,22. Idealnie byłoby, gdyby powstały ortotopowe modele chorób w celu bardziej precyzyjnej oceny działania przeciwnowotworowego.
Tutaj demonstrujemy metodę oceny skuteczności w mysim modelu rozsianego raka płuc w opłucnej, który był leczony za pomocą NIR-PIT. Mysi model rozsiewu opłucnej jest generowany przez wstrzyknięcie komórek nowotworowych do jamy klatki piersiowej i potwierdzany za pomocą luminescencji lucyferazy. Mysz leczono dożylnym wstrzyknięciem mAb sprzężonego z IR700 i napromienianiem NIR w klatkę piersiową. Efekt terapeutyczny oceniano za pomocą luminescencji lucyferazy.

<table><tbody><tr><td>0,25 w / v% Trypsyna-1mmol / l EDTA 4Na Roztwór z fenolem Red</td><td>Wako</td><td>209-016941</td><td>do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>TERUMO</td><td>SS-01T</td><td>dla eksperymentu na myszach</td></tr><tr><td>Igła 30G</td><td>Nipro</td><td>1907613</td><td>do eksperymentu na myszach</td></tr><tr><td>BALB/cSlc-nu/nu</td><td>Japan SLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collidal Blue Staining Kit</td><td>Invitrogen</td><td>LC6025</td><td>zastosowanie do barwienia białek żelowych</td></tr><tr><td>Coomassie (Bradford) Plus test białkowy</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA)</td><td>PI-23200</td><td>do pomiaru stężenia APC</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Wako</td><td>043-07216</td><td>zastosowanie do koniugacji IR700</td></tr><tr><td>D-Lucyferin (sól potasowa)</td><td>Cayman Chemical</td><td>14681</td><td>do obrazowania bioluminescencyjnego i DLIT</td></tr><tr><td>GraphPad Prism7</td><td>Oprogramowanie</td><td></td> GraphPad <td>do analizy statystycznej</td></tr><tr><td>Image Studio</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td></td><td>do analizy obrazu fluorescencyjnego 700 nm</td></tr><tr><td>IRDye 700DX Ester Infrared Dye</td><td>LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA)</td> <td>929-70011</td><td></td></tr><tr><td>izofluran</td><td>Wako</td><td>095-06573</td><td>do znieczulenia myszy</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum CT</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>do przechwytywania obraz bioluminescencyjny i DLIT</td></tr><tr><td>Living Image</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>do analizy obrazu bioluminescencyjnego i DLIT</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA)</td><td>S9763</td><td>zastosowanie do koniugacji IR700</td></tr><tr><td>NIR Laser</td><td>Changchun New Industries Technologia optoelektroniczna</td><td>MRL-III-690R</td><td>do napromieniania NIR</td></tr><tr><td>Novex WedgeWell 4 do 20%, Tris-Glycine, 1,0 mm, Mini Protein Gel, 12 dołków</td><td>Zastosowanie Invitrogen</td><td>XP04202BOX</td><td>dla SDS-PAGE</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample Buffer (x4)</td><td>Zastosowanie Invitrogen</td><td>NP0007</td><td>dla SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Miernik mocy optycznej</td><td>Thorlabs (Newton, NJ, USA)</td><td>PM100</td><td>do pomiaru mocy wyjściowej lasera NIR&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS(-)</td><td>Wako</td><td>166-23555</td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania Pearl Trilogy</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td></td><td>do przechwytywania obrazu fluoostatnie 700 nm</td></tr><tr><td>Roztwór penicyny-streptomycyny (x100)</td><td>Wako</td><td>168-23191</td><td>do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Termochlorowodorek Dihydrocyny</td><td>ThermoFisher</td><td>A1113803</td><td>do transfekcji lucyfekazy</td></tr><tr><td>RediFect Red-Fluc-Puromycyna Lentiviral Zasady</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS960002</td><td>do transfekcji lucyferazy</td></tr><tr><td>RPMI-1640 z L-glutaminą i fenolem Red</td><td>Wako</td><td>189-02025</td><td>do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Kolumna Sephadex G25 (PD-10)&nbsp;</td><td>GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)</td><td>17-0851-01</td><td>zastosowanie do koniugacji IR700</td></tr><tr><td>UV-1900i</td><td>Shimadzu</td><td></td><td>do pomiaru stężenia APC</td></tr></tbody></table>

fotoimmunoterapia w bliskiej podczerwieni w mysich modelach rozsiewu opłucnej

Near Infrared Photoimmunotherapy for Mouse Models of Pleural Dissemination

Skuteczność fotoimmunoterapii można ocenić dokładniej za pomocą ortotopowego modelu myszy niż za pomocą modelu podskórnego. Model rozsiewu opłucnej może być wykorzystany do oceny metod leczenia chorób wewnątrzklatkowych, takich jak rak płuc lub złośliwy międzybłoniak opłucnej.
Fotoimmunoterapia w bliskiej podczerwieni (NIR-PIT) to niedawno opracowana strategia leczenia raka, która łączy specyfikę przeciwciał skierowanych przeciwko nowotworowi z toksycznością spowodowaną przez fotoabsorber (IR700Dye) po ekspozycji na światło NIR. Skuteczność NIR-PIT została opisana przy użyciu różnych przeciwciał; Jednak tylko kilka doniesień wykazało efekt terapeutyczny tej strategii w modelu ortotopowym. W niniejszej pracy przedstawiono przykład oceny skuteczności modelu rozsianego raka płuca w opłucnej, który był leczony za pomocą NIR-PIT.

Przeciwciało anty-podoplanina NZ-1 zostało sprzężone z IR700 w celu wytworzenia NZ-1-IR700. Potwierdzono wiązanie NZ-1 i IR700 za pomocą elektroforezy SDS-PAGE (Rysunek 8). Komórki H2373 wykazujące ekspresję lucyferazy (H2373-luc) przygotowano poprzez transfekcję złośliwych komórek międzybłonniaka (H2373) genem lucyferazy10.
Zanarkotyzowano 8-12-tygodniowe samice homozygotycznych myszy nago (athymic nude) i wstrzykiwano 1 × 105 k...

Fotoimmunoterapia w bliskiej podczerwieni (NIR-PIT) to nowa strategia leczenia raka, która wykorzystuje koniugat przeciwciało-fotoabsorber (IR700Dye) i światło NIR do niszczenia komórek rakowych. W tym miejscu przedstawiono metodę oceny działania przeciwnowotworowego NIR-PIT w mysim modelu rozsianego raka płuc i złośliwego międzybłoniaka opłucnej z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencyjnego.

Fotoimmunoterapia w bliskiej podczerwieni w mysich modelach rozsiewu opłucnej

The efficacy of photoimmunotherapy can be evaluated more accurately with an orthotopic mouse model than with a subcutaneous one. A pleural dissemination ...

Metoda ta może być stosowana do oceny efektów terapeutycznych NIR-PIT na guzy klatki piersiowej w klinicznie istotnym modelu guza. Zabiegi NIR-PIT z wykorzystaniem modelu rozsianego raka opłucnej są łatwe do zrozumienia i wykonania. Aby skonfigurować model rozprzestrzeniania się myszy, użyj pianki polistyrenowej do wykonania korka i zdezynfekuj go 70% etanolem.Przymocuj igłę do korka tak, aby końcówka wystawała na pięć milimetrów poza korek. Zegnij końcówkę igły o rozmiarze 30 czystymi kleszczami lub o twardy przedmiot oczyszczony 70% etanolem i napełnij strzykawkę jednym razy 10 do sześciu docelowych komórek nowotworowych w 100 mikrolitrach PBS. Potwierdź brak reakcji na odruch pedałowania u znieczulonej, ważącej od 19 do 21 gramów, ośmiotygodniowej myszy, homozygotycznej, atymicznej nagiej.Wbić igłę do klatki piersiowej przez przestrzeń międzyżebrową, przesuwając igłę w górę i w dół, aby uniknąć kontaktu z żebrami. Gdy końcówka przejdzie przez przestrzeń międzyżebrową, ustawić strzykawkę tak, aby była dociśnięta do myszy i wstrzyknąć całą objętość komórek docelowych. Po wstrzyknięciu należy obrócić mysz dwa do trzech razy, aby rozprowadzić komórki w całej jamie klatki piersiowej, a następnie umieścić mysz z powrotem w klatce z monitorowaniem aż do pełnego wyzdrowienia.24 godziny po wstrzyknięciu komórki, a następnie codziennie należy wstrzyknąć znieczulonym myszom z wstrzykniętymi komórkami nowotworowymi 200 mikrolitrów 15 miligramów na mililitr D-lucyferyny. Po 10 minutach umieść myszy w kamerze bioluminescencyjnej i otwórz Panel sterowania akwizycją w oprogramowaniu imagera. Wybierz Luminescencyjne, Fotografia i Nakładka.Ustaw czas ekspozycji na Auto, Binning na Mały, przysłonę / stopa na jeden dla luminescencji i na osiem dla fotografii, a pole widzenia na C. Kliknij przycisk Acquire, aby zobrazować bioluminescencję. Ustaw Format wyświetlania na Radiany i wybierz okrąg z narzędzi Obszar zainteresowania w panelu Paleta narzędzi. Kliknij opcję Zmierz obszary zainteresowania, aby zmierzyć intensywność bioluminescencji powierzchni, a następnie użyj opcji Konfiguruj pomiar, aby wybrać wartości istotne dla eksperymentu.Wyeksportuj tę tabelę danych jako plik csv. Następnie użyj całkowitych wartości strumienia do ilościowego oznaczania intensywności bioluminescencji w pliku. Przed wykonaniem fototerapii w bliskiej podczerwieni myszy, którym wstrzyknięto nowotwór, użyj miernika mocy, aby zmierzyć dawkę światła lasera o długości fali 690 nanometrów i dostosuj moc wyjściową do 100 miliwatów na centymetr kwadratowy.24 godziny przed podaniem należy wstrzyknąć dożylnie 100 mikrogramów koniugatu fotouczulacza przeciwciała w 50 do 200 mikrolitrach PBS przez żyłę ogonową zwierzęcia, któremu wstrzyknięto nowotwór. W dniu zabiegu fototerapii umieść znieczuloną, sprzężoną z wstrzyknięciem, obciążoną guzem mysz w pozycji leżącej na plecach i osłoń miejsca niedocelowe folią aluminiową. Po umieszczeniu wszystkich osłon użyj lasera o mocy 100 dżuli na centymetr kwadratowy, aby naświetlić jamę klatki piersiowej światłem bliskiej podczerwieni przez około 30 sekund.Po zakończeniu napromieniania i przebudzeniu myszy należy umieścić zwierzę z powrotem w klatce i codziennie mierzyć bioluminescencję, jak pokazano. W tej reprezentatywnej analizie koniugacja przeciwciała anty-podoplaniny z IR700 została potwierdzona za pomocą analizy SDS-PAGE. Po wstrzyknięciu komórek nowotworowych należy wykonać obrazowanie bioluminescencyjne i tomografię obrazowania luminescencji rozproszonej w celu określenia, które myszy wyrażają wystarczającą aktywność lucyferazy w jamie klatki piersiowej do dalszych badań.W piątym dniu po wstrzyknięciu myszy z wstrzyknięciem przeciwciała anty-podoplaniny IR700 wykazują wysoką aktywność fluorescencji IR700 i lucyferazy w guzach klatki piersiowej, co wskazuje, że dożylnie wstrzyknięte przeciwciało sprzężone z IR700 dociera do rozsianych miejsc guza opłucnej. Warto zauważyć, że myszy z rozsianą opłucną leczone fotoimmunoterapią w bliskiej podczerwieni wykazują zmniejszoną aktywność lucyferazy, podczas gdy względne jednostki świetlne w grupie kontrolnej wykazują stopniowy wzrost intensywności. Ponieważ wymagana energia napromieniowania NIR zależy od linii komórkowej i przeciwciał, należy wcześniej sprawdzić warunki in vitro.

near-infrared-photoimmunotherapy-for-mouse-models-pleural

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Terapia fotodynamiczna (PDT) jest nieinwazyjną i niechirurgiczną metodą leczenia raka płuc. Fotouczulacze selektywnie kumulują się w tkance nowotworowej i prowadzą do śmierci komórek nowotworowych w obecności tlenu i odpowiedniej długości fali światła. Ten film opisuje analizę skuteczności przeciwnowotworowej in vivo przy użyciu fotouczulacza zawierającego nanocząstki u myszy z nowotworem, w celu określenia potencjału fototoksycznego fotouczulacza.

Analiza skuteczności przeciwnowotworowej PDT in vivo: technika określania potencjału fototoksycznego fotouczulacza u myszy z nowotworem

Ten film demonstruje metodę generowania mysiego modelu rozprzestrzeniania się opłucnej poprzez wstrzykiwanie zawiesiny komórek raka płuc do klatki piersiowej myszy z niedoborem odporności.

Opracowanie mysiego modelu rozsianego raka płuc w opłucnej

Ten film demonstruje technikę fotoimmunoterapii w bliskiej podczerwieni w leczeniu raka płuc na zmodyfikowanym modelu myszy, w którym komórki nowotworowe wykazują ekspresję lucyferazy. Po wstrzyknięciu koniugatu przeciwciało-fotosensybilizator (APC), który wiąże się ze specyficznymi antygenami na komórkach nowotworowych, mysz jest wystawiona na promieniowanie bliskiej podczerwieni, wywołując zmiany fotochemiczne w APC i prowadząc do martwiczej śmierci związanych komórek nowotworowych.

Technika fotoimmunoterapii w bliskiej podczerwieni w leczeniu raka płuc w modelu mysim

Ten film demonstruje technikę selektywnego usuwania określonych komórek z mieszanej hodowli komórek 3D za pomocą fotoimmunoterapii w bliskiej podczerwieni. W tej metodzie docelowe komórki są dokładnie identyfikowane za pomocą przeciwciała sprzężonego z fotoabsorberem NIR. Późniejsze naświetlanie światłem podczerwonym indukuje śmierć komórki, skutecznie eliminując docelowe komórki z hodowli 3D.

Fotoimmunoterapia w bliskiej podczerwieni do celowanej eliminacji komórek w mieszanych kulturach 3D

Eliminacja określonych komórek bez uszkadzania innych komórek jest niezwykle trudna, zwłaszcza w tkance o ustalonej pozycji, jednak istnieje pilna potrzeba metody eliminacji komórek w dziedzinie inżynierii tkankowej. W tym miejscu przedstawiamy metodę swoistej eliminacji komórek z mieszanej hodowli komórek 3D z wykorzystaniem fotoimmunoterapii w bliskiej podczerwieni (NIR-PIT).

Selektywna eliminacja komórek z mieszanej hodowli 3D przy użyciu techniki fotoimmunoterapii w bliskiej podczerwieni

Badania nad strategiami leczenia pluripotencjalnych potworniaków pochodzących z komórek macierzystych są ważne dla klinicznego przełożenia terapii komórkami macierzystymi. W tym miejscu opisujemy protokół, aby najpierw wygenerować potworniaki pochodzące z komórek macierzystych u myszy, a następnie selektywnie celować i leczyć te nowotwory in vivo za pomocą napromieniacza dla małych zwierząt.

Celowane i selektywne leczenie pluripotencjalnych potworniaków pochodzących z komórek macierzystych z wykorzystaniem promieniowania wiązki zewnętrznej w modelu małego zwierzęcia

Ten artykuł opisuje generowanie ortotopowego mysiego modelu ludzkiego międzybłoniaka opłucnej poprzez wszczepienie komórek międzybłoniaka H2052/484 do jamy opłucnej myszy z obniżoną odpornością. Podłużne monitorowanie rozwoju guzów wewnątrzopłucnowych oceniano za pomocą nieinwazyjnej multimodalnej [18F]-2-fluoro-2-deoksy-D-glukozy pozytonowej tomografii emisyjnej i obrazowania tomografii komputerowej.

Implantacja i monitorowanie za pomocą PET/CT ortotopowego modelu ludzkiego międzybłoniaka opłucnej u myszy z atymią

Ten protokół przedstawia zestaw eksperymentów przyjętych do oceny fotoprzełączalnych peptydów przeciwnowotworowych, które mogą być użyte w przedklinicznych badaniach przesiewowych takich związków. Obejmuje to ocenę cytotoksyczności w hodowlach komórkowych 2D i 3D, ocenę skuteczności fotoizomeryzacji ex vivo (tkanki modelowej) oraz skuteczności in vivo.

Ocena in vitro i in vivo fotokontrolowanych związków biologicznie czynnych - potencjalni kandydaci na leki w fotofarmakologii nowotworów

Prezentujemy metodę badania redystrybucji komórek nowotworowych z przerzutów do płuc z wykorzystaniem protokołu chirurgicznego selektywnej fotokonwersji przerzutów do płuc, a następnie identyfikacji zaczerwienionych komórek nowotworowych w narządach trzeciego rzędu.

Śledzenie rozsiewu komórek nowotworowych z przerzutów do płuc za pomocą fotokonwersji

Tłumaczenie wyników mikroskopii przyżyciowej jest utrudnione ze względu na jego płytką głębokość penetracji w tkanki. W tym miejscu opisujemy mysi model komory z oknem grzbietowym, który umożliwia jednoczesną rejestrację mikroskopii przyżyciowej i klinicznie stosowanych metod obrazowania (np. CT, MRI) w celu bezpośredniej korelacji przestrzennej, potencjalnie usprawniając kliniczne tłumaczenie wyników mikroskopii przyżyciowej.

Mysi model guza w komorze grzbietowego fałdu skórnego do połączonej mikroskopii przyżyciowej i obrazowania metodą rezonansu magnetycznego w translacyjnych badaniach nad rakiem

W protokole tym przedstawiono techniki i metodologię niezbędne do celowanej terapii hipertermicznej w modelach guzów litych. Podejście to wykorzystuje fototermiczną konwersję światła w bliskiej podczerwieni przez wstrzykiwane domięśniowo złote nanopręty w celu wywołania miejscowego ogrzewania w mikrośrodowisku guza.

Indukowanie ukierunkowanej łagodnej hipertermii w mysich modelach nowotworów poprzez fototermiczną konwersję światła w bliskiej podczerwieni za pomocą wewnątrznowotworowych nanoprętów złota

Poznaj metodę oceny skuteczności fotoimmunoterapii w bliskiej podczerwieni w mysim modelu rozsiewu opłucnej przy użyciu bioluminescencyjnego obrazowania nowotworów.

Fotoimmunoterapia w bliskiej podczerwieni w mysich modelach rozsiewu opłucnej

Przeglądaj więcej filmów