Konstruowanie mutantów w serotypie 1 Streptococcus pneumoniae szczep 519/43

Protokół ten jest istotny, ponieważ umożliwia modyfikację genetyczną wcześniej niewykonalnego serotypu, umożliwiając badania i zrozumienie serotypu. Otwiera to możliwości dla prac biologicznych, takich jak opracowywanie szczepionek. Procedurę zademonstruje Vanessa S.Terra, adiunkt z London School of Hygiene and Tropical Medicine.

Aby rozpocząć generowanie plazmidu pSD1, wykonując ligację zgodnie z instrukcjami producenta pGEM-T Easy System I. Inkubować reakcję przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia przekształć chemicznie kompetentną E.coli Dh5-alfa z pSD1, inkubując 50 mikrolitrów komórek z trzema mikrolitrami reakcji ligacji pSD1 przez 15 minut na lodzie, a następnie wystawić komórki na szok termiczny i umieścić komórki na lodzie na dwie minuty.

Usuń komórki z lodu i dodaj 350 mikrolitrów pożywki SOC, a następnie inkubuj kulturę przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 120 obr./min. Umieść przemianę na agarze Luria-Bertani uzupełnionym 0,4 milimolowym IPTG, 0,24 miligrama na mililitr X-Gal do selekcji niebiesko-białej i 100 mikrogramów na mililitr ampicyliny, aby upewnić się, że wszystkie kolonie rosnące na płytce mają szkielet plazmidowy. Wybierz trzy białe kolonie, które zawierają pSD1 i ustaw nocny wzrost w 10 mililitrach L-B uzupełnionych 100 mikrogramami na mililitr ampicyliny.

Inkubuj kultury przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając. Następnego dnia odwirować kultury w stężeniu 3 082 G i użyć osadu do ekstrakcji plazmidu. Po wyekstrahowaniu DNA plazmidu należy ustawić trawienie restrykcyjne BamH1 zarówno dla plazmidu pSD1, jak i kasety spektynomycyny.

Inkubować reakcje trawienia restrykcyjnego i kontrole w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny. Po zakończeniu ograniczenia przeanalizuj produkty za pomocą elektroforezy, a następnie wytnij odpowiednią banderolę i oczyść ją za pomocą zestawu komercyjnego. Następnie przeprowadź reakcję ligacji przy użyciu trawionego przez BamH1 pSD1 i spektynomycyny.

Spowoduje to wygenerowanie plazmidu pSD2. Przekształć pSD2 w chemicznie kompetentną E.coli DH5-alfa, jak opisano wcześniej. Następnie wybierz transformanty przenoszące plazmid pSD2 na podstawie ich zdolności do wzrostu w LBA uzupełnionym 100 mikrogramami na mililitr spektynomycyny i ampicyliny i wyekstrahuj plazmidowe DNA.

Przygotuj na noc hodowlę S.pneumoniae 519/43 w BHI i pozwól jej rosnąć statycznie w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia rozcieńczyć kultury w proporcjach 1:50 i 1:100 w 10 mililitrach świeżego bulionu BHI. Inkubuj kulturę statycznie w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż OD przy 595 nanometrach będzie wynosił od 0,05 do 0,1.

Po osiągnięciu odpowiedniego OD weź 860 mikrolitrów kultury i przenieś ją do probówki do mikrowirówki. Dodaj 100 mikrolitrów 100-milimolowego wodorotlenku sodu, 10 mikrolitrów 20% BSA, 10 mikrolitrów 100-milimolowego chlorku wapnia, dwa mikrolitry 50 nanogramów na mililitr CSP1 i 500 nanogramów pSD2. Inkubować reakcję statycznie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny.

Następnie rozłóż 330 mikrolitrów na 5% płytkach z agarem z krwią, uzupełnionych 100 mikrogramami na mililitr spektynomycyny co godzinę przez trzygodzinny okres inkubacji. Następnie inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Plastrować kolonie oporne na spektynomycynę na inną płytkę z agarem z krwią uzupełnioną 100 mikrogramami na mililitr spektynomycyny i na płytki z agarem z krwią uzupełnioną 100 mikrogramami na mililitr ampicyliny, co testuje obecność szkieletu plazmidu.

Inkubuj oba zestawy płytek przez noc. Prawidłowe składanie pSD2 zostało potwierdzone trawieniem restrykcyjnym. pSD2 został następnie wykorzystany do transformacji 519,43 komórek typu dzikiego.

Kolonie rosnące na spektynomycynie po całonocnej inkubacji uznano za dodatnie transformanty. Fenotypowe potwierdzenie mutacji pneumolizyny przeprowadzono poprzez ocenę aktywności hemolitycznej dla warstwy D39, 519/43 typu dzikiego i zmutowanej 519/43 delta. Porównano to z hemolizą czerwonych krwinek przez 0,5%saponinę, która jest uważana za 100%Mutant stracił zdolność do lizy czerwonych krwinek.

Wszystkie dodatnie kolonie zostały następnie potwierdzone przez sekwencjonowanie w celu oceny lokalizacji insercji. Zastosowano startery z miejscami wiązania poza obszarem homologii. Podczas przeprowadzania reakcji przemiany ważne jest, aby dodawać odczynniki we właściwej kolejności.