Name: Konstruowanie mutantów w serotypie 1 Streptococcus pneumoniae szczep 519/43 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: Poznaj metodę konstruowania izogenicznych mutantów w genie pneumolizyny w Streptococcus pneumoniae serotypu 1. Technika ta wykorzystuje naturalną zdolność bakterii do pobierania DNA i otwiera nowe możliwości badań nad szczepionkami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Meningitis Trust i MRC za zapewnienie funduszy na tę pracę.

1. Generowanie mutującego amplikonu przez SOE-PCR23 i amplifikacja kasety spektynomycyny
<ol>
	<li>Zacznij od przeprowadzenia PCR w celu amplifikacji ramion homologii (odpowiednio 5' (488 pz) i ply3' (715 pz)) regionów flankujących gen ply ze szczepu 519/43. Użyj podkładów plyFw1_NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAATGACTTTATACTAGCTATG), ply5'R1_BamHI (CGAAATATAGACCAAAGGACGC,GGATCC, AGAACCAAACTTGACCTTGA), ply3'F1_BamHI (TCAAGGTCAAGTTTGGTTCT,GGATCC, GCGTCCTTTGGTTTTGG) i plyRv2_NotI (TTTGCGGCCCATTTTCTCTCCTTATTATTCTC).</li>
	<li>Dla warstwy 5' należy zastosować następujące warunki PCR: denaturacja w temperaturze 94 °C przez 60 s, etap 2: denaturacja w temperaturze 94 °C przez 30 s, etap 3: wyżarzanie w temperaturze 58 °C przez 30 s, etap 4: przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 30 s, krok 5: powrót do kroku 2 i powtórzenie przez 35 cykli, Krok 6: końcowe przedłużenie w temperaturze 72°C przez 30 s.
	<ol>
		<li>Stosować te same warunki PCR dla ply3', z wyjątkiem czasu przedłużenia w kroku 4 i kroku 6, gdzie powinien wynosić 60 s.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analizować produkty PCR za pomocą elektroforezy żelowej i wyciąć amplikon z żelu.</li>
	<li>Amplikony PCR należy oczyścić zgodnie z protokołem opisanym w instrukcjach producenta (tabela materiałów).</li>
	<li>Użyj równomolowych ilości obu ramion homologii jako matryc w SOE-PCR. Połącz dwa amplikony za pomocą starterów plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCCCAGTAATGACTTTATACTAGCTATG) i plyRv2_NotI (TTTGCGGCCCCATTTTCTCTCCTTATCCTCTACC).</li>
	<li>Stosować następujące warunki SOE-PCR (krok 1: denaturacja w temperaturze 94 °C przez 2 minuty, krok 2: denaturacja w temperaturze 94 °C przez 30 s, krok 3: wyżarzanie w temperaturze 58 °C przez 30 s, krok 4: przedłużenie w temperaturze 68 °C przez 60 s, krok 5: wróć do kroku 2 i powtórz przez 25 cykli, krok 6: końcowe przedłużenie w temperaturze 68 °C przez 90 s).</li>
	<li>Analizować produkt SOE-PCR za pomocą elektroforezy żelowej. Wytnij go z żelu za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu i postępuj zgodnie z dostarczonymi instrukcjami.</li>
	<li>Amplifikować kasetę spektynomycyny z plazmidu pR412 przy użyciu następujących warunków PCR: etap 1: denaturacja w temperaturze 94 °C przez 60 s, etap 2: denaturacja w temperaturze 94 °C przez 30 s, etap 3: wyżarzanie w temperaturze 55 °C przez 30 s, etap 4: przedłużenie w temperaturze 68 °C przez 60 s, krok 5: powrót do kroku 2 i powtórzenie przez 25 cykli, Krok 6: końcowe przedłużenie w temperaturze 68 °C przez 60 s.
	<ol>
		<li>Użyj podkładów BamHI_SP2F2 (GGATCC, CTA, GAA, CTA, GTG, GAT, CCC, CC) i BamHI_SP2R2 (GGATCC, AAT, TCT, GCA, GAT, TTT, AC, ATG, ATC). Plazmid pR412 został pozyskany od dr Marca PrudHomme'a (CNRS-Universite Paul Sabatier Toulouse, Francja).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analizować amplikony PCR za pomocą elektroforezy żelowej. Wyciąć i oczyścić otrzymany amplikon PCR, jak opisano powyżej.</li>
</ol>
2. Wytwarzanie plazmidu pSD1 i przemiana chemiczna E. coli Dh5α
<ol>
	<li>Wykonać podwiązanie zgodnie z instrukcją producenta pGEMT-easy system I (Tabela materiałów). W probówce do mikrowirówki dodać 5 μl buforu do ligacji, 1 μl pGEMTeasy, 2 μl produktu ply_SOE, 1 μl ligazy DNA T4 i wodę do całkowitej objętości 20 μl. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. W ten sposób generowany jest plazmid pSD1.</li>
	<li>Przekształć chemicznie kompetentną E. coli Dh5α za pomocą pSD1. Zacznij od inkubacji 50 μl chemicznie kompetentnej E. coli Dh5α z 3 μl reakcji ligacji pSD1 przez 15 minut na lodzie. Następnie kontynuuj, wystawiając ogniwa na szok termiczny (42 °C, 30 s). Umieść komórki na lodzie na 2 minuty.</li>
	<li>Usuń komórki z lodu i dodaj 350 μl pożywki S.O.C. Inkubować kulturę przez 2 godziny w temperaturze 37 °C, 120 obr./min.</li>
	<li>Umieść transformację na agarze Luria Bertani (LBA) uzupełnionym 0,4 mM IPTG, 0,24 mg / ml X-Gal do selekcji niebiesko-białej i 100 μg / ml ampicyliny, aby upewnić się, że wszystkie kolonie rosnące na płytce mają szkielet plazmidowy. Białe kolonie zawierają pSD1.</li>
	<li>Wybierz trzy białe kolonie i ustaw nocne wzrosty w 10 ml LB, uzupełnione 100 μg/ml ampicyliny. Inkubować kultury przez noc w temperaturze 37 °C, wstrząsając.</li>
	<li>Następnego dnia odwirować kultury o masie 3,082 x g i użyć osadu do ekstrakcji plazmidu.</li>
</ol>
3. Ekstrakcja plazmidowego DNA, trawienie restrykcyjne genu pSD1 i spektynomycyny oraz składanie pSD2
<ol>
	<li>Wyodrębnij plazmidowe DNA zgodnie z instrukcjami dostarczonymi z zestawem komercyjnym (tabela materiałów).</li>
	<li>Ustaw trawienie restrykcyjne BamHI zarówno dla plazmidu pSD1, jak i kasety spektynomycyny, uprzednio amplifikowanej i oczyszczonej. Należy zastosować następujące warunki i ilości opisane w tabeli 1.</li>
	<li>Inkubować reakcje trawienia restrykcyjnego i kontrole w temperaturze 37 °C przez 3 godziny.</li>
	<li>Przeanalizować trawienie restrykcji za pomocą elektroforezy, wyciąć banderolę i oczyścić zgodnie z instrukcjami dostarczonymi z zestawem handlowym (tabela materiałów).</li>
	<li>Następnie należy przygotować reakcję ligacji zgodnie z instrukcjami producenta (tabela materiałów) przy użyciu trawionego przez BamHI pSD1 i spektynomycyny (od kroku 3.2). Do probówki do mikrowirówki dodać następujące składniki reakcji: 5 μl buforu do ligacji, 2 μl pSD1, 2 μl kasety spektynomycyny, 1 μl ligazy DNA T4 i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. W ten sposób generowany jest plazmid pSD2.</li>
	<li>Przekształć plazmid pSD2 w chemicznie kompetentny E. coli Dh5α, jak opisano w kroku 2.2.</li>
	<li>Wybierz transformanty przenoszące plazmid pSD2 na podstawie ich zdolności do wzrostu w LBA uzupełnionym 100 μg/ml spektynomycyny i ampicyliny.</li>
	<li>Wykonaj ekstrakcję plazmidowego DNA (pSD2) zgodnie z powyższym opisem i zgodnie z instrukcjami producenta (μL).</li>
</ol>
4. Transformacja szczepu S. pneumoniae 519/43
<ol>
	<li>Przygotować nocną hodowlę S. pneumoniae 519/43 w BHI i pozostawić do statycznego wzrostu w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>Następnego dnia rozcieńczyć kultury w stosunku 1:50 i 1:100 w 10 ml świeżego bulionu BHI. Inkubować kultury statycznie w temperaturze 37 °C, aż OD595 nm znajdzie się między 0,05 a 0,1 (optymalne pobieranie DNA bliższe 0,1 OD).</li>
	<li>Po osiągnięciu OD 0,1 weź 860 μl i przenieś do probówki mikrowirówkowej. Do tej samej probówki do mikrowirówki dodaj: 100 μL 100 mM NaOH, 10 μL 20% (w/v) BSA, 10 μL 100 mM CaCl2, 2 μL 50 ng/ml CSP124 i 500 ng pSD2.</li>
	<li>Inkubować reakcję statycznie w temperaturze 37 °C przez 3 godziny.</li>
	<li>Umieść 330 μl na 5% płytkach z agarem z krwią (BA) uzupełnionych 100 μg/ml spektynomycyny, co godzinę przez 3 godziny inkubacji.</li>
	<li>Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Plastrować kolonie oporne na spektynomycynę na inną płytkę BA uzupełnioną 100 μg/ml spektynomycyny, a także na płytki BA uzupełnione 100 μg/ml ampicyliny. Inkubować oba zestawy płytek przez noc w warunkach określonych powyżej. Płytki ampicyliny mają na celu zbadanie obecności szkieletu plazmidowego.</li>
	<li>Potwierdzić obecność kasety z spektynomycyną metodą PCR przy użyciu starterów plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG) i SPEC_REV (TAATTCCTCTAAGTCATAATTTCCG). Potwierdź mutację metodą PCR przy użyciu starterów plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA) i plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT), które przyczepiają się poza zmutowanym regionem.</li>
	<li>Potwierdź integrację we właściwej lokalizacji genomu poprzez sekwencjonowanie za pomocą starterów plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA), plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACACGGCTGAT), a także starterów z miejscem ich wiązania w kasecie spektynomycyny sqr1 (CCTGATCCAAACATGTAAGTACC) sqf2 (CGTAGTTATCTTGGAGAGAATA) spec_sqf1 (GGTACTTACATGTTTGGATCAGG ) i spec_sqr2 TATTCTCTCCAAGATAACTACG.</li>
</ol>

<ol><li>Bentley, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Analysis+of+the+Capsular+Biosynthetic+Locus+from+All+90+Pneumococcal+Serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic Analysis of the Capsular Biosynthetic Locus from All 90 Pneumococcal Serotypes.</a> PLoS Genetics. 2 (3), 31(2006).</li>
<li>Calix, J. J., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+pneumococcal+serotype%2C+11E%2C+has+a+variably+inactivated+wcjE+gene%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">A new pneumococcal serotype, 11E, has a variably inactivated wcjE gene.</a> The Journal of Infectious Diseases. 202 (1), 29-38 (2010).</li>
<li>Park, I. H., Pritchard, D. G., Cartee, R., Brandao, A., Brandileone, M. C. C., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+New+Capsular+Serotype+%286C%29+within+Serogroup+6+of+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Discovery of a New Capsular Serotype (6C) within Serogroup 6 of Streptococcus pneumoniae.</a> Journal of Clinical Microbiology. 45 (4), 1225-1233 (2007).</li>
<li>Jin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+Report+of+Putative+Streptococcus+pneumoniae+Serotype+6D+among+Nasopharyngeal+Isolates+from+Fijian+Children%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">First Report of Putative Streptococcus pneumoniae Serotype 6D among Nasopharyngeal Isolates from Fijian Children.</a> The Journal of Infectious Diseases. 200 (9), 1375-1380 (2009).</li>
<li>Oliver, M. B., vander Linden, M. P. G., Küntzel, S. A., Saad, J. S., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+Streptococcus+pneumoniae+Serotype+6+Variants+with+Glycosyltransferases+Synthesizing+Two+Differing+Repeating+Units%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Discovery of Streptococcus pneumoniae Serotype 6 Variants with Glycosyltransferases Synthesizing Two Differing Repeating Units.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (36), 25976-25985 (2013).</li>
<li>Calix, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serological+Characterization+of+Two+Capsule+Subtypes+among+Streptococcus+pneumoniae+Serotype+20+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Serological Characterization of Two Capsule Subtypes among Streptococcus pneumoniae Serotype 20 Strains.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (33), 27885-27894 (2012).</li>
<li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((and+Serological+Characterization+of+a+New+Pneumococcal+Serotype%2C+6H%2C+and+Generation+of+a+Pneumococcal+Strain+Producing+Three+Different+Capsular+Repeat+Units%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Vaccine+Immunology%22%5BJournal%5D)">and Serological Characterization of a New Pneumococcal Serotype, 6H, and Generation of a Pneumococcal Strain Producing Three Different Capsular Repeat Units.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 22 (3), 313-318 (2015).</li>
<li>O'Brien, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+disease+caused+by+Streptococcus+pneumoniae+in+children+younger+than+5+years%3A+global+estimates%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates.</a> The Lancet. 374 (9693), 893-902 (2009).</li>
<li>Henriques-Normark, B., Tuomanen, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pneumococcus%3A+Epidemiology%2C+Microbiology%2C+and+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Pneumococcus: Epidemiology, Microbiology, and Pathogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 3 (7), 010215(2013).</li>
<li>Leimkugel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Outbreak+of+Serotype+1+Streptococcus+pneumoniae+Meningitis+in+Northern+Ghana+with+Features+That+Are+Characteristic+of+Neisseria+meningitidis+Meningitis+Epidemics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">An Outbreak of Serotype 1 Streptococcus pneumoniae Meningitis in Northern Ghana with Features That Are Characteristic of Neisseria meningitidis Meningitis Epidemics.</a> The Journal of Infectious Diseases. 192 (2), 192-199 (2005).</li>
<li>Yaro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiological+and+Molecular+Characteristics+of+a+Highly+Lethal+Pneumococcal+Meningitis+Epidemic+in+Burkina+Faso%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Epidemiological and Molecular Characteristics of a Highly Lethal Pneumococcal Meningitis Epidemic in Burkina Faso.</a> Clinical Infectious Diseases. 43 (6), 693-700 (2006).</li>
<li>Antonio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+epidemiology+of+pneumococci+obtained+from+Gambian+children+aged+2-29+months+with+invasive+pneumococcal+disease+during+a+trial+of+a+9-valent+pneumococcal+conjugate+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Molecular epidemiology of pneumococci obtained from Gambian children aged 2-29 months with invasive pneumococcal disease during a trial of a 9-valent pneumococcal conjugate vaccine.</a> BMC Infectious Diseases. 8 (1), 81(2008).</li>
<li>Kwambana-Adams, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+outbreak+of+pneumococcal+meningitis+among+older+children+%28%E2%89%A55+years%29+and+adults+after+the+implementation+of+an+infant+vaccination+programme+with+the+13-valent+pneumococcal+conjugate+vaccine+in+Ghana%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">An outbreak of pneumococcal meningitis among older children (≥5 years) and adults after the implementation of an infant vaccination programme with the 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in Ghana.</a> BMC Infectious Diseases. 16 (1), 575(2016).</li>
<li>Antonio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seasonality+and+outbreak+of+a+predominant+Streptococcus+pneumoniae+serotype+1+clone+from+The+Gambia%3A+Expansion+of+ST217+hypervirulent+clonal+complex+in+West+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Seasonality and outbreak of a predominant Streptococcus pneumoniae serotype 1 clone from The Gambia: Expansion of ST217 hypervirulent clonal complex in West Africa.</a> BMC Microbiology. 8 (1), 198(2008).</li>
<li>Staples, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+an+Australian+serotype+1+Streptococcus+pneumoniae+outbreak%5BTitle%5D)+AND+%22Epidemiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of an Australian serotype 1 Streptococcus pneumoniae outbreak.</a> Epidemiology and Infection. 143 (2), 325-333 (2015).</li>
<li>Gessner, B. D., Mueller, J. E., Yaro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((African+meningitis+belt+pneumococcal+disease+epidemiology+indicates+a+need+for+an+effective+serotype+1+containing+vaccine%2C+including+for+older+children+and+adults%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">African meningitis belt pneumococcal disease epidemiology indicates a need for an effective serotype 1 containing vaccine, including for older children and adults.</a> BMC Infectious Diseases. 10 (1), 22(2010).</li>
<li>Hill, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasopharyngeal+carriage+of+Streptococcus+pneumoniae+in+Gambian+infants%3A+a+longitudinal+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae in Gambian infants: a longitudinal study.</a> Clinical Infectious Diseases. 46 (6), 807-814 (2008).</li>
<li>Ebruke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+changes+in+nasopharyngeal+carriage+of+Streptococcus+pneumoniae+serotype+1+genotypes+in+healthy+Gambians+before+and+after+the+7-valent+pneumococcal+conjugate+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Temporal changes in nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae serotype 1 genotypes in healthy Gambians before and after the 7-valent pneumococcal conjugate vaccine.</a> PeerJ. 3, 90(2015).</li>
<li>Adegbola, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotype+and+antimicrobial+susceptibility+patterns+of+isolates+of+Streptococcus+pneumoniae+causing+invasive+disease+in+The+Gambia+1996-2003%5BTitle%5D)+AND+%22Tropical+Medicine+and+International+Health%22%5BJournal%5D)">Serotype and antimicrobial susceptibility patterns of isolates of Streptococcus pneumoniae causing invasive disease in The Gambia 1996-2003.</a> Tropical Medicine and International Health. 11 (7), 1128-1135 (2006).</li>
<li>Marks, L. R., Reddinger, R. M., Hakansson, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Levels+of+Genetic+Recombination+during+Nasopharyngeal+Carriage+and+Biofilm+Formation+in+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">High Levels of Genetic Recombination during Nasopharyngeal Carriage and Biofilm Formation in Streptococcus pneumoniae.</a> mBio. 3 (5), (2012).</li>
<li>Ritchie, N. D., Mitchell, T. J., Evans, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+different+about+serotype+1+pneumococci%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiology%22%5BJournal%5D)">What is different about serotype 1 pneumococci.</a> Future Microbiology. 7 (1), 33-46 (2012).</li>
<li>Harvey, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+variable+region+of+pneumococcal+pathogenicity+island+1+is+responsible+for+unusually+high+virulence+of+a+serotype+1+isolate%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">The variable region of pneumococcal pathogenicity island 1 is responsible for unusually high virulence of a serotype 1 isolate.</a> Infection and Immunity. 84 (3), 822-832 (2016).</li>
<li>Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+splicing+by+overlap+extension%3A+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> BioTechniques. 8 (5), 528-535 (1990).</li>
<li>Alioing, G., Granadel, C., Morrison, D. A., Claverys, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competence+pheromone%2C+oligopeptide+permease%2C+and+induction+of+competence+in+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Competence pheromone, oligopeptide permease, and induction of competence in Streptococcus pneumoniae.</a> Molecular Microbiology. 21 (3), 471-478 (1996).</li>
<li>Lund, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLund%2C+E+%22Enumeration+and+description+of+the+strains+belonging+to+the+State+Serum+Institute%2C+Copenhagen+Denmark%22">Enumeration and description of the strains belonging to the State Serum Institute, Copenhagen Denmark</a>. , (1951).</li>
<li>Barany, F., Tomasz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+Streptococcus+pneumoniae+by+heterologous+plasmid+deoxyribonucleic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of Streptococcus pneumoniae by heterologous plasmid deoxyribonucleic acid.</a> Journal of Bacteriology. 144 (2), 698-709 (1980).</li>
<li>Terra, V. S., Homer, K. A., Rao, S. G., Andrew, P. W., Yesilkaya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+novel+%CE%B2-galactosidase+activity+that+contributes+to+glycoprotein+degradation+and+virulence+in+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Characterization of novel β-galactosidase activity that contributes to glycoprotein degradation and virulence in Streptococcus pneumoniae.</a> Infection and Immunity. 78 (1), (2010).</li>
<li>Terra, V. S., Zhi, X., Kahya, H. F., Andrew, P. W., Yesilkaya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumococcal+6-phospho-%CE%B2-glucosidase+%28BglA3%29+is+involved+in+virulence+and+nutrient+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Pneumococcal 6-phospho-β-glucosidase (BglA3) is involved in virulence and nutrient metabolism.</a> Infection and Immunity. 84 (1), (2015).</li>
<li>Harvey, R. M., Ogunniyi, A. D., Chen, A. Y., Paton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumolysin+with+Low+Hemolytic+Activity+Confers+an+Early+Growth+Advantage+to+Streptococcus+pneumoniae+in+the+Blood%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Pneumolysin with Low Hemolytic Activity Confers an Early Growth Advantage to Streptococcus pneumoniae in the Blood.</a> Infection and Immunity. 79 (10), 4122(2011).</li>
<li>Terra, V. S., Plumptre, C. D., Wall, E. C., Brown, J. S., Wren, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+pneumolysin+deficient+mutant+in+Streptococcus+pneumoniae+serotype+1+strain+519%2F43+and+phenotypic+characterisation%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathogenesis%22%5BJournal%5D)">Construction of a pneumolysin deficient mutant in Streptococcus pneumoniae serotype 1 strain 519/43 and phenotypic characterisation.</a> Microbial Pathogenesis. 141, 103999(2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Streptococcus pneumoniae, w szczególności serotyp 1, nadal stanowi globalne zagrożenie powodujące inwazyjną chorobę pneumokokową i zapalenie opon mózgowych. Pomimo wprowadzenia różnych szczepionek, które powinny chronić przed serotypem 1, w Afryce ten serotyp jest nadal zdolny do wywoływania epidemii, które prowadzą do wysokiej zachorowalności i śmiertelności13. Możliwość genetycznej manipulacji tym serotypem ma kluczowe znaczenie ze względu na jej znaczenie kliniczne. Metoda opisana w ty...

Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae, pneumokoki) jest jedną z głównych przyczyn zachorowalności i śmiertelności na całym świecie. Do niedawna odkryto blisko 100 serotypów S. pneumoniae1,2,3,4,5,6,7. Rocznie, inwazyjna choroba pneumokokowa (IPD) powoduje około 700 000 zgonów dzieci poniżej 5 roku życia8. S. pneumoniae jest główną przyczyną bakteryjnego zapalenia płuc, zapalenia ucha środkowego, zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych i posocznicy na całym świecie9.
W afrykańskim pasie zapalenia opon mózgowych, serotyp 1 jest odpowiedzialny za wybuchy zapalenia opon mózgowych, gdzie typ sekwencji (ST) ST217, niezwykle zjadliwy typ sekwencji, jest dominujący10,11,12,13,14,15. Jego znaczenie w patologii zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych zostało porównane do znaczenia Neisseria meningitidis w afrykańskim zapaleniu opon mózgowych belt16. Serotyp 1 jest często główną przyczyną IChP; Jednak bardzo rzadko można go znaleźć w przewozie. W rzeczywistości w Gambii ten serotyp odpowiada za 20% wszystkich chorób inwazyjnych, ale stwierdzono go tylko u 0,5% zdrowych nosicieli14,17,18,19. Wymiana genetyczna i rekombinacja genetyczna u kompetentnych pneumokoków zachodzi na ogół w nosicielstwie, a nie w chorobie inwazyjnej20. Ponadto wykazano, że serotyp 1 ma jeden z najkrótszych wskaźników nosicielstwa opisanych wśród pneumokoków (tylko 9 dni). W związku z tym zaproponowano, że ten serotyp może mieć znacznie niższy współczynnik rekombinacji niż inne21.
Konieczne są dogłębne badania, aby zrozumieć przyczynę niskiej szybkości przenoszenia szczepów serotypu 1 i jego znaczenie w inwazyjnych chorobach w Afryce Subsaharyjskiej.
Tutaj przedstawiamy protokół, który pozwala na mutagenezę całego genomu określonego szczepu serotypu 1, 519/43. Szczep ten może łatwo pozyskiwać i rekombinować nowe DNA w swoim genomie. Metoda ta nie jest jeszcze międzyszczepowa, ale jest bardzo skuteczna, gdy jest wykonywana na tle 519/43 (inne cele zostały zmutowane, manuskrypty w przygotowaniu). Po prostu używając szczepu 519/43 i wykorzystując jego naturalne kompetencje, a także zastępując sposób, w jaki dostarczane jest egzogenne DNA, byliśmy w stanie zmutować gen pneumolizyny (ply) w tym szczepie serotypu 1. Ta metoda stanowi ulepszenie w stosunku do metody przedstawionej przez Harvey et al.22, ponieważ jest wykonywana w jednym kroku, bez konieczności przechodzenia DNA przez inny serotyp. Niemniej jednak, ze względu na zmienność między szczepami, żadna metoda nie została ustandaryzowana dla wszystkich szczepów. Zdolność do mutacji określonych genów i obserwowania jej skutków pozwoli na dogłębne zrozumienie szczepów S. pneumoniae serotypu 1 i dostarczy odpowiedzi na pytania dotyczące roli tych szczepów w zapaleniu opon mózgowo-rdzeniowych w Afryce Subsaharyjskiej.

<table><tbody><tr><td>AccuPrime Pfx polimeraza DNA</td><td>Invitrogen</td><td>12344024</td><td>Służy do amplifikacji fragmentów</td></tr><tr><td>Sól sodowa ampicyliny</td><td>Sigma</td><td>Aldrich A9518</td><td>Służy do selekcji bakterii na etapie 1 (pSD1)</td></tr> <tr><td>Agar z krwi Oxoid</td><td></td><td>CM0055</td><td>Służy do powlekania S. pneumoniae transformanty</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca Albumina</td><td>sigma</td><td>55470</td><td>używany do S. pneumoniae Transformacja</td></tr><tr><td>Brain Heart Infusion</td><td>Oxoid</td><td>CM1135</td><td>używany do wzrostu komórek S. pneumoniae</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia Cacl2</td><td>Sigma</td><td>449709 stosowany</td><td>do S. pneumoniae Kompetencja transformacji</td></tr><tr><td>peptyd stymulujący 1</td><td>AnaSpec</td><td>AS-63779</td><td>używany do S. pneumoniae Transformacja</td></tr><tr><td>Luria Bulion Agar</td><td>Gibco</td><td>22700025</td><td>używany do posiewu i selekcji pSD1 i pSD2</td></tr><tr><td>Luria Bulion Base (formulacja Millera)</td><td>Gibco</td><td>12795027</td><td>używany do posiewu i selekcji pSD1 i pSD2</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu Monarch</td><td>NEB</td><td>T1020S</td><td>Służy do ekstrakcji prążków z żelu DNA</td></tr><tr><td>Plasmid Monarch Zestaw Miniprep NEB</td><td></td><td>T1010S</td><td>Służy do ekstrakcji plazmidu z komórek</td></tr><tr><td>pGEM T-easy</td><td>Promega</td><td>A1360</td><td>stosowany jako plazmid</td></tr><tr><td>samobójczy S.O.C.</td><td>Invitrogen</td><td>15544034</td><td>stosowany do odzyskiwania komórek po przemianie</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>Sigma</td><td>S0899</td><td>stosowany do S.pneumoniae Transformacja</td></tr><tr><td>Chlorowodorek spektynomycyny</td><td>SigmaAldrich</td><td>PHR1426</td><td>Stosowany do selekcji</td></tr><tr><td>bakterii Skuteczność subklonowania DH5&alpha; Kompetentne komórki</td><td>Invitrogen</td><td>18265017</td><td>wykorzystywane do tworzenia pSD1 i pSD2</td></tr></tbody></table>

konstruowanie mutantów w serotypie 1 streptococcus pneumoniae szczep 519/43

Constructing Mutants in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae strain 519/43

Streptococcus pneumoniae serotyp 1 pozostaje ogromnym problemem w krajach o niskich i średnich dochodach, szczególnie w Afryce Subsaharyjskiej. Pomimo jego znaczenia, badania nad tym serotypem były utrudnione ze względu na brak narzędzi genetycznych do jego modyfikacji. W tym badaniu opisujemy metodę genetycznej modyfikacji izolatu klinicznego serotypu 1 (szczep 519/43). Co ciekawe, udało się to osiągnąć dzięki wykorzystaniu zdolności pneumokoków do naturalnego pozyskiwania DNA. Jednak w przeciwieństwie do większości pneumokoków, zastosowanie liniowego DNA nie powiodło się; Aby zmutować ten ważny szczep, trzeba było użyć plazmidu samobójczego. Metodologia ta umożliwiła głębsze zrozumienie tego nieuchwytnego serotypu, zarówno pod względem biologicznym, jak i patogenności. Aby potwierdzić tę metodę, główna znana toksyna pneumokokowa, pneumolizyna, została zmutowana, ponieważ ma dobrze znany i łatwy do śledzenia fenotyp. Wykazaliśmy, że mutant, zgodnie z oczekiwaniami, utracił zdolność do lizy czerwonych krwinek. Dzięki możliwości zmutowania ważnego genu w interesującym nas serotypie, byliśmy w stanie zaobserwować różne fenotypy mutantów utraty funkcji w przypadku infekcji dootrzewnowych i donosowych od tych obserwowanych dla innych serotypów. Podsumowując, badanie to dowodzi, że szczep 519/43 (serotyp 1) może być modyfikowany genetycznie.

Opisany tutaj protokół rozpoczyna się od zastosowania PCR w celu amplifikacji lewego i prawego ramienia homologii, przy jednoczesnym usunięciu 191 bp z regionu środkowego genu ply. Podczas przeprowadzania PCR wprowadzana jest sekwencja rozpoznawcza BamHI na końcu 3’ lewego ramienia homologii oraz na końcu 5’ prawego ramienia homologii (Rycina 1A). Następnie przeprowadzana jest procedura PCR-SOE, w której lewe i prawe ramiona homologii są łączone w jeden amplikon (<strong class="xfig...

Tutaj opisujemy szczep S. pneumoniae serotyp 1 519/43, który może być genetycznie modyfikowany poprzez wykorzystanie jego zdolności do naturalnego pozyskiwania DNA i plazmidu samobójczego. Jako dowód tej zasady stworzono izogenicznego mutanta w genie pneumolizyny (ply).

Konstruowanie mutantów w serotypie 1 Streptococcus pneumoniae szczep 519/43

Streptococcus pneumoniae serotype 1 remains a huge problem in low-and-middle income countries, particularly in sub-Saharan Africa. Despite its importance, ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ umożliwia modyfikację genetyczną wcześniej niewykonalnego serotypu, umożliwiając badania i zrozumienie serotypu. Otwiera to możliwości dla prac biologicznych, takich jak opracowywanie szczepionek. Procedurę zademonstruje Vanessa S.Terra, adiunkt z London School of Hygiene and Tropical Medicine.Aby rozpocząć generowanie plazmidu pSD1, wykonując ligację zgodnie z instrukcjami producenta pGEM-T Easy System I. Inkubować reakcję przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia przekształć chemicznie kompetentną E.coli Dh5-alfa z pSD1, inkubując 50 mikrolitrów komórek z trzema mikrolitrami reakcji ligacji pSD1 przez 15 minut na lodzie, a następnie wystawić komórki na szok termiczny i umieścić komórki na lodzie na dwie minuty.Usuń komórki z lodu i dodaj 350 mikrolitrów pożywki SOC, a następnie inkubuj kulturę przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 120 obr./min. Umieść przemianę na agarze Luria-Bertani uzupełnionym 0,4 milimolowym IPTG, 0,24 miligrama na mililitr X-Gal do selekcji niebiesko-białej i 100 mikrogramów na mililitr ampicyliny, aby upewnić się, że wszystkie kolonie rosnące na płytce mają szkielet plazmidowy. Wybierz trzy białe kolonie, które zawierają pSD1 i ustaw nocny wzrost w 10 mililitrach L-B uzupełnionych 100 mikrogramami na mililitr ampicyliny.Inkubuj kultury przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając. Następnego dnia odwirować kultury w stężeniu 3 082 G i użyć osadu do ekstrakcji plazmidu. Po wyekstrahowaniu DNA plazmidu należy ustawić trawienie restrykcyjne BamH1 zarówno dla plazmidu pSD1, jak i kasety spektynomycyny.Inkubować reakcje trawienia restrykcyjnego i kontrole w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny. Po zakończeniu ograniczenia przeanalizuj produkty za pomocą elektroforezy, a następnie wytnij odpowiednią banderolę i oczyść ją za pomocą zestawu komercyjnego. Następnie przeprowadź reakcję ligacji przy użyciu trawionego przez BamH1 pSD1 i spektynomycyny.Spowoduje to wygenerowanie plazmidu pSD2. Przekształć pSD2 w chemicznie kompetentną E.coli DH5-alfa, jak opisano wcześniej. Następnie wybierz transformanty przenoszące plazmid pSD2 na podstawie ich zdolności do wzrostu w LBA uzupełnionym 100 mikrogramami na mililitr spektynomycyny i ampicyliny i wyekstrahuj plazmidowe DNA.Przygotuj na noc hodowlę S.pneumoniae 519/43 w BHI i pozwól jej rosnąć statycznie w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia rozcieńczyć kultury w proporcjach 1:50 i 1:100 w 10 mililitrach świeżego bulionu BHI. Inkubuj kulturę statycznie w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż OD przy 595 nanometrach będzie wynosił od 0,05 do 0,1.Po osiągnięciu odpowiedniego OD weź 860 mikrolitrów kultury i przenieś ją do probówki do mikrowirówki. Dodaj 100 mikrolitrów 100-milimolowego wodorotlenku sodu, 10 mikrolitrów 20% BSA, 10 mikrolitrów 100-milimolowego chlorku wapnia, dwa mikrolitry 50 nanogramów na mililitr CSP1 i 500 nanogramów pSD2. Inkubować reakcję statycznie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny.Następnie rozłóż 330 mikrolitrów na 5% płytkach z agarem z krwią, uzupełnionych 100 mikrogramami na mililitr spektynomycyny co godzinę przez trzygodzinny okres inkubacji. Następnie inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Plastrować kolonie oporne na spektynomycynę na inną płytkę z agarem z krwią uzupełnioną 100 mikrogramami na mililitr spektynomycyny i na płytki z agarem z krwią uzupełnioną 100 mikrogramami na mililitr ampicyliny, co testuje obecność szkieletu plazmidu.Inkubuj oba zestawy płytek przez noc. Prawidłowe składanie pSD2 zostało potwierdzone trawieniem restrykcyjnym. pSD2 został następnie wykorzystany do transformacji 519,43 komórek typu dzikiego.Kolonie rosnące na spektynomycynie po całonocnej inkubacji uznano za dodatnie transformanty. Fenotypowe potwierdzenie mutacji pneumolizyny przeprowadzono poprzez ocenę aktywności hemolitycznej dla warstwy D39, 519/43 typu dzikiego i zmutowanej 519/43 delta. Porównano to z hemolizą czerwonych krwinek przez 0,5%saponinę, która jest uważana za 100%Mutant stracił zdolność do lizy czerwonych krwinek.Wszystkie dodatnie kolonie zostały następnie potwierdzone przez sekwencjonowanie w celu oceny lokalizacji insercji. Zastosowano startery z miejscami wiązania poza obszarem homologii. Podczas przeprowadzania reakcji przemiany ważne jest, aby dodawać odczynniki we właściwej kolejności.

constructing-mutants-serotype-1-streptococcus-pneumoniae-strain

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Systematyczne, wielkoskalowe przesiewy syntetycznych interakcji genetycznych (gen-gen lub epistaza) mogą być wykorzystywane do badania redundancji genetycznej i wzajemnych powiązań między szlakami sygnałowymi. W niniejszej pracy opisujemy opracowaną przez nas technologię wysokoprzepustowych ilościowych przesiewów macierzy syntetycznych interakcji genetycznych, nazwaną eSGA, służącą do wyjaśniania relacji epistatycznych i badania sieci interakcji genetycznych w Escherichia coli.

Mapowanie bakteryjnych sieci funkcjonalnych i szlaków w Escherichia Coli z wykorzystaniem syntetycznych macierzy genetycznych

Źródło: Bennett, J. A. i wsp. Wizualna i mikroskopowa ocena mutantów rozwojowych Streptomyces . J. Vis. Exp. (2018)Ten film pokazuje zastosowanie mikroskopii z kontrastem fazowym do badania różnic fenotypowych między dzikim a zmutowanym Streptomyces coelicolor. Przedstawiono w nim etapy związane z przygotowaniem i obrazowaniem włókien powietrznych w celu wykrycia wad rozwojowych w tworzeniu zarodników.

Mikroskopia z kontrastem fazowym do oceny mutantów rozwojowych u Streptomyces

Śledzenie w czasie rzeczywistym wpływu czynników wirulencji pneumokoków w modelu ostrego mysiego zapalenia płuc z wykorzystaniem bakterii bioluminescencyjnych

Wprowadzanie wielu zmian genomowych do cyjanobakterii jest niezbędnym narzędziem w rozwoju szczepów do celów przemysłowych i badań podstawowych. Opisano system generowania nieoznaczonych mutantów w modelowym gatunku sinic Synechocystis sp. PCC6803 oraz znakowanych mutantów w Synechococcus sp. PCC7002.

Generowanie znakowanych i bezznacznikowych mutantów w modelowych gatunkach sinic

Opisujemy łatwą, szybką i stosunkowo tanią metodę generowania zaburzonych genami szczepów Streptococcus mutans; technika ta może być dostosowana do generowania zaburzonych genami szczepów różnych gatunków.

Wytwarzanie szczepu Streptococcus mutans z zaburzeniami genetycznymi bez klonowania genów

Zakażenie Pseudomonas aeruginosa powoduje znaczną zachorowalność u wrażliwych gospodarzy. Nieredundantna biblioteka mutantów insercji transpozonów szczepu PA14 P. aeruginosa, oznaczona jako PA14NR Set, ułatwia analizę funkcjonalności genów w wielu procesach. Przedstawiono tutaj protokół do generowania wysokiej jakości kopii biblioteki mutantów PA14NR Set.

Replikacja uporządkowanej, nieredundantnej biblioteki mutantów insercji transpozonów Pseudomonas aeruginosa szczepu PA14

Opisana tutaj jest prosta metoda oczyszczania produktu genowego u Streptococcus mutans. Technika ta może być korzystna w oczyszczaniu białek, zwłaszcza białek błonowych i białek o dużej masie cząsteczkowej, i może być stosowana z różnymi innymi gatunkami bakterii.

Oczyszczanie białka o wysokiej masie cząsteczkowej w Streptococcus mutans

Rozszerzenie kodu genetycznego jest stosowane do wprowadzenia nienaturalnego aminokwasu posiadającego biorthogonalną grupę funkcyjną na białku nośnikowym w określonym miejscu. Funkcja biortogalna jest dalej wykorzystywana do selektywnego sprzęgania antygenu węglowodanowego w celu uzyskania jednorodnej szczepionki skoniugowanej glikokoniugatem.

Jednorodny glikokoniugat wytwarzany przez połączenie nienaturalnej inkorporacji aminokwasów i chemii kliknięć do celów szczepionkowych

System rekombinacji za pośrednictwem λ-czerwieni został użyty do stworzenia mutanta delecji małego niekodującego RNA micC.

Niekodujący mały RNA MicC przyczynia się do zjadliwości białek błony zewnętrznej w Salmonella enteritidis

Tutaj opisujemy budowę mutantów zerowych Aeromonas w określonych glikozylotransferazach lub regionach zawierających glikozylotransferazy, testy ruchliwości i oczyszczanie wici przeprowadzone w celu ustalenia udziału i funkcji kodowanych przez nie enzymów w biosyntezie glikanu, a także rolę tego glikanu w patogenezie bakterii.

Generowanie mutantów zerowych w celu wyjaśnienia roli glikozylotransferaz bakteryjnych w ruchliwości bakterii

Ten artykuł opisuje nowy model myszy do przejścia pneumokoków z bezobjawowego kolonizatora w patogen chorobotwórczy podczas infekcji wirusowej. Model ten można łatwo zaadaptować do badania interakcji wielodrobnoustrojowych i gospodarz-patogen w różnych fazach progresji choroby i u różnych gospodarzy.

Mysi model przejścia Streptococcus pneumoniae z kolonizatora w patogen po koinfekcji wirusowej podsumowuje chorobę zaostrzoną wiekiem

Poznaj metodę konstruowania izogenicznych mutantów w genie pneumolizyny w Streptococcus pneumoniae serotypu 1. Technika ta wykorzystuje naturalną zdolność bakterii do pobierania DNA i otwiera nowe możliwości badań nad szczepionkami.

Konstruowanie mutantów w serotypie 1 Streptococcus pneumoniae szczep 519/43

Przeglądaj więcej filmów