Wysokoprzepustowe badania przesiewowe związków chemicznych w celu wyjaśnienia ich wpływu na trwałość bakterii

Opisany tutaj protokół umożliwia zidentyfikowanie warunków, które mogą znacząco wpływać na trwałość bakterii w sposób wysokoprzepustowy. Metodę tę można łatwo dostosować do badań przesiewowych w różnych obszarach, takich jak panele leków, biblioteki genów i inne. Ponieważ metoda obejmuje różne etapy podrzędne, które należy przeprowadzić jednocześnie, demonstracja wizualna może pomóc naukowcom w zarządzaniu czasem w celu uzyskania precyzyjnych wyników.

Zacznij od przygotowania kultur komórkowych w mikromacierzy. Przenieś 250 mikrolitrów komórek fazy wykładniczej do 25 mililitrów świeżej modyfikowanej pożywki LB w 50-mililitrowej probówce wirówkowej. Następnie delikatnie wymieszaj zawiesinę komórkową, aby była jednorodna.

Przenieść rozcieńczoną zawiesinę komórkową do sterylnego zbiornika o pojemności 50 mililitrów. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 150 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdej studzienki płytki mikromacierzy zawierającej różne substancje chemiczne. Mikromacierze mogą być również generowane ręcznie zgodnie z metodą opisaną w manuskrypcie tekstowym.

Przykryj płytkę mikromacierzy gazoprzepuszczalną membraną sufitową i inkubuj ją w wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 250 obr./min przez 24 godziny. Aby przygotować płytki do oznaczania trwałości, należy przygotować 25 mililitrów zmodyfikowanej pożywki LB zawierającej pięć mikrogramów na mililitr ofloksacyny w 50-mililitrowej probówce wirówkowej i przenieść tę pożywkę do sterylnego zbiornika. Przenieść 190 mikrolitrów zmodyfikowanej pożywki LB do każdego dołka ogólnej płytki 96-dołkowej z płaskim dnem.

Po 24-godzinnej inkubacji wyjąć mikromacierz z wytrząsarki i przenieść 10 mikrolitrów kultur komórkowych z mikromacierzy do dołków płytki do oznaczania trwałego zawierającej zmodyfikowaną pożywkę LB z ofloksacyną. Pobrać 10 mikrolitrów zawiesiny komórek z płytki esejowej do utrwalania i seryjnie rozcieńczyć ją trzykrotnie w 290 mikrolitrach roztworu PBS za pomocą okrągłej płytki 96-dołkowej i pipety wielokanałowej. Następnie umieść 10 mikrolitrów wszystkich seryjnie rozcieńczonych zawiesin komórkowych na świeżych płytkach agarowych bez antybiotyków.

Przykryj płytkę testową persistera membraną sufitową przepuszczającą gaz i inkubuj ją w wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 250 obr./min przez sześć godzin. Po sześciogodzinnej inkubacji powtórzyć seryjne rozcieńczanie i plamienie na płytkach agarowych. Inkubować płytki agarowe przez 16 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie policz jednostki tworzące kolonie lub CFU. Użyj poziomów CFU przed i sześć godzin po antybiotykoterapii, aby obliczyć frakcję trwałą w każdym dołku. Liczba CFU przed leczeniem OFX pomaga również ocenić wpływ osmolitów na żywotność E. coli.

Przenieś 250 mikrolitrów komórek o fazie wykładniczej do 25 mililitrów świeżej zmodyfikowanej pożywki LB zawierającej osmolit zidentyfikowany na podstawie badania przesiewowego mikromacierzy. Inkubować kolbę w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 250 obr./min i 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Po 24 godzinach wyjąć kolbę z wytrząsarki i przenieść 250 mikrolitrów kultury komórkowej do 25 mililitrów świeżej zmodyfikowanej pożywki LB w kolbie z przegrodą o pojemności 250 mililitrów.

Dodać 25 mikrolitrów roztworu podstawowego ofloksacyny do zawiesiny komórek i delikatnie wstrząsnąć kolbą, aby uzyskać jednorodną hodowlę testową. Inkubować kolbę w wytrząsarce w temperaturze 37 stopni Celsjusza i prędkości 250 obr./min. Co godzinę podczas leczenia, w tym punkt czasowy przed dodaniem ofloksacyny, przenieść jeden mililitr kultury testowej z kolby do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej i odwirować ją w temperaturze 17 000 razy G przez trzy minuty.

Usuń 950 mikrolitrów supernatantu i umyj komórki trzykrotnie 950 mikrolitrami PBS. Po ostatnim praniu ponownie zawiesić osad komórkowy w 100 mikrolitrach roztworu PBS. Weź 10 mikrolitrów zawiesiny komórkowej i seryjnie rozcieńcz ją sześć razy 90 mikrolitrami PBS wewnątrz 96-dołkowej okrągłej płytki dennej.

Umieść 10 mikrolitrów rozcieńczonych zawiesin komórkowych na płytce agarowej bez antybiotyków. Aby zwiększyć granicę wykrywalności, pozostałe 90 mikrolitrów zawiesiny komórek należy umieścić na świeżej płytce agarowej. Inkubować płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 godzin, a następnie policzyć CFU.

Reprezentatywny obraz płytek agarowych używanych do oznaczania poziomów CFU w kulturach komórkowych przed i po leczeniu OFX jest pokazany tutaj. Pierwsza kolumna to grupa kontrolna. Druga kolumna zawiera komórki, które były hodowane w 100-milimolowym azotanie sodu, a trzecia kolumna zawiera komórki, które były hodowane w 60-milimolowym azotanie sodu.

Dla uproszczenia skupiono się tutaj tylko na dwóch osmolitach. Przedstawiono tutaj graficzną reprezentację danych CFU z płytek i frakcji trwałych kultur komórkowych badanych na płytkach 96-dołkowych. Aby obliczyć frakcje, liczbę osób utrzymujących się znormalizowano do liczby komórek uzyskanej przed antybiotykoterapią.

Aby wygenerować byfazowe krzywe zabijania, komórki hodowano w 25 mililitrach zmodyfikowanej pożywki LB ze wskazanymi osmolitami i przegrodami przez 24 godziny, a następnie przeniesiono do kolb testowych trwałych w celu wyliczenia przetrwałych. Próbując zastosować ten protokół, należy pamiętać, że dostrzeganie komórek na płytce agarowej jest pracochłonne i wymaga skupienia. Błąd na tym etapie może prowadzić do zanieczyszczenia krzyżowego między badanymi warunkami.

Dlatego ważne jest, aby przed eksperymentem ćwiczyć dostrzeganie wielu próbek jednocześnie. Zgodnie z tym protokołem, panele leków i biblioteki zmutowanych komórek mogą być poddawane badaniom przesiewowym w celu zbadania wpływu na trwałość. Dzięki tym badaniom przesiewowym zidentyfikowaliśmy szereg osmolitów i schorzeń PS, które mają znaczący wpływ na trwałość bakterii.