Organoidy nabłonkowe śluzowo-rzęskowe z komórek embrionalnych Xendopus: generacja, hodowla i obrazowanie na żywo w wysokiej rozdzielczości

Nabłonek śluzowo-rzęskowy wyściela narządy wewnętrzne naszego ciała i stanowi pierwszą linię obrony poprzez usuwanie obcych cząstek. Protokół ten umożliwia wytworzenie organoidu nabłonka śluzowo-rzęskowego pochodzącego z komórek embrionalnych w ciągu 24 godzin. Kluczową zaletą naszej metody jest to, że możemy monitorować żywy przebieg przejść komórkowych na powierzchni organoidów.

Ten powtarzalny, skalowalny i szybki protokół dla rozwijającego się organoidu pozwoli naukowcom odpowiedzieć na fundamentalne pytania dotyczące biologii nabłonka śluzowo-rzęskowego. Na początek należy pozyskać zarodki X.Laevis poprzez ręczne pobranie komórek jajowych od stymulowanych samic żab i przeprowadzenie zapłodnienia in vitro. Zapłodnione zarodki należy usunąć z galaretki delikatne mieszanie w 2% cysteinie, w jednej trzeciej modyfikowanej X soli fizjologicznej Bartha przez około pięć minut.

Hoduj zarodki w jednej trzeciej XMBS w preferowanej temperaturze, aż do wykrycia pierwszych oznak stadium 10, takich jak pojawienie się ciemnych komórek barwnikowych wokół blastoporu w widoku roślinnym. Wybierz i zbierz zarodki, gdy osiągną wczesny etap 10, za pomocą narzędzi do włosów pod stereoskopem. Przenieś wybrane zarodki na szalkę Petriego wypełnioną DFA za pomocą jednorazowej pipety transferowej.

Następnie usuń błonę witelinową zarodków za pomocą ostrych kleszczy od strony roślinnej, nie naruszając zwierzęcej strony zarodka. Aby odizolować nasadkę zwierzęcą, należy ustawić zarodek stroną zwierzęcą do góry. Oszacuj wizualnie zakres czapki zwierzęcia do wycięcia i wykonaj pierwsze nacięcie wzdłuż krawędzi nożem do włosów, wyciągając nóż na zewnątrz, aby wykonać cięcie.

Powtórz ten proces, aby utworzyć łańcuch małych nacięć w celu wycięcia nakrętki zwierzęcia. Przyciąć grubą warstwę krawędzi czapki zwierzęcia za pomocą noża do włosów, aby zapobiec włączeniu prekursorów mezodermy. Aby oddzielić głębokie komórki ektodermy od czapeczki zwierzęcej, przenieś wycięte kapsle zwierzęce na szalkę Petriego wypełnioną DFA bez wapnia i magnezu za pomocą jednorazowej pipety do przenoszenia.

Umieść czapki zwierząt tak, aby były skierowane stroną zwierzęcą do góry, zachowując dużą odległość od innych eksplantatów. Odczekaj od pięciu do dziesięciu minut, a następnie monitoruj eksplantaty pod stereoskopem. Gdy rozluźnione głębokie komórki zostaną uwolnione z krawędzi ciemnej warstwy powierzchownej, zacznij podnosić powierzchowną warstwę z dala od jasnych głębokich komórek ektodermy.

Ostrożnie oderwij powierzchowną warstwę nożem do włosów, zaczynając od krawędzi. Następnie zbierz głębokie komórki ektodermy z jak najmniejszą ilością DFA wolnego od wapnia i magnezu. Przenieś zebrane głębokie komórki ektodermiczne do nieprzywiepnych probówek PCR zawierających 200 mikrolitrów DFA i delikatnie pipetuj pożywkę dwa do trzech razy, aby rozproszyć przeniesione komórki.

Zamknij rurki i trzymaj je w pozycji pionowej, aby wywołać spontaniczną agregację na dole. Monitoruj proces agregacji pod mikroskopem stereoskopowym. Komórki zazwyczaj gromadzą się na dnie probówki PCR w ciągu godziny i łączą się w kuliste agregaty w ciągu dwóch do trzech godzin, w zależności od wielkości.

Aby przeprowadzić obrazowanie na żywo lub testy narkotykowe podczas rozwoju organoidów nabłonka śluzowo-rzęskowego, należy zebrać agregaty po dwóch godzinach od agregacji za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów wyposażonej w powiększone końcówki. Aby umożliwić przekształcenie agregatów w organoidy nabłonka śluzowo-rzęskowego w hodowli, należy je pobrać z probówki PCR po pięciu godzinach od agregacji i przenieść na szalkę Petriego wypełnioną DFA. Agregaty należy umieszczać daleko od siebie, aby zapobiec ich stapianiu się.

W ciągu 24 godzin od hodowli w temperaturze pokojowej, bez żadnych dodatkowych czynników, można zaobserwować dojrzałe organoidy nabłonka śluzowo-rzęskowego obracające się z powodu bijących rzęsek, które pokrywają powierzchnię zróżnicowanego nabłonka. Przygotuj komorę obrazowania ze szklanym dnem, przyklejając szkło nakrywkowe do specjalnie zmielonej komory akrylowej za pomocą smaru silikonowego, szczelnie uszczelniając komorę, aby zapobiec wyciekowi pożywki hodowlanej, a następnie napełnij komorę obrazowania DFA. Podnieś jedną sześciokątną transmisyjną mikroskopię elektronową lub siatkę TEM za pomocą kleszczy i nałóż niewielką ilość smaru na krawędź siatki.

Lekko dociśnij, aby przymocować siatkę TEM do dna komory obrazowania. Przenieś agregaty do komory obrazowania i umieść je w siatce. Napełnij komorę DFA i uszczelnij ją szkłem nakrywkowym i smarem.

Aby śledzić postęp tworzenia organoidów nabłonka śluzowo-rzęskowego, należy zebrać poklatkowe obrazy z-stack agregatów za pomocą mikroskopu konfokalnego. Organoidy nabłonka śluzowo-rzęskowego uzyskano z multipotencjalnych przodków zarodków X.Laevis we wczesnym stadium gastruli. Organoidy mają dojrzały naskórek, który jest nie do odróżnienia od naskórka kijanki, w tym w pełni zróżnicowany nabłonek, komórki kubkowe wydzielające śluz, komórki wielorzęskowe i małe komórki wydzielnicze.

Za dynamiką rozwoju organoidów podążano za obrazowaniem na żywo. Aby zbadać nabłonek, który pojawia się na wczesnym etapie tworzenia organoidów, zarodki oznaczono fluorescencyjnie znakowanymi białkami ścisłego połączenia i białkami lokalizującymi błonę. Dzięki podwójnemu znakowaniu sekwencyjne etapy tworzenia ZO-1 dodatniego ścisłego złącza mogą być oznaczane i analizowane ilościowo podczas nabłonkowania.

Niektóre regiony adhezji komórka-komórka mają rozproszone punkty ZO-1 na różnych etapach nabłonkowania. W przeciwieństwie do tego, inne obszary mają w pełni zmontowaną ciągłą ekspresję ZO-1. Z biegiem czasu puncta łączą się i łączą, tworząc ciągłe ścisłe połączenia, które zachowują swoją morfologię nawet podczas podziału komórki.

W miarę dojrzewania ścisłych połączeń komórki dynamicznie poruszają się i wychodzą z powierzchni wzdłuż płaszczyzn wierzchołkowych organoidów. Analiza wieloskalowa jest możliwa dzięki czasoprzestrzennemu śledzeniu komórek na powierzchni różnicujących się organoidów. Próbując tego protokołu, pamiętaj, aby położyć ciemnopigmentowaną stronę czapki izolowanej zwierzęcia do góry i monitorować ją pod stereoskopem.

Bardzo ważne jest, aby oddzielić powierzchowną warstwę kapelusza zwierzęcego we właściwym czasie w pożywkach DFA wolnych od wapnia/magnezu. Ten prosty protokół oferuje przydatne sposoby badania dynamicznych zachowań komórek, a także molekularnych i fizycznych mechanizmów regulujących nabłonek śluzowo-rzęskowy.