Analiza sieci α-aktininy w ludzkich kardiomiocytach pochodzących z iPSC przy użyciu mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek
3 listopada 2020
Tworzenie właściwej sieci sarkomerowej jest ważne dla dojrzewania kardiomiocytów pochodzących z iPSC. Przedstawiamy podejście oparte na super rozdzielczości, które pozwala na ilościową ocenę strukturalnego dojrzewania kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych, w celu poprawy warunków hodowli sprzyjających rozwojowi serca.
Metoda ta może być stosowana do ilościowej oceny dojrzewania sarkomeru w kardiomiocytach pochodzących z iPSC. Korzystając z tego podejścia opartego na super rozdzielczości, możliwe jest wykrycie nawet subtelnych zmian w organizacji sarkomerów, co nie jest możliwe w przypadku konwencjonalnego obrazowania konfokalnego. Co najmniej trzy godziny przed użyciem włączyć mikroskop i doprowadzić próbkę do temperatury pokojowej.
Gdy mikroskop jest gotowy, dodaj 300 mikrolitrów buforu do obrazowania PALM do studzienki z oznakowanymi komórkami i włóż szkiełko komory do uchwytu stolika mikroskopu. Wybierz obiektyw olejowy 1.57 NA 100X i użyj trybu PALM w oprogramowaniu do obrazowania, a następnie aktywuj ustawienia TIRF. Ustaw liczbę klatek na 5 000 do 10 000, moc lasera UV na 0,1%, a laser 647 na 0,2%, a poziom wzmocnienia na 50 do 100.
Po ustawieniu wszystkich parametrów akwizycji włącz oświetlenie laserowe i wybierz komórkę docelową. Aby uzyskać obraz, zwiększ moc lasera 647 do 100% i zmniejsz wzmocnienie do zera. Wybielaj komórkę docelową przez około pięć sekund, a następnie zwiększ wzmocnienie do 50 i rozpocznij akwizycję obrazu PALM.
Aby zrekonstruować dane PALM, po zakończeniu akwizycji otwórz dane w ImageJ i otwórz wtyczkę Thunderstorm. Wybierz opcję uruchom analizę we wtyczce i otwórz menu ustawień kamery. Wprowadź rozmiar piksela i wzmocnienie elektromagnetyczne.
W menu analizy przebiegu ustaw kolejność B-splajn na trzy, skalę B-splajn na dwa, próg intensywności szczytowej na stfwave. f1, promień dopasowania na trzy, początkową sigma na 1,6, powiększenie na pięć, częstotliwość aktualizacji na 50, a następnie kliknij przycisk OK. Po rekonstrukcji wybierz sigma w menu histogramu wykresu i użyj narzędzia prostokąt, aby wybrać interesujący Cię obszar, wykluczając możliwe artefakty. Dodaj obszar zainteresowania do filtru i dodaj wartość niepewności mniejszą niż 25 do wartości obszaru zainteresowania.
Na karcie usuń duplikaty wprowadź próg odległości wynoszący 10 nanometrów. Na karcie scalania ustaw maksymalną odległość na 20, maksymalną liczbę ramek na cząsteczkę na zero, a maksymalną liczbę ramek poza cząsteczką na jedną. W zakładce korekcji dryftu wybierz korelację krzyżową i ustaw liczbę przedziałów oraz powiększenie na pięć, a następnie zapisz końcowy obraz PALM i wyeksportuj dane końcowe
.Aby przeanalizować długość sarkomeru, zaimportuj zrekonstruowany obraz PALM do ImageJ i użyj narzędzia linii, aby narysować linię między wybranymi strukturami sarkomeru prostopadłą do dysku Z, aby zmierzyć najkrótszą odległość między włóknami aktyny. W menu analizy wybierz profil działki i uzyskaj długość między dwoma szczytami. Aby przeanalizować grubość dysku Z, przekonwertuj zrekonstruowany obraz PALM na obraz w trybie ośmiobitowym i otwórz wtyczkę Ridge Detection.
Ustaw szerokość linii na 20, wysoki kontrast na 230, niski kontrast na 10, sigma na 0,79, dolny próg na 25,84, a minimalną długość linii na 20. Wybierz opcję Szacowana szerokość, Wydłuż linię i Wyświetl wyniki, a następnie kliknij przycisk OK i użyj średniej szerokości linii z tabeli wyników do dalszej analizy. Kardiomiocyty i komórki noworodka pochodzące z iPSC wykazują podobny wzór alfa-aktyniny z nieregularnymi, nieuporządkowanymi strukturami sarkomerowymi.
Ocena ilościowa pokazuje, że długość i grubość włókien alfa aktyniny są prawie identyczne między dwiema grupami komórek, co wskazuje na przedwczesny stan rozwojowy kardiomiocytów pochodzących z iPSC. Natomiast dorosłe dojrzałe kardiomiocyty wykazują regularną sieć sarkomerów z nieznacznie zwiększoną długością sarkomeru i zmniejszoną grubością dysku Z. Porównanie konwencjonalnego obrazowania konfokalnego i PALM nie wykazało znaczącej różnicy w długości sarkomeru.
Jednak znacznie zmniejszona grubość dysku Z jest wykrywana, gdy kardiomiocyty iPSC są poddawane obrazowaniu PALM. Po zastosowaniu metody PALM obserwuje się wzrost rozdzielczości, który jest wspierany przez odpowiednie wykresy intensywności. Warto zauważyć, że struktury sarkomerowe uzyskane przy użyciu bufora niskiej jakości wydają się być grubsze w porównaniu ze strukturami uchwyconymi w optymalnych warunkach obrazowania.
Ten brak dokładności danych wynika ze zmniejszonych właściwości mrugania fluoroforu, co skutkuje mniejszą liczbą wykrytych fotonów na zdarzenie lokalizacyjne. Co więcej, precyzja lokalizacji jest zmniejszona, co obniża ogólną rozdzielczość zrekonstruowanego obrazu PALM. Ponadto dryft próbki może wpływać na precyzyjną lokalizację cząsteczek fluorescencyjnych, powodując rozmyte obrazy.
Aby uzyskać prawidłowe obrazy PALM, bardzo ważne jest, aby umożliwić równowagę termiczną całego systemu obrazowania, aby uniknąć nadmiernego dryfu próbki podczas obrazowania. Po tej procedurze inne struktury komórkowe, takie jak mitochondria, mogą być obrazowane za pomocą PALM w celu uzyskania dodatkowych parametrów dojrzewania kardiomiocytów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie koncentruje się na dojrzewaniu sieci sarkomerowe w pochodzących od iPSC kardiomiocytach, co jest kluczowe dla rozwoju serca. Wprowadzono podejście oparte na super rozdzielczości do ilościowej oceny struktury sarkomerów, umożliwiające wykrycie subtelnych zmian organizacyjnych, których metody konwencjonalne nie mogą zidentyfikować.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Dojrzewanie kardiomiocytów
- Modele komórkowe pochodzące od komórek macierzystych
- Mikroskopia super rozdzielczości
Tło
- Formacja sarkomerowe jest niezbędna dla funkcjonalności kardiomiocytów.
- Pochodzące od iPSC kardiomiocyty często wykazują niedojrzałe cechy w porównaniu z dojrzałymi kardiomiocytami.
- Istniejące techniki obrazowania mogą nie adekwatnie uchwycić szczegóły strukturalne.
Zastosowane metody
- Wykorzystano techniki obrazowania oparte na super rozdzielczości, konkretnie PALM.
- Pochodzące od iPSC kardiomiocyty służyły jako biologiczny system modelowy.
- Obróbka i analiza obrazów przeprowadzona została za pomocą ImageJ i jego wtyczek.
Główne wyniki
- Wykonane za pomocą PALM obrazy ujawniły szczegółowe różnice w długości sarkomerowe i grubości pasków Z.
- Stan dojrzewania pochodzących od iPSC kardiomiocytów został zidentyfikowany jako przedwczesny.
- Porównanie z dojrzałymi kardiomiocytami wykazało ustrukturyzowaną sieć sarkomerowe.
Konkluzje
- To badanie pokazuje skuteczność obrazowania o super rozdzielczości w ocenie rozwoju kardiomiocytów.
- Wyniki mają znaczące implikacje dla opracowywania ulepszonych warunków hodowli i oceny zdrowia serca.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of sarcomere organization in iPSC-derived cardiomyocytes is essential for advancing predictive cardiac models in drug discovery and disease modeling. Single molecule localization microscopy enables detection of subtle structural maturation differences, directly impacting the reliability of preclinical cardiac assays. This capability supports translational continuity and de-risks early-stage cardiac target validation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of sarcomere maturation as a functional biomarker for cardiomyocyte development.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing premature from mature cardiac phenotypes at nanoscale resolution.
- Improves predictive confidence in iPSC-derived cardiac models for target validation workflows.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of structurally validated cardiomyocyte systems for downstream compound screening.
- Enables reproducible, quantitative measurement of sarcomere length and Z-disc thickness for assay standardization.
- Supports high-resolution imaging outputs that inform assay readiness and platform scalability.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural maturity metrics with disease-relevant cardiac phenotypes for translational biomarker development.
- Provides continuity from discovery-stage cellular models to preclinical cardiac validation studies.
- Reduces biological risk by enabling early detection of maturation deficits in engineered cardiac tissues.
Pipeline & Workflow Integration
This super resolution imaging method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing quantitative structural readouts for cardiac model qualification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on cardiomyocyte maturation and pathway analysis of sarcomere assembly.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides high-resolution measurements of sarcomere length and Z-disc thickness for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro cardiac model characterization with preclinical biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis workflow for cardiac structural assessment across R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cardiac model systems.
- Operational Value: Standardizes imaging protocols and ensures reproducibility of quantitative outputs.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of cardiac assets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of cardiac models and translational candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in super resolution microscopy and quantitative image analysis.
- Demands access to advanced imaging instrumentation and analytical software (e.g., ImageJ with plugins).
- Necessitates rigorous cross-team standardization of imaging conditions and buffer quality.
- May require adaptation of imaging parameters for different cellular or tissue models.
- Imaging accuracy is sensitive to sample drift, buffer composition, and thermal equilibration.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:27
Photoactivated Localization Microscopy (PALM) Image Acquisition Setup
1:27
PALM Image Acquisition
1:50
PALM Data Reconstruction
2:39
Reconstructed PALM Image Post Processing
3:34
Sarcomere Filament Analysis
4:41
Results: Representative Human Induced Pluripotent Stem Cell (iPSC)-Derived Cardiomyocyte alpha-Actinin Network Analysis
6:23
Conclusion
