Name: Analiza sieci α-aktininy w ludzkich kardiomiocytach pochodzących z iPSC przy użyciu mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Poznaj analizę sieci α-aktininy w kardiomiocytach iPSC przy użyciu mikroskopii PALM. Ta metoda superrozdzielcza pozwala wykryć subtelne zmiany w organizacji sarkomerów, niewidoczne w konwencjonalnym obrazowaniu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Fundusz Strukturalny UE (ESF/14-BM-A55-0024/18). Ponadto H.L. jest wspierany przez program FORUN Centrum Medycznego Uniwersytetu w Rostocku (889001 i 889003) oraz Fundację Josefa i Käthe Klinz (T319/29737/2017). C.I.L. jest wspierany przez Program Klinicysty Naukowca Centrum Medycznego Uniwersytetu w Rostocku. Badania nad rozwojem są wspierane przez DFG (DA1296/6-1), fundację DAMP, Niemiecką Fundację Kardiologiczną (F/01/12) i BMBF (VIP+ 00240).
Dziękujemy Madeleine Bartsch za jej wsparcie techniczne w hodowli komórek iPSC i różnicowaniu serca.

Wszystkie kroki w tym protokole z udziałem noworodków i dorosłych myszy zostały wykonane zgodnie z etycznymi wytycznymi Centrum Medycznego Uniwersytetu w Rostocku dotyczącymi opieki nad zwierzętami.
1. Hodowla i dysocjacja kardiomiocytów pochodzących z iPSC
<ol>
	<li>Różnicuj hiPSC-CM przez 25 dni za pomocą metody monowarstwowej 2D, jak opisano wcześniej17.</li>
	<li>Podgrzej pożywkę dysocjacyjną do 37 °C i utrzymuj temperaturę od medium do pokojowej.</li>
	<li>Umyj komórki dwukrotnie PBS.</li>
	<li>Dodać podgrzaną pożywkę dysocjacyjną do komórek i inkubować przez 12 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Dodaj podłoże pomocnicze do komórek. 
	UWAGA: Objętość dodanego podłoża podporowego musi być dwukrotnie większa niż objętość ośrodka dysocjacyjnego użytego w kroku 1.4.</li>
	<li>Usunąć komórki za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić osad w 3 ml pożywki hodowlanej hiPSC-CM17.</li>
	<li>Komórki nasienne w 8-dołkowych komorach ze szklanym dnem o gęstości komórek 75 000 komórek/studzienkę i hodowla przez 3 dni.</li>
</ol>
2. Izolacja kardiomiocytów u dorosłych
<ol>
	<li>Izolację i hodowlę dorosłych kardiomiocytów od myszy NMRI przeprowadzono zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami18.</li>
	<li>Komórki nasienne w 8-dołkowej szklanej komorze szkiełkowej i hodowla przez jeden dzień.</li>
</ol>
3. Izolacja i hodowla kardiomiocytów noworodków
<ol>
	<li>Procedurę izolacji kardiomiocytów noworodków, uzyskanych od myszy NMRI, przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem19.</li>
	<li>Wyizoluj izolowaną komórkę w szkiełku z 8 dołkami przy gęstości komórek 75 000 komórek/studzienkę i hoduj przez 3 dni w pożywce do hodowli CM noworodków19.</li>
</ol>
4. Znakowanie immunofluorescencyjne sieci α-aktyniny
UWAGA: Aby uzyskać optymalne wyniki, komórki są hodowane w 8-studziennych komorach ze szklanym dnem. Znakowanie należy wykonać dzień przed obrazowaniem.
<ol>
	<li>Podgrzej 4% PFA w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Utrwalić iPSC-CM poprzez dodanie 4% paraformaldehydu bezpośrednio do pożywki hodowlanej (rozcieńczenie 1:1) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Końcowe stężenie PFA do utrwalenia wynosi 2%.</li>
	<li>Utrwalone komórki inkubować w 0,2% Triton-X, rozcieńczonym w PBS, przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj komórki dwukrotnie PBS po 5 minut każda.</li>
	<li>Dodać 1% roztwór BSA (rozcieńczony w PBS) i inkubować przez 60 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować 150 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego, rozcieńczając przeciwciało α-aktyniny w stosunku 1:100 w 1% BSA, zawierającym 0,05% Triton-X. Dodaj do komórek i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 60 minut.</li>
	<li>Przemyć komórki dwukrotnie 0,2% roztworem BSA po 5 minut każda.</li>
	<li>Przygotować 150 μl roztworu przeciwciała drugorzędowego, rozcieńczając kozie przeciwciało anty-mysie Alexa647 w stosunku 1:100 w 1% BSA, zawierającym 0,05% Triton-X. Dodaj do komórek i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 40 minut.</li>
	<li>Przemyć komórki dwukrotnie 0,2% roztworem BSA po 5 minut każda.</li>
	<li>Umyj komórki dwukrotnie PBS po 5 minut każda. Oznakowane komórki należy przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C do czasu obrazowania metodą PALM.</li>
</ol>
5. Przygotowanie bufora do obrazowania PALM
UWAGA: Bardzo ważne jest świeże przygotowanie bufora obrazowania PALM dla każdego eksperymentu.
<ol>
	<li>Przygotować 50% roztwór glukozy, rozpuszczając 25 g glukozy w 50 ml wody destylowanej.</li>
	<li>Przygotować bufor zasadowy zawierający 50 mM Tris-HCl, 10% glukozy i 10 mM chlorku sodu.
	<ol>
		<li>Dostosuj poziom pH do ~8,0 za pomocą kwasu solnego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować roztwór oksydazy piranozowej, rozpuszczając 0,6 mg oksydazy piranozowej w 316 μl buforu zasadowego.</li>
	<li>Przygotować roztwór katalazy, rozpuszczając 7 mg katalazy w 500 μl buforu zasadowego. Dokładnie wymieszać i odwirować przy 10 000 x g przez 3 min. Zachować supernatant do dalszego użycia. Roztwór katalazy można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka dni.</li>
	<li>Przygotować 500 μl buforu do obrazowania PALM, mieszając 316 μl roztworu oksydazy piranozowej, 25 μl roztworu katalazy, 100 μl 50% roztworu glukozy, 50 μl cysteaminy, 5 μl cyklooktatetraenu i 3,5 μl β-merkaptoetanolu. Końcowa aktywność katalityczna oksydazy piranozowej i katalazy musi wynosić odpowiednio 7,5 U, 35,00 U. 
	UWAGA: Bufor obrazowania PALM zapewnia optymalne warunki obrazowania przez 3-5 godzin. Jeśli zdolność mrugania barwnika fluorescencyjnego zmniejsza się, należy przygotować nową podwielokrotność buforu.</li>
</ol>
6. Akwizycja obrazu PALM
<ol>
	<li>Włączyć mikroskop co najmniej 3 godziny przed użyciem i doprowadzić próbkę do temperatury pokojowej przed obrazowaniem, aby umożliwić równowagę termiczną. Jeśli mikroskop jest wyposażony w komorę inkubacyjną, należy ustawić temperaturę na 30 °C.</li>
	<li>Wyczyść obiektyw i spód szkiełka komory za pomocą odpowiedniego rozpuszczalnika czyszczącego.</li>
	<li>Dodać 300 μl bufora do obrazowania PALM do jednego dołka ze znakowanymi komórkami i włożyć szkiełko komory do uchwytu stolika mikroskopu.</li>
	<li>Ustaw parametry akwizycji obrazu PALM.
	<ol>
		<li>Wybierz obiektyw 1.57 N.A. 100x do nabycia</li> oleju.
		<li>Wybierz tryb PALM i aktywuj ustawienia TIRF.</li>
		<li>Dostosuj liczbę klatek, które mają zostać pobrane. Zwykle do uzyskania optymalnych rezultatów wystarcza 5 000-10 000 klatek. Jednak liczba pozyskanych ramek silnie zależy od skuteczności znakowania i zdolności mrugania barwnika fluorescencyjnego i może być dostosowywana przez użytkownika.</li>
		<li>Ustaw moc lasera UV na 0,1%, a laser 647 na 0,2%.</li>
		<li>Ustaw poziom wzmocnienia na 50-100.</li>
		<li>Włącz oświetlenie laserowe i wybierz komórkę docelową. Poziom wzmocnienia można zwiększyć, jeśli intensywność sygnału jest zbyt niska (w zależności od znakowania fluorescencyjnego).</li>
		<li>Wyłącz podświetlenie laserowe</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Akwizycja obrazu PALM
	<ol>
		<li>Zmniejsz wzmocnienie do 0 i zwiększ moc lasera (ex 647) do 100%.</li>
		<li>Wybielaj komórkę docelową przez ~5 s.</li>
		<li>Zwiększ wzmocnienie do 50 i rozpocznij akwizycję obrazu PALM. 
		UWAGA: Wzmocnienie należy dostosować, aby uzyskać wystarczającą intensywność sygnału, podczas gdy należy unikać przesyconych pikseli. Jeśli intensywność sygnału zmniejszy się, zwiększ poziom wzmocnienia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Opcjonalnie stopniowo zwiększaj moc lasera UV (0,1%-10%), aby zwiększyć intensywność sygnału i promować mruganie fluoroforu.</li>
</ol>
7. Rekonstrukcja danych PALM
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie Image J i zaimportuj dane PALM.</li>
	<li>Otwórz wtyczkę Thunderstorm i "Uruchom analizę"
	<ol>
		<li>W menu "Ustawienia kamery" wprowadź rozmiar piksela i wzmocnienie EM. 
		UWAGA: W przypadku korzystania z obiektywów 100x i obiektywu o powiększeniu 1,6x odpowiedni jest rozmiar piksela 100 nm. Ponieważ jednak rozmiar piksela zależy od cech sprzętowych mikroskopu i kamery używanej do obrazowania metodą PALM, użytkownicy muszą dokładnie sprawdzić i dostosować ten parametr. Wartości wzmocnienia EM można uzyskać z metadanych.</li>
		<li>W menu "Uruchom analizę" ustaw parametry w następujący sposób: kolejność B-splajnów: 3, skala B-splajnów: 2.0, próg natężenia szczytu: stf(Wave.F1), promień dopasowania: 3, początkowa sigma: 1.6, powiększenie: 5.0, częstotliwość aktualizacji: 50, przesunięcia boczne: 2. Potwierdź, klikając przycisk "Ok".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obróbka końcowa zrekonstruowanego obrazu PALM
	<ol>
		<li>W menu "Histogram wykresu" wybierz parametr "Sigma".</li>
		<li>Użyj narzędzia "Prostokąt", aby wybrać ROI, wykluczając możliwe artefakty i zastosować ROI do filtra. Wartości ROI pojawią się w polu poleceń filtru.</li>
		<li>Dodaj "& niepewność <25" do wartości ROI. Możliwe polecenie filtrowania będzie wyglądało tak: "(sigma > 48.6821 & sigma < 1117.40) & niepewność <25". Zastosuj wybrane wartości sigma.</li>
		<li>W menu "Usuń duplikaty" wprowadź próg odległości "10 nm" i zastosuj.</li>
		<li>W menu "Scalanie" ustaw maksymalną odległość na "20", maksymalną liczbę ramek na cząsteczkę na "0", a maksymalną liczbę ramek wyłączonych na "1". Zastosuj ustawienia.</li>
		<li>W menu "Korekcja dryftu" wybierz korelację krzyżową i ustaw "Liczba pojemników" na "5" i "Powiększenie" na "5,0". Zastosuj ustawienia korekcji dryfu.</li>
		<li>Zapisz ostateczny obraz PALM i w razie potrzeby wyeksportuj dane po przetworzeniu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Analiza włókien sarkomeru
<ol>
	<li>Analiza długości sarkomeru
	<ol>
		<li>Otwórz oprogramowanie Image J i zaimportuj zrekonstruowany obraz PALM.</li>
		<li>Narysuj linię między wybranymi strukturami sarkomerowymi prostopadłymi do dysku z, aby zmierzyć najkrótszą odległość między włóknami aktyniny.</li>
		<li>Wybierz "Profil wykresu" w menu "Analizuj" i uzyskaj długość między dwoma szczytami. Ponieważ długość sarkomeru może się różnić w obrębie jednej komórki, należy zmierzyć co najmniej 20 sarkomerów w różnych obszarach komórki docelowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza grubości tarczy Z-Disc
	<ol>
		<li>Otwórz oprogramowanie Image J i zaimportuj zrekonstruowany obraz PALM.</li>
		<li>Przekonwertuj zrekonstruowany obraz PALM na obraz w trybie 8-bitowym.</li>
		<li>Otwórz wtyczkę wykrywania grzbietów i wprowadź następujące parametry: szerokość linii: 20, wysoki kontrast: 230, niski kontrast: 10, sigma: 0,79, dolny próg: 25,84, minimalna długość linii: 20.</li>
		<li>Ustaw "Oszacuj szerokość", "Rozciągnij linię" i "Wyświetl wyniki".</li>
		<li>Kliknij "OK" i użyj "Średnia szerokość linii" z tabeli wyników w celu dalszych analiz.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>McAloon, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+changing+face+of+cardiovascular+disease+2000-2012%3A+An+analysis+of+the+world+health+organisation+global+health+estimates+data%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The changing face of cardiovascular disease 2000-2012: An analysis of the world health organisation global health estimates data.</a> International Journal of Cardiology. 224, 256-264 (2016).</li>
<li>Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hiPSCs+Derived+Cardiac+Cells+for+Drug+and+Toxicity+Screening+and+Disease+Modeling%3A+What+Micro-+Electrode-Array+Analyses+Can+Tell+Us%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">hiPSCs Derived Cardiac Cells for Drug and Toxicity Screening and Disease Modeling: What Micro- Electrode-Array Analyses Can Tell Us.</a> Cells. 8 (11), 1331(2019).</li>
<li>Ylä-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPSC-Derived+Cardiomyocytes+Taken+to+Rescue+Infarcted+Heart+Muscle+in+Coronary+Heart+Disease+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">iPSC-Derived Cardiomyocytes Taken to Rescue Infarcted Heart Muscle in Coronary Heart Disease Patients.</a> Molecular Therapy. 26 (9), 2077(2018).</li>
<li>Kadota, S., Shiba, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocyte+Transplantation+for+Heart+Disease+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Cardiology+Reports%22%5BJournal%5D)">Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Transplantation for Heart Disease Treatment.</a> Current Cardiology Reports. 21 (8), 73(2019).</li>
<li>Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%3A+Current+strategies+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules+and+Cells%22%5BJournal%5D)">Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: Current strategies and limitations.</a> Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).</li>
<li>Feric, N. T., Radisic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturing+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+human+engineered+cardiac+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Maturing human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in human engineered cardiac tissues.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 110-134 (2016).</li>
<li>Ali, H., Braga, L., Giacca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+regeneration+and+remodelling+of+the+cardiomyocyte+cytoarchitecture%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Cardiac regeneration and remodelling of the cardiomyocyte cytoarchitecture.</a> The FEBS Journal. 287 (3), 417-438 (2020).</li>
<li>Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+adolescence%3A+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).</li>
<li>Bedada, F. B., Wheelwright, M., Metzger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+status+of+sarcomere+structure+and+function+in+human+iPSC-derived+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Maturation status of sarcomere structure and function in human iPSC-derived cardiac myocytes.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (7), 1829-1838 (2016).</li>
<li>Dai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Troponin+destabilization+impairs+sarcomere-cytoskeleton+interactions+in+iPSC-derived+cardiomyocytes+from+dilated+cardiomyopathy+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Troponin destabilization impairs sarcomere-cytoskeleton interactions in iPSC-derived cardiomyocytes from dilated cardiomyopathy patients.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).</li>
<li>Huang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+human+iPSC-derived+cardiomyocyte+maturation+by+chemical+conditioning+in+a+3D+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Enhancement of human iPSC-derived cardiomyocyte maturation by chemical conditioning in a 3D environment.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 138, 1-11 (2020).</li>
<li>Ronaldson-Bouchard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+maturation+of+human+cardiac+tissue+grown+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells.</a> Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+force+generation+by+3D+hiPSC-derived+cardiac+tissues+is+enhanced+by+rapid+establishment+of+cellular+interconnection+in+matrix+with+muscle-mimicking+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Contractile force generation by 3D hiPSC-derived cardiac tissues is enhanced by rapid establishment of cellular interconnection in matrix with muscle-mimicking stiffness.</a> Biomaterials. 131, 111-120 (2017).</li>
<li>Baddeley, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+Insight+from+Super-Resolution+Microscopy%3A+What+We+Can+Learn+from+Localization-Based+Images%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images.</a> Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).</li>
<li>Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Švindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ThunderSTORM%3A+A+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ThunderSTORM: A comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li>
<li>Mahadev, K., Wu, X., Donnelly, S., Ouedraogo, R., Eckhart, A. D., Goldstein, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adiponectin+inhibits+vascular+endothelial+growth+factor-induced+migration+of+human+coronary+artery+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Adiponectin inhibits vascular endothelial growth factor-induced migration of human coronary artery endothelial cells.</a> Cardiovascular Research. 78 (2), 376-384 (2008).</li>
<li>Lemcke, H., Skorska, A., Lang, C. I., Johann, L., David, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+evaluation+of+the+sarcomere+network+of+human+hiPSC-derived+cardiomyocytes+using+single-molecule+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Quantitative evaluation of the sarcomere network of human hiPSC-derived cardiomyocytes using single-molecule localization microscopy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 2819(2020).</li>
<li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified%2C+langendorff-Free+method+for+concomitant+isolation+of+viable+cardiac+myocytes+and+nonmyocytes+from+the+adult+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">A simplified, langendorff-Free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart.</a> Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li>
<li>Lemcke, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+3D-FRAP+microscopy+to+analyse+gap+junction-dependent+shuttling+of+small+antisense+RNAs+between+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 117-127 (2016).</li>
<li>Karbassi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+maturation%3A+advances+in+knowledge+and+implications+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).</li>
<li>Krysiak, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphatase+5+regulates+titin+phosphorylation+and+function+at+a+sarcomere-associated+mechanosensor+complex+in+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Protein phosphatase 5 regulates titin phosphorylation and function at a sarcomere-associated mechanosensor complex in cardiomyocytes.</a> Nature Communications. 9 (1), 1-14 (2018).</li>
<li>Zaunbrecher, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cronos+Titin+Is+Expressed+in+Human+Cardiomyocytes+and+Necessary+for+Normal+Sarcomere+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cronos Titin Is Expressed in Human Cardiomyocytes and Necessary for Normal Sarcomere Function.</a> Circulation. 140 (20), 1647-1660 (2019).</li>
<li>Fornasiero, E. F., Opazo, F. Super-resolution imaging for cell biologists. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFornasiero%2C+EF+%22BioEssays%22">BioEssays</a>. Fornasiero, E. F., Opazo, F. , Wiley Online Library. (2015).</li>
<li>Jeziorowska, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Sarcomere+and+Electrophysiological+Maturation+of+Human+iPSC-Derived+Cardiac+Myocytes+in+Monolayer+vs.+Aggregation-Based+Differentiation+Protocols%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Differential Sarcomere and Electrophysiological Maturation of Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes in Monolayer vs. Aggregation-Based Differentiation Protocols.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1173(2017).</li>
<li>Kroll, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electro-mechanical+conditioning+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes+for+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Electro-mechanical conditioning of human iPSC-derived cardiomyocytes for translational research.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 212-222 (2017).</li>
<li>Zuppinger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cytoskeleton+features+and+maturation+status+of+cultured+human+iPSC-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of cytoskeleton features and maturation status of cultured human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> European Journal of Histochemistry. 61 (2), 145-153 (2017).</li>
<li>Jradi, F. M., Lavis, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+of+Photosensitive+Fluorophores+for+Single-Molecule+Localization+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemistry of Photosensitive Fluorophores for Single-Molecule Localization Microscopy.</a> ACS Chemical Biology. 14 (6), 1077-1090 (2019).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li>
<li>Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-colour+direct+STORM+with+red+emitting+carbocyanines%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines.</a> Biology of the Cell. 104 (4), 229-237 (2012).</li>
<li>Chamma, I., Levet, F., Sibarita, J. B., Sainlos, M., Thoumine, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+organization+of+synaptic+adhesion+proteins+revealed+by+single-molecule+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophotonics%22%5BJournal%5D)">Nanoscale organization of synaptic adhesion proteins revealed by single-molecule localization microscopy.</a> Neurophotonics. 3 (4), 041810(2016).</li>
<li>Ma, H., Fu, R., Xu, J., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+cost-effective+setup+for+super-resolution+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A simple and cost-effective setup for super-resolution localization microscopy.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).</li>
<li>Olivier, N., Keller, D., Gönczy, P., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+Doubling+in+3D-STORM+Imaging+through+Improved+Buffers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Resolution Doubling in 3D-STORM Imaging through Improved Buffers.</a> PLoS One. 8 (7), 0069004(2013).</li>
<li>Swoboda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+oxygen+scavenging+for+photostability+without+ph+drop+in+single-molecule+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Enzymatic oxygen scavenging for photostability without ph drop in single-molecule experiments.</a> ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).</li>
<li>Mikhaylova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+bundled+microtubules+using+anti-tubulin+nanobodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies.</a> Nature Communications. 6 (1), 1-7 (2015).</li>
<li>Venkataramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+labeling+density+and+whole-cell+3D+dSTORM+imaging+by+repetitive+labeling+of+target+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Enhanced labeling density and whole-cell 3D dSTORM imaging by repetitive labeling of target proteins.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-7 (2018).</li>
<li>Erdélyi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+compensation+of+imaging+artefacts+in+localization-based+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Origin and compensation of imaging artefacts in localization-based super-resolution microscopy.</a> Methods. 88, 122-132 (2015).</li>
<li>McGorty, R., Schnitzbauer, J., Zhang, W., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+depth-dependent+aberrations+in+3D+single-molecule+localization+and+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Correction of depth-dependent aberrations in 3D single-molecule localization and super-resolution microscopy.</a> Optics Letters. 39 (2), 275(2014).</li>
<li>Ribeiro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cardiomyocyte+show+of+force%3A+A+fluorescent+alpha-actinin+reporter+line+sheds+light+on+human+cardiomyocyte+contractility+versus+substrate+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).</li>
<li>Pioner, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+mechanical+measurements+of+myofibrils+from+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation and mechanical measurements of myofibrils from human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 885-896 (2016).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Wytwarzanie funkcjonalnych CM pochodzących z iPSC in vitro jest ważne dla terapii regeneracyjnych, modelowania chorób i rozwoju platform do badań przesiewowych leków. Jednak niewystarczająca dojrzałość tych CM jest główną przeszkodą w badaniach sercowo-naczyniowych20. W związku z tym potrzebne są techniki obrazowania o wysokiej rozdzielczości, które umożliwią monitorowanie stanu dojrzałości strukturalnej CM pochodzącego z iPSC. Jednocześnie mikroskopia superrozdzielcza może być cennym narzędziem d...

Choroby sercowo-naczyniowe (CVD), takie jak zawał mięśnia sercowego czy kardiomiopatia, pozostają główną przyczyną zgonów w świecie zachodnim1. Ponieważ ludzkie serce ma jedynie słabe zdolności regeneracyjne, istnieje potrzeba opracowania strategii wspomagających powrót do zdrowia po chorobach układu krążenia. Obejmuje to terapie zastępcze komórek w celu uzupełnienia utraconych kardiomiocytów (CM), a także opracowywanie nowych leków przeciwarytmicznych do skutecznej i bezpiecznej interwencji farmaceutycznej. Wykazano, że indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) są obiecującym źródłem komórek dla nieograniczonej generacji ludzkiego CM in vitro, odpowiednim do terapii regeneracyjnych, modelowania chorób i opracowywania testów przesiewowych leków2,3,4.
Chociaż istnieje wiele różnych protokołów różnicowania serca, CM wywodzący się z iPSC nadal nie ma pewnych aspektów fenotypowych i funkcjonalnych, które utrudniają stosowanie in vitro i in vivo5,6. Oprócz zmian elektrofizjologicznych, metabolicznych i molekularnych, proces dojrzewania serca obejmuje strukturalną organizację sarkomerów, które są podstawowymi jednostkami wymaganymi do generowania siły i kurczenia się komórek7. Podczas gdy dorosłe CM wykazują dobrze zorganizowany aparat skurczowy, CM pochodzące z iPSC zwykle wykazują nieuporządkowane włókna sarkomerowe, związane ze zmniejszoną zdolnością skurczu i zmienioną dynamiką skurczu8,9. W przeciwieństwie do dojrzałych CM, które wykazują jednoosiowy wzorzec skurczu, zdezorientowane struktury w niedojrzałym CM powodują promieniste skurczenie całej komórki lub sprzyjają pojawieniu się ognisk skurczu9,10.
Dla poprawy dojrzewania serca zastosowano wiele podejść, w tym metody hodowli komórkowych 3D, stymulację elektryczną i mechaniczną, a także użycie matryc zewnątrzkomórkowych naśladujących warunki in vivo11,12,13. Aby ocenić sukces i skuteczność tych różnych warunków hodowli, potrzebne są techniki monitorowania i szacowania stopnia dojrzałości strukturalnej iPSC CM, np. za pomocą technik mikroskopowych. W przeciwieństwie do konwencjonalnego obrazowania konfokalnego, rozdzielczość w przypadku mikroskopii lokalizacji aktywowanej fotoaktywowaną (PALM) jest około 10 razy wyższa. Ta technika z kolei pozwala na dokładniejszą analizę, wykrywając nawet subtelne zmiany w strukturach komórkowych14. Biorąc pod uwagę wysoką rozdzielczość obrazowania opartego na PALM, ogólnym celem tej metody była mikroskopowa ocena dojrzałości sarkomeru w CM pochodzących z iPSC poprzez precyzyjne określenie grubości dysku z i długości sarkomeru. W poprzednich badaniach wykazano, że te cechy strukturalne są odpowiednimi parametrami do oceny dojrzałości serca15. Na przykład chory iPSC-CM pozbawiony dystrofiny na całej długości wykazuje zmniejszoną długość sarkomeru i szerokość pasma z w porównaniu z komórkami typu dzikiego16. Podobnie zmierzono długość poszczególnych sarkomerów, aby zbadać wpływ wskazówek topograficznych na rozwój serca16. W związku z tym zastosowaliśmy to podejście do oceny strukturalnego dojrzewania sieci sarkomerowej w iPSC-CM poprzez ilościowy pomiar długości sarkomeru i grubości dysku z.

<table><tbody><tr><td>ludzka linia komórkowa iPSC</td><td>Takara</td><td>Y00325</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-Slide 8 Well Glass Bottom</td><td>ibidi</td><td>80827</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml probówka eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td>30121023</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A906</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do dysocjacji kardiomiocytów</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>05025</td><td></td></tr><tr><td>Katalaza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C40-1G</td><td></td></tr><tr><td>Cyklooktatetraen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>138924-1G</td><td></td></tr><tr><td>Cysteamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>30070-10g</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco bez Ca2+ i Mg2+</td><td>Thermo Fisher</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>F(ab')2-Goat anty-mysia IgG Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21237</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazu Fidżi (obraz J)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Carl Roth</td><td>X997.2</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>LSM 780 ELYRA PS.1 system</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Merck</td><td>8187150100</td><td></td></tr><tr><td>Oksydaza piranozowe</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4234-250UN</td><td></td></tr><tr><td>sarkomeryczne przeciwciało przeciwko alfa-aktyninie [EA-53]</td> <td>Abcam</td><td>ab9465</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>sterylna woda</td><td>Carl Roth</td><td>3255.1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Merkaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Numer katalogowy: 63689</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza sieci α-aktininy w ludzkich kardiomiocytach pochodzących z ipsc przy użyciu mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek

Analyzing the &alpha;-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

Dojrzewanie kardiomiocytów pochodzących z iPSC jest kluczowym zagadnieniem dla ich zastosowania w terapii regeneracyjnej, testowaniu leków i modelowaniu chorób. Pomimo opracowania wielu protokołów różnicowania, generowanie kardiomiocytów iPSC przypominających fenotyp podobny do dorosłego fenotypu pozostaje wyzwaniem. Jednym z głównych aspektów dojrzewania kardiomiocytów jest tworzenie dobrze zorganizowanej sieci sarkomerów, aby zapewnić wysoką zdolność skurczu. W tym miejscu przedstawiamy podejście oparte na super rozdzielczości do półilościowej analizy sieci α-aktyniny w kardiomiocytach. Za pomocą fotoaktywowanej mikroskopii lokalizacyjnej porównano długość sarkomeru i grubość dysku z kardiomiocytów pochodzących z iPSC i komórek serca wyizolowanych z tkanki noworodka. Jednocześnie pokazujemy, jak ważne dla uzyskania wiarygodnych danych są odpowiednie warunki obrazowania. Nasze wyniki pokazują, że metoda ta jest odpowiednia do ilościowego monitorowania dojrzałości strukturalnej komórek serca z wysoką rozdzielczością przestrzenną, umożliwiając wykrycie nawet subtelnych zmian organizacji sarkomerów.

W celu oszacowania stopnia dojrzałości strukturalnej kardiomiocytów (CM) u noworodków, dorosłych z pełną dojrzałością, oraz pochodzących z komórek iPSC, kardiomiocyty oznakowano przeciwciałem anty-α-aktyninę w celu wizualizacji sieci sarkomerów. Po pozyskaniu obrazów metodą PALM, obrazy zostały odtworzone, a grubość dysków Z zmierzono za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazów z wtyczkami, umożliwiającego automatyczne wykrywanie szerokości pojedynczych filamentów. Długość sarkomeru obliczono poprzez pomiar odległo...

Tworzenie właściwej sieci sarkomerowej jest ważne dla dojrzewania kardiomiocytów pochodzących z iPSC. Przedstawiamy podejście oparte na super rozdzielczości, które pozwala na ilościową ocenę strukturalnego dojrzewania kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych, w celu poprawy warunków hodowli sprzyjających rozwojowi serca.

Analiza sieci α-aktininy w ludzkich kardiomiocytach pochodzących z iPSC przy użyciu mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek

The maturation of iPSC-derived cardiomyocytes is a critical issue for their application in regenerative therapy, drug testing and disease modeling. ...

Metoda ta może być stosowana do ilościowej oceny dojrzewania sarkomeru w kardiomiocytach pochodzących z iPSC. Korzystając z tego podejścia opartego na super rozdzielczości, możliwe jest wykrycie nawet subtelnych zmian w organizacji sarkomerów, co nie jest możliwe w przypadku konwencjonalnego obrazowania konfokalnego. Co najmniej trzy godziny przed użyciem włączyć mikroskop i doprowadzić próbkę do temperatury pokojowej.Gdy mikroskop jest gotowy, dodaj 300 mikrolitrów buforu do obrazowania PALM do studzienki z oznakowanymi komórkami i włóż szkiełko komory do uchwytu stolika mikroskopu. Wybierz obiektyw olejowy 1.57 NA 100X i użyj trybu PALM w oprogramowaniu do obrazowania, a następnie aktywuj ustawienia TIRF. Ustaw liczbę klatek na 5 000 do 10 000, moc lasera UV na 0,1%, a laser 647 na 0,2%, a poziom wzmocnienia na 50 do 100.Po ustawieniu wszystkich parametrów akwizycji włącz oświetlenie laserowe i wybierz komórkę docelową. Aby uzyskać obraz, zwiększ moc lasera 647 do 100% i zmniejsz wzmocnienie do zera. Wybielaj komórkę docelową przez około pięć sekund, a następnie zwiększ wzmocnienie do 50 i rozpocznij akwizycję obrazu PALM.Aby zrekonstruować dane PALM, po zakończeniu akwizycji otwórz dane w ImageJ i otwórz wtyczkę Thunderstorm. Wybierz opcję uruchom analizę we wtyczce i otwórz menu ustawień kamery. Wprowadź rozmiar piksela i wzmocnienie elektromagnetyczne.W menu analizy przebiegu ustaw kolejność B-splajn na trzy, skalę B-splajn na dwa, próg intensywności szczytowej na stfwave. f1, promień dopasowania na trzy, początkową sigma na 1,6, powiększenie na pięć, częstotliwość aktualizacji na 50, a następnie kliknij przycisk OK. Po rekonstrukcji wybierz sigma w menu histogramu wykresu i użyj narzędzia prostokąt, aby wybrać interesujący Cię obszar, wykluczając możliwe artefakty. Dodaj obszar zainteresowania do filtru i dodaj wartość niepewności mniejszą niż 25 do wartości obszaru zainteresowania.Na karcie usuń duplikaty wprowadź próg odległości wynoszący 10 nanometrów. Na karcie scalania ustaw maksymalną odległość na 20, maksymalną liczbę ramek na cząsteczkę na zero, a maksymalną liczbę ramek poza cząsteczką na jedną. W zakładce korekcji dryftu wybierz korelację krzyżową i ustaw liczbę przedziałów oraz powiększenie na pięć, a następnie zapisz końcowy obraz PALM i wyeksportuj dane końcowe.Aby przeanalizować długość sarkomeru, zaimportuj zrekonstruowany obraz PALM do ImageJ i użyj narzędzia linii, aby narysować linię między wybranymi strukturami sarkomeru prostopadłą do dysku Z, aby zmierzyć najkrótszą odległość między włóknami aktyny. W menu analizy wybierz profil działki i uzyskaj długość między dwoma szczytami. Aby przeanalizować grubość dysku Z, przekonwertuj zrekonstruowany obraz PALM na obraz w trybie ośmiobitowym i otwórz wtyczkę Ridge Detection.Ustaw szerokość linii na 20, wysoki kontrast na 230, niski kontrast na 10, sigma na 0,79, dolny próg na 25,84, a minimalną długość linii na 20. Wybierz opcję Szacowana szerokość, Wydłuż linię i Wyświetl wyniki, a następnie kliknij przycisk OK i użyj średniej szerokości linii z tabeli wyników do dalszej analizy. Kardiomiocyty i komórki noworodka pochodzące z iPSC wykazują podobny wzór alfa-aktyniny z nieregularnymi, nieuporządkowanymi strukturami sarkomerowymi.Ocena ilościowa pokazuje, że długość i grubość włókien alfa aktyniny są prawie identyczne między dwiema grupami komórek, co wskazuje na przedwczesny stan rozwojowy kardiomiocytów pochodzących z iPSC. Natomiast dorosłe dojrzałe kardiomiocyty wykazują regularną sieć sarkomerów z nieznacznie zwiększoną długością sarkomeru i zmniejszoną grubością dysku Z. Porównanie konwencjonalnego obrazowania konfokalnego i PALM nie wykazało znaczącej różnicy w długości sarkomeru.Jednak znacznie zmniejszona grubość dysku Z jest wykrywana, gdy kardiomiocyty iPSC są poddawane obrazowaniu PALM. Po zastosowaniu metody PALM obserwuje się wzrost rozdzielczości, który jest wspierany przez odpowiednie wykresy intensywności. Warto zauważyć, że struktury sarkomerowe uzyskane przy użyciu bufora niskiej jakości wydają się być grubsze w porównaniu ze strukturami uchwyconymi w optymalnych warunkach obrazowania.Ten brak dokładności danych wynika ze zmniejszonych właściwości mrugania fluoroforu, co skutkuje mniejszą liczbą wykrytych fotonów na zdarzenie lokalizacyjne. Co więcej, precyzja lokalizacji jest zmniejszona, co obniża ogólną rozdzielczość zrekonstruowanego obrazu PALM. Ponadto dryft próbki może wpływać na precyzyjną lokalizację cząsteczek fluorescencyjnych, powodując rozmyte obrazy.Aby uzyskać prawidłowe obrazy PALM, bardzo ważne jest, aby umożliwić równowagę termiczną całego systemu obrazowania, aby uniknąć nadmiernego dryfu próbki podczas obrazowania. Po tej procedurze inne struktury komórkowe, takie jak mitochondria, mogą być obrazowane za pomocą PALM w celu uzyskania dodatkowych parametrów dojrzewania kardiomiocytów.

analyzing-actinin-network-human-ipsc-derived-cardiomyocytes-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pluripotencjalne komórki macierzyste, zarówno embrionalne, jak i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS), stanowią cenne źródło ludzkich zróżnicowanych komórek, w tym kardiomiocytów. Tutaj skupimy się na indukcji komórek iPS w sercu, pokazując, jak wykorzystać je do uzyskania funkcjonalnych ludzkich kardiomiocytów za pomocą protokołu opartego na ciałach embrionalnych.

Generowanie ludzkich kardiomiocytów: protokół różnicowania od indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych bez karmienia

Pojedyncze kardiomiocyty od myszy typu dzikiego i zmutowanych mogą być izolowane z serca w celu zbadania ich kurczliwości i przejściowych stanów wapnia. Pozwala to na scharakteryzowanie udziału dysfunkcji komórkowej w dysfunkcji serca z dowolnej przyczyny.

Izolacja i analiza fizjologiczna kardiomiocytów myszy

Chorobotwórcze mutacje w aktynie mogą zmienić funkcję cytoszkieletu. Dynamikę cytoszkieletu określa się ilościowo poprzez obrazowanie białek znakowanych fluorescencyjnie przy użyciu całkowitej wewnętrznej mikroskopii fluorescencyjnej. Na przykład białko cytoszkieletu, Aip1p, ma zmienioną lokalizację i ruch w komórkach wyrażających zmutowaną izoformę aktyny, R256H.

Dynamika Aip1p jest zmieniona przez mutację R256H w aktynie

W miocytach serca struktury błony kanalikowej tworzą sieci wewnątrzkomórkowe. Opisujemy zoptymalizowane protokoły i) izolacji miocytów z serca myszy, w tym kontroli jakości, ii) barwienia żywych komórek do najnowocześniejszej mikroskopii fluorescencyjnej oraz iii) bezpośredniej analizy obrazu w celu ilościowego określenia złożoności składników i plastyczności sieci błon wewnątrzkomórkowych.

Analiza sieci błon rurkowych w miocytach serca z przedsionków i komór

Mutacje, które prowadzą do wrodzonych wad serca, korzystają z badań in vivo struktury serca podczas rozwoju, ale badania strukturalne w wysokiej rozdzielczości na embrionalnym sercu myszy są technicznie trudne. W tym miejscu przedstawiamy solidną metodę immunofluorescencji i analizy obrazu w celu oceny struktur specyficznych dla kardiomiocytów w rozwijającym się sercu myszy.

Analiza rozwoju kardiomiocytów za pomocą immunofluorescencji w embrionalnym sercu myszy

Aby odróżnić podział komórek od zmian cyklu komórkowego w kardiomiocytach, prezentujemy protokoły wykorzystujące dwie transgeniczne linie myszy: myszy transgeniczne Myh6-H2B-mCh, do jednoznacznej identyfikacji jąder kardiomiocytów, oraz myszy CAG-eGFP-anilin, do odróżniania podziału komórek od zmian cyklu komórkowego.

Wizualizacja zmian cyklu komórkowego i oznaczanie zarodkowania w kardiomiocytach postnatalnych

Tutaj opisujemy łatwą w użyciu metodologię generowania 3D samodzielnie składających się układów mikrotkanek serca składających się z wcześniej zróżnicowanych, indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych, fibroblastów serca i komórek śródbłonka. Ta przyjazna dla użytkownika i wymagająca niewielkiej liczby komórek technika generowania mikrotkanek serca może zostać wdrożona do modelowania chorób i wczesnych etapów opracowywania leków.

Wytwarzanie matryc mikrotkanek serca 3D przy użyciu ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC, fibroblastów serca i komórek śródbłonka

Tutaj opisujemy optyczne pozyskiwanie i charakterystykę potencjałów czynnościowych z indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych za pomocą szybkiego modułowego systemu fotometrycznego.

Pomiar potencjału czynnościowego optycznego pojedynczej komórki w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

Ta metoda może być użyta do zbadania skrócenia sarkomeru za pomocą kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych z fluorescencyjnie znakowanymi białkami sarkomerowymi.

Sarkomerowe skracanie pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych przy użyciu znakowanych fluorescencyjnie białek sarkomerowych.

Obecny protokół opisuje metodę wizualizacji i pomiaru pierścieni aktynowych i innych składników okresowego szkieletu błony początkowego segmentu aksonu przy użyciu hodowanych neuronów hipokampa szczura i mikroskopii iluminacyjnej o strukturze 3D (3D-SIM).

Pomiar właściwości okresowego szkieletu błonowego początkowego segmentu aksonu przy użyciu mikroskopii oświetlenia strukturalnego 3D (3D-SIM)

Tutaj opisana jest sprawdzona metoda wykonywania pomiarów kurczliwości i wapnia w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych za pomocą platformy opartej na optyce. Platforma ta umożliwia naukowcom badanie wpływu mutacji i reakcji na różne bodźce w szybki i powtarzalny sposób.

Pomiary parametrów wapnia i kurczliwości w czasie rzeczywistym w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

Poznaj analizę sieci α-aktininy w kardiomiocytach iPSC przy użyciu mikroskopii PALM. Ta metoda superrozdzielcza pozwala wykryć subtelne zmiany w organizacji sarkomerów, niewidoczne w konwencjonalnym obrazowaniu.

Analiza sieci α-aktininy w ludzkich kardiomiocytach pochodzących z iPSC przy użyciu mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek (Wideo) | JoVE Journal

Analiza sieci α-aktininy w ludzkich kardiomiocytach pochodzących z iPSC przy użyciu mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek

Przeglądaj więcej filmów