Name: Generowanie bibliotek insercji transpozonów w bakteriach Gram-ujemnych w celu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Poznaj metodę generowania bibliotek transpozonowych w bakteriach Gram-ujemnych, w tym Acinetobacter baumannii. Technika ta umożliwia identyfikację genów niezbędnych i czynników oporności na antybiotyki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta przez fundusze z Narodowego Instytutu Zdrowia (Grant AI146829 dla J.M.B.) i jest wdzięczna.

1. Przygotowanie szczepu bakterii
<ol>
	<li>Szczep "dawcy" (E. coli MFD DAP-/pJNW684, tabela materiałów) dla izolowanych kolonii na agarze Luria-Bertani uzupełnionym 600 μM kwasem diaminopimelicznym (DAP), 100 mg/l ampicyliny i 25 mg/l kanamycyny. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. Używając pojedynczej izolowanej kolonii, zaszczepić 50 ml bulionu Luria (LB) uzupełnionego 600 μM DAP, 100 mg/l ampicyliny i 25 mg/l kanamycyny w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml i oznaczyć ją jako "dawca".</li>
	<li>Prążkować szczep "biorcy" (szczep A. baumannii ATCC 17978, Tabela materiałów) dla izolowanych kolonii na agarze Luria-Bertani. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. Używając pojedynczej izolowanej kolonii, zaszczepić 50 ml LB w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml i oznaczyć ją jako "biorcę".</li>
	<li>Inkubować obie kultury ("dawcę" i "biorcę") przez noc w temperaturze 37 °C, wstrząsając.</li>
</ol>
2. Kojarzenie bakteryjne
<ol>
	<li>Przenieś nocne kultury do stożkowych probówek o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Osadzać zarówno kultury biorcy, jak i dawcy, wirując przy 5 000 x g przez 7 minut.</li>
	<li>Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad szczepu "dawcy" w 35 ml LB uzupełnionego DAP w celu zmycia pozostałości antybiotyków.</li>
	<li>Osadzać komórki szczepu "dawcy" za pomocą wirowania przy 5 000 x g przez 7 minut.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad szczepu "dawcy" w 4,5 ml LB uzupełnionego DAP. Użyj pipety serologicznej o pojemności 10 ml.</li>
	<li>Przenieś ponownie zawieszony szczep "dawcy" do probówki ze szczepem "biorcy", która zawiera granulowane komórki "biorcy". Użyj tej samej pipety serologicznej o pojemności 10 ml z kroku 2.5, aby wymieszać kultury. Natychmiast przejdź do następnego kroku. 
	UWAGA: Całkowita objętość końcowej zawiesiny powinna wynosić 5 ml.</li>
	<li>Rozprowadzić zawiesinę do łączenia w postaci pojedynczych kropelek o pojemności 100 μl na płytkach agarowych LB uzupełnionych DAP (5-7 kropel na płytkę) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Nie naruszając kropelek, ostrożnie przenieść płytki do inkubatora o temperaturze 37 °C i pozostawić kultury do łączenia przez 1 godzinę. 
	UWAGA: Okresy inkubacji przekraczające 1 godzinę grożą powstaniem mutantów siostrzanych.</li>
	<li>Po inkubacji dodaj 1,5 ml LB na każdą płytkę i zbierz poprzez ponowne zawieszenie bakterii z płytek. Do wymieszania należy użyć mikropipety o pojemności 1 ml. Ostateczna objętość powinna wynosić około 12 - 15 ml.</li>
	<li>Połącz zebrane komórki w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Połączyć połączone komórki za pomocą wirowania przy 5 000 x g przez 7 minut.</li>
	<li>Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 50 ml LB w celu usunięcia pozostałości DAP.</li>
	<li>Osadzać paski za pomocą wirowania przy 5 000 x g przez 7 minut.</li>
	<li>Powtórz krok prania (kroki 2.13 i 2.14).</li>
	<li>Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml ponownie zawiesić osad w 10 ml LB uzupełnionego 25% glicerolem.</li>
	<li>Używając umytych komórek, wykonaj pięć seryjnych rozcieńczeń w bulionie LB (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10,000, 1:100,000).</li>
	<li>Rozprowadzić 100 μl każdego rozcieńczenia na 4 różnych płytkach za pomocą sterylnych szklanych kulek: agar Luria-Bertani uzupełniony kanamycyną, agar uzupełniony ampicyliną, agar uzupełniony DAP i sam agar</li>.
	<li>Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Pozostałą ilość materiału podzielić na 1 ml porcji i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Określ odpowiednie rozcieńczenie biblioteki transpozonów
<ol>
	<li>Rejestruj jednostki tworzące kolonie (CFU) z nocnych płytek.</li>
	<li>Wyobraź sobie płytkę z policzalnymi koloniami dla każdego innego stanu płytki (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). 
	UWAGA: Zarówno szczepy "dawcy", jak i "biorcy" powinny rosnąć na płytkach agarowych uzupełnionych DAP, więc większość rozcieńczeń posiewu da trawnik. Tylko szczep "biorca" może rosnąć na płytkach agarowych. Ani szczep "dawcy", ani "biorcy" nie może rosnąć na płytkach agarowych uzupełnionych ampicyliną, więc nie powinno być żadnego/minimalnego wzrostu. Tylko docelowe komórki szczepu kodujące insercję transpozonu mogą rosnąć na płytkach agarowych uzupełnionych kanamycyną. Kolonie powinny różnić się wielkością, co wskazuje na insercji transpozonów w genach, które przyczyniają się do sprawności na agarze uzupełnionym kanamycyną.</li>
	<li>Obliczyć liczbę mutantów transpozonów w zamrożonym kryciu, licząc liczbę kolonii na płytkach agarowych LB uzupełnionych kanamycyną. 
	UWAGA: W przypadku genomu A. baumannii (około 4 Mb/s) celem było uzyskanie około 400 000 kolonii w celu wygenerowania biblioteki mutantów o wysokiej rozdzielczości (około jednej insercji transpozonu/10 par zasad). Jednak liczba ta powinna być zoptymalizowana w oparciu o rozmiar genomu gatunku docelowego).</li>
</ol>
4. Generowanie końcowej biblioteki mutantów bakteryjnych
<ol>
	<li>Rozmrozić podwielokrotność zamrożonego krycia na lodzie.</li>
	<li>Łączenie płytek na 150 mm płytkach agarowych Luria-Bertani uzupełnionych kanamycyną na podstawie jtk obliczonych w kroku 3.1. Dostosuj objętość za pomocą LB, aby uzyskać 13 333 kolonii na 150 μl przed posiewem. 
	UWAGA: Liczba CFU została tutaj określona na około 105 CFU/ml, więc objętość krycia została dostosowana, aby uzyskać 13 333 kolonii na płytkę, ponieważ zapewniłoby to optymalną liczbę kolonii na 30 płytkach dla biblioteki mutantów o wysokiej rozdzielczości bez przepełniania płytek.</li>
	<li>Użyj sterylnych szklanych kulek, aby rozprowadzić 150 μl rozcieńczenia na płytce na płytkach agarowych Luria-Bertani o wymiarach 30 x 150 mm uzupełnionych kanamycyną, aby uzyskać 400 000 kolonii (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C). 
	UWAGA: Do rozprowadzania bakterii na płytkach można używać sterylnych prętów lub wszelkiego rodzaju sterylnych narzędzi do rozsiewania (tj. szklanych kulek).</li>
	<li>Zużytą probówkę zawierającą nadmiar matowania należy zutylizować 
	UWAGA: Cykle zamrażania/rozmrażania powodują selektywne wywieranie nacisku na kulturę bakteryjną, co może zniekształcić wyniki eksperymentu Tn-seq. Za każdym razem należy używać nowej porcji.</li>
	<li>Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 14 h. 
	UWAGA: Czas inkubacji jest zoptymalizowany, aby zapobiec przerostowi (stykaniu się kolonii). Sugeruje się minimalizację wzrostu poprzez skrócenie czasu inkubacji.</li>
</ol>
5. Szacowanie zagęszczenia biblioteki i pulowanie dla pamięci masowej
<ol>
	<li>Policz jtk na każdej płytce, aby oszacować całkowitą liczbę mutantów w bibliotece transpozonów. Policz 20% z co najmniej 3 płytek, aby określić szacunkową liczbę kolonii dla całej grupy płytek (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). Upewnij się, że kolonie nie stykają się z inną kolonią.</li>
	<li>Po obliczeniu szacowanej wydajności kolonii dodaj 3-5 ml LB (lub więcej w razie potrzeby) do każdej płytki i zeskrob bakterie za pomocą sterylnego narzędzia do skrobania. 
	UWAGA: Sterylne pętle zaszczepiające służyły do skutecznego skrobania płytek.</li>
	<li>Zbierz zawiesiny bakteryjne ze wszystkich płytek do stożkowych probówek o pojemności 50 ml (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D). Będzie to wymagało wielu stożkowych probówek o pojemności 50 ml, co najmniej 3.</li>
	<li>Zawiesina bakteryjna w postaci granulatu przez odwirowanie przy 5 000 x g przez 7 min.</li>
	<li>Wyrzuć supernatant i ponownie wymieszaj osad w 5 ml LB uzupełnionego 30% glicerolem.</li>
	<li>Podwielokrotność 1 ml z biblioteki transpozonów do kriowialiów i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
6. Identyfikacja czynników regulujących oporność na kolistynę u A. baumannii
<ol>
	<li>Przygotuj 4 kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml, z których każda zawiera 50 ml bulionu LB i oznacz jako (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B)
	<ol>
		<li>A. baumannii szczep ATCC 17978 Biblioteka Tn-seq; (-) colistin_1</li>
		<li>A. baumannii szczep ATCC 17978 Biblioteka Tn-seq; (-) colistin_2</li>
		<li>A. baumannii szczep ATCC 17978 Biblioteka Tn-seq; (+) colistin_1</li>
		<li>A. baumannii szczep ATCC 17978 Biblioteka Tn-seq; (+) colistin_2 
		UWAGA: W opisanym tutaj wzroście prowokacji każdy warunek, (-) kontrola kolistyny i (+) prowokacja kolistyną, jest testowany w dwóch egzemplarzach. W związku z tym konfiguracja wymaga 4 kolb Erlenmeyera o pojemności 250 ml po dwie na warunek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 50 μl 0,5 mg/l kolistyny do (+) kolb kolistyny (6.1.3 i 6.1.4) i 50 μl wody do (-) kolb kolistyny (6.1.1 i 6.1.2).</li>
	<li>Rozmrozić zamrożoną podwielokrotność biblioteki Tn-seq z kroku 5 na lodzie.</li>
	<li>Odpipetować 1 μl rozmrożonej biblioteki do 1 ml PBS.</li>
	<li>Zmierz gęstość optyczną przy 600 nm (OD600) i pomnóż przez 1 000, 
	UWAGA: Określa OD600 z 1 μL biblioteki Tn.</li>
	<li>Na podstawie obliczeń w kroku 6.5 zaszczepić każdą kolbę zawierającą 50 ml LB do końcowego OD600 0,001.</li>
	<li>Hodować kultury w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C do OD600 0,5, 
	UWAGA: Ważne jest, aby kultury pozostawały w logarytmicznej fazie wzrostu, więc jeśli twój szczep ma inną OD600 podczas wykładniczego wzrostu, OD600 należy dostosować, aby zapewnić, że kultura replikuje się jak najwięcej razy w logarytmicznej fazie wzrostu. Jeśli kultura replikuje się tylko 3 razy, zdolność do wykrywania defektów sprawności u mutantów jest teoretycznie ograniczona do 3-krotnych różnic. Ponieważ różne bakterie mają różne czasy podwajania, ważne jest, aby wysiewać kultury przy ustalonym OD600, aby znormalizować początkowe inokulum. Zapewnia to spójną reprezentację całej biblioteki we wszystkich kulturach.</li>
	<li>Zbierać kultury za pomocą wirowania w temperaturze 5 000 x g w temperaturze 4 °C przez 7 minut.</li>
	<li>Usunąć sklarowany osad i przemyć 50 ml PBS.</li>
	<li>Osad przez odwirowanie w temperaturze 5 000 x g w temperaturze 4 °C przez 7 min.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml PBS. Podwielokrotność ~ 200 μL do 5 probówek do mikrowirówek.</li>
	<li>Osad należy przetworzyć przez odwirowanie w temperaturze 5 000 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Usunąć cały supernatant za pomocą końcówki pipety.</li>
	<li>Przechowuj granulki w temperaturze -20 °C lub przystąp do ekstrakcji gDNA.</li>
</ol>
7. ekstrakcja gDNA
<ol>
	<li>Rozmrozić jedną komórkę na lodzie.</li>
	<li>Dodać 0,6 ml buforu do lizy (tabela materiałów) i odwirować, aby całkowicie zawiesić osad.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Dodać 0,6 ml fenolu/chloroformu/alkoholu izoamylowego do próbki i energicznie przetrząsać.</li>
	<li>Rozdzielaj fazy za pomocą wirowania w mikrowirówce z maksymalną prędkością w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
	<li>Przenieś górną fazę wodną do nowej probówki. Unikaj zakłócania interfejsu fazowego podczas przenoszenia.</li>
	<li>Dodać równą objętość chloroformu do fazy wodnej otrzymanej powyżej i energicznie wirować.</li>
	<li>Rozdziel fazy, wirując w mikrowirówce z maksymalną prędkością w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
	<li>Przenieść górną fazę wodną do nowej probówki. 
	UWAGA: Pamiętaj, aby nie zakłócać działania interfejsu podczas przesyłania.</li>
	<li>Dodać 2,5 razy więcej zimnego 100% etanolu w fazie wodnej i delikatnie wymieszać. Wytrącone DNA będzie widoczne.</li>
	<li>Umieścić probówkę w temperaturze -80 °C na co najmniej 1 godzinę.</li>
	<li>Osad DNA poprzez odwirowanie z maksymalną prędkością w temperaturze 4 °C przez 30 min.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć sklarowany osad bez naruszania osadu DNA i przemyć go pipetowaniem 150 μl 70 % etanolu.</li>
	<li>Osad DNA za pomocą wirowania z maksymalną prędkością w temperaturze 4 °C przez 2 min.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć supernatant.</li>
	<li>Powtórz krok 7.14 jeden raz. Ostrożnie usuń cały pozostały etanol.</li>
	<li>Suszyć DNA przez inkubację w temperaturze pokojowej przez 5-10 minut.</li>
	<li>Zawiesić osad DNA w 100 μl buforu TE przez pipetowanie.</li>
</ol>
8. Ścinanie DNA (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A)
<ol>
	<li>Rozcieńczyć gDNA buforem TE do stężenia 250 ng/ml w całkowitej objętości 200 μL.</li>
	<li>Umieść probówki w sonikatorze łaźni wodnej.</li>
	<li>Sonizacja DNA w celu uzyskania fragmentów około 300 nukleotydów. Moc: 60 %, czas całkowity: 20 min, cykle: 10 s wł. i 10 s wył. w temperaturze 4 °C (<klasa silna = "xfig">Rysunek 3A).</li>
	<li>Potwierdź, że DNA jest odpowiednio ścinane, oddzielając 10 μl nieściętego DNA i 10 μl ściętego DNA na 1% żelu agarozowym. Powtórz sonikację lub zoptymalizuj w razie potrzeby (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B).</li>
</ol>
9. Dodatek do końca 3' z tworzywa sztucznego (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A)
<ol>
	<li>Ustawić reakcję poli-C zgodnie z tabelą 1.</li>
	<li>Inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Oczyść reakcję poli-C za pomocą 40 μl kulek paramagnetycznych o doborze wielkości (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A), wykonując poniższe czynności.
	<ol>
		<li>Do każdej próbki dodać 40 μl kulek paramagnetycznych o doborze wielkości. Wir ~ 5 s lub pipeta w górę iw dół.</li>
		<li>Próbki inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
		<li>Krótko mówiąc, odwirować probówki, aby zebrać płyn na dnie probówki (~ 2 s).</li>
		<li>Przenieś probówki na stojak magnetyczny i inkubuj w temperaturze pokojowej przez ~ 2 minuty, aż roztwór będzie klarowny.</li>
		<li>Za pomocą probówek na stojaku magnetycznym ostrożnie usuń supernatant.</li>
		<li>Za pomocą probówek na stojaku magnetycznym dodaj 200 μl świeżo przygotowanego 80% etanolu (nie przeszkadzaj kulkom).</li>
		<li>Próbki należy inkubować przez co najmniej 30 sekund, aż roztwór będzie klarowny.</li>
		<li>Za pomocą probówek na stojaku magnetycznym ostrożnie usuń supernatant.</li>
		<li>Powtórz etap prania (kroki 9.3.6 - 9.3.8).</li>
		<li>Zebrać płyn na dnie probówki, wykonując krótki etap wirowania (~ 2 s).</li>
		<li>Przenieś probówki do stojaka magnetycznego i usuń pozostały płyn.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2-5 minut w celu wysuszenia próbek. Nie suszyć zbyt mocno.</li>
		<li>Wyjmij probówki ze stojaka magnetycznego i dodaj do każdej 25 μl wody. Wirować przez ~ 5 s lub pipetować w górę iw dół.</li>
		<li>Krótko mówiąc, odwirować probówki, aby zebrać płyn na dnie probówki (~ 2 s).</li>
		<li>Przenieś probówki na stojak magnetyczny i pozostaw na ~ 2 minuty, aż roztwór będzie klarowny.</li>
		<li>Za pomocą probówek na stojaku magnetycznym usuń płyn bez naruszania kulek i przenieś do nowej probówki (~ 23 μL DNA).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
10. Wzmocnienie złącza transpozonowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A)
<ol>
	<li>Ustaw PCR 1 zgodnie z opisem w Tabeli 1 dla pierwszego zagnieżdżonego PCR (Tabela 2).</li>
	<li>Przeprowadzić PCR 1 w warunkach opisanych w Tabeli 1.</li>
	<li>Oczyść produkty PCR za pomocą 40 μl kulek paramagnetycznych o doborze wielkości (kroki 9.3.1 – 9.3-12). Eluować w 50 μl wody (etapy 9.3.13 – 9.3.16). W tym momencie próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotuj kulki paramagnetyczne sprzężone ze streptawidyną:
	<ol>
		<li>Ponownie zawiesić kulki Streptawidyny, energicznie potrząsając.</li>
		<li>Dodać 32 μl kulek na próbkę do świeżej probówki do mikrowirówki. 
		UWAGA: Koraliki na 6 + próbki można przygotować w jednej tubie.</li>
		<li>Przenieś rurkę na stojak magnetyczny. Inkubować przez ~ 2 minuty, aż roztwór będzie klarowny.</li>
		<li>Za pomocą rurki na stojaku magnetycznym usuń supernatant.</li>
		<li>Wyjmij rurkę ze stojaka magnetycznego. Przepłukać kulki przez ponowne zamieszanie w 1 ml 1x bufor czarno-biały, pipetując w górę iw dół.</li>
		<li>Przenieś rurkę na stojak magnetyczny. Inkubować przez ~ 2 minuty, aż roztwór będzie klarowny.</li>
		<li>Z rurką na stojaku magnetycznym usuń supernatant.</li>
		<li>Powtórz etap mycia z 1 ml 1x buforem czarno-białym (kroki 10.4.5 – 10.4.7) jeszcze dwa razy, co daje w sumie 3 prania.</li>
		<li>Wyjmij probówkę ze stojaka magnetycznego i ponownie zawieś kulki w 52 μl 2x czarno-białego bufora na próbkę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Połączyć 50 μl przygotowanych kulek z 50 μl oczyszczonego PCR1 (z kroku 10.3). Odpipetować do mieszania.</li>
	<li>Obracaj w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Zmyj niezwiązane DNA:
	<ol>
		<li>Krótko odwirować, aby zebrać płyn na dnie probówki (~ 2 s).</li>
		<li>Przenieś rurkę na stojak magnetyczny. Inkubować przez ~ 2 minuty, aż roztwór będzie klarowny.</li>
		<li>Z rurką na stojaku magnetycznym usuń supernatant.</li>
		<li>Wyjmij probówkę ze stojaka magnetycznego, umyj kulki, ponownie umieszczając je w 100 μl 1x bufor czarno-biały i pipetując w górę iw dół.</li>
		<li>Przenieś rurkę do stojaka magnetycznego. Inkubować przez ~ 2 minuty, aż roztwór będzie klarowny.</li>
		<li>Za pomocą rurki na stojaku magnetycznym usuń supernatant.</li>
		<li>Powtórz kroki mycia ze 100 μl LoTE (kroki 10.7.4 – 10.7.6) jeszcze dwa razy, w sumie 3 prania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustawić PCR 2 zgodnie z opisem w Tabeli 1, aby wzmocnić złącza transpozonów i dodać pojedynczy kod kreskowy do każdej próbki (Tabela 2 i Tabela 3).</li>
	<li>Przeprowadzić PCR 2 w warunkach opisanych w Tabeli 1.</li>
	<li>Oczyść za pomocą 40 μl kulek paramagnetycznych do wyboru wielkości (kroki 9.3.1 – 9.3.12). Eluować w 17 μL wody (kroki 9.3.13 – 9.3.16), zebrać ~ 15 μL.</li>
	<li>Określić ilościowo stężenie DNA za pomocą fluorometru. Stężenia końcowe powinny wynosić od ~ 50 do 250 ng/μl.</li>
	<li>Oceń jakość DNA za pomocą elektroforezy kapilarnej opartej na chipie (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

A. baumannii stanowi nowe zagrożenie dla globalnego zdrowia publicznego ze względu na szybkie nabywanie oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe przeciwko terapiom "ostatniego rzutu", takim jak kolistyna 10,11,12,23,24,30,31. W ostatnich dziesięcioleciach Tn-seq odegrał kluczową r...

Odkrycie antybiotyków jest niewątpliwie jednym z najbardziej wpływowych wydarzeń związanych ze zdrowiem wXX wieku. Antybiotyki nie tylko szybko rozwiązują poważne infekcje bakteryjne, ale odgrywają również kluczową rolę we współczesnej medycynie. Poważne operacje, przeszczepy i postępy w medycynie neonatologicznej i chemioterapii sprawiają, że pacjenci są podatni na zagrażające życiu infekcje, a terapie te nie byłyby możliwe bez antybiotyków1,2. Jednak szybki rozwój i rozprzestrzenianie się oporności na antybiotyki wśród ludzkich patogenów znacznie zmniejszyło skuteczność wszystkich klinicznie ważnych klas antybiotyków3. Wiele infekcji bakteryjnych, które kiedyś można było łatwo usunąć za pomocą leczenia antybiotykami, nie reaguje już na klasyczne protokoły leczenia, powodując poważne zagrożenie dla globalnego zdrowia publicznego1. Oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR) polega na tym, że komórki bakteryjne rosną w śmiertelnych stężeniach antybiotyków, niezależnie od czasu trwania leczenia4,5. Istnieje pilna potrzeba zrozumienia czynników molekularnych i biochemicznych regulujących oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe, co pomoże w ukierunkowaniu rozwoju alternatywnych środków przeciwdrobnoustrojowych. W szczególności patogeny ESKAPE są problematyczne w warunkach klinicznych i związane z rozległym opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe. Należą do nich Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa i Enterobacter spp. Podczas gdy kilka mechanizmów przyczynia się do oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe w patogenach ESKAPE, ostatnie cztery organizmy są Gram-ujemne.
Bakterie Gram-ujemne tworzą charakterystyczną zewnętrzną membranę, która chroni je przed niekorzystnymi warunkami środowiskowymi. Błona zewnętrzna służy jako bariera przepuszczalności, która ogranicza wnikanie toksycznych cząsteczek, takich jak antybiotyki, do komórki. W przeciwieństwie do innych błon biologicznych, błona zewnętrzna jest asymetryczna. Zewnętrzna ulotka jest wzbogacona o lipopolisacharyd naświetlony powierzchniowo, podczas gdy wewnętrzna ulotka jest mieszaniną fosfolipidów6. Cząsteczki lipopolisacharydu są zakotwiczone w błonie zewnętrznej przez konserwatywną cząstkę lipidową A osadzoną w dwuwarstwie lipidowej7. Kanoniczny lipid Domena lipopolisacharydu Escherichia coli jest wymagana do wzrostu większości bakterii Gram-ujemnych i jest syntetyzowana przez dziewięcioetapowy szlak enzymatyczny, który jest jednym z najbardziej podstawowych i konserwatywnych szlaków w organizmach Gram-ujemnych6,7,8.
Polimyksyny to kationowe peptydy przeciwdrobnoustrojowe, które celują w domenę lipidów A lipopolisacharydu, aby zaburzyć zewnętrzną błonę i lizować komórkę. Oddziaływanie elektrostatyczne między dodatnio naładowanymi resztami polimyksyn a ujemnie naładowanymi grupami fosforanowymi lipidów A rozrywa błonę komórkową bakterii, ostatecznie prowadząc do śmierci komórki9,10,11,12,13. Kolistyna (polimyksyna E) jest lekiem przeciwdrobnoustrojowym stosowanym w leczeniu zakażeń wywołanych przez wielolekooporne Gram-ujemne patogeny szpitalne, takie jak Acinetobacter baumannii14,15,16. Po raz pierwszy odkryte w 1947 roku, polimyksyny są wytwarzane przez bakterie glebowe, Paenibacillus polymyxa17,18,19. Polimyksyny były przepisywane w leczeniu zakażeń Gram-ujemnych przez lata, zanim ich kliniczne zastosowanie zostało ograniczone ze względu na doniesienia o znaczącej nefrotoksyczności i neurotoksyczności20,21.
A. baumannii jest szpitalnym patogenem Gram-ujemnym, który w ciągu ostatnich dziesięcioleci znacznie zwiększył zachorowalność i śmiertelność pacjentów22. To, co kiedyś było uważane za patogen niskiego zagrożenia, obecnie stanowi znaczne ryzyko infekcji szpitalnych na całym świecie ze względu na jego niesamowitą zdolność do nabywania oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe i wysokie ryzyko epidemii23,24. A. baumannii odpowiada za ponad 10% zakażeń szpitalnych w Stanach Zjednoczonych. Choroba objawia się zapaleniem płuc, bakteriemią, infekcjami dróg moczowych, infekcjami skóry i tkanek miękkich, zapaleniem opon mózgowych i zapaleniem wsierdzia25. Możliwości leczenia zakażeń A. baumannii zmniejszyły się z powodu oporności na prawie wszystkie klasy antybiotyków, w tym β-laktamy, fluorochinolony, tetracyklinę i aminoglikozydy23,24. Rozpowszechnienie wielolekoopornych, w znacznym stopniu lekoopornych i panlekoopornych izolatów A. baumannii doprowadziło do ponownego leczenia kolistyną, która została uznana za jedną z niewielu pozostałych opcji terapeutycznych nadal skutecznych przeciwko wielolekoopornemu A. baumannii. Jednak zwiększona oporność na kolistynę wśród izolatów A. baumannii jeszcze bardziej zwiększyła jej zagrożenie dla globalnego zdrowia publicznego10,11,12,13,27,30,31.
Ostatnie postępy w technologiach sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, takie jak sekwencjonowanie transpozonów (Tn-seq), dostarczyły ważnych narzędzi do pogłębienia naszej wiedzy na temat sprawności bakterii in vitro i in vivo. Tn-seq to potężne narzędzie, które można wykorzystać do badania interakcji genotyp-fenotyp u bakterii. Tn-seq ma szerokie zastosowanie w patogenach bakteryjnych, gdzie łączy tradycyjną mutagenezę transpozonów z masowym sekwencjonowaniem równoległym w celu szybkiego mapowania miejsc insercji, które można wykorzystać do powiązania mutacji DNA z wariantami fenotypowymi w skali całego genomu32,33,34,35. Chociaż metody mutagenezy transpozonów zostały już wcześniej opisane, ogólne kroki są podobne33. Po pierwsze, biblioteka insercyjna jest generowana za pomocą mutagenezy transpozonów, w której każda komórka bakteryjna w populacji jest ograniczona do pojedynczej insercji transpozonu w genomowym DNA (gDNA). Po mutagenezie poszczególne mutanty są łączone. gDNA jest ekstrahowane z puli mutantów insercyjnych, a złącza transpozonowe są amplifikowane i poddawane sekwencjonowaniu o wysokiej przepustowości. Odczyty reprezentują miejsca insercji, które można zmapować do genomu. Insercje transpozonów, które zmniejszają sprawność, szybko wypadają z populacji, podczas gdy korzystne insercje są wzbogacane. Tn-seq odegrał zasadniczą rolę w pogłębieniu naszej wiedzy na temat wpływu genów na sprawność bakterii w stresie33.
System transpozonów marynarskich Himar1 zakodowany w pJNW684 został specjalnie skonstruowany i zoptymalizowany na potrzeby mutagenezy transpozonów. Obejmuje transpozon z rodziny marynarzy flankujący gen oporności na kanamycynę, który jest używany do selekcji mutantów insercji transpozonów u A. baumannii. Koduje również specyficzny dla A. baumannii promotor, który napędza ekspresję genu kodującego transpozazę36. Transpozon oparty na marynarzu zawiera również dwa terminatory translacyjne poniżej genu oporności na kanamycynę, co zapobiega odczytowi poniżej klasy insertion<sup="xref">37. pJNW684 ma również warunkowe pochodzenie replikacji RP4/oriT/oriR6K, które wymaga genu λpir wniesionego przez szczep dawcy do replikacji38. W przypadku braku genu λpir, wektor pJNW684 przenoszący maszynerię transpozycji nie będzie w stanie replikować się w szczepie biorcy A. baumannii10,36,38. Dlatego podczas koniugacji bakteryjnej tylko transpozon jest wprowadzany do genomu biorcy bez insercji w tle plazmidu, który przenosi gen transpozazy. Jest to istotne, ponieważ utrata aktywności transpozazy wraz z plazmidem powoduje pojedyncze, stabilne zdarzenie transpozycji, które zapobiega przemieszczaniu się transpozonu w różne miejsca po wprowadzeniu go do genomu biorcy.
pJNW648 został również przetestowany pod kątem aktywności w innym organizmie Gram-ujemnym, E. coli. Pomyślne zmontowanie wysycającej biblioteki sekwencyjnej Tn-seq w szczepie E. coli W3110 wykazało, że system jest zdolny do przeprowadzania mutagenezy w szerokim zakresie patogenów, w tym Enterobacteriaceae. Co więcej, specyficzny promotor A. baumannii, który napędza ekspresję transpozazy, może być szybko wymieniony na promotor specyficzny dla gatunku. Wreszcie, gen oporności na kanamycynę może być wymieniany na inne kasety oporności, w zależności od fenotypu oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe badanego organizmu.
Jednym z czynników, który przyczynia się do oporności na kolistynę u A. baumannii, jest podawanie niewystarczających dawek, gdzie bakterie są narażone na selektywne ciśnienie na poziomie nieśmiertelnym39. Kilka raportów wykazało, że subhamujące stężenia przeciwdrobnoustrojowe mogą indukować regulowane odpowiedzi, które zmieniają fizjologię komórki w celu zmniejszenia podatności całej populacji bakterii11,12,30,31. Korzystając z Tn-seq, odkryliśmy czynniki regulujące oporność na kolistynę w szczepie A. baumannii ATCC 17978 po ekspozycji na hamujące10 i subhamujące stężenia kolistyny. Ten przykład szczegółowo opisuje metodę Tn-seq, która usprawnia konstrukcję i wzbogacanie nasyconej biblioteki mutantów transpozonów przy użyciu rodziny transpozonów opartych na marynarzach40,41. Podczas gdy kilka protokołów Tn-seq generuje od 20 000 do 100 000 mutantów35,42,43,44,45,46, protokół opisany tutaj może szybko wygenerować bibliotekę transpozonów składającą się z 400 000 + mutantów, co w przybliżeniu odpowiada wstawieniu transpozonu co 10 par zasad w A. baumannii10. Co więcej, rozmiar biblioteki może być zwiększony bez znaczącego dodatkowego wysiłku. Metoda ta eliminuje również konieczność stosowania endonukleaz restrykcyjnych, ligacji adaptera i oczyszczania żelu, co może zmniejszyć ostateczną różnorodność biblioteki.

<table><tbody><tr><td>10 mM ddCTP, 2',3'-Dideoksycytydyno-5'-Trifosforan</td><td>Affymetrix</td><td>77112</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dCTP 2'-deoksycytydyno-5'-trifosforan</td><td>Invitrogen</td><td>10217-016</td><td></td></tr><tr><td>100bp Drabinka DNA Marker masy cząsteczkowej</td><td>Promega</td><td>PR-G2101</td><td></td></tr><tr><td>100mm x 15mm Szalki Petriego</td><td>Corning</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>150mm x 15mm Szalki Petriego</td><td>Corning</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>1X B& W</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Rozcieńczony 2X B& W o połowę, aby uzyskać 1X czarno-biały.</td></tr><tr><td>Kwas 2,6-diaminopomeliczny</td><td>Alfa Aesar</td><td>B2239103</td><td>stosowany w 600 &mikro; M</td></tr><tr><td>2X B& W</td><td>n/a</td><td>n/d</td><td>Dodać 2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7,5) do wody. Stosowany z kulkami Streptawidyny. Roztwory przechowywać w temperaturze pokojowej.</td></tr><tr><td>50 ml stożkowe sterylne polipropylenowe probówki wirówkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-271</td><td></td></tr><tr><td>9,5 mM dCTP/0,5 mM ddCTP</td><td>N</td><td>/A N/A</td><td>9,5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85,5 ml wody. Przechowywać w temperaturze -20&st;C.</td></tr><tr><td>AccuPrimeTM Pfx DNA Polymerase</td><td>Invitrogen</td><td>12344</td><td></td></tr><tr><td>Acinetobacter baumannii ATCC 17978</td><td>ATCC</td><td>N/A</td><td>AmpS, KanS</td></tr><tr><td>Ampicillin (100 mg/L)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760</td><td>stosowany przy 100 mg/L</td></tr><tr><td>System oczyszczania AMPure XP PCR</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>BioAnalyzer</td><td>Bioanalizator Agilent</td><td>G2939B</td><td></td></tr><tr><td>Analiza DNA o wysokiej czułości</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanina roztworów deoksynukleotydów (dNTP)</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>Stojak magnetyczny DynaMag-2 Invitrogen</td><td></td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>E.coli MFD Dap-N</td><td>/A N</td><td>/A N/A</td><td>Auksotrof DAP, wymaga do wzrostu 600 mM egzogennie dodanego DAP. Zawiera maszynerię RP4 do transferu plazmidu. Nośnik do JNW68 (36).</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4094</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki kriogeniczne z gwintem zewnętrznym</td><td>Corning</td><td>09-761-71</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki szklane</td><td>Corning</td><td>72684</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33</td><td></td></tr><tr><td>Pętle do zaszczepiania</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-602</td><td>Narzędzie do skrobania</td></tr><tr><td>Kanamycyna</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906</td><td>stosowany w agarze 25 mg/L</td></tr><tr><td>LB,</td> bulion Miller <td>Fisher Scientific</td><td>BP1425</td><td></td></tr><tr><td>LB, Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>LoTE</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Dodaj 3 mM Tris-HCl, 0,2 mM EDTA (pH 7,5) do wody. Stosowany z kulkami Streptawidyny. Roztwory przechowywać w temperaturze pokojowej.</td></tr><tr><td>Bufor do lizy</td><td>Nie</td> dotyczy nie <td>dotyczy</td><td>9,34 ml buforu TE; 600 ml 10% SDS; 60 ml proteinazy K (20 mg/ml)</td></tr><tr><td>Fenol/chloroform/alkohol izoamylowy (mieszanina 25:24:1, pH 6,7/8,0, Liq.)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1752I</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, 10X roztwór</td><td>Fisher Scientific BP39920</td><td></td><td>Rozcieńczony do 1X</td></tr><tr><td>Fluorometr Qubit 4</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q33238</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do oznaczania kubitów</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw testowy Qubit dsDNA HS</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Sonikator z lodówką kąpiel wodna</td><td>Qsonica Sonicators</td><td>Q2000FCE</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna Kulki magnetyczne</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td>S1420S</td><td></td></tr><tr><td>Bufor TE</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>10 mM Tris-HCl (pH 8,0); 1 mM EDTA (pH 8,0)</td></tr><tr><td>Końcowa deoksynukleotydylotransferaza (rTdt)</td><td>Promega</td><td>PR-M1875</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie bibliotek insercji transpozonów w bakteriach gram-ujemnych w celu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości

Generating Transposon Insertion Libraries in Gram-Negative Bacteria for High-Throughput Sequencing

Sekwencjonowanie transpozonów (Tn-seq) to potężna metoda, która łączy mutagenezę transpozonów i masowe sekwencjonowanie równoległe w celu identyfikacji genów i szlaków, które przyczyniają się do sprawności bakterii w szerokim zakresie warunków środowiskowych. Zastosowania Tn-seq są rozległe i umożliwiły nie tylko badanie zależności genotyp-fenotyp na poziomie organizmu, ale także na poziomie populacji, społeczności i systemów. Bakterie Gram-ujemne są silnie związane z fenotypami oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe, co zwiększa liczbę przypadków niepowodzenia leczenia antybiotykami. Oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe definiuje się jako wzrost bakterii w obecności antybiotyków, które w przeciwnym razie byłyby śmiertelne. Kolistyna przeciwdrobnoustrojowa "ostatniego rzutu" jest stosowana w leczeniu zakażeń bakteryjnych Gram-ujemnych. Jednak kilka patogenów Gram-ujemnych, w tym Acinetobacter baumannii, może rozwinąć oporność na kolistynę poprzez szereg mechanizmów molekularnych, z których niektóre scharakteryzowano przy użyciu Tn-seq. Ponadto szlaki transdukcji sygnału, które regulują oporność na kolistynę, różnią się w obrębie bakterii Gram-ujemnych. W tym miejscu proponujemy skuteczną metodę mutagenezy transpozonów u A. baumannii, która usprawnia generowanie nasyconej biblioteki insercji transpozonów i konstrukcji biblioteki amplikonów, eliminując potrzebę enzymów restrykcyjnych, ligacji adaptera i oczyszczania żelu. Opisane tu metody umożliwią dogłębną analizę determinantów molekularnych, które przyczyniają się do sprawności A. baumannii po podaniu kolistyny. Protokół ma również zastosowanie do innych Gram-ujemnych patogenów ESKAPE, które są przede wszystkim związane z lekoopornymi zakażeniami szpitalnymi.

Opisane metody przedstawiają generowanie biblioteki transpozonów o wysokiej gęstości w szczepie A. baumannii ATCC 17978 poprzez koniugację bakteryjną przy użyciu E. coli MFD DAP-, który replikuje plazmid pJNW684 (Rysunek 4B). Szczegółowy protokół wykorzystuje biparentalną koniugację bakteryjną do transferu pJNW684 ze szczepu donora E. coli λpir+ do szczepu biorcy A. baumannii. Jest to wydajna i niedroga metoda generowania gęstych biblio...

Opisujemy metodę generowania nasyconych bibliotek mutantów transpozonów w bakteriach Gram-ujemnych i późniejszego przygotowania bibliotek amplikonów DNA do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Jako przykład skupiamy się na patogenie ESKAPE, Acinetobacter baumannii, ale ten protokół jest podatny na szeroką gamę organizmów Gram-ujemnych.

Generowanie bibliotek insercji transpozonów w bakteriach Gram-ujemnych w celu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości

Transposon sequencing (Tn-seq) is a powerful method that combines transposon mutagenesis and massive parallel sequencing to identify genes and pathways ...

Metoda ta jest istotna, ponieważ może być stosowana u różnych gatunków bakterii do identyfikacji niezbędnych genów, genów oporności na antybiotyki i genów ważnych dla sprawności in vivo podczas infekcji. Główną zaletą tej techniki jest mechaniczne udostępnianie genomowego DNA i edycja Poly-CTL, które eliminują potrzebę stosowania drogich enzymów restrykcyjnych, promieniowania adaptorowego i oczyszczania żelu. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię problematycznych zakażeń bakteryjnych, ponieważ geny zidentyfikowane jako ważne dla infekcji lub oporności na antybiotyki mogą służyć jako cele dla nowych terapii przeciwdrobnoustrojowych.Metoda ta może zapewnić wgląd w złożone relacje genotypowe, fenotypowe między gatunkami bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich oraz poprawić naszą obecną wiedzę na temat genetyki bakterii. Na początek przenieś nocne kultury do 50-mililitrowych stożkowych probówek i zagnieżdżaj zarówno kultury biorcy, jak i dawcy, używając wirowania przy 5 000 razy G przez 7 minut. Odrzucić supernatant.Użyj 10-mililitrowej pipety serologicznej, aby ponownie zawiesić osad szczepu dawcy w 4,5 mililitra LB uzupełnionym kwasem diaminomelicznym. Przenieś ponownie zawieszony szczep dawcy do probówki ze szczepem biorcy. I natychmiast rozprowadzić zawiesinę kojarzącą się w postaci pojedynczych kropelek o pojemności 100 mikrolitrów na płytkach agarowych LB, uzupełnionych kwasem diaminomelicznym Inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez 30 minut.Następnie ostrożnie przenieś płytki do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza i pozwól kulturom łączyć się w pary przez godzinę. Po inkubacji dodaj 1,5 mililitra LB na każdą płytkę i zbierz bakterie do 50-mililitrowej stożkowej probówki. Osadzać połączone komórki za pomocą wirowania w temperaturze 5 000 razy G przez siedem minut.Następnie wyrzuć supernatant i ponownie zawieś komórki w 10 mililitrach LB, aby usunąć pozostałości kwasu diminopimelicznego Ponownie zagnieździć komórki i powtórzyć mycie za pomocą LB. Po zakończeniu użyj 10-mililitrowej pipety serologicznej, aby ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach LB, uzupełnionych 25% glicerolem. Rozłóż komórki na płytkach, zgodnie ze wskazówkami rękopisu. Następnie inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.Utwórz jednomililitrowe porcje pozostałych bakterii i przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Na lód wylać porcję zamrożonego krycia. Następnie użyj sterylnych szklanych kulek, aby rozprowadzić 150 mikrolitrów rozcieńczenia na każdej płytce agarowej Luria-Bertani o wymiarach 30 na 150 milimetrów, uzupełnionej Kanamycyną.Wyrzuć zużytą probówkę zawierającą nadmiar krycia i inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 14 godzin. Po inkubacji policz jednostki tworzące kolonie na każdej płytce, aby oszacować całkowitą liczbę mutantów w bibliotece transpozonów. Policz 20% co najmniej trzech płytek, aby określić szacunkową liczbę kolonii dla całej grupy płytek.Po obliczeniu szacowanej wydajności kolonii dodaj od trzech do pięciu mililitrów LB do każdej płytki i zeskrob bakterie za pomocą sterylnego narzędzia do skrobania. Wyciągnij zawiesiny bakteryjne ze wszystkich płytek do 50-mililitrowych stożkowych probówek i osadzaj zawiesiny, wirując w temperaturze 5 000 razy G przez siedem minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach LB, uzupełnionych 30% glicerolem.Następnie zrób jednomililitrowe porcje z biblioteki transpozonów w kriowialach i przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Rozcieńczyć gDNA buforem TE do stężenia 250 nanogramów na mikrolitr, w całkowitej objętości 200 mikrolitrów i umieścić go w sonikatorze łaźni wodnej. Sonizacja DNA w celu uzyskania fragmentów około 300 nukleotydów.Potwierdź, że DNA jest ścinane, uruchamiając 10 mikrolitrów nieściętego DNA i 10 mikrolitrów ściętego DNA na 1% żelu do pieczenia wieprzowiny. W razie potrzeby powtórzyć sonikację. Aby dodać ogon nasienny Polly do trzech głównych końców czystego DNA, ustaw reakcję polityczną zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym i inkubuj probówki reakcyjne przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Aby oczyścić reakcję polityczną, dodaj 40 mikrolitrów kulek paramagnetycznych do wyboru wielkości do każdej próbki i przekręć rurkę reakcyjną. Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie krótko je odwiruj, aby zebrać płyn na dnie probówki.Przenieś probówki na stojak magnetyczny i inkubuj je w temperaturze pokojowej przez dwie minuty lub do momentu, gdy roztwór będzie klarowny. Ostrożnie usuń sklarowany osad i dodaj 200 mikrolitrów świeżo przygotowanego, 80% etanolu, nie naruszając kulek. Inkubować próbki, aż roztwór będzie klarowny.Następnie usunąć supernatant i powtórzyć płukanie etanolem. Krótko odwiruj probówki i włóż je z powrotem do stojaka magnetycznego, aby usunąć pozostały płyn. Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez dwie do pięciu minut, aby mogły wyschnąć.I dodaj 25 mikrolitrów wody do każdej probówki. Wiruj je przez około pięć sekund lub pipetuj w górę iw dół. Następnie odwiruj probówki, aby zebrać płyn na dnie.Przenieś probówki na stojak magnetyczny i pozostaw je na około dwie minuty, aż roztwór będzie klarowny. Następnie przenieś supernatant do nowej probówki, nie naruszając kulek. Protokół ten został wykorzystany do wygenerowania biblioteki transpozonów o wysokiej gęstości w szczepie A-baumannii ATCC 17978, poprzez koniugację bakterii przy użyciu auksotrofu E-coli MFD DAP, który replikuje plazmid pJNW684.Biblioteka mutantów transpozonów A-baumannii została wykorzystana do identyfikacji czynników dopasowania, ważnych dla oporności na kolistynę w subhamujących stężeniach środka przeciwdrobnoustrojowego. Po wyczerpaniu zmutowanej biblioteki genów, które przyczyniają się do oporności na kolistynę, całkowite gDNA pozostałej biblioteki wyizolowano z hodowli kontrolnych i eksperymentalnych. GDNA zostało rozdrobnione za pomocą mechanicznego ścinania, a do fragmentów DNA dodano ogon polityczny w ramach przygotowań do sekwencjonowania.Obliczono stężenia DNA, a próbki przeanalizowano za pomocą elektroforezy kapilarnej opartej na chipach, aby potwierdzić udane zbudowanie biblioteki. Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas próby tej procedury, jest dostosowanie objętości krycia w oparciu o liczbę CFU dla określonych szczepów docelowych w celu wygenerowania biblioteki mutantów o wysokiej rozdzielczości. Dodatkowo, szczep biorca musi być wrażliwy na marker oporności na antybiotyki, przy użyciu transpozonu przed mutagenezą.Po tej procedurze można przeprowadzić delecję genu lub metodę mówienia dźwiękiem, aby znokautować pojedyncze głowy uzyskane z wyników sekwencjonowania i zwalidować interesujące geny w trudnych warunkach.

generating-transposon-insertion-libraries-gram-negative-bacteria-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Źródło: Kazi, M. I., et al., Generowanie bibliotek insercji transpozonów w bakteriach Gram-ujemnych do sekwencjonowania wysokoprzepustowego. J . Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje selekcję, kwantyfikację i zachowanie bakterii biorców Gram-ujemnych przenoszących inserpozycje transpozonów w oparciu o oporność na kanamycynę.

Izolacja bakterii Gram-ujemnych z insercją transpozonów genomowych

Enterobacter sp. YSU rośnie w pożywce z minimalnymi solami glukozy. Auksotrofy są generowane przez przekształcenie go w transposom, który losowo wstawia się do genomu gospodarza. Mutanty są znajdowane przez replikowanie posiewu ze złożonej pożywki do minimalnej pożywki. Przerwane geny są identyfikowane przez ratowanie genów i sekwencjonowanie.

Wytwarzanie auksotrofów Enterobacter sp. YSU z wykorzystaniem mutagenezy transpozonów

Ten manuskrypt opisuje zautomatyzowane podejście do wyboru rozmiaru żelu do oczyszczania fragmentów DNA do sekwencjonowania nowej generacji. Technologia Ranger zapewnia pełną automatyzację całego procesu ładowania żelem agarozowym, analizy elektroforetycznej i odzyskiwania docelowych fragmentów DNA, co pozwala na uzyskanie wysokiej przepustowości i wysokiej jakości bibliotek sekwencjonowania nowej generacji.

Zautomatyzowany wybór wielkości żelu w celu poprawy jakości bibliotek sekwencjonowania nowej generacji przygotowanych na podstawie próbek wody środowiskowej

Tutaj moc losowej insercji niekodującego elementu DNA za pośrednictwem transpozonu została wykorzystana do określenia jego optymalnej pozycji chromosomalnej.

Określenie optymalnej lokalizacji chromosomalnej dla elementu DNA w Escherichia coli przy użyciu nowatorskiego podejścia opartego na transpozonach

Przedstawiona tutaj jest prosta metoda tworzenia biblioteki wstawiania transpozonów o dużej gęstości w Escherichia coli lub Shigella flexneri przy użyciu koniugacji bakteryjnej. Protokół ten pozwala na stworzenie kolekcji setek tysięcy unikalnych mutantów w bakteriach poprzez losową insercję genomową transpozonu.

Stworzenie gęstej biblioteki insercji transpozonów za pomocą koniugacji bakteryjnej w szczepach enterobakteryjnych, takich jak Escherichia coli czy Shigella flexneri

Metody generowania dużych bibliotek gRNA powinny być proste, wydajne i opłacalne. Opisujemy protokół produkcji bibliotek gRNA oparty na enzymatycznym trawieniu docelowego DNA. Metoda CORALINA (comprehensive gRNA library generation through controlled nuclease activity) stanowi alternatywę dla kosztownej, niestandardowej syntezy oligonukleotydów.

Uniwersalny protokół do produkcji bibliotek gRNA na dużą skalę z dowolnego źródła DNA

Opisujemy tutaj technikę, która łączy mutagenezę transpozonów z sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości w celu identyfikacji i ilościowego określenia transpozonów mutantów leptospiralnych w tkankach po wyzwaniu chomików. Protokół ten może być stosowany do badań przesiewowych mutantów pod kątem przeżycia i rozprzestrzeniania się u zwierząt, a także może być stosowany w badaniach in vitro.

Wysokoprzepustowe sekwencjonowanie równoległe w celu pomiaru sprawności Leptospira interrogans Mutanty insercji transpozonów podczas infekcji złotego chomika syryjskiego

Korzystanie z wektora binarnego pBIBAC-GW sprawia, że generowanie roślin transgenicznych z nienaruszonymi pojedynczymi kopiami jest łatwym procesem. W tym miejscu przedstawiono szereg protokołów, które prowadzą czytelnika przez proces generowania transgenicznych roślin Arabidopsis oraz testowania roślin pod kątem nienaruszalności i liczby kopii wkładek.

Generowanie roślin transgenicznych z insercją pojedynczej kopii przy użyciu wektora binarnego BIBAC-GW

Wzajemna hemizygotyczność poprzez sekwencjonowanie (RH-seq) to nowa, potężna metoda mapowania genetycznych podstaw różnic między gatunkami. Pule hemizygot są generowane przez mutagenezę transpozonów, a ich sprawność jest śledzona poprzez wzrost konkurencyjności przy użyciu sekwencjonowania o wysokiej długości czasu. Analiza uzyskanych danych wskazuje geny leżące u podstaw tej cechy.

Mapowanie genetyczne różnic w termotolerancji między gatunkami drożdży Saccharomyces za pomocą analizy wzajemnej hemizygotyczności całego genomu

To jest dostosowana metoda identyfikacji potencjalnych czynników kolonizacji owadów w korzystnym symbiontie Burkholderia. Gospodarz chrząszcza jest zainfekowany losową zmutowaną biblioteką wygenerowaną przez mutagenezę transpozonów, a złożoność biblioteki po kolonizacji jest porównywana z kontrolą wyhodowaną in vitro.

Sekwencjonowanie insercji transpozonów jako narzędzie do wyjaśnienia czynników kolonizacji bakteryjnej u mieczyków Burkholderia gladioli z chrząszczami Lagria villosa

Poznaj metodę generowania bibliotek transpozonowych w bakteriach Gram-ujemnych, w tym Acinetobacter baumannii. Technika ta umożliwia identyfikację genów niezbędnych i czynników oporności na antybiotyki.

Generowanie bibliotek insercji transpozonów w bakteriach Gram-ujemnych w celu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości

Przeglądaj więcej filmów