Generowanie bibliotek insercji transpozonów w bakteriach Gram-ujemnych w celu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości
July 7th, 2020
Opisujemy metodę generowania nasyconych bibliotek mutantów transpozonów w bakteriach Gram-ujemnych i późniejszego przygotowania bibliotek amplikonów DNA do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Jako przykład skupiamy się na patogenie ESKAPE, Acinetobacter baumannii, ale ten protokół jest podatny na szeroką gamę organizmów Gram-ujemnych.
Metoda ta jest istotna, ponieważ może być stosowana u różnych gatunków bakterii do identyfikacji niezbędnych genów, genów oporności na antybiotyki i genów ważnych dla sprawności in vivo podczas infekcji. Główną zaletą tej techniki jest mechaniczne udostępnianie genomowego DNA i edycja Poly-CTL, które eliminują potrzebę stosowania drogich enzymów restrykcyjnych, promieniowania adaptorowego i oczyszczania żelu. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię problematycznych zakażeń bakteryjnych, ponieważ geny zidentyfikowane jako ważne dla infekcji lub oporności na antybiotyki mogą służyć jako cele dla nowych terapii przeciwdrobnoustrojowych.
Metoda ta może zapewnić wgląd w złożone relacje genotypowe, fenotypowe między gatunkami bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich oraz poprawić naszą obecną wiedzę na temat genetyki bakterii. Na początek przenieś nocne kultury do 50-mililitrowych stożkowych probówek i zagnieżdżaj zarówno kultury biorcy, jak i dawcy, używając wirowania przy 5 000 razy G przez 7 minut. Odrzucić supernatant.
Użyj 10-mililitrowej pipety serologicznej, aby ponownie zawiesić osad szczepu dawcy w 4,5 mililitra LB uzupełnionym kwasem diaminomelicznym. Przenieś ponownie zawieszony szczep dawcy do probówki ze szczepem biorcy. I natychmiast rozprowadzić zawiesinę kojarzącą się w postaci pojedynczych kropelek o pojemności 100 mikrolitrów na płytkach agarowych LB, uzupełnionych kwasem diaminomelicznym Inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
Następnie ostrożnie przenieś płytki do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza i pozwól kulturom łączyć się w pary przez godzinę. Po inkubacji dodaj 1,5 mililitra LB na każdą płytkę i zbierz bakterie do 50-mililitrowej stożkowej probówki. Osadzać połączone komórki za pomocą wirowania w temperaturze 5 000 razy G przez siedem minut.
Następnie wyrzuć supernatant i ponownie zawieś komórki w 10 mililitrach LB, aby usunąć pozostałości kwasu diminopimelicznego Ponownie zagnieździć komórki i powtórzyć mycie za pomocą LB. Po zakończeniu użyj 10-mililitrowej pipety serologicznej, aby ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach LB, uzupełnionych 25% glicerolem. Rozłóż komórki na płytkach, zgodnie ze wskazówkami rękopisu. Następnie inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.
Utwórz jednomililitrowe porcje pozostałych bakterii i przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Na lód wylać porcję zamrożonego krycia. Następnie użyj sterylnych szklanych kulek, aby rozprowadzić 150 mikrolitrów rozcieńczenia na każdej płytce agarowej Luria-Bertani o wymiarach 30 na 150 milimetrów, uzupełnionej Kanamycyną.
Wyrzuć zużytą probówkę zawierającą nadmiar krycia i inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 14 godzin. Po inkubacji policz jednostki tworzące kolonie na każdej płytce, aby oszacować całkowitą liczbę mutantów w bibliotece transpozonów. Policz 20% co najmniej trzech płytek, aby określić szacunkową liczbę kolonii dla całej grupy płytek.
Po obliczeniu szacowanej wydajności kolonii dodaj od trzech do pięciu mililitrów LB do każdej płytki i zeskrob bakterie za pomocą sterylnego narzędzia do skrobania. Wyciągnij zawiesiny bakteryjne ze wszystkich płytek do 50-mililitrowych stożkowych probówek i osadzaj zawiesiny, wirując w temperaturze 5 000 razy G przez siedem minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach LB, uzupełnionych 30% glicerolem.
Następnie zrób jednomililitrowe porcje z biblioteki transpozonów w kriowialach i przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Rozcieńczyć gDNA buforem TE do stężenia 250 nanogramów na mikrolitr, w całkowitej objętości 200 mikrolitrów i umieścić go w sonikatorze łaźni wodnej. Sonizacja DNA w celu uzyskania fragmentów około 300 nukleotydów.
Potwierdź, że DNA jest ścinane, uruchamiając 10 mikrolitrów nieściętego DNA i 10 mikrolitrów ściętego DNA na 1% żelu do pieczenia wieprzowiny. W razie potrzeby powtórzyć sonikację. Aby dodać ogon nasienny Polly do trzech głównych końców czystego DNA, ustaw reakcję polityczną zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym i inkubuj probówki reakcyjne przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Aby oczyścić reakcję polityczną, dodaj 40 mikrolitrów kulek paramagnetycznych do wyboru wielkości do każdej próbki i przekręć rurkę reakcyjną. Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie krótko je odwiruj, aby zebrać płyn na dnie probówki.
Przenieś probówki na stojak magnetyczny i inkubuj je w temperaturze pokojowej przez dwie minuty lub do momentu, gdy roztwór będzie klarowny. Ostrożnie usuń sklarowany osad i dodaj 200 mikrolitrów świeżo przygotowanego, 80% etanolu, nie naruszając kulek. Inkubować próbki, aż roztwór będzie klarowny.
Następnie usunąć supernatant i powtórzyć płukanie etanolem. Krótko odwiruj probówki i włóż je z powrotem do stojaka magnetycznego, aby usunąć pozostały płyn. Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez dwie do pięciu minut, aby mogły wyschnąć.
I dodaj 25 mikrolitrów wody do każdej probówki. Wiruj je przez około pięć sekund lub pipetuj w górę iw dół. Następnie odwiruj probówki, aby zebrać płyn na dnie.
Przenieś probówki na stojak magnetyczny i pozostaw je na około dwie minuty, aż roztwór będzie klarowny. Następnie przenieś supernatant do nowej probówki, nie naruszając kulek. Protokół ten został wykorzystany do wygenerowania biblioteki transpozonów o wysokiej gęstości w szczepie A-baumannii ATCC 17978, poprzez koniugację bakterii przy użyciu auksotrofu E-coli MFD DAP, który replikuje plazmid pJNW684.
Biblioteka mutantów transpozonów A-baumannii została wykorzystana do identyfikacji czynników dopasowania, ważnych dla oporności na kolistynę w subhamujących stężeniach środka przeciwdrobnoustrojowego. Po wyczerpaniu zmutowanej biblioteki genów, które przyczyniają się do oporności na kolistynę, całkowite gDNA pozostałej biblioteki wyizolowano z hodowli kontrolnych i eksperymentalnych. GDNA zostało rozdrobnione za pomocą mechanicznego ścinania, a do fragmentów DNA dodano ogon polityczny w ramach przygotowań do sekwencjonowania.
Obliczono stężenia DNA, a próbki przeanalizowano za pomocą elektroforezy kapilarnej opartej na chipach, aby potwierdzić udane zbudowanie biblioteki. Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas próby tej procedury, jest dostosowanie objętości krycia w oparciu o liczbę CFU dla określonych szczepów docelowych w celu wygenerowania biblioteki mutantów o wysokiej rozdzielczości. Dodatkowo, szczep biorca musi być wrażliwy na marker oporności na antybiotyki, przy użyciu transpozonu przed mutagenezą.
Po tej procedurze można przeprowadzić delecję genu lub metodę mówienia dźwiękiem, aby znokautować pojedyncze głowy uzyskane z wyników sekwencjonowania i zwalidować interesujące geny w trudnych warunkach.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę generowania nasyconych bibliotek mutantów transpozonowych w bakteriach Gram-ujemnych, ze szczególnym uwzględnieniem Acinetobacter baumannii. Technika ta umożliwia identyfikację esencjalnych genów i czynników odporności na antybiotyki, mającą na celu poprawę strategii terapeutycznych przeciwko infekcjom bakteryjnym.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Mutageneza transpozonowa
- Badania nad odpornością na antybiotyki
- Mikrobiologia
Tło
- Znaczenie identyfikacji genów związanych z dostosowaniem in vivo podczas infekcji
- Wyzwania stawiane przez patogeny odporne na antybiotyki
- Zastosowanie sekwencjonowania wysokoprężnościowego do zrozumienia genetyki bakterii
Stosowane metody
- Mechaniczne udostępnianie genomowej DNA i edycja Poly-CTL
- Odmiany Acinetobacter baumannii ATCC 17978
- Generowanie biblioteki transpozonowej o wysokiej gęstości poprzez koniugację bakteryjną
Główne wyniki
- Udana kreacja biblioteki mutantów transpozonowych
- Identyfikacja genów istotnych dla dostosowania w warunkach stresu antybiotykowego
- Wgląd w złożone relacje genotyp-fenotyp
Konkluzje
- Badanie demonstruje nowatorskie podejście do badania esencjalnych genów bakteryjnych istotnych dla infekcji
- Wyniki mają zastosowanie w rozwijaniu nowych leków przeciwdrobnoustrojowych
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
High-density transposon insertion libraries in Gram-negative bacteria enable systematic identification of genetic determinants underlying antimicrobial resistance and bacterial fitness. This capability is critical for de-risking target selection and advancing predictive confidence in early-stage anti-infective discovery. The streamlined protocol supports portfolio-wide interrogation of resistance mechanisms in clinically relevant pathogens, directly impacting translational research and therapeutic innovation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables genome-wide identification of essential genes and resistance determinants in Gram-negative bacteria.
- Supports functional target validation by linking genotype to phenotype under antibiotic challenge.
- Facilitates mechanistic de-risking for anti-infective target selection and prioritization.
Screening & Assay Development
- Generates validated mutant libraries for robust, reproducible high-throughput screening workflows.
- Provides quantitative outputs for comparative fitness analysis across genetic backgrounds.
- Standardizes library construction, improving scalability and cross-study comparability.
Translational & Preclinical Research
- Aligns genetic findings with disease-relevant resistance phenotypes in ESKAPE pathogens.
- Enables continuity from discovery to preclinical validation of antimicrobial targets.
- Supports risk-adjusted advancement of candidates targeting validated resistance mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and lead identification, providing a reusable platform for hypothesis-driven genetic interrogation in Gram-negative pathogens.
- Discovery Biology: Systematically tests gene function and resistance pathways under selective pressure.
- Screening: Delivers high-density mutant pools for scalable, quantitative fitness assays.
- Analytics: Enables statistical comparison of mutant abundance and gene essentiality across conditions.
- Translational Research: Bridges genotype-phenotype mapping to preclinical model validation for resistance targets.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable to multiple Gram-negative species, supporting broad anti-infective R&D initiatives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and resistance mechanism elucidation.
- Operational Value: Streamlines library generation, reducing cost and technical barriers to high-throughput genetic screening.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making for anti-infective portfolios by clarifying mechanistic risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and pathways for therapeutic development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial genetics, high-throughput sequencing, and data analysis.
- Needs access to mechanical DNA shearing, capillary electrophoresis, and sequencing infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for library construction and fitness assays.
- Adaptable to diverse Gram-negative pathogens but may require optimization for specific strains.
- Dependent on accurate CFU quantification and antibiotic marker sensitivity for library quality.
