Name: Funkcjonalna izolacja pojedynczych jednostek motorycznych mięśnia brzuchatego łydki przyśrodkowego szczura (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Poznaj metodę izolacji pojedynczych jednostek motorycznych mięśnia brzuchatego łydki przyśrodkowej szczura przy użyciu stymulacji elektrycznej. Technika umożliwia precyzyjny zapis siły skurczu i potencjałów czynnościowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant Narodowego Centrum Badawczego 2018/31/B/NZ7/01028.

Wszystkie procedury muszą być zatwierdzone przez lokalną komisję etyki i zgodne z wytycznymi Unii Europejskiej dotyczącymi opieki nad zwierzętami, jak również z krajowym prawem dotyczącym ochrony zwierząt.
UWAGA: Każdy eksperymentator biorący udział w tej procedurze musi być przeszkolony w zakresie podstawowych procedur chirurgicznych i musi uzyskać ważną licencję na przeprowadzanie eksperymentów na zwierzętach.
1. Znieczulenie
<ol>
	<li>Znieczulić szczura wstrzyknięciem dootrzewnowym pentobarbitalu sodu (dawka początkowa 60 mg·kg-1).</li>
	<li>Po około 5 minutach sprawdź głębokość znieczulenia, szczypiąc ucho lub kończynę przednią szczura kleszczami. Przejdź do kolejnych kroków protokołu tylko wtedy, gdy nie zaobserwuje się działania odruchowego.</li>
	<li>Podczas zabiegu należy co 10-15 minut sprawdzać zwierzę pod kątem odruchów i uzupełniać znieczulenie, jeśli zwierzę reaguje na uszczypnięcie ruchem (zwykle 10 mg·kg-1·h-1 pentobarbital sodu, IP).</li>
</ol>
2. Chirurgia
<ol>
	<li>Przygotuj zwierzę do zabiegu chirurgicznego, goląc sierść nad lewą kończyną tylną od pięty do biodra (pierwszy segment, izolacja mięśni i nerwów), prawą kończynę tylną od pięty do biodra (drugi segment, elektroda uziemiająca) oraz tył od ogona do segmentów piersiowych (trzeci segment, laminektomia). Środek antyseptyczny nie jest konieczny ze względu na ostry charakter eksperymentu.
	<ol>
		<li>Ułóż szczura na brzuchu na poduszce grzewczej (37 °C ± 1 °C.)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Laminektomia
	<ol>
		<li>Za pomocą ostrych, nożyczek przetnij skórę wzdłuż kręgosłupa od kości krzyżowej do kręgów piersiowych.</li>
		<li>Oddziel skórę od leżących pod nią mięśni</li>.
		<li>Za pomocą nożyczek z końcówką wytnij mięsień najdłuższy po obu stronach kości krzyżowej i wyrostków kolczystych odcinka lędźwiowego.</li>
		<li>Zidentyfikuj kręg S1 jako najniższy segment. Za pomocą ostrych, nożyczek wytnij i usuń wyrostki kolczyste z kręgów L6 do L2. Następnie, za pomocą cienkich rongeurów, usuń wyrostki poprzeczne L6-L2 i wykonaj laminektomię nad segmentami L6 – L2 (najpierw wyrostki poprzeczne, następnie blaszka, zaczynają się od segmentu kręgowego L6), aby odsłonić odcinki lędźwiowe rdzenia kręgowego pokryte oponą twardą. Należy uważać, aby nie przeciąć kości krzyżowej i wyrostka kolczystego L1, który będzie używany jako punkt mocowania do unieruchomienia zwierzęcia.</li>
		<li>Za pomocą ostrych nożyczek przeciąć rdzeń kręgowy (jego fragment ogonowy) oraz korzenie grzbietowe i brzuszne na poziomie segmentu kręgów L2, na górnej granicy laminektomii. Umieść małe kawałki wysuszonej pianki żelowej, aby zatrzymać krwawienie. Następnie umieść cienką, nasączoną solą bacikową watę na odsłoniętych segmentach rdzenia kręgowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja mięśnia brzuchatego łydki przyśrodkowego i jego nerwu
	<ol>
		<li>Za pomocą ostrych, nożyczek wykonaj podłużne cięcie po tylnej stronie lewej kończyny tylnej, od ścięgna Achillesa do biodra.</li>
		<li>Chwyć skórę kleszczami i oddziel skórę od leżących pod nią mięśni po obu stronach nacięcia.</li>
		<li>Zlokalizuj dół podkolanowy z tyłu stawu kolanowego, który jest pokryty mięśniem dwugłowym uda. Za pomocą nożyczek wykonaj cięcie między przednią i tylną częścią tego mięśnia.</li>
		<li>Poruszając się w górę, odetnij dwie głowy bicepsa, kości udowej aż do biodra, aby odsłonić nerw kulszowy.</li>
		<li>Za pomocą kleszczy i nożyczek oddziel boczną od przyśrodkowej głowy mięśnia brzuchatego łydki i przetnij dystalny przyczep (ścięgno Achillesa) przyśrodkowego mięśnia brzuchatego łydki. Zachowaj fragment ścięgna Achillesa tak długo, jak to możliwe, aby można go było użyć do połączenia z przetwornikiem siły.</li>
		<li>Zidentyfikuj nerw brzuchaty łydki przyśrodkowego (MG). Za pomocą kleszczy i nożyczek odetnij wszystkie pozostałe pobocza nerwu kulszowego, w tym zabezpieczenia tylnego bicepsa i półścięgnistego. Pozostaw nienaruszone naczynia krwionośne doprowadzające do przyśrodkowego brzuchatego łydki.</li>
		<li>Przeciągnij nieelastyczną ligaturę przez ścięgno Achillesa i wykonaj trzy węzły.</li>
		<li>Umieść nasączony solą fizjologiczną kawałek waty pod odsłoniętym nerwem i mięśniem.</li>
		<li>Za pomocą ząbkowanych kleszczy zamknij skórę nad operowanym obszarem.</li>
		<li>Za pomocą ostrych, nożyczek wykonać 2-centymetrowe nacięcie w skórze i leżącej pod nią tkance łącznej wzdłuż przedniej strony lewej kończyny tylnej w celu unieruchomienia za pomocą metalowego zacisku (3.1.6.).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie do nagrania i stymulacji
<ol>
	<li>Stabilizacja kręgosłupa i nogi oraz układ mięśni
	<ol>
		<li>Za pomocą stalowego zacisku przymocuj lewą tylną kończynę, zakładając zacisk na piszczel.</li>
		<li>Umieść szczura w specjalnie wykonanej regulowanej ramie (izolowany drut miedziany, 1 mm), podciągnij płaty skóry wokół laminektomii za pomocą czterech ligatur i przyszyj skórę do ramy, aby utworzyć kałużę oleju parafinowego (o wymiarach około 50 mm x 50 mm) nad odsłoniętym rdzeniem kręgowym.</li>
		<li>Za pomocą kleszczy Dumont #55 podnieś oponę twardą na przecięciu rdzenia kręgowego, przetnij ją doogonowo aż do kości krzyżowej i cofnij.</li>
		<li>Za pomocą szklanego pręta oddziel lewe i prawe korzenie grzbietowe i brzuszne na kolejnych poziomach, uważając, aby ich nie uszkodzić.</li>
		<li>Napełnij basen nad rdzeniem kręgowym ciepłym (37 °C) olejem parafinowym, pokrywając odsłonięte korzenie brzuszne i grzbietowe.</li>
		<li>Umieść szczura na wykonanej na zamówienie aluminiowej płycie (długość 260 mm, szerokość 120 mm, wysokość 80 mm) z basenem (długość 135 mm, szerokość 100 mm, głębokość 45 mm) dla jego tylnych kończyn podłączonym do systemu grzewczego w pętli zamkniętej. Płytka jest miejscem, w którym zwierzę zostanie unieruchomione i zostanie przeprowadzony eksperyment.</li>
		<li>Zamocuj zacisk umieszczony na lewej kończynie tylnej za pomocą metalowego pręta, aby unieruchomić tylną kończynę.</li>
		<li>Zamocuj kręgosłup, umieszczając stalowe zaciski na kości krzyżowej i kręgu L1, aby unieruchomić ciało zwierzęcia i wyeliminować artefakty w nagraniach siły związanych z ruchami oddechowymi.</li>
		<li>Połączyć lewy mięsień brzuchaty łydki przyśrodkowego z ligaturą nieelastyczną z przetwornikiem siły (z dokładnością 50 μm/250 mN, zakresem pomiarowym 0-1000 mN) przez ścięgno Achillesa.</li>
		<li>Napełnij komorę na kończyny tylne ciepłym (37 °C) olejem parafinowym w celu pokrycia mięśnia brzuchatego łydki przyśrodkowego i utrzymuj temperaturę oleju na poziomie 37 °C ± 1 °C za pomocą sondy temperatury i systemu automatycznego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozmieszczenie elektrod do rejestracji i stymulacji potencjałów czynnościowych
	<ol>
		<li>Przełóż bipolarną elektrodę ze srebrnego drutu przez środkową część przyśrodkowego mięśnia brzuchatego łydki, prostopadle do jego długiej osi. Zachowaj odległość około 5 mm między dwiema elektrodami znajdującymi się wzdłuż długiej osi mięśnia. Elektrody te będą wykorzystywane do rejestrowania potencjałów czynnościowych jednostek motorycznych (MUAP). Podłącz elektrody do wzmacniacza o niskim poziomie szumów.</li>
		<li>Rozciągnąć operowany mięsień do biernego napięcia 100 mN, kontrolowanego przez przetwornik siły. W przypadku mięśnia brzuchatego łydki przyśrodkowego szczura na tym odcinku, MU trzech typów wytwarzają najwyższą siłę skurczu15.</li>
		<li>Za pomocą ostrych, nożyczek wykonaj 2-centymetrowe nacięcie w skórze prawej kończyny tylnej i wprowadź elektrodę ze srebrnego drutu, która będzie używana jako elektroda odniesienia.</li>
		<li>Umieść i zamocuj wykonaną na zamówienie izolowaną metalową płytkę (rozmiar 30 mm x 13 mm) nad odsłoniętymi korzeniami kręgosłupa. Połóż na talerzu lewe pary korzeni brzusznych i grzbietowych (L4, L5 i L6).</li>
		<li>Dodaj sól fizjologiczną do basenu utworzonego przez skórę wokół laminektomii. Poziom soli fizjologicznej powinien znajdować się poniżej izolowanej płyty.</li>
		<li>Umieść elektrodę stymulującą srebrny drut (dwa srebrne druty o średnicy 0,5 mm, długości 50 mm) nad odsłoniętymi korzeniami rdzeniowymi, umieść biegun dodatni 3 mm nad płytką w oleju, natomiast biegun ujemny w soli fizjologicznej (dodany do basenu, poniżej płytki) i podłącz do stymulatora.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Nagrania jednostek motorycznych
<ol>
	<li>Stymulacja impulsami elektrycznymi prostokątnymi (czas trwania 0,1 ms, amplituda do 0,5 V), wybierz korzenie brzuszne (L4, L5 i L6); stymulacja korzeni brzusznych wywołuje skurcz mięśni, podczas gdy w przypadku korzeni grzbietowych nie ma takiego efektu. Wyeliminuj korzenie grzbietowe z płytki. W przypadku mięśnia brzuchatego łydki przyśrodkowego większość aksonów znajduje się w korzeniu brzusznym L5.</li>
	<li>Używając pary kleszczyków Dumont #55 i szkieł powiększających, podziel korzenie brzuszne L5 lub L4 na bardzo drobne wiązki aksonów (chwyć odcięty koniec korzonka brzusznego obydwoma kleszczami i oderwij korzeń); umieść jedną z tych wiązek na elektrodzie ze srebrnego drutu i stymuluj (prostokątne impulsy 0,1 ms o amplitudzie do 0,5 V) do osiągnięcia aktywności pojedynczego MU. Solidna podpora (metalowy pręt) jest bardzo przydatna do manipulowania cienkimi wiązkami aksonów, które mogą służyć jako podparcie dłoni za pomocą kleszczy. Należy również pamiętać, że konieczne jest dodatkowe źródło światła.</li>
	<li>Stopniowo zwiększając intensywność bodźca, zidentyfikuj pojedynczy MU na podstawie wywołanego charakteru "wszystko albo nic" bodźca skurczu drgawkowego i potencjału czynnościowego. Dokładnie przetestuj wywołaną aktywność przy stymulacji w okolicach progu.
	<ol>
		<li>Gdy w badanym mięśniu kurczy się więcej niż jeden MU i widoczny jest zwiększający się poziom siły, a także zwiększająca się amplituda lub zmieniający się kształt potencjału czynnościowego, wróć do kroku 4.2 i ponownie podziel wiązkę aksonów. Należy zauważyć, że najsilniejsze MU w brzuchatym łydce przyśrodkowym szczura mają około 70 razy większą siłę skurczu niż najsłabsze, a gdy bardzo silny MU drga drugi, słaby MU może nie być widoczny. Należy również zauważyć, że niektóre MU mają włókna mięśniowe zlokalizowane poza obszarem zapisu elektrody i nie są widoczne na elektromiogramie; W takim przypadku zmiany amplitudy bodźca mogą mieć wpływ na siłę, ale nie na potencjał czynnościowy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Stymuluj jednostkę ruchową za pomocą protokołu stymulacji niezbędnego do osiągnięcia celu eksperymentu. Aby uzyskać podstawowy protokół stymulacji niezbędny do obliczenia wszystkich podstawowych właściwości kurczliwości i potencjałów czynnościowych jednostek motorycznych, należy uwzględnić następujące elementy.
	<ol>
		<li>Uwzględnij 5 bodźców o częstotliwości 1 Hz (5 pojedynczych drgań zarejestrowanych i uśrednionych; uśrednienie to eliminacja szumów, co jest szczególnie ważne w przypadku najsłabszych MU).</li>
		<li>Obejmują serię bodźców o częstotliwościach 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 100 i 150 Hz o czasie trwania 500 ms (nagrania te umożliwiają obliczenie zależności siła-częstotliwość, maksymalnej siły tężcowej przy 150 Hz, a także ugięcia przy stymulacji 20-40 Hz).</li>
		<li>Uwzględnij test zmęczeniowy (tężec wywoływany przez ciągi 14 bodźców o częstotliwości 40 Hz, powtarzane co sekundę przez 4 minuty).</li>
		<li>Uwzględnij co najmniej 10-sekundowe odstępy czasowe między wszystkimi elementami powyższego protokołu.</li>
		<li>Powtórz proces z kolejnymi izolowanymi jednostkami silnikowymi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zakończyć eksperyment i poddać zwierzę eutanazji poprzez dootrzewnowe podanie śmiertelnej dawki pentobarbitalu sodu (180 mg·kg-1).</li>
</ol>
5. Aparatura elektroniczna
UWAGA: Stworzony na zamówienie program komputerowy steruje stymulatorem, dając możliwość tworzenia zmiennych wzorców stymulacji, w tym tych wskazanych w kroku 4.4. Program współpracuje z przetwornikiem analogowo-cyfrowym (co najmniej 10 kHz dla nagrań MUAP i force).
<ol>
	<li>Podłącz wzmacniacz prądu przemiennego do komputera za pomocą przetwornika analogowo-cyfrowego i równolegle do oscyloskopu.</li>
	<li>Podłącz przetwornik siły do komputera za pomocą przetwornika analogowo-cyfrowego i równolegle do oscyloskopu. Użyj przetwornika siły, aby kontrolować pasywną siłę mięśni podczas eksperymentu. Należy pamiętać, że podczas eksperymentu siła bierna może się zmniejszyć; Dlatego konieczne jest zwiększenie długości mięśni, aby utrzymać stałą siłę mięśni biernych.</li>
</ol>

<ol><li>Burke, R. E., Levine, D. N., Tsairis, P., Zajac, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+types+and+histochemical+profiles+in+motor+units+of+the+cat+gastrocnemius%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Physiological types and histochemical profiles in motor units of the cat gastrocnemius.</a> Journal of Physiology. 234, 723-748 (1973).</li>
<li>Celichowski, J., Drzymała-Celichowska, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+number+of+motor+units+in+the+medial+gastrocnemius+muscle+of+male+and+female+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The number of motor units in the medial gastrocnemius muscle of male and female rats.</a> Journal of Physiology and Pharmacology. 58, 821-828 (2007).</li>
<li>Grottel, K., Celichowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+of+motor+units+in+medial+gastrocnemius+muscle+of+the+rat+in+light+of+variability+of+their+principal+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurobiologiae+Experimentalis%22%5BJournal%5D)">Division of motor units in medial gastrocnemius muscle of the rat in light of variability of their principal properties.</a> Acta Neurobiologiae Experimentalis. 50, 571-588 (1990).</li>
<li>Celichowski, J., Krutki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+and+plasticity+of+motor+unit+properties+in+mammalian+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biocybernetics+and+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Variability and plasticity of motor unit properties in mammalian skeletal muscle.</a> Biocybernetics and Biomedical Engineering. 32 (4), 33-45 (2012).</li>
<li>Gardiner, P. F., Olha, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+and+electromyographic+characteristics+of+rat+plantaris+motor+unit+types+during+fatigue+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Contractile and electromyographic characteristics of rat plantaris motor unit types during fatigue in situ.</a> Journal of Physiology. 385, 13-34 (1987).</li>
<li>Drzymała-Celichowska, H., Kaczmarek, P., Krutki, P., Celichowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Summation+of+slow+motor+unit+forces+at+constant+and+variable+interpulse+intervals+in+rat+soleus+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electromyography+and+Kinesiology%22%5BJournal%5D)">Summation of slow motor unit forces at constant and variable interpulse intervals in rat soleus muscle.</a> Journal of Electromyography and Kinesiology. 30, 1-8 (2016).</li>
<li>Krutki, P., Celichowski, J., Łochyński, D., Pogrzebna, M., Mrówczyński, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+differences+of+motor+units+properties+in+the+medial+gastrocnemius+muscle+of+cat+and+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+Italiennes+de+Biologie%22%5BJournal%5D)">Interspecies differences of motor units properties in the medial gastrocnemius muscle of cat and rat.</a> Archives Italiennes de Biologie. 144, 11-23 (2006).</li>
<li>Burke, R. E., Rudomin, P., Zajac, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+activation+history+on+tension+production+by+individual+muscle+units%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The effect of activation history on tension production by individual muscle units.</a> Brain Research. 109, 515-529 (1976).</li>
<li>Celichowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+the+regulation+of+motor+unit+contraction+in+the+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying the regulation of motor unit contraction in the skeletal muscle.</a> Journal of Physiology and Pharmacology. 51, 17-33 (2000).</li>
<li>Burke, R. E., Levine, D. N., Salcman, M., Tsairis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+units+in+cat+soleus+muscle%3A+physiological%2C+histochemical+and+morphological+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Motor units in cat soleus muscle: physiological, histochemical and morphological characteristics.</a> Journal of Physiology. 238, 503-514 (1974).</li>
<li>Milner-Brown, H. S., Stein, R. B., Yemm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contractile+properties+of+human+motor+units+during+voluntary+isometric+contractions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The contractile properties of human motor units during voluntary isometric contractions.</a> Journal of Physiology. 228, 285-306 (1973).</li>
<li>Taylor, A., Stephens, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+human+motor+unit+contractions+by+controlled+intramuscular+microstimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Study of human motor unit contractions by controlled intramuscular microstimulation.</a> Brain Research. 117, 331-335 (1976).</li>
<li>Westling, G., Johansson, R. S., Thomas, C. K., Bigland-Ritchie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+contractile+and+electrical+properties+of+single+human+thenar+motor+units+in+response+to+intraneural+motor-axon+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Measurement of contractile and electrical properties of single human thenar motor units in response to intraneural motor-axon stimulation.</a> Journal of Neurophysiology. 64, 1331-1338 (1990).</li>
<li>Burke, R. E. Motor units: anatomy, physiology and functional organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBurke%2C+RE+%22APS+Handbook+of+Physiology+Series%2C+Section+1%2C+The+Nervous+System%22">APS Handbook of Physiology Series, Section 1, The Nervous System</a>. 11, part 1, Motor Control 345-422 (1981).</li>
<li>Celichowski, J., Grottel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dependence+of+the+twitch+course+of+medial+gastrocnemius+muscle+of+the+rat+and+its+motor+units+on+stretching+of+the+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+Italiennes+de+Biologie%22%5BJournal%5D)">The dependence of the twitch course of medial gastrocnemius muscle of the rat and its motor units on stretching of the muscle.</a> Archives Italiennes de Biologie. 130, 315-325 (1992).</li>
<li>Celichowski, J., Grottel, K., Bichler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+profile+of+unfused+tetani+of+fast+motor+units+with+respect+to+their+resistance+to+fatigue+in+the+rat+medial+gastrocnemius+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Muscle+Research+and+Cell+Motility%22%5BJournal%5D)">Differences in the profile of unfused tetani of fast motor units with respect to their resistance to fatigue in the rat medial gastrocnemius muscle.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 20, 681-685 (1999).</li>
<li>Krutki, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+of+motor+units+into+fast+and+slow+on+the+basis+of+profile+of+20+Hz+unfused+tetanus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Division of motor units into fast and slow on the basis of profile of 20 Hz unfused tetanus.</a> Journal of Physiology and Pharmacology. 59, 353-363 (2008).</li>
<li>Drzymała-Celichowska, H., Krutki, P., Celichowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Summation+of+motor+unit+forces+in+the+rat+medial+gastrocnemius+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electromyography+and+Kinesiology%22%5BJournal%5D)">Summation of motor unit forces in the rat medial gastrocnemius muscle.</a> Journal of Electromyography and Kinesiology. 20, 599-607 (2010).</li>
<li>Kaczmarek, P., Celichowski, J., Drzymała-Celichowska, H., Kasiński, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+image+of+motor+unit+architecture+in+the+mechanomyographic+signal+during+single+motor+unit+contraction.+In+vivo+and+simulation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electromyography+and+Kinesiology%22%5BJournal%5D)">The image of motor unit architecture in the mechanomyographic signal during single motor unit contraction. In vivo and simulation study.</a> Journal of Electromyography and Kinesiology. 19, 553-563 (2009).</li>
<li>Celichowski, J., Krutki, P., Bichler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+conduction+velocity+of+motor+units+of+rat%27s+medial+gastrocnemius+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology+%28Paris%29%22%5BJournal%5D)">Axonal conduction velocity of motor units of rat's medial gastrocnemius muscle.</a> Journal of Physiology (Paris). 90, 75-78 (1996).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konfliktu interesów, który mogliby ujawnić.

Jeśli zostanie prawidłowo wykonany przez doświadczonych naukowców, chirurgiczny element opisanego protokołu powinien zostać zakończony w ciągu około dwóch godzin. Należy zwrócić szczególną uwagę na utrzymanie stabilnych warunków fizjologicznych zwierzęcia podczas zabiegu, w szczególności temperatury ciała i głębokości znieczulenia, które powinny być systematycznie kontrolowane poprzez ocenę małżowiny usznej i odruchów odstawienia. Po zabiegu powinno być możliwe utrzymanie stabilnych warunków zapisu przez co najmniej sześ...

Jednostki motoryczne (MU) to najmniejsze jednostki funkcjonalne mięśni szkieletowych. Dlatego zrozumienie ich funkcji, plastyczności i właściwości skurczowych, a także mechanizmów regulacji ich siły, jest kluczowe dla postępu w fizjologii mięśni. Podstawowe właściwości kurczliwe MU i proporcje ich typów fizjologicznych zostały udokumentowane dla wielu mięśni, głównie mięśni kończyn tylnych u zwierząt doświadczalnych. Jednak zarówno plastyczność właściwości MU, jak i mechanizmy regulacji siły MU nie są jeszcze w pełni poznane.
Zasada opisanej metody polega na rozległym odnerwieniu mięśni kończyn tylnych, z wyjątkiem badanego, oraz laminektomii na kręgach lędźwiowych w celu przygotowania cienkich korzonków brzusznych, z których każdy zawiera pojedynczy "funkcjonalny" akson motoryczny, stymulowany elektrycznie w celu zarejestrowania siły i potencjału czynnościowego MU. Stosując technikę opisaną w tym artykule, możliwe jest wyizolowanie ponad połowy MU mięśnia brzuchatego łydki przyśrodkowego w udanym eksperymencie. Szczur ma średnio 52 MU (samice) lub 57 MU (samce) trzech typów fizjologicznych: S (wolny), FR (szybko odporny) i FF (szybko męczący)1,2 i mają zmienne właściwości skurczowe3. W przypadku eksperymentów porównujących średnie wartości MU w grupie kontrolnej i eksperymentalnej konieczna jest izolacja i rejestracja 10-30 MU dla każdej z tych grup. Co istotne, poszczególne jednostki MU mogą być dostępne do stymulacji przez okres przekraczający jedną godzinę. Ponadto, ponieważ technika ta pozwala na rejestrację zarówno siły MU, jak i potencjałów czynnościowych, metoda ta nadaje się do badania zjawisk związanych z wytwarzaniem siły, oceny wpływu zmęczenia i obserwacji związku między siłą a potencjałami czynnościowymi.
Poprzednie badania potwierdziły, że właściwości kurczliwe MU są plastyczne i mogą być modulowane przez liczne interwencje. Eksperymenty z wykorzystaniem opisanej tutaj techniki zostały przeprowadzone na mięśniach brzuchatych łydek przyśrodkowych szczura4 lub innych mięśniach kończyn tylnych szczura 5,6, a także na mięśniach kota7, przy użyciu podobnej metody izolacji pojedynczego MU. Kolejna seria eksperymentów z wykorzystaniem ciągów bodźców dostarczanych w zmiennych odstępach międzyimpulsowych dostarczyła obserwacji dotyczących procesów kontroli motorycznej, a wyniki w ogóle zwracają uwagę na historię stymulacji, w tym na istotne efekty przesunięcia skali czasowej nawet jednego bodźca, kluczowego dla produkcji siły8,9.
MU mogą być również badane przy użyciu alternatywnych metod. Pierwszą z metod jest bezpośrednia stymulacja neuronów ruchowych. Burke wykorzystał wewnątrzkomórkową stymulację motoneuronów w mięśniu brzuchatym łydki i płaszczkowatym kota za pomocą szklanych mikroelektrod używanych równolegle do określenia właściwości elektrofizjologicznych tych neuronów1,10. Zaproponowano inne metody badania MU w mięśniach ludzkich, które wymagają znacznie mniejszej interwencji. W przypadku wszystkich tych metod elektrody stymulujące i rejestrujące są wprowadzane do mięśnia lub nerwu, a siła jest rejestrowana z palca lub stopy. Pierwsza z tych metod została wykorzystana do badania MU w pierwszym grzbietowym mięśniu międzykostnym. Dla tego mięśnia, kurczącego się z niewielką siłą, w elektromiogramie zarejestrowanym za pomocą elektrody igłowej wprowadzonej do mięśnia zidentyfikowano potencjały czynnościowe tylko jednej aktywnej jednostki motorycznej. Następnie fragmenty siły mięśniowej zarejestrowane równolegle i podążające za każdym potencjałem czynnościowym zostały uśrednione (uśrednienie wywołane kolcem). Metoda ta umożliwia wydobycie siły jednej jednostki motorycznej z recordingu siły mięśniowej11. Jednak słabością metodologiczną tej procedury jest to, że nie uśredniono pojedynczej siły skurczu, ale raczej fragmenty skurczów tężcowych. Ludzkie MU mogą być również badane za pomocą drugiej metody domięśniowej mikrostymulacji elektrycznej za pomocą elektrody wprowadzonej do mięśni12, która stymuluje fragment drzewa aksonalnego, prowadząc do aktywacji pojedynczej jednostki motorycznej. Trzecią metodą jest mikrostymulacja z elektrodą wprowadzoną do nerwu. Gdy elektroda aktywuje tylko jeden akson motoryczny w nerwie, tylko jedna jednostka motoryczna kurczy się13. Te ostatnie metody mają pewne ograniczenia, m.in. stabilność i jakość nagrania, ograniczenia etyczne i dostęp do materiału eksperymentalnego. Protokół ten był szeroko stosowany u kotów w latach 70-tych i 80-tych14.

<table><tbody><tr><td>Przetwornik siły</td><td>wykonany na</td><td></td><td></td>zamówienie</tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki o naturze</td><td>nr 11255-20</td><td>Dumont #55 z ekstra lekkimi i cienkimi trzonkami</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>precyzyjnej nr 11150-10</td><td>Ekstra drobne kleszcze do nagolenników</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>do narzędzi naukowych</td><td>nr 11026-15</td><td>Specjalny wzór miseczek zapewniający doskonały chwyt</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Fine Science Narzędzia</td><td>nr 11023-10</td><td>Kleszcze z cienkimi zębami 1x2</td></tr><tr><td></td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej</td><td>nr 11251-20</td><td>Dumont #5</td></tr><tr><td>Hemostats</td><td>Narzędzia naukowe</td><td>nr 13003-10</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka izolacyjna</td> Hartman <td>Instrumenty do trawy</td><td>S1U5A</td><td></td></tr><tr><td>Niski poziom hałasu Bioamplifer</td><td>World Precision Instruments</td><td>Kod zamówienia 74030</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyty na igły</td><td>Grzywna Narzędzia naukowe</td><td>nr 12503-15</td><td>Ze szczękami z węglika wolframu</td></tr><tr><td>Rongeurs</td><td>Narzędzia naukowe</td><td>nr 16021-14</td> Nożyczki <td>Friedmana-Pearsona</td></tr><tr><td></td><td>Narzędzia naukowe</td><td>nr 14101-14</td><td>Proste, ostre/z dużymi pętlami na palce</td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Narzędzia do nauki</td> o nauce nr <td>14075-11</td><td>Zakrzywione/</td></tr><tr><td>nożyczki</td><td>Narzędzia do nauki o nauce</td><td>nr 14084-08</td><td>Bardzo cienkie</td></tr><tr><td>nożyczki</td> bonn <td>Narzędzia do nauki o napięciu</td> nr <td>15000-00</td><td>Proste, idealne do cięcia nerwów</td></tr><tr><td>Stymulator</td><td>Instrumenty do trawy</td><td>S88</td><td>Stymulator impulsów kwadratowych z podwójnym wyjściem</td></tr></tbody></table>

funkcjonalna izolacja pojedynczych jednostek motorycznych mięśnia brzuchatego łydki przyśrodkowego szczura

Functional Isolation of Single Motor Units of Rat Medial Gastrocnemius Muscle

Ta praca opisuje funkcjonalną izolację jednostek motorycznych (MU), standardową elektrofizjologiczną metodę określania cech jednostek motorycznych w mięśniach kończyn tylnych (takich jak mięsień brzuchaty łydki przyśrodkowej, płaszczkowaty lub podeszwowy) u szczurów doświadczalnych. Istotnym elementem metody jest zastosowanie bodźców elektrycznych dostarczanych do aksonu ruchowego odizolowanego od korzenia brzusznego. Bodźce mogą być dostarczane w stałych lub zmiennych odstępach między impulsami. Ta metoda jest odpowiednia do eksperymentów na zwierzętach w różnych stadiach dojrzałości (młode, dorosłe lub stare). Co więcej, protokół ten może być stosowany w eksperymentach badających zmienność i plastyczność jednostek motorycznych wywoływanych przez szerokie spektrum interwencji. Wyniki tych eksperymentów mogą zarówno poszerzyć podstawową wiedzę z zakresu fizjologii mięśni, jak i przełożyć na praktyczne zastosowania. Procedura ta koncentruje się na chirurgicznym przygotowaniu do rejestracji i stymulacji MU, z naciskiem na niezbędne kroki w celu osiągnięcia stabilności preparatu i powtarzalności wyników.

Parametry skurczów jednostek motorycznych oraz potencjałów czynnościowych można obliczyć na podstawie zapisów, gdy zapewnione są stabilne warunki rejestracji. Rysunek 1 przedstawia reprezentatywny zapis pojedynczego drgnięcia szybkiej jednostki motorycznej. Górny ślad pokazuje potencjał czynnościowy jednostki motorycznej. Opóźnienie między podaniem bodźca a początkiem potencjału czynnościowego jednostki motorycznej wynika z czasu przewodzenia z korzenia brzusznego do mięśnia. <strong class="...

Ta metoda pozwala na rejestrację siły skurczów skurczowych i tężcowych oraz potencjałów czynnościowych w trzech typach jednostek motorycznych w mięśniu brzuchatym łydki przyśrodkowego szczura. Izolacja funkcjonalna pojedynczej jednostki silnikowej jest indukowana przez stymulację elektryczną aksonu.

Funkcjonalna izolacja pojedynczych jednostek motorycznych mięśnia brzuchatego łydki przyśrodkowego szczura

This work outlines functional isolation of motor units (MUs), a standard electrophysiological method for determining characteristics of motor units in ...

Metoda ta pozwala na funkcjonalną izolację pojedynczych jednostek motorycznych w przenoszeniu mas zwierząt doświadczalnych. Główną zaletą tej techniki jest rejestracja siły i potencjałów czynnościowych poszczególnych jednostek motorycznych o zidentyfikowanym typie fizjologicznym. W zademonstrowaniu procedury pomoże prof. dr hab. Jan Celichowski, kierownik zakładu neurobiologii.Zacznij od przecięcia skóry wzdłuż kręgosłupa, od kości krzyżowej do kręgów piersiowych, ostrymi, nożyczkami. Zidentyfikuj kręg S1 jako najniższy segment. Następnie przetnij i usuń mięśnie najdłuższe oraz wyrostki kolczyste od kręgów L6 do L2.Użyj drobnych rongeurs, aby usunąć wyrostki poprzeczne od L6 do L2 i wykonaj laminektomię nad segmentami L6 do L2, aby odsłonić odcinki lędźwiowe rdzenia kręgowego pokryte oponą twardą. Za pomocą ostrych nożyczek przetnij rdzeń kręgowy oraz korzenie grzbietowe i brzuszne w segmencie kręgów L2, na poziomie górnej granicy laminektomii. Umieść małe kawałki suchej pianki żelowej, aby zatrzymać krwawienie.Następnie użyj ostrych, nożyczek, aby przytulić się podłużnie po tylnej stronie lewej kończyny tylnej, od ścięgna Achillesa do biodra. Zlokalizuj dół podkolanowy z tyłu staw

functional-isolation-single-motor-units-rat-medial-gastrocnemius

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Aby ocenić efekty in vivo interwencji terapeutycznych w chorobach mięśni, konieczne są metody ilościowego pomiaru generowanej siły oraz podatności na zmęczenie w leczonych mięśniach. Szczegółowo opisujemy podejście do oceny właściwości miomechanicznych w wyizolowanym mięśniu kończyny tylnej myszy. Analiza ta stanowi solidną metodę ilościowego określania wpływu modyfikacji genetycznej na funkcję mięśni, a także porównywania terapii w modelach mysich chorób mięśni.

Analiza miomechaniczna wyizolowanego mięśnia szkieletowego

Niniejszy film prezentuje chirurgiczne przygotowanie i procedury niezbędne do badania odpowiedzi skurczowej preparatu przyśrodkowej części mięśnia brzuchatego szczura in situ. Preparat ten umożliwia pomiar właściwości skurczowych mięśnia szkieletowego w warunkach fizjologicznych. Zwierzę zostaje poddane znieczuleniu, a mięsień zostaje oddzielony od otaczających go tkanek na jego końcu dystalnym. Ścięgno Achillesa zostaje przymocowane do przetwornika siły, co pozwala na pomiar odpowiedzi...

Procedury badania właściwości kurczliwych mięśni szkieletowych szczura in situ

Opisujemy metodę bezpośredniego pomiaru siły mięśniowej, mocy mięśniowej, kinetyki skurczu oraz podatności na zmęczenie izolowanych mięśni szkieletowych w układzie in vitro z wykorzystaniem stymulacji polowej. Dzięki zastosowaniu różnych protokołów stymulacji można uzyskać cenne informacje na temat właściwości gospodarki Ca2+ oraz mechanizmu skurczowego mięśnia.

Ex Vivo ocena kurczliwości, męczliwości i alternansu w izolowanych mięśniach szkieletowych

Ten film pokazuje izolację pojedynczych włókien mięśniowych z pobranego mięśnia myszy Extensor Digitorum Longus (EDL). Wyizolowane włókna mięśniowe można hodować w celu zbadania aktywności komórek macierzystych mięśni związanych z włóknami mięśniowymi.

Izolacja włókien mięśniowych: technika uzyskiwania pojedynczych włókien mięśniowych z zebranego mięśnia prostownika myszy Digitorum Longus (EDL)

Izolacja i hodowla włókien mięśniowych to złoty standard systemu in vitro do badania przejścia komórek satelitarnych przez spoczynek, aktywację i różnicowanie.  Co ważne, system hodowli pojedynczych włókien mięśniowych zachowuje asocjację miofiber/komórki macierzyste, która jest niezbędnym składnikiem niszy komórek macierzystych mięśni.

Izolacja i hodowla poszczególnych włókien mięśniowych i ich komórek satelitarnych z dorosłych mięśni szkieletowych

Model przecięcia nerwu piszczelowego jest dobrze tolerowanym, sprawdzonym i powtarzalnym modelem zaniku mięśni szkieletowych. Modelowy protokół chirurgiczny został opisany i zademonstrowany na myszach C57Black6.

Przecięcie nerwu piszczelowego - standaryzowany model atrofii mięśni szkieletowych wywołanej denerwacją u myszy

Tutaj proponujemy metodę efektywnego pozyskiwania pojedynczych włókien mięśniowych we wczesnych stadiach rozwoju pourodzeniowego z homozygotycznego zmutowanego modelu myszy Lamin Δ8-11, bardzo ciężkiego modelu dystrofii mięśniowej Emery'ego-Dreifussa (EDMD).

Izolacja i hodowla pojedynczych włókien mięśniowych z mysiego modelu dystrofii mięśniowej Embergla-Dreifussa we wczesnym rozwoju poporodowym

Zdolność do dokładnego wykrywania komponentów połączenia nerwowo-mięśniowego jest kluczowa w ocenie zmian w jego architekturze spowodowanych procesami patologicznymi lub rozwojowymi. Poniżej przedstawiamy pełny opis prostej metody uzyskiwania wysokiej jakości obrazów całych połączeń nerwowo-mięśniowych, które można wykorzystać do wykonywania pomiarów ilościowych.

Rozwarstwienie pojedynczych włókien mięśni szkieletowych do analiz immunofluorescencyjnych i morfometrycznych połączeń nerwowo-mięśniowych w całości

Tutaj opisujemy szczegółową metodę izolacji mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy i późniejszą analizę oddychania za pomocą wskaźnika zużycia tlenu (OCR) za pomocą testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach. Rurociąg ten można zastosować do badania wpływu wielu interwencji środowiskowych lub genetycznych na metabolizm mitochondriów.

Izolacja mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy do testów respirometrycznych

Opisujemy protokół uzyskiwania enzymatycznie zdysocjowanych włókien o różnych długościach i typach z sześciu mięśni dorosłych myszy: trzy z nich już opisane (zginacz palca krótkiego, prostownik palca długiego, płaszczkowaty) i trzy z nich pomyślnie zdysocjowane po raz pierwszy (prostownik palucha długiego, mięsień długi długi, peroneus digiti quarti).

Nienaruszone krótkie, pośrednie i długie włókna mięśni szkieletowych uzyskane w wyniku enzymatycznej dysocjacji sześciu mięśni kończyn tylnych myszy: poza zginaczem digitorum brevis

Ten protokół opisuje izolację nienaruszonych pojedynczych włókien mięśniowych z utlenianego mięśnia podkolanowego oraz ustanowienie wysoce czystych kultur mioblastów pochodzących z tych włókien. Zoptymalizowana procedura niezawodnie przynosi około 300–500 nienaruszonych miofibryli na jednego mysza, umożliwiając dalszą molekularną i komórkową analizę.

Test izolacji pojedynczych włókien do oceny utleniania zachowania miofibrili

Poznaj metodę izolacji pojedynczych jednostek motorycznych mięśnia brzuchatego łydki przyśrodkowej szczura przy użyciu stymulacji elektrycznej. Technika umożliwia precyzyjny zapis siły skurczu i potencjałów czynnościowych.

Funkcjonalna izolacja pojedynczych jednostek motorycznych mięśnia brzuchatego łydki przyśrodkowego szczura

Przeglądaj więcej filmów