Mysi model gojenia ran wycinających i histologiczna morfometryczna analiza ran
21 sierpnia 2020
Ten protokół opisuje, jak generować obustronne rany wycinające o pełnej grubości u myszy oraz jak następnie monitorować, zbierać i przygotowywać rany do analizy morfometrycznej. Dołączono szczegółowy opis sposobu wykorzystania seryjnych odcinków histologicznych do definiowania, precyzyjnego określania ilościowego i wykrywania wad morfometrycznych.
Protokół ten wykorzystuje analizę histologiczną w celu uzyskania solidnych pomiarów morfometrycznych ran wycinanych myszy. Korzystając z tej techniki, możemy przeanalizować całą ranę za pomocą podzbioru odcinków seryjnych, co pozwala nam dokładniej wykryć wady, które w przeciwnym razie mogłyby zostać pominięte. Procedurę zademonstruje Lindsey Rhea, pracownik naukowy z mojego laboratorium.
Po potwierdzeniu braku reakcji na odruch pedałowania u znieczulonej dorosłej myszy, nałóż maść na oczy zwierzęcia i użyj elektrycznej maszynki do strzyżenia maszynki do golenia ruchem ogonowo-rostralnym, aby usunąć sierść z grzbietu myszy na poziomie ramion. Użyj żyletki trzymanej pod kątem 20 stopni od tyłu ruchem rostralno-ogonowym, aby usunąć wszelkie pozostałe włosy z odsłoniętej skóry, a następnie oczyść skórę jedną chusteczką z jodonem powidonu i jedną chusteczką z 70% alkoholem izopropylowym. W celu indukcji rany ułóż czysty ręcznik papierowy na płaskiej powierzchni pokrytej woskiem dentystycznym i umieść mysz na ręczniku w pozycji leżącej.
Ściśnij skórę myszy między łopatkami wzdłuż grzbietowej linii środkowej i odciągnij umieszczoną w kanapce fałd skóry od ciała. Przełączając mysz do pozycji leżącej na boku, umieść stempel biopsyjny o pożądanym rozmiarze rany jak najbliżej ciała i pozwól skórze się rozluźnić. Dociśnij stempel ruchem kołyszącym, aby przebić wszystkie warstwy skóry i usuń biopsje stempla z rany za pomocą sterylnych nożyczek i pęsety, aby w razie potrzeby uwolnić stempel od otaczającej skóry.
Następnie pozwól myszy odzyskać sprawność dzięki monitorowaniu i przeciwbólowi. W celu analizy morfometrycznej łożyska rany należy otworzyć cyfrowy obraz barwionej rany. Aby ustawić preferencje skali i pomiaru, w obszarze Analizuj wybierz opcję Ustaw skalę i wprowadź odległość w pikselach, znaną odległość i jednostkę długości.
Wybierz opcje Globalne i OK, aby zachować taką samą skalę dla każdego otwartego obrazu, a następnie wybierz opcję Analizuj i ustaw pomiary, aby potwierdzić, że pole obszaru jest zaznaczone. Aby zmierzyć długość rany, wybierz opcję odręczną i za pomocą narzędzia prześledź wzdłuż połączenia skórno-naskórkowego, zaczynając od ostatniego mieszka włosowego nieuszkodzonej tkanki po jednej stronie rany do pierwszego mieszka włosowego nieuszkodzonej tkanki po drugiej stronie. Jeśli naskórek nie pokrywa całej rany, należy podążać za połączeniem skórno-naskórkowym po jednej stronie rany, gdzie kończy się wędrujący język i kontynuować wzdłuż górnej części tkanki ziarninowej lub połączenia między tkanką ziarninową a strupem, aż do osiągnięcia migrującego języka i pierwszego mieszka włosowego nieuszkodzonej tkanki po drugiej stronie rany.
Następnie kliknij przycisk Analizuj i mierz. Długość pomiaru pojawi się w tych samych jednostkach, co ustawione na skali. Jeśli naskórek nie pokrywa całej rany, należy zmierzyć odległość między każdą krawędzią naskórka podążającą za górnym aspektem tkanki ziarninowej lub połączeniem między tkanką ziarninową a strupem do pierwszego mieszka włosowego.
Aby zmierzyć obszar rany, za pomocą narzędzia odręcznego prześledź wzdłuż górnej części naskórka lub górnej części tkanki ziarninowej, zaczynając od ostatniego mieszka włosowego nieuszkodzonej tkanki po jednej stronie rany do pierwszego mieszka włosowego nieuszkodzonej tkanki po drugiej stronie. Kontynuuj śledzenie pionowo wzdłuż mieszka włosowego do tkanki ziarninowej. Po dotarciu do przeciwległego mieszka włosowego i tkanki tłuszczowej lub mięśnia, podążaj za dolną granicą tkanki ziarninowej po przeciwnej stronie rany i połącz punkt początkowy wzdłuż mieszka włosowego, aby zamknąć obszar.
Jeśli rana nie jest w pełni nabłonkowana, należy prześledzić wzdłuż górnej części naskórka aż do krawędzi czołowej i powrócić do punktu początkowego po połączeniu skórno-naskórkowym. Jak pokazano na ilustracji, wykonując pomiary 2D w całej ranie, byliśmy w stanie obliczyć parametry, które nie są możliwe przy analizie 2D tylko na środku rany, co jest powszechnie stosowaną metodą w terenie. W tym eksperymencie wykorzystano pomiary 2D powierzchni rany i uśredniono je dla całej rany lub środkowego podzbioru rany i nie wykazały istotnej różnicy między grupami eksperymentalnymi ani metodami analizy.
Obliczona objętość rany różniła się jednak istotnie między grupami eksperymentalnymi, co świadczy o znaczeniu pogłębionej analizy histologicznej parametrów gojenia się rany. Generowanie ran o stałej wielkości do analizy histologicznej i przeprowadzanie rygorystycznych cięć seryjnych ma kluczowe znaczenie dla dokładnej analizy morfometrycznej. Niebarwione skrawki mogą być używane do immunofluorescencji lub barwienia trichromowego Massona w celu pomiaru innych aspektów gojenia się ran, podczas gdy rany zamrożone błyskawicznie mogą być używane wraz z morfometrią do ilościowej analizy białek.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje sposób tworzenia obustronnych, pełnej grubości ran wycięciowych u myszy oraz późniejsze monitorowanie i przygotowanie tych ran do analizy morfometrycznej. Podkreślono w nim zastosowanie seryjnych przekrojów histologicznych w celu dokładnego ilościowego oznaczenia i wykrycia defektów morfometrycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia
- Histologia
Wstęp
- Zrozumienie mechanizmów gojenia ran jest kluczowe w badaniach biomedycznych.
- Rany wycięcia u myszy służą jako model do badania regeneracji skóry.
- Analiza histologiczna pozwala na uzyskanie wiedzy na temat morfologii tkanek i procesów gojenia.
- Dokładne pomiary morfometryczne są niezbędne do oceny gojenia ran.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnego protokołu tworzenia ran wycinanych u myszy.
- Monitorowanie i analiza procesu gojenia za pomocą analizy morfometrycznej.
- Wykorzystanie przekrojów histologicznych do szczegółowej oceny charakterystyki ran.
Zastosowane metody
- Indukcja obustronnych, pełnościennych ran wyciętych u znieczulonych myszy.
- Zastosowanie technik histologicznych w celu przygotowania próbek tkanek.
- Wykorzystanie serii cięć do analizy morfologii rany.
- Ilościowe określenie defektów morfometrycznych poprzez szczegółowe pomiary.
Główne wyniki
- Skuteczne indukowanie ran wycinanych przy minimalnej liczbie powikłań.
- Analiza histologiczna dostarczyła istotnych informacji na temat gojenia ran.
- Dane ilościowe potwierdziły skuteczność protokołu.
- Za pomocą zastosowanej metody precyzyjnie zidentyfikowano defekty w procesie gojenia ran.
Wnioski
- Protokół zapewnia solidne ramy do badania gojenia ran u myszy.
- Analiza histologiczna jest cennym narzędziem do oceny morfometrycznej.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodologii w celu zgłębienia mechanizmów gojenia.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Dokładna kwantyfikacja parametrów gojenia ran jest kluczowa dla wykrywania subtelnych zmian fenotypowych w modelach przedklinicznych. Niniejszy protokół umożliwia rygorystyczną analizę morfometryczną wyciętych ran u myszy, wspierając walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w programach dermatologicznych i medycyny regeneracyjnej. Dzięki zwiększeniu czułości pomiarów zwiększa on pewność prognostyczną we wczesnej fazie oceny terapeutycznej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez precyzyjny pomiar wymiarów naskórka i rany w poszczególnych fazach gojenia.
- Wartość operacyjna: Dostarcza standaryzowanych wyników morfometrycznych, które zmniejszają zmienność w badaniach nad oddziaływaniem na cel terapeutyczny.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe pomiary powierzchni i objętości rany, odpowiednie do wysokoprzepustowej analizy modulatorów gojenia ran.
- Wartość operacyjna: Wspiera standaryzację testów poprzez seryjne cięcie i przepływy pracy oparte na analizie obrazu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Ułatwia modelowanie systemów istotnych dla przebiegu chorób poprzez rejestrację trójwymiarowej dynamiki ran, której nie można wykryć za pomocą konwencjonalnej analizy 2D.
- Wartość operacyjna: Umożliwia podłużne śledzenie postępów gojenia w celu zapewnienia ciągłości badań przedklinicznych oraz podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu projektu (go/no-go).
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z procesami badawczymi w biologii odkrywczej, dostarczając ilościowych wyników histopatologicznych, które pomagają w wyborze celu terapeutycznego oraz optymalizacji wiodących związków.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków sygnałowych i ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez obiektywne fenotypowanie morfometryczne.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych wyników niezbędnych do przesiewania związków oraz badań zależności struktura-aktywność.
- Analityka: Pozwala na pomiary objętości naskórka, objętości rany oraz jej powierzchni, co umożliwia statystyczne porównanie różnych warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia z walidacją przedkliniczną za pomocą mierzalnych punktów końcowych gojenia ran.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę opartą na histologii, którą można ponownie wykorzystać w badaniach nad gojeniem ran w ramach różnych programów.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną dzięki wykrywaniu morfometrycznych defektów o niewielkim efekcie, które pomijane są w konwencjonalnych analizach.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i skalowalność dzięki ustandaryzowanym protokołom cięcia i pomiarów.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez zmniejszenie odsetka wyników fałszywie ujemnych w przesiewie fenotypowym.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów do leczenia ran z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o solidne dane histopatologiczne.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w przygotowywaniu skrawków histologicznych, barwieniu oraz obsłudze oprogramowania do morfometrii.
- Zależność od infrastruktury mikrotomii, mikroskopii i analizy obrazu w celu przetwarzania serii skrawków.
- Konieczność standaryzacji procedur indukowania ran i przygotowywania skrawków pomiędzy zespołami w przypadku badań wieloośrodkowych.
- Wymaga uwzględnienia modyfikacji przy zastosowaniu metody w różnych szczepach myszy lub modelach ran.
- Ograniczone przez zwiększone zapotrzebowanie czasowe i zasobowe w porównaniu do analizy pojedynczego skrawka, co jest jednak uzasadnione wyższą czułością detekcji.
