Name: Mysi model gojenia ran wycinających i histologiczna morfometryczna analiza ran (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Naucz się tworzyć dwustronne rany wycięciowe u myszy i przeprowadzać szczegółową analizę morfometryczną za pomocą technik histologicznych. Ta metoda umożliwia dokładne wykrywanie defektów gojenia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni wszystkim członkom Laboratorium Dunnwald, którzy przyczynili się do optymalizacji tego protokołu na przestrzeni lat, oraz Ginie Schatteman, której wytrwałość w promowaniu stosowania seryjnego cięcia do analizy ran umożliwiła jego stworzenie. Prace te były wspierane przez fundusze z NIH/NIAMS dla Martine Dunnwald (AR067739).

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z przepisami federalnymi oraz polityką i procedurami Uniwersytetu Iowa, które zostały zatwierdzone przez IACUC Uniwersytetu Iowa.
1. Zwierzęta i hodowla
<ol>
	<li>Użyj dorosłych myszy z pożądanej linii myszy w wieku 8-10 tygodni, gdy mieszek włosowy jest w stadium telogenu.</li>
	<li>W dniu operacji należy umieścić myszy w czystych klatkach i pojedynczo trzymać je w domu, aby zminimalizować przerwanie rany.</li>
</ol>
2. Chirurgia
UWAGA: Nie ma potrzeby utrzymywać sterylnych warunków chirurgicznych. Chociaż należy zachować ostrożność w celu utrzymania sterylności między zwierzętami, sama biopsja stempla jest wykonywana na czystej, ale niesterylnej powierzchni. Czas trwania operacji na zwierzę wynosi od 10 do 15 minut.
<ol>
	<li>Znieczulenie
	<ol>
		<li>Znieczulaj zwierzę przez 1-2 minuty w komorze indukcyjnej z parownikiem izofluranu ustawionym na 4-5% natężenie przepływu i przepływomierzem tlenu ustawionym na 1 litr na minutę. Zobacz Dyskusja, aby zapoznać się z alternatywnymi opcjami znieczulenia.</li>
		<li>Przed rozpoczęciem zabiegu należy potwierdzić prawidłowe znieczulenie. Głębokość znieczulenia można potwierdzić mocnym uszczypnięciem palca u nogi.</li>
		<li>Przenieś mysz z pojemnika indukcyjnego na stożek nosowy i zmniejsz natężenie przepływu izofluranu do 1,5%, a przepływomierza tlenu do 0,5 l/min.</li>
		<li>Nałóż maść okulistyczną na oba oczy, gdy zabieg trwa dłużej niż 5 minut.</li>
		<li>Utrzymuj normalną temperaturę ciała za pomocą podkładki termicznej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie miejsca rany
	<ol>
		<li>Użyj elektrycznej maszynki do golenia w ogonowym ruchu rostralnym, aby usunąć sierść z tyłu myszy na poziomie ramion. W razie potrzeby usuń włosy poniżej pleców, jeśli wykonujesz więcej niż dwie rany.</li>
		<li>Usuń pozostałe włosy za pomocą żyletki w rostralnym ruchu ogonowym trzymanym pod kątem 20° od tyłu myszy, aby dokładnie ogolić przycięty obszar (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A).</li>
		<li>Oczyść ogolony obszar wacikiem z powidonem i jodem.</li>
		<li>Przetrzyj skórę sterylnym wacikiem z 70% alkoholem izopropylowym, aby zmniejszyć potencjalne podrażnienie skóry spowodowane wacikiem jodowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Postrzelaj
	<ol>
		<li>Ściśnij skórę między łopatkami wzdłuż grzbietowej linii środkowej i odciągnij warstwowy fałd skórny od ciała (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B).</li>
		<li>Ustaw mysz na boku z fałdem skórnym na płaskiej powierzchni pokrytej czystym ręcznikiem papierowym lub jego odpowiednikiem. Użyj arkusza wosku dentystycznego pod ręcznikiem, aby chronić znajdującą się pod spodem powierzchnię przed uszkodzeniem (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C).</li>
		<li>Umieść stempel biopsyjny o pożądanej wielkości jak najbliżej ciała i pozwól skórze się rozluźnić. Nie rozciągaj skóry, ponieważ rana będzie miała większy rozmiar niż wyznaczony rozmiar stempla (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D).</li>
		<li>Uderz w skórę, naciskając w dół, można użyć ruchu kołyszącego, aby upewnić się, że wszystkie warstwy skóry po obu stronach zostały przebite (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1E). Użyj nowego stempla do biopsji dla każdego zwierzęcia.</li>
		<li>Usuń biopsje stempla z ran (<silna klasa="xfig">Rysunek 1F). Jeśli nadal znajdują się miejsca przyczepu, użyj sterylnych nożyczek i pęsety, aby uwolnić stempel od otaczającej skóry. Przetwarzaj tkankę kontrolną biopsji stempla zgodnie z wymaganiami w oparciu o dalsze plany analiz gojenia się ran (patrz Dyskusja, aby zapoznać się z sugestiami).</li>
		<li>Wykonuj zdjęcia makroskopowe z równej odległości od miejsc rany lub za pomocą linijki w kadrze, aby zmierzyć początkowy obszar rany i wyeliminować wartości odstające z analizy.</li>
		<li>Analgezję należy podawać przez co najmniej 24 godziny zgodnie z zatwierdzonym protokołem dla zwierząt. Na przykład: Buprenorfina SR-LAB, wstrzykiwana w pojedynczej dawce podskórnie w dawce 0,5-2 mg/kg przez 48 godzin łagodzenia bólu (patrz Dyskusja, aby zapoznać się z alternatywnymi sugestiami i rozważaniami).</li>
		<li>Monitoruj mysz po wyjściu z narkozy, aż utrzyma wyprostowaną postawę i będzie normalnie chodzić po klatce.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Monitorowanie po ranie
<ol>
	<li>Codziennie monitoruj myszy pod kątem eksperymentalnych punktów końcowych określonych przez badacza oraz zgodnie z protokołami instytucjonalnymi. Przykładami są: infekcja, widoczna utrata masy ciała lub zgarbiona postawa.</li>
	<li>Wykonuj codzienne zdjęcia makroskopowe w kontrolowany sposób, tak jak robiono to po pierwszej operacji.</li>
</ol>
4. Zbieranie ran
<ol>
	<li>Eutanazja myszy w pożądanym punkcie czasowym po zranieniu zgodnie z zatwierdzonym protokołem dla zwierząt.</li>
	<li>Wykonaj makroskopowe zdjęcia miejsc ran w sposób kontrolowany, zgodny z wcześniejszym pozyskiwaniem zdjęć (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A,C).</li>
	<li>Wytnij szeroki prostokąt wokół miejsc rany za pomocą skalpela (Rysunek 2D,E).</li>
	<li>Uwolnij prostokątny kawałek tkanki za pomocą nożyczek i pęsety, aby odkleić i odciąć skórę od tkanki znajdującej się pod spodem (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2F). Umieść na szalce Petriego (Rysunek 2G).</li>
	<li>Zbierz rany. Przyciąć do 2 mm niezranioną tkankę otaczającą ranę ze wszystkich stron w kształcie prostokąta (<silna klasa="xfig">Rysunek 2H,I). Zobacz Dyskusję, aby zapoznać się z alternatywnymi opcjami zbierania rany.</li>
	<li>Przetwarzaj rany zgodnie z wymaganiami do kolejnych badań. Zarezerwować co najmniej jedną ranę na mysz do zatopienia w parafinie i analizy histologicznej.</li>
</ol>
5. Utrwalanie ran i osadzanie
<ol>
	<li>Napraw ranę
	<ol>
		<li>Utrwalić tkankę rany w świeżo przygotowanym 4% roztworze paraformaldehydu8 przez 3 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie przenieść na noc do 4 °C. Filtracja paraformaldehydu i roztworu w mikroskopii elektronowej (EM) nie jest wymagana.</li>
		<li>Przemyć rany dwukrotnie przez 30 minut w 1x PBS.</li>
		<li>Zastąp PBS 70% ETOH i przechowuj w temperaturze 4 °C do momentu zatopienia. Przetwarzaj tkanki w ciągu 24-48 godzin, aby uniknąć utraty antygenu lub w ciągu 1-2 tygodni, jeśli oceniasz tylko cechy histologiczne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetwarzaj i osadź ranę
	<ol>
		<li>Przenieś każdą ranę do kasety do zatapiania. Oznacz kasety do osadzania ołówkiem, ponieważ proces ten usunie atramenty.</li>
		<li>Przetwarzaj tkankę ręcznie lub za pomocą automatycznego procesora, odwadniając tkankę ze zwiększaniem zawartości procentowej etanolu, oczyszczając ją ksylenem, a następnie naciekając tkankę woskiem parafinowym (Tabela 1).</li>
		<li>Osadź ranę pod kątem 90° ("stojąc") od poziomej powierzchni formy do zatapiania (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A,B).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Dzień 0 analiza obszaru rany
<ol>
	<li>Pobierz bezpłatne oprogramowanie NIH-Image J lub NIH-Fiji (https://imagej.net/Fiji/Downloads).</li>
	<li>Otwórz plik ze zdjęciem ran z dnia 0.</li>
	<li>Zaznacz pole "Obszar" w obszarze Analiza | Ustaw wymiary.</li>
	<li>Wybierz "Ustaw skalę" w obszarze Analizuj. Wprowadź odległość w pikselach, znaną odpowiednią odległość i jednostkę odległości (= jednostkę długości), jeśli pomiary makroskopowe są częścią badania, lub pomiń ten krok, jeśli wymagane są tylko pomiary względne.</li>
	<li>Wybierz "Zaznaczanie odręczne" na pasku narzędzi Fidżi.</li>
	<li>Nakreśl obwód rany.</li>
	<li>Kliknij pozycję Zmierz w obszarze Analizuj.</li>
	<li>Utwórz arkusz kalkulacyjny, aby śledzić wymiary na zwierzę na ranę.</li>
	<li>Skopiuj wymiar obszaru rany w arkuszu kalkulacyjnym.</li>
	<li>Obliczyć średnią powierzchnię i odchylenie standardowe wszystkich ran dla danego eksperymentu.</li>
	<li>Wykluczyć z analizy histologicznej wszelkie rany poza dwoma odchyleniami standardowymi średniej.</li>
</ol>
7. Podział szeregowy
<ol>
	<li>Bloki ran zatopione w parafinie schłodzić w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Włóż blok parafiny do uchwytu bloku mikrotomu i ustaw go tak, aby ostrze cięło prosto w poprzek bloku. Ustaw blok tak, aby tkanka "stała" pod kątem 90°, umożliwiając jednoczesne cięcie naskórka i skóry właściwej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3C, D).</li>
	<li>Wykonaj 2-4 wstęgi po 20-30 kawałków parafiny po 7 μm każda.</li>
	<li>Użyj suchego pędzla i igły do rozwarstwiania, aby przenieść każdą wstążkę na twardą, ale łatwą do manipulowania powierzchnię, taką jak twardy plastikowy arkusz.</li>
	<li>Odłącz górną część każdej wstążki za pomocą żyletki i umieść na szkiełku mikroskopowym.</li>
	<li>Obserwuj niezabarwione skrawki pod mikroskopem jasnego pola, aby określić, które z nich zawierają zranioną tkankę, którą można zidentyfikować po braku mieszków włosowych, zmianach w wyglądzie tkanki łącznej lub naskórka i/lub obecności strupa (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4A,B).</li>
	<li>Wyrzuć niezranione odcinki do 20 odcinków przed rozpoczęciem rany.</li>
	<li>Przeciąć ranę, powtarzając kroki 7.3 i 7.4 do momentu, gdy nie zostanie wykryta żadna rana w niebarwionych skrawkach.</li>
</ol>
8. Montaż sekcji parafinowych
<ol>
	<li>Oddziel sekcje parafiny co 5 sekcji żyletką, zaczynając od pierwszej wstążki (<silna klasa="xfig">Rysunek 3E).</li>
	<li>Oznacz szkiełka mikroskopowe zarówno numerem preparatu, jak i numerami wszystkich sekcji.</li>
	<li>Chwyć grupę 5 sekcji mokrym pędzlem i unieś je na powierzchni wody w ciepłej łaźni wodnej (40-45 °C), aby je spłaszczyć.</li>
	<li>Za pomocą jednego z oznaczonych szkiełek mikroskopowych należy wybrać grupę 5 sekcji z kąpieli wodnej (<silna klasa="xfig">Rysunek 3F) i umieścić na szkiełku podstawowym ustawionym na temperaturę 37 °C na okres do 24 godzin.</li>
	<li>Przechowuj slajdy w pozycji pionowej w pudełku na slajdy.</li>
</ol>
9. Barwienie histologiczne
<ol>
	<li>Przenieś co 8szkiełko mikroskopowe (co odpowiada każdemu 40 krawkowi parafiny) do stojaka do barwienia i zabarwić hematoksyliną i eozyną.</li>
</ol>
10. Obrazowanie mikroskopowe
<ol>
	<li>Rejestruj obrazy za pomocą mikroskopu jasnego pola wyposażonego w obiektyw 4x i możliwość akwizycji cyfrowej. Zapisz skalę, w jakiej zdjęcie zostało wykonane.</li>
	<li>Wyobraź sobie całą ranę w górnej części każdego barwionego szkiełka i upewnij się, że po obu stronach znajduje się trochę niezranionej tkanki. Zrób wiele nakładających się na siebie zdjęć, jeśli rana jest większa niż ramka pojedynczego zdjęcia.</li>
	<li>Zapisz plik wraz z numerem przekroju do analizy morfometrycznej. Użyj numeru sekcji, po którym następuje a, b, c itd., aby uzyskać nakładające się zdjęcia tej samej rany.</li>
</ol>
11. Analiza morfometryczna
UWAGA: Gdy rana obejmuje wiele obrazów, zsumuj pomiary wykonane z poszczególnych zdjęć, aby uzyskać jedną wartość dla każdej metryki na sekcję rany, aby zapisać ją w arkuszu kalkulacyjnym.
<ol>
	<li>Na obrazie J otwórz plik cyfrowy z poplamionym obrazem rany. Nie używaj zszytych obrazów do analizy. Wykonuj pomiary na powiększonych, nakładających się na siebie obrazach, znajdując punkty orientacyjne, które można pominąć, i pobieraj pomiary z obrazu na obraz.</li>
	<li>Ustaw preferencje skali i pomiaru.
	<ol>
		<li>Wybierz "Ustaw skalę" w obszarze Analizuj. Wprowadź odległość w pikselach, znaną odpowiednią odległość i jednostkę odległości (= jednostkę długości). Skala powinna pojawić się w oknie i powinna odpowiadać skali, w jakiej obraz został uzyskany.</li>
		<li>Zaznacz pole "Globalny", aby skala była taka sama dla każdego otwartego obrazu.</li>
		<li>Powtórz kroki od 11.2.1 do 11.2.2 za każdym razem, gdy obraz J jest zamykany i ponownie otwierany.</li>
		<li>Zaznacz pole "Obszar" w obszarze Analiza | Ustaw wymiary.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz długość rany
	<ol>
		<li>Wybierz "Zaznaczanie odręczne" na pasku narzędzi Fidżi.</li>
		<li>Zmierz zaczynając od ostatniego mieszka włosowego nieuszkodzonej tkanki po jednej stronie rany do pierwszego mieszka włosowego nieuszkodzonej tkanki po drugiej stronie rany (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4A,B).</li>
		<li>Śledź wzdłuż połączenia skórno-naskórkowego, aby dotrzeć do tych dwóch punktów orientacyjnych. Jeśli naskórek nie pokrywa całej rany, podążaj za połączeniem skórno-naskórkowym po jednej stronie rany i tam, gdzie kończy się migrujący język, kontynuuj podążanie za górnym aspektem tkanki ziarninowej lub połączeniem między tkanką ziarninową a strupem, aż dotrzesz do migrującego języka, a następnie do pierwszego mieszka włosowego nieuszkodzonej tkanki po drugiej stronie (<silna klasa="xfig">Rysunek 4E, F).</li>
		<li>W obszarze Analizuj kliknij pozycję Zmierz. Długość pomiaru pojawi się w tych samych jednostkach, co ustawione na skali.</li>
		<li>Utwórz arkusz kalkulacyjny, aby śledzić pomiary (Tabela uzupełniająca 1).</li>
		<li>Skopiuj długość rany do arkusza kalkulacyjnego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz długość naskórka
	<ol>
		<li>Jeśli naskórek pokrywa całą ranę, długość naskórka jest taka sama jak długość rany.
		<ol>
			<li>Skopiuj pomiar "długości rany" do kolumny "długość naskórka" w arkuszu kalkulacyjnym Excel i przejdź do kroku 11.5.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Jeśli naskórek nie pokrywa całej rany, wybierz "Selekcje odręczne" i zmierz odległość między każdą krawędzią natarcia naskórka podążającą za górnym aspektem tkanki ziarninowej lub połączeniem między tkanką ziarninową a strupem do pierwszego mieszka włosowego (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4C,D).
		<ol>
			<li>W obszarze Analizuj kliknij pozycję Zmierz.</li>
			<li>Odejmij ten pomiar od długości rany i zapisz liczbę w polu "długość naskórka" w arkuszu kalkulacyjnym Excel.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz obszar rany
	<ol>
		<li>Wybierz "Zaznaczanie odręczne" na pasku narzędzi Fidżi.</li>
		<li>Mierz zaczynając od ostatniego mieszka włosowego nieuszkodzonej tkanki po jednej stronie rany do pierwszego mieszka włosowego nieuszkodzonej tkanki po drugiej stronie rany (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4A,B,E,F).</li>
		<li>Śledź wzdłuż górnej części naskórka (nie należy uwzględniać strupka) lub górnej części tkanki ziarninowej, jeśli rana nie jest w pełni pokryta przez naskórek.</li>
		<li>Kontynuuj śledzenie pionowo wzdłuż mieszka włosowego do tkanki ziarninowej po osiągnięciu przeciwległego mieszka włosowego i aż do osiągnięcia tkanki tłuszczowej lub mięśnia. Podążaj za dolną granicą tkanki ziarninowej na przeciwną stronę rany i połącz punkt początkowy wzdłuż mieszka włosowego, aby zamknąć obszar (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4E,F).</li>
		<li>W obszarze Analizuj kliknij pozycję Zmierz.</li>
		<li>Skopiuj obszar rany do arkusza kalkulacyjnego w sekcji "zmierzona powierzchnia rany".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz obszar naskórka
	<ol>
		<li>Wybierz "Zaznaczanie odręczne" na pasku narzędzi Fidżi.</li>
		<li>Jeśli rana jest w pełni nabłonkowana:
		<ol>
			<li>Śledź wzdłuż górnej części naskórka, aż do osiągnięcia przeciwległego mieszka włosowego i zakończ obszar, "wracając" do punktu początkowego po połączeniu skórno-naskórkowym między naskórkiem a skórą właściwą (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4D).</li>
			<li>W obszarze Analizuj kliknij pozycję Zmierz.</li>
			<li>Skopiuj obszar naskórka do arkusza kalkulacyjnego Excel w sekcji "zmierzony obszar naskórka" i przejdź do kroku 11.7.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Jeśli rana nie jest w pełni nabłonkowana:
		<ol>
			<li>Śledź wzdłuż górnej części naskórka aż do krawędzi czołowej i wróć do punktu początkowego po połączeniu skórno-naskórkowym (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4C).</li>
			<li>W obszarze Analizuj kliknij pozycję Zmierz.</li>
			<li>Powtórzyć kroki 11.6.3.1 i 11.6.3.2 po przeciwnej stronie rany.</li>
			<li>W obszarze Analizuj kliknij pozycję Zmierz.</li>
			<li>Zsumuj dwie liczby uzyskane w krokach 11.6.3.2 i 11.6.3.4 i wprowadź wynik w polu "zmierzona powierzchnia naskórka" w arkuszu kalkulacyjnym.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórz kroki od 11.3 do 11.6 na co 40sekcji (co 8slajdzie).</li>
	<li>Oblicz obszar naskórka całej rany.
	<ol>
		<li>Utwórz nową kolumnę w arkuszu kalkulacyjnym "obliczono obszar naskórka" obok "długość naskórka".</li>
		<li>Pomnóż liczbę "długości naskórka" przez 280 dla każdej sekcji z wyjątkiem ostatniej (sekcja o grubości 7 μm x 40 sekcji).</li>
		<li>Pomnóż liczbę "długości naskórka" przez 7 dla ostatniego odcinka (grubości przekroju).</li>
		<li>Zsumuj wartość "obliczonej powierzchni naskórka" dla każdego odcinka, aby uzyskać powierzchnię naskórka całej rany.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oblicz powierzchnię rany całej rany.
	<ol>
		<li>Powtórz kroki od 11.8.1 do 11.8.4, korzystając z pomiarów długości uzwojenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oblicz objętość naskórka całej rany.
	<ol>
		<li>Powtórzyć kroki od 11.8.1 do 11.8.4, używając pomiarów "zmierzonej powierzchni naskórka".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oblicz objętość całej rany.
	<ol>
		<li>Powtórzyć kroki od 11.8.1 do 11.8.4, korzystając z pomiarów "zmierzona powierzchnia rany".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oblicz procentową objętość naskórka w ranie.
	<ol>
		<li>Podziel całkowitą objętość naskórka przez całkowitą objętość rany i pomnóż przez 100, aby uzyskać procent (nie rób tego stosunku dla każdego odcinka).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oblicz procentowy udział powierzchni naskórka w obszarze rany.
	<ol>
		<li>Podziel całkowitą powierzchnię naskórka przez całkowitą powierzchnię rany i pomnóż przez 100, aby uzyskać procent. Jeśli rana jest w pełni nabłonkowana, liczba ta powinna wynosić 100.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair+and+regeneration%3A+mechanisms%2C+signaling%2C+and+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation.</a> Science Translational Medicine. 6 (265), (2014).</li>
<li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-scale+coordination+of+cellular+behaviour+promotes+epidermal+wound+repair+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice.</a> Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).</li>
<li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).</li>
<li>Ansell, D. M., Campbell, L., Thomason, H. A., Brass, A., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+statistical+analysis+of+murine+incisional+and+excisional+acute+wound+models%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regeneration%22%5BJournal%5D)">A statistical analysis of murine incisional and excisional acute wound models.</a> Wound Repair Regeneration. 22 (2), 281-287 (2014).</li>
<li>Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Modeling+Conundrum%3A+Murine+Models+for+Cutaneous+Wound+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">A Modeling Conundrum: Murine Models for Cutaneous Wound Healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).</li>
<li>Crowe, M. J., Doetschman, T., Greenhalgh, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+wound+healing+in+immunodeficient+TGF-beta+1+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Delayed wound healing in immunodeficient TGF-beta 1 knockout mice.</a> Journal of Investigative Dermatology. 115 (1), 3-11 (2000).</li>
<li>Pietramaggiori, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+cutaneous+healing+in+diabetic+mice+exposed+to+healthy+peripheral+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Improved cutaneous healing in diabetic mice exposed to healthy peripheral circulation.</a> Journal of Investigative Dermatology. 129 (9), 2265-2274 (2009).</li>
<li>Cold Spring Harbor. Paraformaldehyde in PBS. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22">Cold Spring Harbor Protocols</a>. 1 (1), (2006).</li>
<li>Gerharz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometric+analysis+of+murine+skin+wound+healing%3A+standardization+of+experimental+procedures+and+impact+of+an+advanced+multitissue+array+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Morphometric analysis of murine skin wound healing: standardization of experimental procedures and impact of an advanced multitissue array technique.</a> Wound Repair Regeneration. 15 (1), 105-112 (2007).</li>
<li>Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+wounds+in+the+MRL%2FMPJ+mouse+heal+with+scar%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar.</a> Wound Repair Regeneration. 14 (1), 81-90 (2006).</li>
<li>Le, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor+beta+3+is+required+for+proper+excisional+wound+repair+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor beta 3 is required for proper excisional wound repair in vivo.</a> PLoS One. 7 (10), 48040(2012).</li>
<li>Sato, T., Yamamoto, M., Shimosato, T., Klinman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+wound+healing+mediated+by+activation+of+Toll-like+receptor+9%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Accelerated wound healing mediated by activation of Toll-like receptor 9.</a> Wound Repair Regeneration. 18 (6), 586-593 (2010).</li>
<li>Martin, P., Leibovich, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+cells+during+wound+repair%3A+the+good%2C+the+bad+and+the+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).</li>
<li>Shaw, T. J., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair%3A+a+showcase+for+cell+plasticity+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Wound repair: a showcase for cell plasticity and migration.</a> Current Opinion in Cell Biology. 42, 29-37 (2016).</li>
<li>Hoffman, M., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+intensity+laser+therapy+speeds+wound+healing+in+hemophilia+by+enhancing+platelet+procoagulant+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Low intensity laser therapy speeds wound healing in hemophilia by enhancing platelet procoagulant activity.</a> Wound Repair Regeneration. 20 (5), 770-777 (2012).</li>
<li>Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myofibroblasts+and+mechano-regulation+of+connective+tissue+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).</li>
<li>Uchiyama, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX2+Epidermal+Overexpression+Promotes+Cutaneous+Wound+Healing+via+Activation+of+EGFR%2FMEK%2FERK+Signaling+Mediated+by+EGFR+Ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">SOX2 Epidermal Overexpression Promotes Cutaneous Wound Healing via Activation of EGFR/MEK/ERK Signaling Mediated by EGFR Ligands.</a> Journal of Investigative Dermatology. 139 (8), 1809-1820 (2019).</li>
<li>Sen, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skin+wounds%3A+a+major+and+snowballing+threat+to+public+health+and+the+economy%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy.</a> Wound Repair Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).</li>
<li>Rhea, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+regulatory+factor+6+is+required+for+proper+wound+healing+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Interferon regulatory factor 6 is required for proper wound healing in vivo.</a> Developmental Dynamics. 249 (4), 509-522 (2020).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Obustronny model rany wycinającej jest wysoce konfigurowalną procedurą, która może być wykorzystana do badania wielu różnych aspektów gojenia się ran. Przed rozpoczęciem projektu gojenia się ran badacze powinni przeprowadzić analizę mocy, aby określić liczbę ran potrzebnych do wykrycia defektu o określonej wielkości efektu. W literaturze istnieją niespójności co do tego, czy poszczególne myszy lub rany powinny być używane jako repliki biologiczne, jednak ostatnie badanie wykazało, że nie ma znaczącej korelacji między dwi...

Gojenie się ran skórnych to złożony proces biologiczny z kolejno nakładającymi się na siebie fazami. Wymaga koordynacji procesów komórkowych i molekularnych, które są regulowane czasowo i przestrzennie w celu przywrócenia funkcji barierowej uszkodzonego nabłonka. W pierwszej fazie stan zapalny, neutrofile i makrofagi migrują do rany, mobilizując miejscowe i ogólnoustrojowe mechanizmy obronne1. Po fazie zapalnej i nakładającej się na nią następuje faza proliferacji. Fibroblasty zaczynają szybko się namnażać i migrować do tkanki ziarninowej. Keratynocyty z dala od krawędzi natarcia proliferują kierunkowo w kierunku rany, gdy zróżnicowane keratynocyty na krawędzi natarcia migrują, aby ponownie nabłonkować ranę2. Wreszcie rozpoczyna się faza przebudowy i dojrzewania, podczas której fibroblasty w tkance ziarninowej zaczynają syntetyzować i odkładać kolagen. Przebudowa i organizacja nowej matrycy może trwać do 1 roku po urazie3. Ze względu na złożoność nakładających się na siebie zdarzeń obejmujących wzajemne oddziaływanie między wieloma typami komórek oraz pomimo wieloletnich badań, wiele mechanizmów komórkowych i molekularnych leżących u podstaw gojenia się ran pozostaje słabo poznanych.
Model myszy jest dominującym modelem ssaków do badania mechanizmów gojenia się ran ze względu na łatwość użycia, stosunkowo niski koszt i możliwość manipulacji genetycznej1,4,5. Chociaż w modelu mysim opisano różne rodzaje ran, najczęstszą jest rana wycinająca (obustronna biopsja stempla lub bezpośrednia biopsja dziurka), a następnie modele ran ciętych4. Model rany wycinającej ma wyraźną przewagę nad modelem naciętym, ponieważ z natury generuje tkankę kontrolną, która nie została poddana procesowi gojenia. Tkanka z biopsji dziurkowej, która jest wycinana w ramach protokołu chirurgicznego, może być przetwarzana w taki sam sposób, jak zraniona tkanka i wykorzystywana do ustalenia warunków homeostatycznych dla pożądanego kryterium. Wycięta tkanka kontrolna może być również przydatna do oceny efektów wstępnej obróbki skóry lub potwierdzania udanej zmiany genu w momencie urazu4.
Parametry leczenia mogą być oceniane za pomocą wielu różnych technik, w tym planimetrii czy histologii. Jednak planimetria może ocenić tylko widoczne cechy rany, a ze względu na obecność strupa często nie koreluje z pomiarami gojenia, które są wizualizowane przez histologię, co sprawia, że histologia jest "złotym standardem" analizy4. Pomimo tego, że analiza histologiczna jest złotym standardem, najczęściej przeprowadza się ją na dowolnym podzbiorze rany6,7. Na przykład przecięcie rany "na pół" przed osadzeniem i pocięciem rany jest obecnie powszechną praktyką mającą na celu skrócenie czasu i zasobów poświęcanych na cięcie materiałów i analizę danych. Metoda analizy morfometrycznej opisana w tym protokole została opracowana w celu objęcia całej tkanki rany, dokładnego odzwierciedlenia cech morfologicznych rany oraz zwiększenia prawdopodobieństwa wykrycia wad gojenia się rany przy niewielkim rozmiarze efektu. W tym protokole szczegółowo opisujemy chirurgiczną metodę generowania najczęściej badanej rany mysiej, obustronnej rany wycinającej o pełnej grubości, a także szczegółową i rygorystyczną metodę analizy histologicznej, która jest rzadko stosowana w terenie.

<table><tbody><tr><td>100% etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>80% etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>95%</td><td></td><td></td><td></td></tr> etanol <tr><td>Przygotowanie alkoholu</td><td>NOVAPLUS</td><td>V9100</td><td>70% Alkohol izopropylowy, sterylne</td></tr><tr><td>Wodorotlenek</td><td></td><td></td><td></td>amonu</tr><tr><td>Podkładki do biopsji</td><td>Cellpath</td><td>22-222-012</td><td></td></tr><tr><td>plastikowy arkusz</td><td></td><td></td><td>Coś mocnego, ale podatnego na manipulację o wielkości kartki papieru</td></tr><tr>Mikroskop <td></td><td></td><td>jasnego pola</td><td>Z cyfrowymi możliwościami akwizycji i obiektywem 4X</td></tr><tr><td>Aplikatory</td><td></td><td></td><td></td>z bawełnianą końcówką</tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td></td><td></td><td>22 x 60 #1</td></tr><tr><td>Arkusze</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>wosku dentystycznegoAparat</td><td></td><td></td> cyfrowy <td>Dołącz linijkę do skali, jeśli dotyczy</td></tr><tr><td>Igła do rozwarstwiania (prosta)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Formy <td></td><td></td><td>do zatapiania</td><td>22 x 22 x 12</td></tr><tr><td>Pierścienie do osadzania</td><td>Simport Scientific Inc.</td><td>M460</td><td></td></tr><tr><td>Eozyna Y</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lodowaty kwas</td><td></td><td></td><td></td>octowy</tr><tr><td>Maszynka</td><td></td><td></td><td></td>do strzyżenia włosów</tr><tr><td>Poduszka grzewcza</td><td>Conair</td><td></td><td>Wilgotna sucha poduszka grzewcza</td></tr><tr><td>Hematoksylina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ostrza</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr>mikrotomu<td>Pędzle malarskie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafina Typ 6</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosforan roztwór buforowy (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Powidon-jod</td><td>Aplicare</td><td>82-255</td><td></td></tr><tr><td>Kaseta procesowa</td><td>Simport Scientific Inc.</td><td>M490-2</td><td></td></tr><tr><td>Żyletki</td> <td>ASR.009</td><td></td><td></td> Regular Duty</tr><tr><td>Ostrza skalpela #10</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rękojeść</td><td></td><td></td><td></td>skalpela</tr><tr><td>Ostre nożyczki</td><td></td><td></td> chirurgiczne <td>sterylne do operacji</td></tr><tr><td>Stemple do biopsji</td><td></td><td></td> skóry <td>Rozmiar określony przez badacza</td></tr><tr><td>Pudełka</td><td></td><td></td><td></td> na prowadnice</tr><tr>Podgrzewacze <td></td><td></td><td></td><td>do szkiełków</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Superfrosted</td><td>Fisher Scientific</td><td>22 037 246</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel</td><td></td><td></td><td></td>wodna z regulacją temperatury</tr><tr><td>Stacja</td><td></td><td></td> zatapiania tkanek <td>Minimum dozownika parafiny i zimnej płyty</td></tr><tr><td>Procesor</td><td></td><td></td> tkanek <td>Minimum piekarnika z pompą próżniową</td></tr><tr><td>Potrójny antybiotyk </td> pęseta do maści <td></td><td></td><td></td>optalmicznej</tr><tr><td>, zakrzywiona końcówka</td><td></td><td></td><td>sterylna do</td></tr><tr><td>pęsety chirurgicznej, stożkowa końcówka</td><td></td><td></td><td>sterylna do operacji</td></tr><tr><td>WypAll X60</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34865</td><td></td></tr></tbody></table>

mysi model gojenia ran wycinających i histologiczna morfometryczna analiza ran

Murine Excisional Wound Healing Model and Histological Morphometric Wound Analysis

Model mysiego rany wycinającej był szeroko stosowany do badania każdej z kolejno nakładających się na siebie faz gojenia się ran: zapalenia, proliferacji i przebudowy. Rany mysie mają histologicznie dobrze zdefiniowane i łatwo rozpoznawalne łożysko rany, na którym można zmierzyć te różne fazy procesu gojenia. W tej dziedzinie często używa się arbitralnie zdefiniowanego "środka" rany do analiz histologicznych. Jednak rany są bytem trójwymiarowym i często nie są histologicznie symetryczne, co potwierdza potrzebę dobrze zdefiniowanej i solidnej metody kwantyfikacji w celu wykrycia defektów morfometrycznych o niewielkim rozmiarze efektu. W niniejszym protokole opisujemy procedurę tworzenia obustronnych ran wycinających o pełnej grubości u myszy, a także szczegółową instrukcję pomiaru parametrów morfometrycznych za pomocą programu do przetwarzania obrazu na wybranych odcinkach seryjnych. Dwuwymiarowe pomiary długości rany, długości naskórka, obszaru naskórka i obszaru rany stosuje się w połączeniu ze znaną odległością między sekcjami w celu ekstrapolacji trójwymiarowego obszaru naskórka pokrywającego ranę, całkowitej powierzchni rany, objętości naskórka i objętości rany. Chociaż ta szczegółowa analiza histologiczna jest bardziej czasochłonna i zasobożerna niż konwencjonalne analizy, jej rygor zwiększa prawdopodobieństwo wykrycia nowych fenotypów w z natury złożonym procesie gojenia się ran.

Rysunek 5 przedstawia zakres zmierzonych i obliczonych wartości uzyskanych poprzez przeprowadzenie analizy morfometrycznej ran typu dzikiego, wytworzonych u różnych szczepów myszy przez wielu chirurgów i analizowanych przez różne osoby. Myszy typu dzikiego z różnych szczepów mogą wykazywać różnice statystyczne, co opisano zarówno w naszych badaniach, jak i w literaturze9,10. Na podstawie tych reprezentatywnych wyników zalecamy, aby w...

Ten protokół opisuje, jak generować obustronne rany wycinające o pełnej grubości u myszy oraz jak następnie monitorować, zbierać i przygotowywać rany do analizy morfometrycznej. Dołączono szczegółowy opis sposobu wykorzystania seryjnych odcinków histologicznych do definiowania, precyzyjnego określania ilościowego i wykrywania wad morfometrycznych.

Mysi model gojenia ran wycinających i histologiczna morfometryczna analiza ran

The murine excisional wound model has been used extensively to study each of the sequentially overlapping phases of wound healing: inflammation, ...

Protokół ten wykorzystuje analizę histologiczną w celu uzyskania solidnych pomiarów morfometrycznych ran wycinanych myszy. Korzystając z tej techniki, możemy przeanalizować całą ranę za pomocą podzbioru odcinków seryjnych, co pozwala nam dokładniej wykryć wady, które w przeciwnym razie mogłyby zostać pominięte. Procedurę zademonstruje Lindsey Rhea, pracownik naukowy z mojego laboratorium.Po potwierdzeniu braku reakcji na odruch pedałowania u znieczulonej dorosłej myszy, nałóż maść na oczy zwierzęcia i użyj elektrycznej maszynki do strzyżenia maszynki do golenia ruchem ogonowo-rostralnym, aby usunąć sierść z grzbietu myszy na poziomie ramion. Użyj żyletki trzymanej pod kątem 20 stopni od tyłu ruchem rostralno-ogonowym, aby usunąć wszelkie pozostałe włosy z odsłoniętej skóry, a następnie oczyść skórę jedną chusteczką z jodonem powidonu i jedną chusteczką z 70% alkoholem izopropylowym. W celu indukcji rany ułóż czysty ręcznik papierowy na płaskiej powierzchni pokrytej woskiem dentystycznym i umieść mysz na ręczniku w pozycji leżącej.Ściśnij skórę myszy między łopatkami wzdłuż grzbietowej linii środkowej i odciągnij umieszczoną w kanapce fałd skóry od ciała. Przełączając mysz do pozycji leżącej na boku, umieść stempel biopsyjny o pożądanym rozmiarze rany jak najbliżej ciała i pozwól skórze się rozluźnić. Dociśnij stempel ruchem kołyszącym, aby przebić wszystkie warstwy skóry i usuń biopsje stempla z rany za pomocą sterylnych nożyczek i pęsety, aby w razie potrzeby uwolnić stempel od otaczającej skóry.Następnie pozwól myszy odzyskać sprawność dzięki monitorowaniu i przeciwbólowi. W celu analizy morfometrycznej łożyska rany należy otworzyć cyfrowy obraz barwionej rany. Aby ustawić preferencje skali i pomiaru, w obszarze Analizuj wybierz opcję Ustaw skalę i wprowadź odległość w pikselach, znaną odległość i jednostkę długości.Wybierz opcje Globalne i OK, aby zachować taką samą skalę dla każdego otwartego obrazu, a następnie wybierz opcję Analizuj i ustaw pomiary, aby potwierdzić, że pole obszaru jest zaznaczone. Aby zmierzyć długość rany, wybierz opcję odręczną i za pomocą narzędzia prześledź wzdłuż połączenia skórno-naskórkowego, zaczynając od ostatniego mieszka włosowego nieuszkodzonej tkanki po jednej stronie rany do pierwszego mieszka włosowego nieuszkodzonej tkanki po drugiej stronie. Jeśli naskórek nie pokrywa całej rany, należy podążać za połączeniem skórno-naskórkowym po jednej stronie rany, gdzie kończy się wędrujący język i kontynuować wzdłuż górnej części tkanki ziarninowej lub połączenia między tkanką ziarninową a strupem, aż do osiągnięcia migrującego języka i pierwszego mieszka włosowego nieuszkodzonej tkanki po drugiej stronie rany.Następnie kliknij przycisk Analizuj i mierz. Długość pomiaru pojawi się w tych samych jednostkach, co ustawione na skali. Jeśli naskórek nie pokrywa całej rany, należy zmierzyć odległość między każdą krawędzią naskórka podążającą za górnym aspektem tkanki ziarninowej lub połączeniem między tkanką ziarninową a strupem do pierwszego mieszka włosowego.Aby zmierzyć obszar rany, za pomocą narzędzia odręcznego prześledź wzdłuż górnej części naskórka lub górnej części tkanki ziarninowej, zaczynając od ostatniego mieszka włosowego nieuszkodzonej tkanki po jednej stronie rany do pierwszego mieszka włosowego nieuszkodzonej tkanki po drugiej stronie. Kontynuuj śledzenie pionowo wzdłuż mieszka włosowego do tkanki ziarninowej. Po dotarciu do przeciwległego mieszka włosowego i tkanki tłuszczowej lub mięśnia, podążaj za dolną granicą tkanki ziarninowej po przeciwnej stronie rany i połącz punkt początkowy wzdłuż mieszka włosowego, aby zamknąć obszar.Jeśli rana nie jest w pełni nabłonkowana, należy prześledzić wzdłuż górnej części naskórka aż do krawędzi czołowej i powrócić do punktu początkowego po połączeniu skórno-naskórkowym. Jak pokazano na ilustracji, wykonując pomiary 2D w całej ranie, byliśmy w stanie obliczyć parametry, które nie są możliwe przy analizie 2D tylko na środku rany, co jest powszechnie stosowaną metodą w terenie. W tym eksperymencie wykorzystano pomiary 2D powierzchni rany i uśredniono je dla całej rany lub środkowego podzbioru rany i nie wykazały istotnej różnicy między grupami eksperymentalnymi ani metodami analizy.Obliczona objętość rany różniła się jednak istotnie między grupami eksperymentalnymi, co świadczy o znaczeniu pogłębionej analizy histologicznej parametrów gojenia się rany. Generowanie ran o stałej wielkości do analizy histologicznej i przeprowadzanie rygorystycznych cięć seryjnych ma kluczowe znaczenie dla dokładnej analizy morfometrycznej. Niebarwione skrawki mogą być używane do immunofluorescencji lub barwienia trichromowego Massona w celu pomiaru innych aspektów gojenia się ran, podczas gdy rany zamrożone błyskawicznie mogą być używane wraz z morfometrią do ilościowej analizy białek.

murine-excisional-wound-healing-model-histological-morphometric-wound

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W tym filmie opisujemy procedurę izolowania łożyska rany wywołanego kolonoskopią w odpowiednim momencie do szczegółowej analizy molekularnej. Analiza ta pomaga zrozumieć proces gojenia się ran w stanach zapalnych przewodu pokarmowego.

Kolonoskopowy model rany mysiej sterowanej: metoda izolowania łożyska rany wywołanej biopsją od jelita grubego, aby zrozumieć proces gojenia

Mysi model gojenia się ran skórnych, który może być używany do oceny związków terapeutycznych w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych.

Mysi model gojenia się ran

Podczas rozwoju ssaków, rany skóry na wczesnym etapie ciąży goją się bez blizny. Tutaj szczegółowo opisujemy wiarygodny i powtarzalny model gojenia się ran bez blizn płodu w grzbietu skóry zarodków myszy E16.5 (bez blizn) i E18.5 (bliznowaciejących).

Model skóry płodu myszy z gojeniem ran bez blizn

Opisujemy nieinwazyjny protokół obrazowania in vivo, który jest uproszczony i opłacalny, wykorzystując L-012, chemiluminescencyjny analog luminolu, do wizualizacji i ilościowego określenia reaktywnych form tlenu (ROS) generowanych w mysim modelu rany wycinającej.

In vivo (in vivo) Obrazowanie reaktywnych form tlenu w mysim modelu rany

Tutaj prezentujemy protokół dla testu in vitro z użyciem pierwotnych fibroblastów oraz dla testu in vivo gojenia ran skóry na myszach. Oba testy są prostymi metodami oceny gojenia się ran in vitro i in vivo.

Test migracji zadrapań i komora grzbietowego fałdu skórnego do analizy gojenia się ran in vitro i in vivo

Tutaj opisane są dwa modele gojenia ran u myszy, jeden przeznaczony do oceny reakcji na gojenie się ran komórkowych i cytokinowych, a drugi do ilościowego określania szybkości zamykania ran. Metody te mogą być stosowane w złożonych modelach chorób, takich jak cukrzyca, w celu określenia mechanizmów różnych aspektów złego gojenia się ran.

Ocena ostrego gojenia się ran za pomocą grzbietowej podskórnej implantacji gąbki z polialkoholu winylowego i wycinających raki skóry ogona.

Celem tego badania było opracowanie mysiego modelu gojenia się ran po oparzeniach. Oparzenie termiczne wywołano na skórze grzbietowej myszy za pomocą podgrzanego mosiężnego szablonu. Spaloną tkankę oczyszczono i pokryto przeszczepem skóry pobranym z ogona genetycznie podobnej myszy dawcy.

Mysi model rany oparzeniowej zrekonstruowany za pomocą allogenicznego przeszczepu skóry

Tutaj demonstrujemy zoptymalizowaną technikę oceny gojenia ran za pomocą ludzkiej skóry ex vivo w połączeniu z podejściem polegającym na barwieniu całego wierzchowania. Metodologia ta stanowi przedkliniczną platformę do oceny potencjalnych terapii ran.

Ludzki model ran ex vivo i barwienie całej góry w celu dokładnej oceny naprawy skóry

To badanie przedstawia dwie kluczowe techniki eksperymentalne: budowę mysiego modelu rany do oceny zamknięcia rany oraz przygotowanie zawiesin jednokomórkowych z mysiej skóry w celu zachowania żywotności komórek.

Modele ran u myszy i przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek

Rany stanowią globalne wyzwanie zdrowotne. W ramach tego badania opracowano standaryzowaną kabinę fotograficzną wykorzystującą planimetrię cyfrową w celu zminimalizowania zmienności pomiaru rany. Monitorowanie ran u myszy przez 14 dni wykazało początkowy wzrost powierzchni i obwodu rany, po którym następowało stopniowe zamykanie. Metodologia ta może pomóc w ocenie kinetyki zamykania ran w modelach przedklinicznych.

Planimetria cyfrowa do oceny kinetyki zamykania ran w modelu mysim

Opisano zostało szczurze modele rany skóry, które umożliwiają ocenę różnych środków terapeutycznych w warunkach fizjologicznych lub patologicznych na różnych etapach procesu gojenia. Ponadto szczegółowo opisano protokół do wykonywania manualnej planimetrji w celu monitorowania szybkości kurczenia się rany w trakcie naprawy tkanki.

Model szczurzych ran chirurgicznych: podejście do badań nad gojeniem się ran i oceną biomateriałów

Naucz się tworzyć dwustronne rany wycięciowe u myszy i przeprowadzać szczegółową analizę morfometryczną za pomocą technik histologicznych. Ta metoda umożliwia dokładne wykrywanie defektów gojenia.

Mysi model gojenia ran wycinających i histologiczna morfometryczna analiza ran

Przeglądaj więcej filmów