Półautomatyczna procedura ChIP-Seq do badań epigenetycznych na dużą skalę

Protokół ten jest istotny, ponieważ pozwala na wysokoprzepustową analizę ChIP-Seq próbek pierwotnych w celu lepszego zrozumienia mechanizmów cis-regulacyjnych i ich wpływu na chorobę. Głównymi zaletami tej metody są powtarzalność danych i drastyczne skrócenie czasu pracy w laboratorium. W celu ścinania chromatyny dodaj 70 mikrolitrów świeżego, pełnego buforu do lizy o temperaturze pokojowej do utrwalonego glicyną, zatrzaskowo zamrożonego i rozmrożonego osadu komórkowego, który Cię interesuje, na jednominutową inkubację w temperaturze pokojowej, a następnie jedną minutę ponownego zawieszenia bez pęcherzyków.

Inkubować próbkę przez kolejną minutę w temperaturze pokojowej, przed umieszczeniem komórek na lodzie. Przenieś zawieszony granulat do 0,65 mililitrowej rurki o niskim stopniu wiązania na lodzie, przed załadowaniem probówki do uchwytu probówki sonikatora. Wypełnij wszelkie szczeliny rurkami równoważącymi zawierającymi 70 mikrolitrów wody i pozwól komórkom ustabilizować się w łaźni wodnej przez około minutę przed rozpoczęciem sonikacji.

Po trzech cyklach wyjmij próbki z sonikatora w celu delikatnego wirowania i pulsacyjnie obracaj probówki przed umieszczeniem ich z powrotem w uchwycie. W celu modyfikacji histonów dodaj 100 mikrolitrów kompletnego buforu tC1 do każdej probówki z dwoma ośmiorurkowymi paskami chipowymi i przenieś 20 mikrolitrów każdej z 16 próbek współdzielonych chromatyną do pojedynczych probówek z ośmiorurkowymi paskami chipa. Przemyć probówki chromatyny pełnym buforem tC1 o pojemności 80 mikrolitrów i połączyć popłuczyny w odpowiednich probówkach z ośmiorurkowymi paskami chipowymi, uzyskując końcową objętość 200 mikrolitrów roztworu na probówkę.

Dodaj odpowiednią objętość przeciwciała do 500 mikrolitrów buforu TBW1 i szybko wiruj i pulsuj. Następnie dodaj 70 mikrolitrów tBW1 i 30 mikrolitrów roztworu przeciwciała do każdej probówki nowego paska z ośmioma probówkami z chipem. Następnie dokładnie zwiruj pojemnik z roztworem kulek białka A i dodaj pięć mikrolitrów kulek na 0,5 mikrograma przeciwciała do nowego paska probówki.

Pulsacyjnie zakręć paskiem kulek i wypełnij ostatni rząd urządzenia do obsługi cieczy wiórowej oznaczonymi, pustymi, ośmiorurkowymi paskami z wiórami. Następnie postępuj zgodnie ze specyfikacją programu chip 16-I pure 200 D dotyczącą rozmieszczenia pozostałych pasków i załaduj we właściwe pozycje. Po sekwencjonowaniu uchwyć kulki w ośmiorurowym magnesie paskowym i przenieś 25 mikrolitrów buforu znacznikowego do każdej probówki.

Po wyjęciu probówek z magnesu delikatnie wymieszaj, aż roztwory kulek będą jednorodne, a następnie umieść ponownie zamknięte probówki w podgrzanym ThermoMixerze na trzy minuty. Pod koniec inkubacji usunąć paski z ośmiorurkami z chipami w ostatnim rzędzie pojemnika na płyn do chipsów i dodać dwa mikrolitry Rnazy A do każdej próbki. Następnie pulsacyjnie odkręć ponownie zakorkowane rurki i delikatnie wymieszaj, aż roztwory kulek będą jednorodne.

W celu oczyszczenia oznakowanych fragmentów DNA, przenieś 100 mikrolitrów próbek DNA usieciowanego D do pojedynczych probówek o pojemności 1,5 mililitra i umyj probówki 100 mikrolitrami buforu wiążącego DNA na probówkę. Umieść płuczki w odpowiednich probówkach i załaduj próbki do kolumn. Umieść kolumny w nowych probówkach zbiorczych o pojemności 1,5 mililitra i dodaj dziewięć mikrolitrów buforu Tris-EDTA o temperaturze 55 stopni Celsjusza bezpośrednio do matryc kolumn.

Po jednej minucie odwirować kolumny i przenieść dziewięć mikrolitrów eluatu z każdej kolumny do nowego ośmioprobówkowego paska na lodzie. Ponownie eluować fragmenty DNA, jak pokazano, ale z ośmioma mikrolitrami buforu Tris-EDTA i połączyć eluat z wcześniej zebranym roztworem fragmentu DNA. Aby amplifikować oczyszczone próbki fragmentów DNA, należy wymieszać próbki za pomocą pipety wielokanałowej i wykonać program amplifikacji z odpowiednią liczbą cykli.

Po amplifikacji użyj płyty magnetycznej, aby uchwycić koraliki i wyrzuć supernatant. Umyj koraliki trzykrotnie 200 mikrolitrami świeżego 80% etanolu na pranie, nie naruszając granulki kulek. Po ostatnim praniu użyj końcówki pipety o pojemności 20 mikrolitrów, aby usunąć nadmiar etanolu i pozostaw kulki do wyschnięcia na 10 minut lub do momentu, gdy pojawią się pęknięcia w granulkach kulek.

Dodaj 40 mikrolitrów wstępnie podgrzanej wody do każdej wysuszonej próbki i uszczelnij płytkę przed dokładnym wirowaniem i krótkim pulsacyjnym wirowaniem. Następnie określ ilościowo DNA, używając testu ilościowego fluorescencji, zgodnie ze standardowymi protokołami. Pomiary wielkości fragmentów chromatyny ze ściętymi krawędziami wykazują dużą powtarzalność, przy czym ponad 70% próbek obserwuje się między 100 a 500 parami zasad przez 14 cykli.

Jak pokazano, cykl, w którym intensywność znakowanej próbki jest o połowę mniejsza od średniego maksimum, jest optymalny do oznaczania cyklu. Najlepsze dane sekwencjonowania uzyskuje się, gdy ponad 85% fragmentów DNA mieści się w zakresie od 200 do 1000 par zasad. W tych reprezentatywnych ścieżkach wzbogacania dla czterech loci genów, indywidualne ścieżki dla każdej próbki wykazują wysoką jakość mapowania i stosunek sygnału do szumu.

Pierwsze dwa loci zawierają dobrze wyrażone geny w tych typach komórek, podczas gdy geny w ostatnich dwóch loci nie są wyrażane i służą jako kontrola tła. W przypadku większości porównań parami wskaźniki korelacji Pearsona wykazują ponad 90% korelację, co sugeruje wysoki poziom spójności między kontrpróbami biologicznymi. Podczas gdy loci specyficzne dla typu komórki wykazują wysokie wzbogacenie w odpowiednie komórki, gen porządkowy wykazuje bardzo konsekwentną modyfikację histonów.

Analiza korelacji między zestawem danych ChIP-Seq przeprowadzona z próbek zawierających mniej niż 100 000 komórek nadal wykazuje wysoką odtwarzalność i korelację do 10 000 komórek. Jednak wraz ze zmniejszaniem się liczby komórek występuje zwiększone tło, a także spadek ich współczynników korelacji. Właściwa liza komórek jest niezbędna do generowania wysokiej jakości danych, ponieważ odkryliśmy, że niepełna liza komórek wpływa na resztę protokołu.

Korzystając z tej metody, można przetestować wiele różnych modyfikacji histonów i czynników transkrypcyjnych na różnych typach komórek, aby pogłębić naszą wiedzę na temat elementów cis-regulatorowych.